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Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
ANÁLISIS DEL PERFIL METABÓLICO EN Caricapapaya DURANTE ESTRÉS GENERADO POR SEQUÍA
Tesis que presenta
GABRIELA FLORES VARGAS
En opción al título de
MAESTRA EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)
Mérida, Yucatán, México
Marzo 2017
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en las secciones de Materiales y Métodos,
Resultados y Discusión de este documento proviene de las actividades de
experimentación realizadas durante el período que se me asignó para desarrollar mi
trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de
Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los servicios
educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos de la Ley
Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y en
el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o
desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por
la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración.
________________________________
Gabriela Flores Vargas
AGRADECIMIENTOS
Gracias al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada
(número CVU 662282) en apoyo a mis estudios de Maestría y por el financiamiento del
proyecto en ciencia básica titulado: “FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN DE PAPAYA
(CARICA PAPAYA VAR. MARADOL) COMO UNA PLATAFORMA MOLECULAR PARA
MEJORAR SU TOLERANCIA A ESTRESES BIÓTICOS Y ABIÓTICOS” SEP-CONACYT
(Número 163556, CB-2010-01).
Gracias al Centro de Investigación Científica de Yucatán A. C. (CICY) por las
instalaciones prestadas durante mi preparación académica; al Director General del CICY,
el Dr. Felipe Sánchez Teyer, a la subdirectora de docencia CP. Ligelia García Cano, al
director de docencia el Dr. Manuel Martínez Estévez, al Departamento de Posgrado a
cargo de la Lic. Nancy Sulub Herrera; a la Unidad de Biotecnología a cargo del Dr. Luis
Sáenz Carbonell así como a la Coordinadora de Posgrado actual la Dra. Marcela Gamboa
Angulo.
Agradezco al Dr. Luis Carlos Rodríguez Zapata por todo su apoyo, enseñanzas, consejos
asesoría y amistad a lo largo de estos años.
Agradezco al Dr. Enrique Castaño de la Serna por su apoyo, asesoría académica, por su
amistad y confianza que deposito en mi persona.
Agradezco al Centro de Análisis y Síntesis del Departamento de Química de la
Universidad de Lund por permitirme realizar una estancia de investigación en sus
instalaciones. A la Dra. Irene Rodríguez Meizoso por la confianza depositada en mí, sus
valiosos consejos, apoyo académico y personal. Gracias a la Dra. Alicia Gil Ramírez por
sus enseñanzas prácticas y teóricas; y a la Dra. Merichel Plaza del Moral por sus
instrucciones y apoyo en la parte técnica y manejo de datos. Así también agradezco a
Claudia Balderas, Romy Vázquez, Marta Espina y todos los integrantes del Laboratorio
del grupo de la Dra. Irene Rodríguez Meizoso y la Dra. Charlotta Turner por recibirme
durante la estancia y por todo su apoyo profesional y personal.
Agradezco de todo corazón a nuestro técnico de laboratorio Q.F.B. Miguel Keb Llanes por
su apoyo en el trabajo diario y en especial por su asesoría durante los episodios de
micropropagación.
Agradezco a mi comité tutoral integrado por el Dr. Luis Carlos Rodríguez Zapata, la Dra.
Rocío Borges Argáez, el Dr. Enrique Castaño de la Serna y el Dr. José Luis Cabrera
Ponce.
También agradezco a mi comité revisor de tesis integrado por el Dr. Luis Carlos
Rodríguez Zapata, la Dra. Rocío Borges Argáez, el Dr. Enrique Castaño de la Serna, el
Dr. José Luis Cabrera Ponce y la Dra. Ana Ly Arroyo Herrera.
Gracias a todos mis compañeros de laboratorio: Dr. Alejandro Pereira, M. en C. Jorge
Espadas, M. en C. Alejandro Zamora, M. en C. Samuel Gamboa, M. en C. Sandy Reyes,
M. en C. Ricardo Ortiz, M. en C. Christian Alcocer, IBT. Jordán Alvarado, IBQ. Evelyn
Carrillo, IBQ. Karina Sosa, Biol. Aarón G.Cantón y Carolina Sulu. Su compañerismo y
apoyo incondicional hicieron del laboratorio un espacio único.
DEDICATORIAS
Dedico esta tesis a mi familia:
A mis padres José Gerardo Flores Rodríguez y Ruby Leticia Vargas Díaz, a mi hermano
Gerardo Iván Flores Vargas. El trabajo que aquí presento no hubiera podido ser finalizado
sin su cariño incondicional y apoyo en especial para esos días de noches exhaustivas de
estudio y desvelos por trabajo de laboratorio.
También dedico este trabajo a Lili Flores Rodríguez y Silvia Arzate Trujillo, no sólo son las
mejores tías que podría pedir, son también dos personas maravillosas.
“Nothing in life is to be feared, it is only to be understood. Now is the time to understand
more, so that we may fear less.” Marie Curie
I
ÍNDICE
RESUMEN ......................................................................................................................................... 1
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 3
CAPÍTULO I ....................................................................................................................................... 7
1.1. ANTECEDENTES ................................................................................................................. 7
1.1.1. GENERALIDADES DEL ESTRÉS ABIÓTICO .......................................................... 7
1.1.2. ESTRÉS POR SEQUÍA .............................................................................................. 10
1.1.3. METABOLISMO SECUNDARIO EN PLANTAS ..................................................... 18
1.1.4. Carica papaya COMO MODELO DE ESTUDIO ..................................................... 23
1.2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................. 28
1.3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 29
1.3.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................ 29
1.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 29
1.4. HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 29
1.5. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ...................................................................................... 30
CAPÍTULO II. TRATAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE ESTRÉS POR SEQUÍA EN C.
papaya .............................................................................................................................................. 31
2.1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 31
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 32
2.2.1. MATERIAL VEGETAL ................................................................................................ 32
2.2.2. TRATAMIENTO DE ESTRÉS HÍDRICO ................................................................. 32
2.2.3. MEDICIÓN DE PARÁMETROS FISOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS .................... 33
2.2.2. MEDICIÓN DE PARÁMETROS MOLECULARES ................................................. 33
2.3. RESULTADOS .................................................................................................................... 38
2.3.1. MEDICIÓN DE PARÁMETROS FISIOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS................... 38
2.3.2. MEDICIÓN DE PARÁMETROS MOLECULARES ................................................. 41
2.4. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 47
2.4.1. PARÁMETROS FISIOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS .............................................. 47
2.4.2. PARÁMETROS MOLECULARES ............................................................................. 50
II
2.5. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 54
CAPÍTULO III. MEDICIÓN DE METABOLISMO SECUNDARIO EN PLANTAS DE Carica
papaya SOMETIDAS A ESTRÉS POR SEQUIA ...................................................................... 55
3.1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 55
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 56
3.2.1. MATERIAL VEGETAL ................................................................................................ 56
3.2.2. EXTRACCIÓN DE MUESTRAS ................................................................................ 56
3.2.3. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Y CARACTERIZACIÓN DE LOS
METABOLITOS SECUNDARIOS ........................................................................................ 57
3.2.4. IDENTIFICACIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS ............................ 58
3.3. RESULTADOS .................................................................................................................... 60
3.3.1. EXTRACCIÓN DE MUESTRAS ................................................................................ 60
3.3.2. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Y CARACTERIZACIÓN DE LOS
METABOLITOS SECUNDARIOS ........................................................................................ 64
3.3.3. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS .................................. 70
3.4. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 77
3.5. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 83
CAPÍTULO IV. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES GENERALES ........................................... 85
4.1. DISCUSIÓN GENERAL ..................................................................................................... 85
4.2. CONCLUSIONES GENERALES ...................................................................................... 90
4.3. PERSPECTIVAS ................................................................................................................ 91
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 93
III
LISTADO DE ABREVIATURAS
ABA Ácido abscísico
ADN Ácido desoxirribonucléico
ADNc Ácido desoxirribonucléico complementario
ARN Ácido ribonucléico
bZIP Zipper leucina básico
CO2 Dióxido de carbono
CRA Contenido relativo de agua
DAD Detector de arreglo de diodos
DEPC Dietilpirocarbonato
ECD Detector electroquímico
ERF Factor de resistencia al etileno
ESI Ionización en electrospray
GC Cromatografía de gases
HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia
H-NMR Resonancia magnética nuclear de protón
MS Espectrometría de masas
MYB Oncogen del virus de la mieloblastosis aviar
m/z Masa de un ion en unidades de masa atómica unificada dividido por su número de carga
NAC NAM: sin meristema apical
nm Nanómetros
ROS Especies reactivas a oxígeno
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
pb Pares de bases
psi Libras por pulgada cuadrada
PLE Extracción líquida presurizada
PTFE Politetrafluoroetileno
qTOF Acelerador cuádruple tiempo de vuelo
TGA Grupo de factores de transcripción de la familia bZIP
TIC Cromatograma de iones totales
tr Tiempo de retención
UPLC Cromatografía líquida de ultra eficacia
UV Ultravioleta
μmol Micromolar
IV
V
ÍNDICE DE FIGURAS
CÁPITULO I
Figura 1.1. Esquema general de la respuesta de señalización de la planta ante un estrés abiótico. Modificado de Kuromori et al., 2014…………………………………………………..8
Figura 1.2. Esquema general del mecanismo de acción a nivel molecular dentro de la planta ante un estrés generado por sequía. Modificado a partir de Trenberth et al., 2014. …………………………………………………………………………………………………..….15
Figura 1.3. Estructura tridimensional del dominio conservado de la familia bZIP. Modificado de Guedes-Correa et al., 2008. El dominio de dos hélices alfas continuas se encuentra dividido en dos secciones. Modificado a partir de Jakoby et al., 2002…………………………………………………………………………………………….…..16
Figura 1.4. Esquema de la ruta de biosíntesis de los fenilpropanoides. Tomado de Dixon et al., 2001………………………………………....................................................................21
Figura 1.5. Esqueleto estructural básico de los flavonoides. Tomado de de Kumar y Pandey, 2013……………………………………………………………………………...………21
Figura 1.6. Morfología de Carica papaya var. Maradol. I. a) Planta de tres semanas de edad, b) Hoja laminar y petiolo, c)Sistema radicular de una planta de 5 meses, d) Tallo de una planta de un año de edad con sus respectivas cicatrices al perder el pectiolo, e) Floración con tres pistilos, f) Fruto de una papaya hermafrodita. II. Árbol de papaya hermafrodita (CONABIO, 2015 y Jiménez et al., 2014……………………………….………25
Figura 1.7. Esquema de las aplicaciones de compuestos bioactivos en la medicina tradicional en relación al tipo de tejido del cual fue aislado…………………………...……..26
CÁPITULO II
Figura 2.1. Mapa del vector de clonación pGEM®-T Easy………………………………..37
Figura 2.2. Efecto del tratamiento de estrés hídrico sobre la parte aérea de plantas de papaya durante los cuatro puntos de medición del estrés…………………………..…….39
Figura 2.3. Cálculo del contenido relativo de agua de hojas de C. papaya bajo estrés por sequía………………………………………………….………………………………………......39
Figura 2.4. Contenido de prolina en hojas de plantas de papaya durante los diferentes puntos del tratamiento de estrés por sequía. La línea roja señala la respuesta de las hojas estresadas; la línea azul indica la respuesta de las hojas no estresadas………….…..40
Figura 2.5. Árbol filogenético de las secuencias TGA caracterizadas funcionalmente en angiospermas y caracterizadas in silico de C. papaya. En color rojo el subclado I, en azul el subclado II y en amarillo el subclado III clasificación propuesta por Idrovo-Espín et al. (2012). Las relaciones filogenéticas son inferidas por el método de distancia Neighborgh joining con Bootstrap de 100 réplicas, en cada nodo se ubica el valor de bootstrap
VI
correspondiente. La visualización y edición del árbol fueron realizadas mediante el programa MEGA6 (Tamura et al., 2007)………………………………………………….……43
Figura 2.6. A) Predicción estructural en 3D de la proteína del factor de transcripción CpTGA1 y AtTGA1. B) Frecuencia de amioácidos del dominio conservado bZIP generado a partir del alineamiento de secuencias ortólogas a CpTGA1. C) Frecuencia de aminoácidos del dominio DOG1 encontrado dentro de secuencias ortólogas a CpTGA1..............................................................................................................................44
Figura 2.7. Comprobación de la calidad de ARN total de hoja y raíz de plántulas de Carica papaya bajo estrés hídrico……………………………………………………………..………..45
Figura 2.8. Amplificación del gen TGA1 bajo estrés hídrico en 0, 5, 8 y 12 días. (M.W.) marcador molecular. (H) tejido de hoja, (R) tejido de raíz………………………………..…46
CÁPITULO III
Figura 3.1. Celda de extracción del método de extracción por Agua caliente presurizada (PLE). Dentro de la celda fue colocada por capas la muestra junto con las perlas…….61
Figura 3.2. Extractos metanólicos totales en los viales de recolección del método PHWE , las muestras corresponden a diferentes puntos de estrés. De izquierda a derecha: Día 12, 6 y 0 de sequía…………………………………………………………………………….…62
Figura 3.3. Matraz aforado con el que se lleva a a un volumen de 50ml los extractos etanólicos………………………………………………………………………………….……….62
Figura 3.4. Perfil cromatográfico por HPLC-DAD a 280nm de hojas de C. papaya bajo condiciones de estrés por sequía. En el eje de las x: el tiempo de corrida en minutos. En el eje de las y: detección medida en mili-unidades de absorbancia (mAU). A) día 0 o control B) 6 días C) 12días……………………………………………………………..………66
Figura 3.5. Espectro Uv-Vis caracteristicos de los compuestos fenólicos observados en la detección HPLC-DAD. A) ácidos hidroxicinámicos, 230 – 330nm. B) flavonoles, con señal a dos bandas, la primera de 230-285 y la segunda de 300-550nm……………………..67
Figura 3.6. Amperograma correspondiente al análisis HPLC-ECD señalanado la actividad antioxidante en hojas de C. papaya bajo condiciones de estrés por sequía. En el eje de las x: el tiempo de retención en minutos. En el eje de las y: el voltaje de corriente en microampers (uA). A) día 0 o control B) 6 días y C) 12días……………………………..69
Figura 3.7. Patrón de fragmentación de los compuestos identificados por HPLC-ESI-QTOF-MS a [M-H]. Con flechas se indica la ruta tentativa de rotura de la molécula junto con la masa del fragmento. A) Ácido caffeoylmálico, B) Kaempferol 3-O-glucopiranosido, C) Ácido p-coumárico, D) Ácido feruloylmálico, E) Rutina y F) Nicotiflorina. La reconstruccion de la molécula por el software MassLynx™ v. 4.1, edición de moléculas en la plataforma ChemDraw………………………………………………………………….....…74
VII
ÍNDICE DE CUADROS
CÁPITULO I
Cuadro 1.1. Compuestos fenólicos identificados en hojas de Carica papaya…………..27
CÁPITULO II
Cuadro 2.1 Secuencias de oligonucleótidos utilizados para el análisis de expresión en la caracterización molecular de C. papaya bajo un estrés hídrico. CpTGA1: gen a determinar relación al estrés; CpNAC002: como marcador de control interno; CpAct2: gen de normalización. F: Forward y R: Reverse……………………………..………………………...36
Cuadro 2.2 .Secuencias caracterizadas in silico del grupo TGA en C. papaya…………42
CÁPITULO III
Cuadro 3.1. Valores de la extracción de compuestos fenólicos totales obtenidos a través del método por PLE. Recuperación de muestra (mg de peso seco /ml extracto etanólico total) y Rendimiento de extracción (mg del compuesto en el extracto/ g hoja liofilizada)…………………………………………………………………………………….….…63
Cuadro 3.2.Caracterización de compuestos fenólicos de las muestras de hojas de C. papaya sometidas a un estrés por sequía (0d, 6d y 12d) analizadas por HPLC-ESI-QTOF-MS…………………………………………………………………………………………….….…73
0
1
RESUMEN
En Carica papaya L. se han identificado metabolitos secundarios (MS) como compuestos
de carácter fenólico en diversos tipos de tejido, tales como hoja, tallo y raíz de importancia
industrial y farmacéutica. No existen estudios que señalen la naturaleza y concentración
de los compuestos fenólicos identificados en hojas de la papaya en relación a un periodo
de estrés hídrico. Por lo cual el objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto del
estrés por sequía y su relación sobre el metabolismo secundario en tejido foliar de la
papaya.
Plantas germinadas a partir de semilla de tres meses de edad fueron sometidas a estrés
por sequía durante un periodo de 12 días. Se realizó la caracterización del estrés
ocasionado por sequía en hojas de papaya a nivel fisiológico, bioquímico y molecular.
Asimismo se obtuvieron perfiles metabólicos de los compuestos fenólicos totales de las
hojas bajo condiciones de estrés hídrico establecidas a partir de la caracterización del
estrés.
Los resultados señalan que las hojas de papaya comienzan a presentar daños moderados
de estrés a partir del sexto día de exposición a la sequía de acuerdo a la respuesta
fenotípica y a los datos del contenido relativo de agua y concentración de prolina. El
marcador de estrés, el factor de transcripción CpTGA1, indica tener una expresión
relacionada a los efectos por la sequía. Se identificaron diez compuestos fenólicos
derivados del estrés hídrico en las hojas los cuales son: rutina, nicotiflorina, kaempferol-3-
O-glucopiranosido, ácido caffeoylmálico, ácido p-coumárico, ácido feruloylmálico, ácido p-
coumaroylmálico y un derivado glicosilado de quercetina. Sin embargo no se observó
correlación de los compuestos identificados con respecto al tratamiento de estrés con
excepción del ácido p-coumaroylmálico.
2
3
ABSTRACT
In Carica papaya L. several secondary metabolites (SM) of industrial and pharmaceutical
importance have been identified among them, phenolic compounds in diverse tissue such
as leaves, stem and roots. Up until this moment, there haven’t been studies that link the
nature and concentration of phenolic compounds identified in papaya leaves with a
drought stress period. Therefore the aim of this work consisted on determining the effect of
drought stress and its relation with phenolic compounds on papaya leaves.
Seed germinated plants of three months old were subjected to hydric stress over twelve
days. The response of papaya leaves under drought stress was characterized at
physiological, biochemical and molecular level. Also metabolic profiles of total phenolic
compounds were obtained from leaves under drought stress conditions established from
the stress characterization.
Our results suggest that papaya leaves start to show moderate damage from stress
starting from the sixth day of drought exposure according to the phenotypical observations
and data from the relative water content and proline accumulation. The transcription factor
CpTGA1 was used as a molecular marker of stress. Its expression indicates to be related
to drought effects on plant. Eight phenolic compounds were identified: rutin, nicotiflorin,
kaempferol-3-O- glucopyranoside, caffeoylmalic acid, p-coumaric acid, feruloylmalic acid,
p-coumaroylmalic acid and a quercetin glicoside derivative. Nonetheless there wasn’t a
clear correlation between the identified compounds and the stress treatment with the
single expetion of p-coumaroylmalic acid.
4
5
INTRODUCCIÓN
Los compuestos fenólicos son de interés biotecnológico dadas sus propiedades
antioxidantes. Estos han sido utilizados ampliamente en la medicina tradicional y son de
gran relevancia en la dieta humana por su capacidad de prevenir enfermedades
degenerativas. Dentro de los compuestos fenólicos, los flavonoides son el grupo más
abundante y diverso que se encuentra en las plantas.
Al igual que el resto del metabolismo secundario en la planta, la naturaleza y
concentración de los compuestos fenólicos es dependiente de las condiciones
ambientales a las que la planta se ve expuesta. Diferentes estudios en los últimos 5 años
señalan que puede existir una relación estrecha en la acumulación de estos grupos
fenólicos versus periodos de estrés generados por sequía (Grieser et al., 2015;
Oszmiánski et al., 2011).
Poco se conoce del comportamiento del metabolismo secundario ante los efectos de un
estrés por sequía en plantas tropicales adaptadas a un ambiente semi-árido como en el
caso de la papaya. El fruto de C. papaya tiene un importante valor comercial con
demandas en el mercado a nivel nacional e internacional. Los cultivos de esta planta en la
península de Yucatán son susceptibles a los efectos ocasionados por las temporadas de
sequía, en ocasiones los estragos resultan en la pérdida del fruto (Chaves-Quintal et al.,
2011), lo cual se traduce a pérdidas económicas de hasta un 40% de la producción.
El tejido foliar a lo largo del ciclo de la planta termina como desperdicio. Una alternativa
que permita aprovechar las propiedades de las hojas de la papaya consistiría en la
extracción de metabolitos biológicamente activos. El aprovechamiento de este recurso
sería un valor agregado a la producción de la papaya.
Se han realizado estudios relacionados a la caracterización de los compuestos fenólicos
presentes en hojas de papaya (Gogna et al., 2015; Spinola et al., 2015; Julianti et al.,
2014; Afzan et al., 2012; Gayosso-García Sancho et al. 2011; Canini et al., 2007). Sin
embargo hasta nuestro conocimiento, no existen estudios que señalen la naturaleza y
6
concentración de los compuestos fenólicos identificados en hojas de papaya en relación a
un periodo de estrés por sequía.
Anteriormente la identificación de los compuestos fenólicos se apoyaba en gran medida
por la detección del espectro UV-Visible (Sakakibara et al., 2003). Trabajos recientes en la
identificación de polifenoles utilizan la espectrometría de masas ya que esta herramienta
brinda información exacta del peso molecular de los iones de la molécula y la detección
de picos es más sensible y selectiva.
7
CAPÍTULO I
1.1. ANTECEDENTES
1.1.1. GENERALIDADES DEL ESTRÉS ABIÓTICO Las plantas son organismos de naturaleza sésil que continuamente se encuentran
expuestas a diferentes factores ambientales, los cuales pueden tener un efecto negativo
en su desarrollo y crecimiento. Los factores que delimitan la producción vegetal se
clasifican en estrés de tipo biótico (por ejemplo: el ataque por diferentes tipos de virus,
bacterias, hongos, etc) y abiótico. En las plantas existen diferentes tipos de estrés
abiótico, entre los más destacados se encuentran la sequía, salinidad, altas y bajas
temperaturas, alta osmolaridad, oxidación, luz, deficiencia en nutrientes y acidificación de
los suelos. Como consecuencia las plantas han desarrollado respuestas adaptativas para
minimizar los efectos del estrés y garantizar su supervivencia (Lindemose et al., 2013).
Levitt (1980) definió el estrés como un factor ambiental con el potencial de desfavorecer o
perjudicar los mecanismos de resistencia destinados a la supervivencia de la planta en
respuesta al mismo factor ambiental. El estrés abiótico además del daño directo sobre la
planta tiene efectos negativos sobre sus mecanismos de defensa, lo que la convierte más
susceptible a enfermedades infecciosas por patógenos (Amtmann et al., 2008;
Mazzucotelli et al., 2008).
Diferentes tejidos dentro de la planta reaccionan de manera diferente al efecto del estrés y
los cambios pueden ser elásticos (reversibles) o plásticos (irreversibles). Añadiendo que
el grado y duración del estrés tiene un efecto significativo en la integridad de la planta así
como la complejidad del mecanismo de respuesta (Cramer et al., 2011).
El mecanismo de respuesta ante un estrés abiótico comienza con un estímulo ambiental
que activa y desencadena una compleja ruta de señalización la cual puede ser regulada o
no por la presencia del ácido abscísico (ABA) (Figura 1.1 y 1.2). Por lo cual diferentes
proteínas específicas son sintetizadas para contraatacar los daños generados por el
estrés (Cramer et al., 2011).
8
El ABA es una fitohormona ligada a respuestas adaptativas generadas a una exposición
de estrés ambiental, particularmente ligado a cambios en la disponibilidad de agua
(Himmelbach et al., 2003). Sus concentraciones van ligadas a cambios en el metabolismo
y desarrollo de la planta. No solo participa en condiciones de estrés, también es requerida
bajo condiciones óptimas de desarrollo debido a sus interacciones regulatorias con otros
mecanismos de crecimiento, como por ejemplo la fithormona etileno. El pH y el estado
redox dentro de la célula son factores cruciales en la regulación de señales
transduccionales asociadas a el ABA (Cheong et al., 2002).
Figura 1.1. Esquema general de la respuesta de señalización de la planta ante un estrés
abiótico. Modificado de Kuromori et al., 2014.
El ABA actúa como activador de diferentes rutas de señalización y rutas metabólicas que
se encuentran relacionadas con la respuesta al estrés abiótico, incluyendo a
determinados y específicos procesos celulares tales como la traducción y transcripción de
diversos factores de transcripción, en la activación de diversas proteínas involucradas en
9
la fotosíntesis, mecanismos antioxidantes, respuestas a patógenos, señalización
hormonal y síntesis de osmólitos compatibles. Se sabe que los mecanismos mencionados
actúan en conjunto parar brindar la tolerancia que la planta requiere para afrontar el
estrés; más sin embargo se desconoce con precisión los mecanismos subyacentes. Los
efectos del estrés también conllevan a la acumulación de metabolitos secundarios que
actúan como elicitores o moléculas de señalización a favor de la supervivencia de la
planta. A pesar que se conoce un gran número de metabolitos aún quedan muchos por
definir su relación con el estrés (Suzuki et al., 2014; Rasmussen et al., 2013; Akula et al.
2011).
La evaluación de los efectos de un estrés en ocasiones resulta una tarea desafiante
puesto que rara vez un factor abiótico único afecta a la planta. En un escenario verdadero
se tiene un conjunto de parámetros abióticos interactuando simultáneamente donde todos
contribuyen al estrés en la planta (Cramer, 2010). Uno de los problemas más grandes
dentro de la agricultura es la fluctuación de temperaturas, sequías y altas concentraciones
salinas que de manera individual o en conjunto son factores que restringen el crecimiento
y desarrollo de plantas a lo largo del mundo. Se estima que hasta un 70% de la
producción de cultivos en los Estados Unidos se pierde por los efectos de factores
ambientales (Cramer et al., 2011).
Como consecuencia de su limitación motriz, las plantas han desarrollado complejas
respuestas bioquímicas para así protegerse de las condiciones ambientales. La
combinación sinérgica o antagónica de los mecanismos fisiológicos bioquímicos y
moleculares conforman una cascada de señalización “crosstalk” que permite la
supervivencia de la planta ante las condiciones del estrés. Estudios que integren análisis
en transcriptómica, metabolómica y proteómica brindan información más profunda de la
respuesta en plantas ante un estrés abiótico. La comprensión detallada de estas
respuestas es crucial para la elaboración de estrategias de manejo y prevención de
productos agrícolas (Fujita et al., 2006).
10
1.1.2. ESTRÉS POR SEQUÍA Los pronósticos del clima para los años futuros indican un considerable aumento de la
temperatura, fenómeno que por lo general significa de periodos de sequía. Periodos
prolongados de sequía pueden llevar a la disminución de producción agrícola a nivel
mundial (Anjum et al., 2011; IPCC, 2008).
La sequía es uno de los estreses con mayor impacto en el desarrollo de la planta y es uno
de los factores ambientales que más preocupa al considerar la producción de cultivos
agrícolas. De acuerdo al Centro de Información Ambiental Nacional de Estados Unidos
(NOAA), durante 1980 a 2012 las pérdidas en agricultura ocasionadas por desastres de
sequía y altas temperaturas tuvieron un impacto de $200 billones de dólares tan solo en
Estados Unidos.
Generalmente al referirse al estrés por sequía, se considera a varios factores ambientales
como: la disposición de agua, el tiempo de incidencia y grado de severidad de
temperaturas específicas, radiación solar y disponibilidad de nutrientes. Estos parámetros
en conjunto limitan el desarrollo y crecimiento de la planta. Se considera que una planta
experimenta los efectos de estrés por sequía cuando el suministro de agua en las raíces
se dificulta y/o cuando los niveles de transpiración en la parte área son elevados (Ajum et
al. 2011).
Asimismo el estrés por sequía afecta: la integridad membranal de células, el contenido de
pigmentos, la actividad fotosintética y la relación de ajuste entre agua y el contenido de
osmolitos compatibles. En periodos moderados a severos de estrés, los efectos de altas
temperaturas conllevan a la deshidratación de la planta. (Anjum et al., 2011; Praab et al.,
2009; Benjamin y Nielsen, 2006). Para evitar la deshidratación las plantas han
desarrollado diversas adaptaciones entre las cuales destacan el cierre de los estomas y la
acumulación de osmolitos o solutos compatibles que mantengan un potencial de agua
bajo (Grieser et al., 2015).
La aclimatación de las plantas a este factor ambiental es el resultado de diversos eventos
que culminan en cambios de diferentes procesos físico-bioquímicos dentro de sus células.
Los impactos de la sequía desencadenan todo un mecanismo de regulación mediante la
activación de genes específicos y moléculas de señalización que tiene por objetivo brindar
11
resistencia a la planta y disminuir los efectos negativos sobre su desarrollo ante el estrés
causado (Anjum et al., 2011; Das y Pandey, 2010).
Los impactos más notorios del estrés recaen en la respuesta morfológica de la planta;
cambios que se ven reflejados en la germinación, falta de fuerza en el soporte de tallo,
impedimento en la floración, reducción del tamaño y número de hojas (Anjum et al., 2011;
Harris et al., 2002). El estrés hídrico de tipo moderado lleva al cierre de los estomas,
pérdida de turgencia, inhibición del crecimiento celular y limitación del intercambio
gaseoso (Jaleel et al., 2009). El estrés severo puede resultar en la perturbación de la tasa
de fotosíntesis y el metabolismo basal, las cuales pueden conllevar a la muerte del
organismo. Durante periodos prolongados de estrés el crecimiento celular se ve
severamente mermado y en plantas vasculares se ha observado que la elongación celular
es inhibida por interrupción del flujo del agua a través del xilema (Anjum et al., 2011;
Nonami, 1998).
Debido a que los efectos del estrés por sequía afectan de diferente manera a la planta
según el tipo de tejido y el tiempo de exposición al estrés, la respuesta al estrés suele
clasificarse a nivel fisiológico, bioquímico y molecular.
RESPUESTA FISIOLÓGICA
El déficit de agua es una de las causas principales que lleva a la planta al cambio de
procesos fisiológicos para contrarrestar los efectos del estrés. El ácido abscísico (ABA),
citocininas, el etileno y el malato son moléculas de señalización cuya concentración va
relacionada al estrés abiótico, en particular el ABA.
Se ha demostrado que el ABA está involucrada en el mecanismo de señalización que
empieza a partir de las raíces hacia los brotes a través de la corriente de transpiración
resultando en el cierre de los estomas. La señalización comienza cuando la planta pasa
por deshidratación, causando un incremento en la concentración de ABA. Este promueve
el flujo de iones K+ a partir de las células guarda, por lo cual, consecuentemente hay una
pérdida de presión de turgencia y esto resulta en el cierre de los estomas. Esta
adaptación es una de las primeras respuestas al estrés y significa un ahorro del recurso
12
de agua ya que limita los niveles de transpiración de las hojas (Anjum et al., 2011; Chaves
et al., 2003).
Dicho lo anterior, queda claro que el estrés por sequía daña el intercambio gaseoso de la
planta lo cual tiene efectos secundarios sobre la oxidación de cloroplastos, cambio en la
estructura de pigmentos y proteínas. La actividad fotosintética se ve relacionada con la
actividad de los estomas; de tal manera que sí los estomas se encuentran cerrados, la
actividad fotosintética disminuye. La clorofila a y b son susceptibles a la deshidratación,
en diversas especies vegetales se observa una disminución del contenido de clorofila
como síntoma del estrés oxidativo (Anjum et al., 2011; Farooq et al., 2009; Samarah et al.,
2009).
El contenido relativo de agua, potencial hídrico de hojas, resistencia de estomas, tasa de
transpiración, temperatura de la hoja y temperatura del dosel son factores importantes a
considerar para la relación de agua durante el periodo de estrés. Entre estos parámetros,
el contenido relativo de agua es considerado como una medición eficiente del estatus de
agua en la planta. Refleja la actividad metabólica de los tejidos en la planta y también
refleja el índice de tolerancia por deshidratación (Anjum et al., 2011).
RESPUESTA BIOQUÍMICA
El estrés por sequía a nivel bioquímico tiene repercusiones en los procesos de
fotosíntesis, respiración, translocación, balance en la captación de iones, metabolismo de
carbohidratos, nutrientes e inductores de crecimiento (Zlatev y Yordanov 2004; Jaleel et
al., 2009).
Una adaptación en consecuencia al estrés abiótico es la acumulación de compuestos
osmóticamente activos y síntesis de proteínas específicas. Las plantas acumulan
diferentes tipos de solutos orgánicos e inorgánicos en el citosol a manera de mantener la
turgencia celular. Durante periodos de sequía el balance de turgencia se consigue a
través del ajusto osmótico en respuesta a la acumulación de solutos como prolina,
sacarosa, carbohidratos solubles, glicinebetaina entre los más destacados. Al proceso de
acumulación de los solutos mencionados durante el estrés por sequía se le conoce como
13
ajuste osmótico, el cual va fuertemente ligado a la cantidad de agua presente dentro de la
planta (Anjum et al., 2011; Rhodes y Samaras, 1994).
La prolina es un aminoácido que por sus propiedades tiene la capacidad de disminuir el
potencial osmótico en el citosol, lo cual facilita la entrada de agua a la célula y evitando
que las proteínas sean desnaturalizadas y disminuya los efectos de especies reactivas de
oxígeno (Das y Pandey, 2010). La generación de especies reactivas a oxígeno incluyen a
moléculas de naturaleza oxidativa que son iones oxígeno, radicales libres y peróxidos que
son parte importante del metabolismo y señalización celular. Durante periodos de sequía,
la concentración de estas moléculas incrementa al grado de oxidar drásticamente a
proteínas, ácidos nucleicos y lípidos (Anjum et al., 2011; Apel y Hirt, 2004).
La señalización generada por la prolina promueve la activación de ciertos genes
específicos como los factores de transcripción NAC, WRKY, bZIP, MYB, etc., modulando
funciones importantes dentro de la mitocondria esenciales para la respuesta de tolerancia
al estrés, las cuales tienen efecto sobre la proliferación o muerte celular (Szabadso y
Savoure et al., 2009). La medición del incremento de prolina suele ser un indicador para
cuantificar la respuesta al estrés por déficit de agua (Verslues, 2010).
RESPUESTA MOLECULAR
La fitohormona ABA es responsable de una cascada de señalización en respuesta a
condiciones de estrés por alta salinidad o ausencia de agua que conlleva a la expresión
de un gran número de genes y síntesis de proteínas específicas con funciones que
brindan tolerancia a una planta ante un estrés por sequía.
Por lo cual un gen en particular puede estar involucrado en la activación de una o varias
rutas metabólicas en respuesta al ABA. Más de 1300 genes regulados por ABA fueron
identificados a través de secuenciación masiva al azar de transcritos en Arabidopsis
(Himmelbach et al., 2003). Un ejemplo ampliamente estudiado son las proteínas
chaperonas conocidas como las proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteins) cuya
función es evitar que temperaturas elevadas dañen la estructura y conformación de
diferentes macromoléculas dentro de la célula (Umezawa et al., 2006).
14
Entre los genes identificados como genes reguladores, destacan las proteínas cinasas y
los factores de transcripción. Los factores de transcripción son proteínas que regulan
diversos mecanismos y procesos moleculares mediante la expresión de genes
específicos. Dentro de su estructura poseen un sitio de unión específica al ADN (specific
DNA-binding site/protein) que interactúa con los promotores de genes específicos, y de
esta manera modula el nivel de síntesis del ARN mensajero (Atkinson y Urwin, 2012).
Existen diversos mecanismos de regulación, la mayoría de ellos ocurre justo antes de la
síntesis del transcrito, al formarse el complejo de proteínas de pre-iniciación sobre el
promotor de un gen (Figura 1.2). Los factores de transcripción tienen efectos
estabilizadores (enhancers) o desestabilizadores (repressors) sobre el complejo de pre-
iniciación de la transcripción, a través de interacciones directas con los componentes del
complejo o interacciones indirectas con alguno de los co-reguladores asociados (Wray et
al., 2003).
Un factor de transcripción está compuesto por un dominio de unión al ADN, un dominio de
dimerización y dominio regulador (Lindemose et al., 2013). Basándose en las
características estructurales, los factores de transcripción son categorizados en distintas
familias de acuerdo a las propiedades conservadas de los dominios de sitios de unión al
ADN. Golldack et al. (2014) indican que las principales familias de factores de
transcripción relacionadas a tolerancia de estrés abiótico son NAC (acrónimo derivado del
dominio NAM: sin meristema apical), bZIP (acrónimo derivado del zipper leucina básico) ,
AP2/ERF(acrónimo derivado del factor de resistencia al etileno) y MYB (acrónimo
derivado del oncogen del virus de la mieloblastosis aviar).
El reino Plantae está conformado de al menos 64 familias de factores de transcripción.
Muchos de estos genes son conservados a lo largo de las diferentes especies de plantas.
El genoma de Arabidopsis codifican aproximadamente 1500 factores de transcripción,
cantidad que es equivalente al 5% del genoma de la planta (Udvardi et al., 2007;
Riechmann et al., 2000).
15
Figura 1.2. Esquema general del mecanismo de acción a nivel molecular dentro de la
planta ante un estrés generado por sequía. Modificado a partir de Trenberth et al., 2014.
Dentro del genoma de Arabidopsis se encuentran reportados 75 factores de transcripción
de la familia denominada bZIP. (Jacoby et al., 2002). Es considerada una de las familias
más grandes y diversas funcionalmente y han sido caracterizados en numerosas especies
vegetales (Guedes-Correa et al., 2008).
Esta familia recibe su nomenclatura a partir de la estructura del dominio conservado
denominado bZIP. Dentro del dominio conservado se encuentran dos motivos: una región
básica hélice-alpha continua (conformada de alrededor de 20 aminoácidos con seis
argininas y cuatro residuos de lisina) responsable de la unión específica al ADN; y una
región de dimerización (constituida de alrededor de 41 aminoácidos con residuos de
leucina en cada séptima posición) denominada zipper de leucina dada su conformación
estructural (Figura 1.3). Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del zipper de
leucina, la proteína es de carácter homodímero o heterodímero (Gatz, 2013; Guedes-
Correa et al., 2008).
16
Figura 1.3. Estructura tridimensional del dominio conservado de la familia bZIP.
Modificado de Guedes-Correa et al., 2008. El dominio de dos hélices alfas continuas se
encuentra dividido en dos secciones. La barra en color rojo indica la región básica (RB)
que actúa como sitio de unión al ADN; la barra en color azul señala la región zipper de
leucina (ZL). Las terminaciones N de la RB se posicionan ligeramente apartadas conforme
su unión al ADN; la región ZL se dimeriza y tiene un efecto de enrollamiento. Modificado a
partir de Jakoby et al., 2002.
Las proteínas bZIP, así como otros factores de transcripción se unen al ADN en puntos de
reconocimiento específicos. Estos motivos consisten en elementos cis característicos de
cajas promotoras que son reconocidas y pareadas por el factor de transcripción. Cada
subfamilia bZIP reconoce cajas promotoras específicas, los de mayor preferencia son la
caja A (TACGTA), caja C (GACGTC) caja G (CACGTG), caja H (CCTACC), motivo
TGACG, motivo ABRE (ABA-elemento de respuesta), y motivo osc element (Jacoby et al.,
2002; Izawa et al., 1993).
Entre las principales funciones de las proteínas tipo bZIP destacan la regulación de genes
contra defensa a patógenos, señalización inducida por luz, respuesta a estrés abiótico,
17
señalización de hormonas, maduración de semillas y desarrollo de floración (Alves et al.,
2013; Deppmann et al., 2004; Fukazawa et al., 2000).
Estudios de factores de transcripción bZIP en Arabidopsis, tomate (Solanum
lycopersicum), soya (Glycine max) y arroz (Oryza sativa) han demostrado una mayor
expresión ante un estrés por sequía (Gao et al., 2011; Hsieh et al., 2010; Amir et al.,
2009). Más sin embargo, pocos factores de transcripción bZIP han sido explorados como
candidatos potenciales para aplicaciones de mejoramiento genético para tolerancia a
sequía en cultivos (Lindemose et al., 2013).
Las proteínas bZIP el motivo D/TGA han sido ampliamente relacionados como
reguladores del mecanismos de defensa contra patógenos a través de la ruta de
señalización del ácido salicílico (Alves et al., 2013), aunque su función también se ha
relacionado con la respuesta de señalización a un estrés abiótico, específicamente de los
genes AtTGA1 y AtTGA4 (Alvarez et al., 2014; Zander et al., 2014).
Dentro del genoma de Carica papaya se han identificado seis genes TGA-bZIP ortólogos
a la subfamilia correspondiente en Arabidopsis (Idrovo-Espín et al., 2012). En el mismo
trabajo se realizó la expresión diferencial en diferentes tipos de tejido con los seis TGAs
determinados mediante análisis in silico, más no se ha corroborado la actividad funcional
de dichas proteínas identificadas. Los factores de transcripción TGA-bZIP en Arabidopsis
han demostrado tener funciones reguladoras de defensa relacionadas al estrés abiótico
(Gatz, 2013 y Alves et al., 2013).
18
1.1.3. METABOLISMO SECUNDARIO EN PLANTAS Los metabolitos secundarios son moléculas cuya función está asociada en la interacción
de la planta con su ambiente e influenciados por factores abióticos y bióticos. La función
de los metabolitos secundarios es la de incrementar la supervivencia de la planta
(Karuppusamy et al., 2009). También se le conoce como productos naturales y son
importantes en la industria farmacéutica por sus propiedades bioquímicas donde son
usados como fuente de aditivos de alimentos, saborizantes, colorantes y fármacos.
Poseen aplicaciones significativas prácticas en las áreas de medicina, cosmética, y
alimentaria (Akula y Ravishankar, 2011).
Por lo general, los niveles de concentración de metabolitos secundarios son inferiores a
las cantidades observadas en el metabolismo primario dentro un mismo individuo.
Normalmente su producción representa menos del 1% del peso seco (Reddy et al. 2004).
La concentración presente de metabolitos secundarios en cualquier organismo es el
resultado de interacciones de síntesis, almacenamiento y degradación de los mismos. La
producción de un metabolito secundario depende de la fase de desarrollo del organismo,
tipo de tejido, estado fisiológico, cambios morfológicos y citológicos, regulación de
enzimas y regulación de otros metabolitos secundarios (Ramachandra y Ravishankar,
2004). De igual manera, se ha observado que la acumulación de metabolitos secundarios
a menudo es consecuencia de efectos de estrés que en la planta son desencadenados
por elicitores o señalización molecular (Akula y Ravishankar, 2011).
Con el conjunto de información de diversos estudios se ha logrado determinar el orden de
la ruta biosintética de diversos metabolitos secundarios localizados en plantas. Se han
realizado numerosas investigaciones en plantas con el fin de mejorar la producción y
almacenamiento de metabolitos en cultivos celulares, tejidos y órganos (Johnson, 2002;
Rabi y Gupta, 2014). Sin embargo aún hace falta mucha información sobre los elementos
involucrados en los mecanismos de producción. Existe poca información respecto a los
puntos de señalización que impulsan positiva o negativamente la síntesis metabolitos
secundarios. Los metabolitos secundarios en plantas se clasifican en cinco grupos
estructurales de acuerdo a los orígenes biosintéticos: isoprenoides, alcaloides,
fenilpropanoides, flavonoides y policétidos (Oksman-Caldentey e Inze, 2004). De acuerdo
19
a los objetivos del presente trabajo, en este capítulo se profundizará en la literatura
correspondiente a la familia de los flavonoides y a los compuestos fenólicos.
PROPIEDADES DE LOS FENILPROPANOIDES
La ruta de biosíntesis de los fenilpropanoides inicia con el ácido shikímico, un amplio
número de fenilpropanoides derivan del esqueleto flavonoide C15 (Figura 1.4). Dicho
esqueleto es sintetizado por vía de la chalcona sintasa (CHS), condensación catalizadas
de la p-coumaroyl-coenzima A (CoA) y de tres moléculas de malonil-CoA. El producto
inicial de CHS, tetrahidroxichlacona es transformado a productos flavonoides como
flavonas, flavanonas, isoflavonas y antocianinas (Holton y Cornish, 1995).
Los compuestos fenólicos se clasifican de acuerdo a la complejidad de su estructura en:
polifenoles sencillos, benzoquinonas, ácidos polifenólicos, ácido fenilácéticos, ácidos
hidroxicinámicos, fenilpropanoides, coumarinas, isocoumarinas, naftoquinonas,
xanthonas, estilbenos, antraquinonas, flavonoides y lignanos. Los más conocidos y
ampliamente distribuidos en las plantas es el grupo de los flavonoides y terpenos
(Harbone et al., 2013; Bravo, 1998).
La estructura común de los flavonoides consiste en dos anillos aromáticos (Figura 1.5) y
se los encuentra en la naturaleza normalmente de manera glicosilada y derivados
glicosilados. Dentro del grupo de los flavonoides, se sabe que el rango máximo de
absorción a ondas longitudinales: flavanonas (280-290nm), flavonas (304-350nm),
flavonoles (352-385nm) (Harborne et al., 2013; Bravo, 1998).
Este grupo de metabolitos presenta amplia diversidad estructural ocasionada por
modificaciones como hidroxilación, dehidrogenación, glicosilación, acilación, sulfatación y
metilación (Soleka, 1997). A nivel celular, la acumulación de los fenilpropanoides suele
ser en la vacuola (Mhertens et al., 2005).
Los compuestos fenólicos tienen diversas funciones en la planta. Los flavonoides tienen
funciones antimicrobianas y en general se les considera como metabolitos relacionados al
estrés biótico pues su síntesis suele estar ligada a la protección contra ataques de
insectos a herbívora de mamíferos (Harbone, 2000).
20
Los compuestos fenólicos también son ampliamente conocidos por su actividad
antioxidante. En conjunto con los carotenoides y las vitaminas tradicionales como C y E,
los compuestos fenólicos son considerados como una fuente de antioxidantes importante
de los productos naturales en plantas. Una molécula antioxidante es toda aquella
sustancia que a bajas concentraciones retrasa o previene la oxidación de algún sustrato
(Halliwell et al., 1995). Su actividad ayuda a disminuir y neutralizar los efectos de los
radicales libres.
Los flavonoides se encuentran entre los compuestos bioactivos con mayores beneficios a
la salud humana por sus propiedades antioxidantes, funcionan como mecanismos de
prevención contra diversas enfermedades crónico-degenerativas. Los flavonoides han
demostrado actividad contra enfermedades cardiovasculares, estomacales, hepáticas y
cancerígenas (Harbone y Williams, 2000). La actividad antioxidante de los compuestos
fenólicos también indica funciones de prevención ante enfermedades degenerativas como
la diabetes, enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares, hipertensión e incluso
cáncer (Plaza et al., 2016; Sakakibara et al., 2003). Entre otras enfermedades crónicas,
se ha observado que una dieta rica en flavonoides parece tener efectos de protección
sorbre asma, diabetes, artritis reumatoides y cataratas (Graf et al., 2005).
La actividad antioxidante por lo general va ligada al número y posición de grupos hidroxilo
presentes en la molécula (Plaza et al., 2014). En años recientes, los extractos de hojas
han ganado atención en la fitoquímica por su relevancia en el área nutricional.
Compuestos fenólicos purificados tienen potencial como aditivos en la comida como
nutracéuticos (Oszmiánsi et al., 2011).
21
Figura 1.4. Esquema de la ruta de biosíntesis de los fenilpropanoides. Tomado de Dixon
et al., 2001.
Figura 1.5. Esqueleto estructural básico de los flavonoides. Tomado de de Kumar y
Pandey, 2013.
22
FENILPROPANOIDES BAJO CONDICIONES DE ESTRÉS ABIOTICO
El metabolismo secundario es parte de la cascada de señalización que es influenciada por
las condiciones ambientales bióticas y abióticas. Un aumento en la producción de
metabolitos secundarios puede inducirse a través de la exposición de la planta a
condiciones de estrés como deficiencia de nutrientes, exposición a UV, intensidad
lumínica, disponibilidad de CO2 y temperatura (Jaafar et al., 2012; Ibrahim et al., 2011;
Couceiro et al., 2006, Zobayed et al., 2005). Se ha observado un incremento en la
acumulación de compuesto fenólicos bajo tratamientos de radiación a UV, alta
luminosidad, temperaturas, herbicidas, daño mecánico y ataque de patógenos (Dixon y
Paiva, 1995), particularmente sobre en hojas (Soleka, 1997). Entre estos factores, la
radiación por UV es el parámetro que más se ha estudiado. Existen diversos estudios que
correlacionan la concentración de flavonoides como mecanismo de protección ante la
radiación UV (Grieser et al., 2015; Agati y Tattini, 2010; Tattini et al., 2000).
Por ejemplo, las antocianinas son acumuladas en la epidermis de hojas funcionando
como filtro protector a radiaciones por UV (Mhertens et al., 2005). El compuesto ácido p-
coumárico es un precursor de flavonoides, cuyo incremento en su concentración en hojas
bajo radiación solar intensa tiene como consecuencia un incremento en la activación de
biosíntesis de flavonoides (Oszmiánski et al., 2011). Ante los efectos de radiación solar,
también se han observado características morfo-fisiológicas particulares en las hojas;
manchas de color amarillo- naranja intenso que indican altas concetraciones de
flavonoides (Tattini et al., 2000).El estrés hídrico es uno de los tipos de estrés abiótico que
más afecta las propiedades bioquímicas de las plantas (Zobayed et al., 2005). Los efectos
del estrés hídrico tienen repercusiones en diversas rutas metabólicas entre ellas las rutas
de biosíntesis involucradas en los ácidos grasos, isoprenoides, carotenoides fotosíntesis y
antocianinas (Deluc et al., 2009). Existen reportes que corroboran la relación que durante
condiciones de déficit hídrico de intensidad moderada a severa, hay un incremento en la
concentración de compuestos fenólicos (Varela et al., 2016; Savoi et al., 2016; Grieser et
al., 2015; delValle et al., 2015). En especies vegetales de hábitats áridos a semi-áridos, se
ha observado que los flavonoides glicosilados son acumulados en la superficie de las
hojas (Fahn, 1988).
23
1.1.4. Carica papaya COMO MODELO DE ESTUDIO
Carica papaya es una planta dicotiledónea perteneciente a la familia Caricaceae dentro
del orden Brassicales. Es una planta semileñosa ampliamente cultivada en zonas
tropicales y semitropicales y de gran importancia económica en México. Es una planta
dicotiledónea perteneciente a la familia Caricaceae dentro del orden Brassicales.
La morfología de la planta se caracteriza por un único tallo sin ramas laterales con las
hojas agrupadas en la parte superior en forma de hélice súper enrollada. Las hojas tienen
un tiempo de vida de entre 3 a 6 meses bajo condiciones estables y continuamente
emergen hojas nuevas a partir del ápice de la planta (Jiménez et al., 2014).
Las condiciones de temperatura óptimas de crecimiento de C. papaya oscilan entre 21 a
33 °C, mientras que a temperaturas inferiores a 10°C por lo general la planta no lo tolera.
En cuanto a condiciones de riego, requiere entre 1000 y 1800mm pluviales al año
(Jiménez et al., 2014; Teixeira da Silva et al., 2007). Ejemplares adultos pueden alcanzar
los 10 metros de altura, sin embargo la mayoría de los cultivos no sobrepasan esta altura
para permitir una recolección de frutos más rápida.
El fruto de la papaya es de un color amarillo a un rojo salmón en estado maduro,
consecuencia del alto contenido de carotenoides entre ellos los más importantes:
licopeno, β-caroteno y β-cryptoxantina (Rivera-Pastrana et al., 2010). El fruto tiene un
importante valor comercial con demandas en el mercado a nivel nacional e internacional
por su alto valor nutritivo rico en vitaminas A, B y C (FAO, 2009), potasio, magnesio,
calcio, fósforo (Somonsohn, 2000), ácido fólico, carotenos, carbohidratos y ácidos grasos
esenciales (Mueller y Menchler, 2005).
La comercialización del fruto genera importantes ganancias para el mercado de
exportación de países en Asia y América latina (Evans y Ballen, 2012). México, Brasil y
Belice son los países dominantes en la exportación de papaya. En 2009, México
representaba un 41% del comercio exportado, el cual equivale a 134,960 toneladas para
finales del mismo año. Las variedades de papaya cultivadas en México son la Maradol y
la Roja distribuidas en cultivos dentro de los estados de Yucatán, Chiapas, Oaxaca,
Michoacán, Tabasco y Veracruz (FAOSTAT, 2012a).
24
Los estudios más extensivos en papaya se han dedicado a analizar las características del
fruto principalmente en las variedades con mayor intercambio comercial: Sunrise, SunUp
y Kahopo cultivadas en Hawaii. A partir del año 2008, Ming y colaboradores dejaron a
disponibilidad pública el primer genoma de Carica papaya L. variedad SunUp. Esta
variedad es la única que a la fecha tiene secuenciado completo el genoma de papaya,
una variedad transgénica resistente al virus de la mancha anular de la papaya (PRSV)
diseñada de la variedad “Sunrise” (Jiménez et al., 2014; Ming et al. 2008). El análisis
genómico posiciona a papaya como modelo de estudio prometedor dada su relativo bajo
tamaño de genoma (372 Megabases). Al comparar el genoma de papaya con el de
Arabidopsis no sólo se observa su cercanía taxonómica, sino que además el número de
genes correspondientes a factores de transcripción y/o relacionados es menor que el
número observado para Arabidopsis (Ming et al. 2008). Esto sugiere que la manipulación
genética en papaya es más fácil dado a que la expresión de sus genes es más precisa y
no redundante.
Uno de los primeros trabajos de biotecnología con papaya consistió en el
aprovechamiento de la papaína, proteasa que se obtiene de la savia de los frutos de
papaya. Es una de las proteasas más aprovechadas debido a sus diversas aplicaciones
industriales (alimentos, cosméticos, farmacéuticos, curtido de cuero, medicina, etc.)
(Devitt et al., 2009). Las hojas de papaya también han sido de interés para aplicaciones
industriales dado el contenido de vitamina E y por las enzimas: esterasas, proteasas y
saponinas (Baur y Fruhmann, 1979).
En la medicina tradicional existen muchas aplicaciones que utilizan las hojas, raíces,
frutos, semillas y flores de papaya (Figura 1.7); cualidades que a través de validaciones
científicas se ha demostrado contar con propiedades medicinales como actividad
antibacterial antifúngica, antiprotozoaria, antihelmíntica, antiinflamatoria, protección contra
la hipertensión, actividad antitumoral, diurética, abortiva, antifertilizante, captadora de
radicales libres, neuroprotectiva y curativa para la cicatrización de heridas (Krishna et al.,
2008; Chávez-Quintal et al. 2009; Singh et al., 2010; Lim, 2012; Nguyen et al., 2013).
Diversos extractos puros de metabolitos secundarios aislados de la papaya han
presentado algún tipo de citotoxicidad a cultivos de células cancerígenas en diferentes
tejidos y tipos de cáncer. Algunos de estos compuestos son: licopeno, ácido ferúlico,
25
Figura 1.6. Morfología de Carica papaya var. Maradol. I. a) Planta de tres semanas de
edad, b) Hoja laminar y petiolo, c)Sistema radicular de una planta de 5 meses, d) Tallo de
una planta de un año de edad con sus respectivas cicatrices al perder el pectiolo, e)
Floración con tres pistilos, f) Fruto de una papaya hermafrodita. II. Árbol de papaya
hermafrodita (CONABIO, 2015 y Jiménez et al., 2014.
ácido caféico, kaempferol, quercetina, β-caroteno, β-criptoxantina y ácido p-coumárico
(Pierson et al., 2011). La actividad antioxidante de estos compuestos (carotenoides y
compuestos fenólicos) ha sido caracterizada en frutos de papaya en diversos estudios
(Maisarah et al. 2013; Gayosso-García Sancho et al. 2011; Rivera-Pastrana et al., 2010;
Mendiola et al., 2010).
Diversos metabolitos de la ruta de los fenilpropanoides han sido identificado en el tejido
foliar de papaya (Cuadro 1.1) a través de metodologías de cromatografía líquida y de
gases. Asimismo, se han realizado mediciones de la actividad antioxidante de
compuestos fenólicos totales de extractos de hojas (Spinola et al., 2015; Maisarah et al.,
2013; Vuong et al., 2013; Mendiola et al., 2010); estos estudios se han enfocado en la
optimización del método de extracción pero entre sus parámetros no se incluyen factores
de estrés abiótico.
26
Los estudios previos mencionados emplean técnicas tradicionales de extracción y
separación cromatográfica con excepción del trabajo de Mendiola et al. (2010), el único
antecedente en la literatura de papaya que utiliza una extracción líquida presurizada (PLE
por sus siglas en inglés) donde identifican vitaminas y grupos fenólicos, pero la
determinación de estos últimos no queda completamente resuelta a identificación
específica.
Figura 1.7. Esquema de las aplicaciones de compuestos bioactivos en la medicina
tradicional en relación al tipo de tejido del cual fue aislado.
El clima en el que la papaya es cultivada se caracteriza por ser de temperaturas cálidas, a
lo cual se considera que la planta posee mecanismos de defensa y relativa tolerancia a
situaciones de déficit hídrico. Ante la exposición de sequía, las plantas de papaya
padecen de absición foliar, su tasa fotosintética disminuye al igual que la coductancia de
estomas y tasa de transpiración (Mahouachi et al. 2006). Sin embargo ante periodos
cortos de estrés hídrico, la papaya ha demostrado que sus mecanismos de defensa, como
27
acumulación de osmolitos activos le confieren la habilidad a la planta de aclimatarse
(Vincent et al., 2015).
En la península de Yucatán, el consumo de papaya se restringe únicamente al fruto
maduro. En algunos casos durante la temporada de sequía, las hojas son utilizadas como
alimento para animales domésticos. Sin embargo la mayoría del tejido foliar termina como
desperdicio (Chaves-Quintal et al., 2011). Una alternativa que permita aprovechar las
propiedades de hojas de papaya consistiría en la extracción de metabolitos
biológicamente activos. El aprovechamiento de este recurso sería un valor agregado a la
producción de papaya para la venta de su fruto.
Cuadro 1.1. Compuestos fenólicos identificados en hojas de Carica papaya.
Grupos fenólicos Método de identificación Referencia
Hesperidina UPLC-ESI-MS, H-NMR Gogna et al., 2015
Ácido caféico UPLC-ESI-MS, H-NMR, GC-MS Gogna et al., 2015; Canini et al., 2007
Ácido vainíllico UPLC-ESI-MS, H-NMR Gogna et al., 2015
Ácido coumarico UPLC-ESI-MS, H-NMR, GC-MS Gogna et al., 2015; Canini et al., 2007
Rutina UPLC-ESI-MS, H-NMR, HPLC-MS Gogna et al., 2015; Julianti et al., 2014
Naringerina UPLC-ESI-MS, H-NMR Gogna et al., 2015
Kaempferol UPLC-ESI-MS, H-NMR, GC-MS, UPLC-TripleTOF-ESI-MS
Canini et al., 2007; Gogna et al., 2015
Ácido cinámico UPLC-ESI-MS, H-NMR Afzan et al., 2012; Gogna et al., 2015
Ácido clorogénico UPLC-ESI-MS, H-NMR, GC-MS Gogna et al., 2015; Canini et al., 2007
Ácido protocateuico UPLC-ESI-MS, H-NMR, GC-MS Gogna et al., 2015; Canini et al., 2007;
Quercetina GC-MS, UPLC-TripleTOF-ESI-MS Afzan et al.,2012; Canini et al., 2007
5,7-Dimethoxicoumarina
GC-MS Canini et al., 2007
Manghaslin HPLC-MS Julianti et al., 2014
28
1.2. JUSTIFICACIÓN
El metabolismo secundario está sujeto al efecto de condiciones ambientales, como lo es
el estrés por sequía. En plantas como la vid, Vitis vinifera se ha determinado la relación de
incremento en la concentración de compuestos fenólicos a lo largo de un periodo de
sequía (Savoi et al., 2016). Sin embargo en plantas tropicales aún falta por realizar
estudios con este enfoque.
Carica papaya es una planta ampliamente cultivada en la península de Yucatán, México
con demandas comerciales a nivel nacional e internacional ocupando el quinto lugar
mundial en producción y primer lugar en exportación del fruto (FAOSTAT, 2012a).
Diversos tejidos de la planta se han empleado en la medicina tradicional como agentes
antifúngicos, antibacteriales, antiinflamatorios y antihelmínticos (Chaves-Quintal et al.,
2011) propiedades adjudicadas a su actividad antioxidante y neutralización de radicales
libres (Maisarah et al., 2013).
En cultivos de papaya variedad Maradol de la península de Yucatán se ha señalado la
presencia y actividad antioxidante de alcaloides, terpenos y flavonoides en extractos de
hojas (Chaves-Quintal et al. 2011), más no se ha logrado identificar compuestos
específicos del grupo de los flavonoides o grupos fenólicos.
A la fecha no existen estudios en papaya donde se observe la acumulación de
metabolitos ante condiciones ambientales por estrés. Existe poca información sobre
análisis de papaya empleando técnicas de extracciones presurizadas o de análisis
estadísticos sobre su actividad antioxidante. Por estas razones, se plantea utilizar como
planta modelo a C. papaya bajo condiciones de estrés por sequía, para estudiar la
concentración de compuestos fenólicos.
29
1.3. OBJETIVOS
1.3.1. OBJETIVO GENERAL Determinar el efecto del estrés por sequía sobre el metabolismo secundario en hojas de
Carica papaya.
1.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Determinar el estrés por sequía mediante parámetros fisiológicos, bioquímicos y
moleculares en hojas de papaya.
2. Obtener perfiles metabólicos totales de compuestos fenólicos de plantas de C.
papaya bajo condiciones de estrés hídrico.
3. Analizar la relación de los compuestos fenólicos cuantificados y su actividad
antioxidante con respecto al tratamiento de estrés hídrico.
1.4. HIPÓTESIS El estrés hídrico en hojas de Carica papaya tendrá efecto sobre la concentración de
compuestos fenólicos.
30
1.5. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
31
CAPÍTULO II. TRATAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE ESTRÉS
POR SEQUÍA EN C. papaya
2.1. INTRODUCCIÓN
Las plantas son organismos sésiles que se encuentran expuestos a las condiciones de su
entorno ya sea de carácter positivo o negativo. Condiciones adversas restringen su
crecimiento y desarrollo, por lo que se desencadena un estrés. En plantas existen dos
clases principales de estrés: abiótico y biótico. Para cada estimulo, la planta ejecuta una
cadena de regulaciones fisiológicas que le confiere tolerancia al estrés y así sobrevivir a
potenciales amenazas (Das y Pandey, 2010). Gran parte del mecanismo de respuesta
ante una condición de estrés es consecuencia de la activación de genes específicos que
desencadenan mecanismos moleculares de señalización (Pereira, 2016).
El estrés abiótico generado por sequía o déficit de agua es uno de los factores que más
limitan el desarrollo y productividad de las plantas. Escenarios en agricultura para los
próximos años estipulan que el estrés por sequía será el parámetro más costoso para
mantener la producción de cultivos (Jacobsen y Fiu, 2012). Para el año 2050 se calcula
que alrededor del 50% de las tierras cultivables quedarán deterioradas por el efecto de
sequía y salinización de los suelos (Wang et al. 2003).
Por lo que es necesario recurrir a técnicas de mejoramiento del uso-eficiencia de
producción y/o técnicas que aprovechen un mayor porcentaje del recurso con el que
actualmente se produce. Para llevar a cabo cualquiera de estas dos estrategias es
necesario tener un amplio conocimiento de la biología del cultivo en condiciones óptimas y
con déficit hídrico.
La papaya es una planta con propiedades que le confieren alta resistencia a los efectos
de sequía. Se han realizado estudios en los cuales se observa la regulación
transcripcional y su función como mecanismo de defensa ante un estrés por sequía
(Arroyo-Herrera et al., 2016; Pan & Jiang, 2014), sin embargo aún falta por definir a
detalle la respuesta de la planta a diferentes niveles durante un estrés por sequía
moderado.
El objetivo de este capítulo consiste en la caracterización de los efectos por estrés de
sequía en hojas de C. papaya a nivel fisiológico, bioquímico y molecular. Esto mediante el
32
establecimiento de un tratamiento de estrés hídrico o ausencia de riego donde las
condiciones ambientales a las que la planta se encuentre sean lo más parecidas a las
condiciones de campo.
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1. MATERIAL VEGETAL
Para el material biológico se utilizaron semillas de papaya L. variedad Maradol Roja
certificadas de la marca comercial Semillas del Caribe ®, Especialistas en Papayas S.A
de C.V., las cuales fueron germinadas en medio sólido bajo condiciones controladas
dentro de un cuarto de cultivo. El medio sólido consiste de un compuesto de Hortipearl,
Sunshine 3, Vermiculita y Peat moss en proporción 2:4:2:2. Las primeras plantas se
obtuvieron aproximadamente 15 días después de haber iniciada la etapa de germinación.
Las plantas fueron crecidas bajo condiciones controladas a un fotoperiodo de 16 hrs luz y
a una temperatura oscilante entre los 24-27°C.
Una vez que alcanzaron 10cm de altura fueron trasplantas a recipientes con medio sólido
y fueron crecidas en condiciones de invernadero con riego cada 2-3 días. Plantas de 3
meses y de alrededor de 45cm de altura fueron seleccionadas para el tratamiento de
estrés hídrico.
2.2.2. TRATAMIENTO DE ESTRÉS HÍDRICO
El tratamiento consistió en la ausencia de riego para cada planta, se tomaron mediciones
de estrés en los siguientes puntos: 0,5, 8 y 12 días. Para cada punto de estrés se
utilizaron tres réplicas experimentales. Durante el tiempo del tratamiento las plantas
estuvieron expuestas a una temperatura promedio de 31 °C. El grupo control permaneció
en riego continuo a lo largo del experimento.
Previo a la toma de muestras se realizó un experimento de déficit hídrico con un diferente
lote de plantas como parámetro de estandarización para el establecimiento de los
periodos adecuados para la medición y toma de muestra. Los puntos de medición de
estrés fueron establecidos de acuerdo a los fenotipos observados a lo largo del
tratamiento exploratorio. Las plantas fueron regadas aproximadamente cada 3 días hasta
antes del inicio del experimento.
33
2.2.3. MEDICIÓN DE PARÁMETROS FISOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS
Para la determinación del contenido relativo de agua (CRA), hojas bandera de papaya
fueron seleccionadas por triplicado. Tejido de aproximadamente 4cm de largo fue cortado
e inmediatamente transferido a tubos falcon en hielo, los cuales fueron previamente
pesados en una balanza analítica. Se registró el peso fresco de las muestras foliares y se
añadió agua destilada a cada tubo para dejarlos a 4°C en oscuridad. 24 horas después,
se tomaron los datos para el peso turgente secando cuidadosamente el exceso de agua
de las hojas. Posteriormente las hojas fueron colocadas a 70°C durante 24 horas y se
obtuvo el peso seco de cada una (Smart y Bingham, 1974). El porcentaje del contenido
relativo de agua se obtuvo mediante la fórmula:
CRA (%) = ((PF-PS) / (PT-PS)) X 100
Dónde: PF= Peso fresco; PS= Peso seco; PT= Peso turgente.
Para la determinación del contenido de prolina, se utilizó 100mg de tejido foliar de plantas
de papaya el cual fue congelado con N2 líquido y guardado a -80°C hasta colectar todas
las muestras de los puntos del tratamiento de estrés. Una vez obtenidas todas las
muestras, éstas fueron maceradas en adición de ácido sulfosalicílico al 3%. El extracto
macerado fue filtrado por medio de papel filtro, se tomó 1ml de la solución filtrada a la cual
se le añadió 1ml de ninhidrina y 1ml de ácido acético glacial. Las muestras se incubaron a
baño maría durante una hora a 95°C, posteriormente se enfriaron rápidamente con agua
fría. A las muestras se le agrego 2ml de tolueno a cada una y se agitaron vigorosamente
en vortex dejando las muestras en reposo hasta observar la separación de fases. Se tomó
la fase superior y se midió su absorbancia a 520nm. El contenido de prolina se determinó
mediante la curva de calibración y los resultados se muestran en μmol/g de peso fresco
(Gutierréz-Rodríguez et al., 1998).
2.2.2. MEDICIÓN DE PARÁMETROS MOLECULARES
Con base a la literatura, un factor de transcripción procedente de Arabidopsis fue
seleccionado como candidato para la evaluación y medición del efecto de estrés por
sequía a nivel molecular. El gen del factor de transcripción TGA1 (At5g65210) se
34
encuentra relacionado con la cascada de señalización tras estímulos provocados por
estrés abiótico (deficiencia de nitratos y déficit hídrico) y síntesis de ABA en Arabidopsis
thaliana (Alvarez et al., 2014; Lv et al. 2014).
Se realizó una búsqueda en similitud de secuencias ortólogas a AtTGA1 en el genoma de
papaya, mediante la base de datos de Arabidopsis Information Resource (TAIR: Lamesch
et al., 2012); la plataforma de base de datos del Laboratorio Europeo de Biología
Molecular- Instituto Europeo de Bioinformática EMLB-EBI
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/wgs.html), la plataforma PHYTOZOME
(http://phytozome.jgi.doe.gov/) y la plataforma del Centro de Información Biotecnológica
(NCBI).
A través del programa FGENESH+ (http://www.softberry.com/berry) se seleccionó la
secuencia del gen ortólogo dentro del genoma de papaya el cual fue denominado como
CpTGA1. Con base a esta predicción de secuencia se diseñan los oligonucleótidos
(Cuadro 2.1) necesarios para el análisis de expresión.
Se realizó una evaluación de todas las secuencias del grupo TGA, bZIP caracterizadas
funcionalmente en angiospermas y se compararon con las seis secuencias de TGA
identificadas in silico en papaya por Idrovo-Espín y colaboradores (2012). La revisión y
edición de secuencias fue interpretada por el programa de alineamiento Clustal Omega de
la plataforma EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Una vez alineadas las
secuencias se determinó el grado de homología entre ellas mediante la elaboración del
árbol filogenético generado por el software MEGA 6 (Tamura et al., 2007). La filogenia se
obtuvo por el método de distancia por Neighborgh joining con Bootstrap de 100 réplicas y
como Outgroup una secuencia miembro del clado S (S-like).
EXTRACCION DE ARN Y SINTESIS DE ADNc
Para la extracción de ARN total se cortaron 100 mg de tejido de hoja y raíz
respectivamente para cada uno de los puntos de medición del tratamiento. Después de
pesar las muestras se prosiguió a colocarlas inmediatamente a -80°C. El tejido fue
35
macerado vigorosamente y la extracción del ARN total fue realizada mediante el protocolo
de TRIzol (Invitrogen) (Chomczynski, 1993). Las muestras fueron almacenadas en
isopropanol a -20°C hasta su manipulación para la síntesis del ADNc. Una vez colectadas
las muestras de todos los puntos del tratamiento se continuó con la extracción de ARN
total, lavando las pastillas del ARN precipitado dos veces con una mezcla de Etanol-
DEPC al 70%. El ARN fue resuspendido en agua DEPC estéril. Se corroboró la calidad
del ARN purificado mediante su cuantificación por nanodrop y visualización a través de un
gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (1μg/ml).
Una vez determinada la calidad y concentración del ARN total se realizó la síntesis de
ADNc (ADN complementario) a través de la enzima M-MLV reversa transcriptasa
(Invitrogen) y siguiendo el protocolo Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit
(CLONTECH) (Zhu et al., 2001). Se utilizaron los oligonucleótidos SMART-SITINV
(GATATCAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATTCGGG) y FER-1
(GAGCTAGTTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTVN) para la síntesis de la primera cadena.
La segunda cadena fue sintetizada con los cebadores FER-1 y Primer/IA
(AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT) en conjunto con la enzima 50x Advantage
Polymerase Mix.
AMPLIFICACIÓN DE CpTGA1 POR RT-PCR Y qRT-PCR EN ADNc de Papaya
A través del programa Oligo versión 7.60 y la plataforma IDT
(https://www.idtdna.com/Site/Order/oligoentry) se diseñaron oligonucleótidos para el
análisis de expresión del gen CpTGA1por PCR de punto final (RT-PCR) (Cuadro 2.1). El
análisis de expresión se realizó para muestras de hoja y raíz por triplicado.
Por cada reacción de RT-PCR se manejó un volumen final de 25 l. El programa de
amplificación implicó un paso inicial de desnaturalización a 95°C durante 5 min, seguido
de 25 ciclos con una desnaturalización a 95°C por 30seg, 30seg de alineamiento a 60°C y
una extensión a 72°C durante 1.10 min; con una extensión final de 72°C por 5 min. Como
referencia para la cuantificación de CpTGA1 se efectuaron normalizaciones con los
cebadores del gen constitutivo Actina (Act2) (Zhu et al., 2004) y se empleó el factor de
transcripción CpNAC002 con función ante el estrés conocida y previamente caracterizado
36
en nuestro laboratorio (Pereira-Santana, 2015). La longitud del amplicón esperado así
como la temperatura de fusión (Tm) de cada gen se indica en el Cuadro 2.1. Los
productos de la amplificación fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% teñido de
EtBr con buffer TAE.
Cuadro 2.1 Secuencias de oligonucleótidos utilizados para el análisis de expresión en la caracterización molecular de C. papaya bajo un estrés hídrico. CpTGA1: gen a determinar relación al estrés; CpNAC002: como marcador de control interno; CpAct2: gen de normalización. F: Forward y R: Reverse.
SECUENCIACIÓN DE CpTGA1
Se realizó una PCR con la ADN polimerasa Phusion (Thermo Scientific) (Chester y
Marshak, 1993) de alta fidelidad cuyas condiciones de amplificación implicaron una
desnaturalización inicial a 98°C, seguido por 30 ciclos con desnaturalización a 98°C por
10 seg, alineamiento a 63°C durante 15 seg, extensión a 72°C por 15 seg y una
extensión final a 72°C durante 10 min. Se corrió un gel con la amplificación PCR-Phusion
y se purificaron los productos mediante el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega) y las muestras fueron resuspendidas en 10l. Debido a que la ADN polimerasa
Phusion genera amplicones con extremos romos, se efectuó el paso de adición de colas
de adenina mediante mezcla de reacción de PCR pero sin cebadores a una incubación de
72°C durante 30 min. Este paso fue requerido para la ligación del inserto al vector de
clonación. La ligación al vector pGEM®-T Easy (Figura 2.1) se realizó con la enzima T4-
DNA ligasa. Posteriormente, se transformaron células calcio competentes de E. coli,
cepas DH5-α con las construcciones obtenidas. Para este procedimiento las células
fueron descongeladas con hielo, se les adicionó 150 ng del vector más el inserto y se
incubaron durante 30 min a 4°C. Seguidamente se realizó un choque térmico a 42°C por
50 seg e inmediatamente después se transfirieron a hielo durante 5 min. A cada muestra
Nombre Tm Secuencia pb Longitud Amplicón
CpTGA1 F 60.6 5'- ATGAGCTCTCCTTCAACTGAACTGGC -3' 26 1092 bp
CpTGA1 R 63.7 5'- GGCAGGTTCACGAGGACGAGCA -3' 22 CpNAC002 F 55.5 5’- ATGGATAATGTTTCAAAGGATAAT -3’ 24 1041 pb
CpNAC002 R 56.9 5’- ATAGTTCCAGAGGCAATATAAAT -3' 23
CpAct2 F 55.2 5’- ATGTTTCCAAGGGAGTATGATGAG -3’ 24 124 pb
CpAct2 R 55.8 5’- ACACAGGACACAAAAGCCAATACTA -3’ 25
37
se le adicionó 0.5 mL de medio LB líquido sin antibiótico y se dejaron crecer a 37°C
durante 1.15 hrs a 200 rpm. Por último las células fueron plaqueadas en 100 µL del cultivo
en medio sólido de LB con ampicilina (100 mg/mL), X-gal (20 mg/mL) e IPTG (100 mM).
Las placas fueron dejadas en incubación a 37°C hasta la aparición de colonias.
Se realizó un PCR-colonia para la identificación de células de E. coli transformadas con el
inserto de interés. A continuación se realizó un Miniprep de las colonias identificadas
como transformadas con el Kit Qiaprep Spin Column (Qiagen) de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Como último paso se utilizó 15l de muestra de TGA1 para
ser enviadas a secuenciar al departamento de Servicios Genómicos Cinvestav-Langebio.
Figura 2.1. Mapa del vector de clonación pGEM®-T Easy.
38
2.3. RESULTADOS
El tratamiento de estrés hídrico consistió en la medición de cuatro puntos: día 0, 5, 8 y 12
días de exposición. Durante el tratamiento las plantas fueron abstenidas de riego con
excepción del lote control que fue regado continuamente a lo largo del experimento. Para
cada punto de estrés se tomaron muestras de hoja y raíz para el análisis de parámetros
moleculares, muestras de hojas para la medición de parámetros fisiológicos y
bioquímicos, y también se tomaron muestras de hojas de cada punto para la medición de
metabolitos secundarios, sección descrita en el Capítulo III.
En la Figura 2.2 se observa la respuesta cualitativa de plantas de papaya variedad
Maradol Roja de alrededor de 3 meses después del día de germinación y de
aproximadamente 45 cm de altura. A lo largo del estrés se puede ver en el fenotipo de las
plantas un daño progresivo de la parte aérea de la planta como la pérdida de turgencia y
pérdida de las hojas más viejas. La coloración de las hojas también cambio a lo largo de
estrés, disminuyendo con cada punto su color verde y pasando a tonos amarillos. Cabe
mencionar que el último punto del estrés (12 días) fue el único en el que no se observó
una recuperación ante la re-hidratación post estrés de las plantas.
2.3.1. MEDICIÓN DE PARÁMETROS FISIOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS
Para la sección de mediciones fisiológicas se tomó como parámetro marcador del estrés
al contenido relativo de agua del tejido foliar. La determinación del porcentaje de agua de
la sección foliar de papaya se determinó tomando la tercera hoja completamente
desarrollada a partir del ápice de la planta. Los datos de este parámetro se expresan en
porcentaje de agua como se observa en la Figura 2.3. Al inicio del experimento, la
comparación entre el día de estrés 5 con 87.61% y el control con 86.68% no demuestran
diferencia significativa. Después sin embargo, al comparar el día 5 con el siguiente punto:
el día 8 con 64.52%, la variación entre ambos puntos es de alrededor del 22%. La mayor
diferencia significativa entre los puntos de estrés radica entre el día 8 y el día 12 con
16.93% del contenido de agua. Al final del tratamiento la diferencia entre el día 12 y el
control es más del 50% en comparación.
39
Figura 2.2. Efecto del tratamiento de estrés hídrico sobre la parte aérea de plantas de
papaya durante los cuatro puntos de medición del estrés.
Figura 2.3. Cálculo del contenido relativo de agua de hojas de papaya bajo estrés
por sequía.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
Co
nte
nid
o r
ela
tivo
de
agu
a (%
)
Días
0 5 8 12
40
Como parámetro indicador del estrés a nivel bioquímico se utilizó la medición del
contenido de prolina de las hojas estresadas durante el tratamiento de sequía. Hojas de
papaya fueron irrigadas (plantas control) y no irrigadas (plantas estresadas) para la
medición de este parámetro. El contenido de prolina de las plantas del grupo control (Día
0) se mantuvo entre 0.60 y 0.68 de mol/g de peso fresco de la hoja. Los días de estrés 5
y 8 demuestran un leve incremento del contenido de prolina con unidades de 0.75 y 0.85
mol/g respectivamente. A partir del día 8 del tratamiento, el contenido de prolina
aumenta significativamente alcanzando un valor de 2.12 mol/g en la medición del día
12. En la Figura 2.4 se observa la acumulación progresiva de prolina en las hojas de
papaya a lo largo de los puntos de medición de estrés y su diferencia con respecto al
control.
Figura 2.4. Contenido de prolina en hojas de plantas de papaya durante los diferentes
puntos del tratamiento de estrés por sequía. La línea roja señala la respuesta de las hojas
estresadas; la línea azul indica la respuesta de las hojas no estresadas.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6 8 10 12 14
Pro
lina
(µm
ol/
g P
F)
Tiempo (Días)
Control Sequía
41
2.3.2. MEDICIÓN DE PARÁMETROS MOLECULARES
Realizando el análisis bioinformático se identificó que en el contiq 100.3 del genoma de
papaya existe una alta probabilidad que el gen para el factor de transcripción TGA1 se
encuentre en esa sección. A partir del contiq seleccionado se obtuvo la predicción del gen
denominado CpTGA1. La predicción del gen CpTGA1 indica un marco de lectura abierto
de 1014pb, codificando una proteína de 338 aminoácidos (Cuadro 2.2). CpTGA1 tiene un
porcentaje de identidad de 76% con respecto a la proteína AtTGA1 de Arabidopsis.
Una vez obtenidas las secuencias consenso, estas fueron corroboraras a través de los
resultados de secuenciación y se realizó un alineamiento espacial de la frecuencia de los
aminoácidos conformantes del dominio conservado de la familia para cada gen utilizando
el programa WebLogo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi). Así mismo mediante la
plataforma PFAM (Finn et al., 2016) se identificaron los dominios conservados dentro de
la secuencia codificante CpTGA1.
A partir del alineamiento de secuencias TGA-bZIP se generó un árbol filogenético
utilizando a especies de angiospermas con funciones caracterizadas: Arabidopsis
thaliana, Nicotiana tabacum, Oryza sativa y Phaseolus vulgaris. Los resultados de la
relación filogenética (Figura 2.5) colocan a CpTGA1 evolutivamente cerca de AtTGA1 y
AtTGA4. Nuestros resultados del árbol filogenético tienen concordancia con la relación en
homologías reportada en el análisis in silico de Idrovo-Espín y colaboradores (2012).
De acuerdo a nuestro análisis filogenético, CpTGA1 también tiene una constitución
ortóloga al gen PvTGA1 de Phaseolus vulgaris. El subclado III permaneció prácticamente
intacto en comparación con el análisis filogenético previamente realizado entre papaya y
Arabidopsis (Idrovo-Espín et al., 2012).
Durante el análisis bioinformático nuestra búsqueda detecto a un séptimo integrante de la
subfamilia TGA dentro del genoma de papaya, el cual fue denominado como CpTGA7 y
se coloca en el subclado II (Figura 2.5). La familia bZIP en papaya destaca como un grupo
con menor número de genes TGA en comparación con los identificados en Arabidopsis.
Esta proporción podría indicar que aquellos factores de transcripción tipo bZIP tienen una
función más precisa y no redundante en comparación con el mayor número observado
para el caso de Arabidopsis.
42
Cuadro 2.2. Secuencias caracterizadas in silico de los genes del grupo TGA en papaya.
TGA Contiq Especie aa Referencia
TGA1 100.3 Carica papaya 338 Idrovo-Espín et al., 2012
TGA2 5.165 Carica papaya 438 Idrovo-Espín et al., 2012
TGA3 49.3 Carica papaya 349 Idrovo-Espín et al., 2012
TGA4 1.202 Carica papaya 492 Idrovo-Espín et al., 2012
TGA5 32.14 Carica papaya 516 Idrovo-Espín et al., 2012
TGA6 85.93 Carica papaya 514 Idrovo-Espín et al., 2012
TGA7 847.1 Carica papaya 208 No reportado
Se realizó un alineamiento espacial de las secuencias de aminoácidos empleadas para el
árbol filogenético, el cual revelo que todos los genes TGA comparten dos dominios: el
dominio característico de la familia bZIP y el dominio DOG1 con funciones vinculadas al
control de latencia de semillas (Figura 2.6). La representación gráfica de los dominios fue
realizada mediante la edición de Logotipos o LOGO. De esta forma se obtiene una
descripción más detallada y visual de la secuencia consenso y los dominios que la
conforman.
Se realizó la predicción estructural proteica tridimensional de CpTGA1 utilizando el
programa de simulación PHYRE2 (Protein Fold Recognition Server). Esto para comparar
la predicción de estructura del TGA1 en papaya con respecto a su ortólogo AtTGA1 en
Arabidopsis (Figura 2.6. A). Los resultados de los logotipos y estructuras 3D de las
proteína CpTGA1 tienen una estructura y secuencia de dominio similar a la proteína
AtTGA1 en Arabidopsis.
El dominio característico de la familia bZIP se encuentra integrado por dos motivos: una
región básica responsable de la unión específica al ADN; y una región de dimerización
denominada zipper de leucina (Guedes-Correa et al., 2008). En conjunto las dos
secciones del dominio bZIP interaccionando con el ADN tienen una estructura que
asemeja una “Y” así como se observa en la Figura 1.3.
43
Figura 2.5. Árbol filogenético de las secuencias TGA caracterizadas funcionalmente en
angiospermas y caracterizadas in silico de C. papaya. En color rojo el subclado I, en azul
el subclado II y en amarillo el subclado III clasificación propuesta por Idrovo-Espín et al.
(2012). Las relaciones filogenéticas son inferidas por el método de distancia Neighborgh
joining con Bootstrap de 100 réplicas, en cada nodo se ubica el valor de bootstrap
correspondiente. La visualización y edición del árbol fueron realizadas mediante el
programa MEGA6 (Tamura et al., 2007).
Subclado III
Subclado III
Subclado I
Subclado III
Subclado II
Subclado III
44
Figura 2.6. A) Predicción estructural en 3D de la proteína del factor de transcripción
CpTGA1 y AtTGA1. B) Frecuencia de amioácidos del dominio conservado bZIP generado
a partir del alineamiento de secuencias ortólogas a CpTGA1. C) Frecuencia de
aminoácidos del dominio DOG1 encontrado dentro de secuencias ortólogas a CpTGA1.
Para cada subfamilia bZIP reconoce cajas promotoras específicas, los de mayor
preferencia son la caja A (TACGTA), caja C (GACGTC) caja G (CACGTG), caja H
(CCTACC), motivo TGACG (Jacoby et al., 2002). Los factores de transcripción del clado
D/TGA de la familia bZIP han sido caracterizados principalmente en Arabidopsis como
reguladores ante condiciones de estrés biótico y abiótico (Gatz, 2012).
Para poder confirmar que las amplificaciones obtenidas en el perfil de expresión
correspondan a la predicción in silico de CpTGA1, el gen del factor de transcripción fue
amplificado por oligonucleótidos diseñados, la secuencia completa fue purificada y llevada
a un vector de clonación para someter la lectura a secuenciación a través de los servicios
de LANGEBIO (http://labsergen.langebio.cinvestav.mx/labsergen/index1.html). Una vez
obtenidos los resultados se confirmó que la secuencia de CpTGA1 era la esperada y que
su serie de nucleótidos se encontraba integra.
45
Siguiendo con el análisis de expresión diferencial, se realizó una prueba de calidad de las
extracciones del ARN total previo a la síntesis del ADNc. Extracciones de los diferentes
puntos de estrés en hoja y raíz fueron visualizadas en un gel de agarosa con EtBr al 1%
a 95 V (Figura 2.7). Una vez sintetizado el ADNC se prosiguió a realizar la expresión
diferencial por PCR de punto final del gen CpTGA1.
En la figura 2.8 se observa que CpTGA1 en el tejido foliar aumenta su expresión
conforme a los días del tratamiento, siendo el día 12 aquel que presenta una mayor
expresión. En el caso de del tejido de raíz, CpTGA1 demuestra un aume/nto de expresión
al tratamiento con respecto al control, más sin embargo el perfil no es tan claro como en el
tejido foliar. El gen empleado como control interno CpNAC002 demostró un
comportamiento esperado y similar a pruebas previamente realizadas en el grupo de
laboratorio, donde se observa que su expresión aumenta proporcionalmente de acuerdo
al tiempo del tratamiento.
Figura 2.7. Comprobación de la calidad de ARN total de hoja y raíz de plantas de papaya
bajo estrés hídrico.
46
Figura 2.8. Amplificación del gen TGA1 bajo estrés hídrico en 0, 5, 8 y 12 días. (M.W.)
marcador molecular. (H) tejido de hoja, (R) tejido de raíz.
47
2.4. DISCUSIÓN
Las plantas son organismos sésiles que se encuentran en constante exposición a las
variables ambientales, por lo cual están provistas de mecanismos que les ayudan a
resistir los efectos en su crecimiento y que confieren adaptación de la planta al medio en
el que se desarrolla. El mecanismo de señalización ante un estrés abiótico consiste en
una red de respuesta compleja que comprende comunicación intra y extracelular. La
primera señal a los efectos de un estrés por lo general inicia con la activación de genes
específicos, continuando por una regulación transcripcional y postraduccional (Kuromori et
al., 2014).
Existen diversas maneras para determinar los efectos y grado de estrés a la que una
planta se encuentra. En el presente estudio se determinó los efectos de un estrés por
sequía a nivel de respuesta fisiológico, bioquímico y molecular en hojas de papaya.
2.4.1. PARÁMETROS FISIOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS
El tejido foliar es uno de los primeros tejidos en mostrar señales de daño por estrés
hídrico. Es bien conocido que a consecuencia de la falta de agua, los estomas en las
hojas se cierran y consecuentemente ocurre una reducción en la asimilación de CO2.
(Jaleel et al., 2009). Gran parte del contenido de agua de la planta se pierde por el
intercambio gaseoso en las hojas, por lo que es crucial la activación de mecanismos que
disminuyan y/o eviten la pérdida de agua.
El contenido relativo de agua es una medición que revela el estado del porcentaje de
agua de plantas que han pasado por un tratamiento y/o estrés, particularmente de hojas y
raíces. Esta técnica es una de las más comunes para conocer la cantidad de agua de un
tejido con respecto al total de agua que el tejido puede almacenar (Varela et al., 2016).Los
resultados de este estudio demuestran que los efectos de sequía en las hojas de papaya
se ven reflejados en la pérdida de turgencia, disminución visible a partir del primer punto
de estrés (día 5), con más severidad en el último día del tratamiento (día 12) (Figura 2.2).
La determinación del contenido relativo de agua de la sección foliar de papaya demostró
una disminución del porcentaje en el transcurso del estrés. La comparación de los
48
porcentajes de días de estrés, particularmente la comparación entre el día 8 (64.52%) y
día 12 (16.93%) revelan una pérdida de agua significativa. Entre el día 5 y el control se
observa poca diferencia significativa en los porcentajes. Al concluir la medición del
tratamiento la diferencia entre el día 12 y el control es más del 50% en comparación
(Figura 2.3). Este patrón concuerda a los resultados esperados y la respuesta es similar a
estudios previamente reportados en papaya (Mahouachi et al., 2012; Jeyakumar et al.,
2005).
Mahouachi et al. (2012) reportan que las plantas de papaya hidratadas oscilan entre 89 y
93% de agua, en un tiempo de déficit hídrico de 18 días alcanzan a 60% de agua. En el
estudio de Jeyakumar et al. (2005) se observa que los valores obtenidos son más
similares a los nuestros. Ante el estrés hídrico, plantas de papaya parten de un control de
90.6% y conforme el avance del tratamiento el porcentaje disminuye a 82% y 77.4%.
Cabe añadir que las plantas utilizadas para estos estudios eran plantas más desarrolladas
y el tiempo del tratamiento fue estacional.
Los resultados en este estudio revelan un porcentaje de contenido relativo de agua con
diferencias de valores más significativos que los resultados de los dos antecedentes con
papaya mencionados (Jeyakumar et al. 2015; Mahouachi et al. 2012). Las hojas de
papaya indica signos de efecto negativo considerables ocasionados por estrés hídrico a
partir del octavo día de tratamiento. Al terminar el experimento todas las plantas se
recuperaron tras la rehidratación con excepción del lote de plantas del día 12.
Durante periodos de ausencia de agua el desarrollo y crecimiento de las plantas es
severamente afectado puesto que los efectos del estrés conllevan al cierre de estomas,
reducción en fotosíntesis, mayor producción de especie reactivas a oxígeno (ROS),
aumento de producción de osmolitos, entre otros (Jaleel et al., 2009). Los solutos
compatibles u osmolitos de bajo peso molecular actúan como osmoprotectores ayudando
a equilibrar el potencial osmótico en las células, estabilizar proteínas y membranas (Wani
et al., 2013).
La prolina es uno de los principales solutos compatibles que además de su función como
osmoprotector, actúa como compuesto quelante, antioxidante y molécula señal (Hayat et
al., 2012). Se ha demostrado que la concentración de prolina en papaya está relacionada
49
al estrés hídrico; hojas, tallos y raíces manifiestan una mayor concentración de prolina
tras un tratamiento de estrés hídrico (Mahouachi et al., 2012; Mahouachi et al., 2006).
En el presente estudio, se realizó la medición del contenido de prolina de las hojas de
papaya expuestas a un tratamiento de estrés hídrico. A lo largo del tratamiento se
observó una acumulación progresiva de prolina donde el último punto de medición del
estrés (día 12) fue el que registró el nivel más alto de prolina (Figura 2.4). La comparación
entre el control (0.603 μmol/g) y el día 5 (0.753 μmol/g) no demostró diferencia
significativa. Por otra parte, el día 8 (0.952 μmol/g) con respecto al día 12 (2.124 μmol/g)
registró la mayor diferencia significativa para este estudio.
Que la prolina tenga una mayor acumulación en los últimos puntos del tratamiento de un
estrés hídrico es un patrón que también se ve reportado en otras plantas como
Arabidopsis thaliana, Oryza sativa y Zea mays (Lum et al., 2014; Sharma y Verslues,
2010; Hayano-Kanashito et al., 2009). El incremento en la concentración de prolina nos
indica que las hojas de C. papaya demandan mayor contenido del soluto como requisito al
ajuste del equilibrio osmótico, mecanismo de defensa contra el estrés oxidativo.
De acuerdo a las observaciones por Sharma y Verslues (2010) y Verslues y Bray (2006),
la acumulación de prolina es más significativa en periodos de estrés hídrico de días que
de horas; señalando que las funciones que desempeña este osmolito son necesarias ante
temporadas de sequía a fin de mantener la estabilidad de la estructura celular. Asimismo,
los resultados reportados en este capítulo apoyan la idea propuesta por Reddy et al.
(2004). Estos autores han propuesto que las especies de plantas con capacidad de
resistir el estrés por sequía comparten la característica de disminuir su nivel de contenido
relativo de agua, esto a causa del ajuste osmótico que permite mantener un potencial
positivo de turgencia y presión adecuada a nivel celular. Lo que sugiere que la
acumulación de prolina ayuda a papaya a mantener estables los parámetros fisiológicos
en sus hojas al menos por periodos cortos de sequía.
Después de un periodo de estrés hídrico, los niveles de prolina son reversibles y
consiguen alcanzar su nivel basal (Deuschle et al., 2004). La rehidratación de las plantas
de papaya fue realizada un día después de la medición del estrés para los puntos 6 y 12
días. El lote de plantas fue recuperado con excepción de las plantas referentes al día 12.
50
No se tomó el valor del contenido de prolina después de la rehidratación, no obstante, la
respuesta observada en el día 12 nos sugiere que a pesar del incremento de prolina en
las hojas, su concentración no fue la suficiente como para evitar daños irreversibles a la
integridad de la planta. Que las plantas del día 12 no sobrevivan no quiere decir que la
acumulación de prolina no haya brindado beneficios al estrés, sino que es probable que
los efectos del estrés hayan sobrepasado la capacidad de respuesta de la planta hasta un
punto letal. En este estudio no se realizaron las mediciones de capacidad de campo de
suelo o punto de marchitez permanente, de haber tomado estos valores se hubiera podido
determinar si el tratamiento llevo a las plantas a un estrés hídrico o un estrés letal.
2.4.2. PARÁMETROS MOLECULARES
La respuesta de regulación molecular es compleja y abarca una red de acción con
muchos elementos participantes. Muchas de estas respuestas están reguladas por
factores de transcripción (Kuromori et al., 2014). Los factores de transcripción actúan de
manera específica sobre un conjunto de genes cuando la planta recibe la señal de estrés.
En Arabidopsis existen 64 familias y alrededor de 1500 factores de transcripción con
funciones de regulación positiva o negativa (Maston et al., 2006). Cada familia tiene
funciones particulares a algún tipo de estrés o estreses en conjunto (Tsuda y Somssich,
2015).
Las proteínas de la familia bZIP, subfamilia TGA son factores de transcripción con
funciones reguladoras ante estreses bióticos y abióticos (Gatz et al. 2012). El factor de
transcripción AtTGA1 (Arabidopsis thaliana) se conoce por su caracterización funcional
como un gen involucrado en la cadena de respuesta al mecanismo de defensa
(señalización del ácido jasmónico) y respuesta ante un estrés abiótico (Zhong et al.,
2015). En el presente estudio se realizó un análisis bioinformático para determinar la
homología del gen putativo TGA1 en papaya con respecto al gen funcionalmente
caracterizado de Arabidopsis thaliana, se determinó el perfil de expresión génica durante
el tratamiento de estrés hídrico en el tejido foliar y se corroboró la identidad del gen
CpTGA1 mediante técnicas de secuenciación.
Dentro del análisis bioinformático realizado, el alineamiento múltiple entre los TGA
ortólogos de papaya en relación con otras especies vegetales, demostró el alto grado de
51
conservación que existe a lo largo de la subfamilia (Figura 2.5), así como se ha observado
en otros estudios (Guedes-Correa et al.,2008; Jacoby et al., 2002). Nuestro análisis
demuestra que la secuencia de los siete genes TGA de papaya mantienen integra la zona
conservada denominada D/TGA. Esta zona representa el dominio de nucleótidos por el
cual la subfamilia lleva el nombre. Con la información experimental disponible de factores
de transcripción TGAs en otras especies vegetales, se realizó un árbol filogenético cuyas
correlaciones apuntan que CpTGA1 es estructuralmente similar a AtTGA1. Asimismo,
CpTGA1 demostró tener estrecha similitud con los genes CrTGA4 y AtTGA4.
Así como en el trabajo de Idrovo-Espín et al., (2012), nuestros resultados indican que
CpTGA1 tiene alta probabilidad de encontrarse en el contiq 100.3 de la base de datos
genómica de Carica papaya. El porcentaje de identidad de CpTGA1 con respecto a la
proteína AtTGA1 de Arabidopsis fue de 76%. Los resultados de secuenciación
demostraron que el factor de transcripción CpTGA1 posee un marco de lectura abierto de
1014pb, y codifica una proteína de 338 aminoácidos.
Por otra parte, se identificó un nuevo miembro de la subfamilia TGA en papaya y que lleva
por denominación CpTGA7. La secuencia de CpTGA7 fue añadida a la filogenia creada a
partir de los alineamientos múltiples de las secuencias caracterizadas (Figura 2.5).
Previamente un análisis in silico había identificado a seis miembros de la subfamilia TGA
en papaya (Idrovo-Espín et al., 2012). Al igual que cualquier otro gen de la subfamilia
TGA, CpTGA7 contiene el dominio conservado del clado D/TGA y el dominio
representativo de la familia bZIP (Figura 2.6).
Los factores de transcripción del clado D/TGA de la familia bZIP han sido caracterizados
principalmente en Arabidopsis como elementos reguladores ante condiciones de estrés
biótico y abiótico (Gatz, 2012). La secuencia de CpTGA1 demuestra similitud a la
secuencia de proteínas cuyas funciones han sido relacionadas a los mecanismos de
respuesta ante un estrés abiótico (Figura 2.5). Alvarez et al. (2014) demuestran que
AtTGA1 en Arabidopsis responde ante un estrés abiótico y ante el metabolismo de
nitrógeno. AtTGA1 y AtTGA4 en Arabidopsis exhiben un alto grado de homología en los
resultados de nuestra filogenia; el mismo patrón es observado en los trabajos de Guedes-
Correa et al. (2008) e Idrovo-Espín et al. (2012). Plántulas sobreexpresantes de AtTGA4
en Arabidopsis han demostrado conferir mayor resistencia a condiciones de sequía, al
52
mismo tiempo que mejoran el aprovechamiento de consumo y transporte de nitratos
(Zhong et al., 2015). En otro estudio, Leite et al., (2014) describen que la sobreexpresión
del factor de transcripción del clado TGA denominado AtAREB1 otorga mayor porcentaje
de supervivencia a plantas durante un estrés hídrico.
De acuerdo al perfil de expresión génica registrado en este trabajo, CpTGA1 demuestra
evidencias en que su expresión se encuentra relacionada a la respuesta ante un estrés
abiótico, específicamente a un estrés por sequía. CpTGA1 demostró un mayor encendido
del gen en los puntos de estrés del día 8 y 12. En general la expresión de CpTGA1 fue
mayor en hojas que en raíz, con la diferencia significativa más notoria en el día 12 de
hojas estresadas.
La expresión de CpTGA1 registró el valor de concentración más alto en el día 12 de
estrés, a pesar que las plantas después de este día no sobrevivieron los efectos de la
sequía. La diferenciación en el perfil de expresión del gen nos indica que existe una
relación entre este y el estrés hídrico. Se requiere de mayor información experimental
para determinar si esta relación es de carácter positivo o negativo. A primera instancia
podría parecer que CpTGA1 no brinda funciones de tolerancia a la planta ante los efectos
del estrés hídrico, puesto que el grupo de plantas del día 12 no sobrevivió la rehidratación.
Sin embargo también existe la posibilidad que las condiciones del tratamiento en conjunto
al estado de desarrollo de la planta la llevaron a un estrés letal del cual pese al
incremento en concentración del gen CpTGA1 ( y las funciones que su expresión
desencadenen) no fue suficiente para proteger a la papaya.
Para poder afirmar o descartar que CpTGA1 en papaya tiene funciones de tolerancia ante
un estrés hídrico se requiere la generación de mutantes. Hasta el momento, la expresión
del factor de transcripción CpTGA1 en hojas de papaya indica una respuesta de
señalización ante un estrés hídrico, aumentando su expresión hasta llegar al nivel de
expresión más alto medido: 12 días.
La expresión de las imágenes resultantes de la amplificación por PCR de punto final fue
medida por densitometría a través del programa ImageJ. Como referencia a observar la
expresión de un gen con expresión conocida se utilizó el factor de transcripción NAC002,
previamente caracterizado en nuestro laboratorio en papaya (Pereira-Santana, 2015). La
expresión del gen NAC002 está ligada a sequía, daño mecánico y patógenos (Lu et al.,
53
2007). El gen CpNAC002 demostró un comportamiento esperado y similar a pruebas
previamente realizadas en el grupo de laboratorio, donde así como se observa en la
Figura 2.8, su expresión aumenta proporcionalmente de acuerdo al tiempo del
tratamiento.
Cabe señalar que el trabajo reportado por Idrovo-Espín et al., (2012) se limitó a identificar
genes ortólogos de TGA en papaya a través de un análisis in silico (en comparación con
Arabidopsis) y a observar en que parte del tejido de papaya se presentaba su expresión;
empero no se determinó la funcionalidad de los genes TGA. Por lo cual el trabajo
experimental realizado del presente trabajo es el primer acercamiento a la función de un
factor de transcripción TGA en papaya. Queda como perspectiva determinar si la función
de CpTGA1 se encuentra verdaderamente relacionada a los mecanismos de tolerancia
ante un estrés hídrico. Para esta afirmación se requiere generar mutantes sobre-
expresantes del gen a través de transformación por biobalística de embriones somáticos
de papaya y comparar su desempeño ante el estrés con la variedad silvestre.
En el presente estudio se determinó los efectos de un estrés por sequía a nivel de
respuesta fisiológica, bioquímica y molecular en hojas de papaya empleando las
mediciones del contenido relativo de agua, concentración del osmolito prolina y perfil de
expresión génica de un factor de transcripción asociado a la respuesta de tolerancia al
estrés. Una vez obtenidos los resultados de los tres diferentes parámetros censados, se
prosiguió a unificar los valores a un patrón de respuesta consenso. Nuestros resultados
señalan que las plantas de papaya experimentan los efectos negativos del estrés hídrico;
a partir del día 8 de estrés las hojas demuestran mayor severidad de daños. El daño
observado en las hojas a lo largo del estrés conduce a una calificación descriptiva de la
siguiente manera: bajo daño (control y 5 días), daño moderado (8 dias) y daño severo (12
días). En los resultados de los tres niveles medidos (fisiológico, bioquímico y molecular) el
último punto de estrés es el más significativamente diferente y por tanto el más afectado.
La ausencia de agua en plantas de alrededor de tres meses de edad de papaya tiene
efectos negativos para el desarrollo y crecimiento de la planta más con daños reversibles
antes de alcanzar los doce días de ausencia de riego.
54
2.5. CONCLUSIONES
El estrés hídrico al cual las plantas de papaya fueron sometidas provocó daños
significativos en las hojas de la planta así como señalan los datos en la disminución del
contenido relativo de agua y acumulación de prolina.
El factor de transcripción CpTGA1 posee alto grado de similitud con AtTGA1, de modo
que es probable que funcionalmente compartan las mismas características.
La expresión del gen CpTGA1 en hojas de papaya aumenta conforme el avance de estrés
por sequía. Se comprobó por secuenciación que el gen CpTGA1 amplificado por PCR
corresponde a la predicción realizada a partir del genoma de Carica papaya.
Los efectos más significativos del estrés por sequía en hojas de papaya ocurren durante
el periodo del día 8 a 12.
55
CAPÍTULO III. MEDICIÓN DE METABOLISMO SECUNDARIO EN
PLANTAS DE Carica papaya SOMETIDAS A ESTRÉS POR SEQUIA
3.1. INTRODUCCIÓN La extracción por líquidos presurizados (PLE, por sus siglas en inglés) es considerada
una técnica de extracción verde ya que en comparación con métodos convencionales de
extracción, utiliza una menor cantidad de disolvente y extracto, su duración de tiempo es
más corta y los residuos de extracción pueden liberarse a la atmosfera sin daños mayores
(Jaime et al., 2010; Plaza y Turner, 2015). Las condiciones de extracción para extractos
fenólicos por medio de la extracción PLE son por lo general similares (Plaza y Turner,
2015). Empero son pocos los estudios con la técnica de extracción PLE que empleen
especies tropicales.
Diversos compuestos fenólicos han sido identificados en C. papaya, particularmente en
tejido foliar (Canini et al., 2007; Jiao et al: 2010; Schweiggert et al., 2011; Gogna et al.,
2015). En hojas de C. papaya se ha observado una correlación del porcentaje de
compuestos fenólicos en respuesta a variaciones en la temperatura e intensidad de luz
(Rivera-Pastrana et al., 2010). A la fecha no se tiene información del comportamiento de
dichos metabolitos dentro del tejido foliar de C. papaya ante el efecto ocasionado por
estrés hídrico.
La importancia de estos compuestos reside en sus propiedades antioxidantes. Se ha
observado que la concentración de compuestos fenólicos sirve como mecanismo de
protección ante los efectos de estrés abiótico. Bajo tratamientos de radiación UV, alta
luminosidad y altas temperaturas se registra un incremento en la acumulación de
compuestos fenólicos en el tejido foliar (Savoi et al., 2016; Tattini et al., 2000; Soleka,
1997).
El objetivo de este trabajo consiste en obtener perfiles metabólicos de los compuestos
fenólicos totales de hojas de C. papaya bajo condiciones de estrés hídrico, y analizar la
relación de los metabolitos observados con respecto al tratamiento de estrés hídrico. Las
actividades realizadas en este capítulo consistieron en: extracciones por PLE de hojas,
separación cromatográfica por HPLC con detección por absorbancia UV-Vis y detector de
captura de electrones, caracterización de la actividad antioxidante e identificación a través
de espectrometría de masas.
56
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1. MATERIAL VEGETAL Para el material biológico se utilizaron semillas de Carica papaya L. cultivar Maradol Roja
certificadas de la marca comercial Semillas del Caribe ®, Especialistas en Papayas S.A
de C.V., las cuales fueron germinadas en medio sólido bajo condiciones controladas
dentro de un cuarto de cultivo. El medio sólido consiste de un compuesto de Hortipearl,
Sunshine 3, Vermiculita y Peat moss en proporción 2:4:2:2. Las primeras plantas se
obtuvieron aproximadamente 15 días después de haber iniciada la etapa de germinación.
Las plantas fueron crecidas bajo condiciones controladas a un fotoperiodo de 16 hrs luz y
a una temperatura oscilante entre los 24-27°C. Plantas de 3 meses y de alrededor de
45cm de altura fueron seleccionadas para el tratamiento de estrés hídrico.
Cabe señalar que las plantas empleadas para la medición del metabolismo secundario no
pertenecen al mismo lote utilizado para el capítulo II, puesto que las plantas a la
mencionada edad de 3 meses no poseen suficiente cobertura foliar como para realizar la
toma de muestra de todos los parámetros con la misma planta.
De manera similar al capítulo anterior, el tratamiento de sequía consistió en la ausencia
de riego para cada planta tomando la medición del estrés durante los días 0, 6 y 12.Para
cada punto de estrés se utilizó tres réplicas experimentales.
Después de la recolección de hojas para cada punto de estrés, las hojas fueron
maceradas en un mortero con ayuda de nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C hasta el
momento de liofilización. Para el transporte y manejo de las muestras, estas fueron
liofilizadas durante 4 días hasta alcanzar la pérdida total de agua.
3.2.2. EXTRACCIÓN DE MUESTRAS La extracción de los metabolitos se realizó a través del método conocido como “PLE”
(Pressurized Liquid Extraction) mediante el equipo Dionex ASE 350 (ThermoFisher,
Waltham, MA, USA). Una mezcla de etanol al 70% fue degasificada por 40 min y usada
como disolvente de extracción a una temperatura de 120° C, con una presión de1500psi y
tiempo estático de 3 minutos. Las condiciones de extracción fueron basadas en el método
de extracción descrito por Plaza y colaboradores (2016).
57
Se utilizaron celdas de extracción de volumen de 10ml en las cuales por cada extracción
se utilizaron 410mg de muestra Las celdas de extracción utilizadas se observan en la
Figura 3.1. Dentro de cada celda fue colocada por capas la muestra junto con perlas de
vidirio de 5mm de diámetro para así eficientizar la matriz de separación.
Los pasos del procedimiento de la extracción por PLE se describen a continuación: a) la
celda de extracción fue introducida al horno, b) la celda es llenada con disolvente hasta
alcanzar la presión de 1500 psi, c)se aplicó el tiempo de calentamiento, d) se efectuó el
tiempo estático de extracción con la válvulas cerradas e) la celda fue enjugada con
disolvente hasta un volumen del 60% de la celda, f) el disolvente es purgado de la celda
con gas nitrógeno y por úlitimo g) el sistema es depresurizado.
Entre cada diferente extracción se realizó un lavado completo del sistema para evitar
contaminación por arrastre de muestras anteriores. Las muestras fueron preparadas por
duplicado.
Los extractos obtenidos fueron diluidos a un volumen de 50ml empleado el mismo
disolvente de la extracción. Se midió el porcentaje de rendimiento de muestra de cada
punto de estrés tomando el peso seco de la muestra antes y después del método de
extracción. El extracto fue filtrado con filtros PTFE de 0.5micras (VWR International, West
Chester, PA, USA) y almacenado en oscuridad a -20 Celsius hasta el momento de la
separación cromatográfica. No fue requerido un paso de limpieza adicional para la
inyección de muestra a la separación por HPLC.
3.2.3. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Y CARACTERIZACIÓN
DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS El método de separación fue basado en previos estudios de compuestos fenólicos (Plaza
et al., 2016; Plaza et al., 2014) con algunas modificaciones. La instrumentación de la
separación cromatográfica consistió en un equipo HPLC-DAD-ECD. El equipo HPLC
UltimMate 3000 sistema de Dionex (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) equipado con un
degasificador, bomba cuaternaria, autoinjector y un detector de arreglo de diodos (DAD).
El detector electroquímico (ECD) fue instalado justo después del DAD. La columna
58
analítica empleada fue una C18 de la compañía Supelco (150mm x 2.1mm, 2.7um)
(Bellefonte, PA, USA).
Como fase móvil se utilizó Agua con 0.2% de ácido fórmico (Solvente A) y Metanol con
0.2% de ácido fórmico (Solvente B), en un gradiente de elución: 0min 10%B, 0-5min
10%B, 5-10min 30%B, 10-30min 40%B. con un tiempo de post-acondicionamiento de 10
min y un flujo a 300ul/min. El detector DAD empleo la detección de ondas a rango de 280,
350, 370 y 520nm.
El detector ECD consiste en una detección por amperometría, sistema que incluye una
delgada capa de celda de flujo (Bioanalytical Systems Inc., West Lafayette, IN, USA), con
electrodos duales de carbono de 3mm de diámetro y un electrodo de trabajo integrado en
un bloque (peek) (Bioanalytical Systems Inc., West Lafayette, IN, USA).El potencial redox
ECD se midió a 0,6 V frente a Ag / AgCl.
El software Palm Tiempo (frente a 2.3.0.0, Palmsens) se utilizó para recopilar los datos
del detector ECD. La lectura de los cromatogramas así como la integración de picos y
análisis de longitud de onda (DAD) se realizó por medio del software Chromalelon 6.80
(ThermoFisher, Waltham, MA, USA).
3.2.4. IDENTIFICACIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS Para la elucidación estructural de los compuestos fenólicos se llevó a cabo el análisis por
espectrometría de masas mediante el sistema Waters Acquity UHPLC (Waters Corp.,
Manchester, UK), sistema equipado con un detector de arreglo de diodos (DAD) y un
acelerador cuádruple y ortogonal tiempo-de-vuelo en tándem mass espectrómetro Xevo
G2 qTOF con una ionización en electrospray (ESI) (Waters MS Technologies,
Manchester, UK),
El sistema HPLC equipado con una doble bomba de disolvente, un auto-inyector y un
compartimiento con temperatura ajustable para la columna. La instrumentación fue
controlada por el software en Cromatografía de Waters® Empower™. La fase móvil
consistió en agua con 0.5% ácido fórmico (Solvente A) y acetonitrilo con 0.5% de ácido
59
fórmico (Solvente B); las condiciones de separación fueron las mismas que las
mencionadas en la sección 2.3.
El espectro UV-Vis fue medido dentro del rango de 200 a 500 nm. La interfase ESI
operando en modo negativo y el análisis completo de espectros HPLC-qTOF-MS se
obtuvo con de un escaneo entre 50 a 1200 m/z. Todos los análisis se realizaron con
leucina-enkephalina (2ng/uL, 10ul/min) en el Lock-spray monitoreado a 0.1 Hz con un
promedio de 20 escaneos. Se utilizó nitrógeno como gas de desolvatación (1000L/h) a
una temperatura de 300°C.
El espectrómetro de masas fue calibrado utilizando una disolución de formiato de sodio.
La obtención de datos se realizó en modo centroid. Se obtuvo simultáneamente la masa
exacta en energía de colisión alta y baja MSE, en donde E representa la energía de
colisión, se utilizó para obtener una de exploración precisa de los fragmento de masa de
iones precursores. La energía de colisión en la función 1 (baja energía) estaba
desactivada mientras que en la función 2 (alta energía) la energía de colisión fue de 15 a
60 eV.
El análisis de datos de los cromatogramas se realizó con el software MassLynx™ (versión
4.1., SCN 779, Waters Corp., Manchester, UK).
60
3.3. RESULTADOS En este capítulo, plantas de Carica papaya de alrededor de tres meses de edad a partir
del día de germinación fueron sometidas a un tratamiento de estrés hídrico. Durante el
tratamiento las plantas fueron abstenidas de riego con excepción del lote control, el cual
fue regado continuamente a lo largo del experimento. Se tomaron muestras de hojas en
los días del tratamiento: 0 días o control, 6 días (estrés moderado) y 12 días (estrés
severo).
El tejido liofilizado de los diferentes puntos de medición del estrés se utilizó para obtener
perfiles metabólicos de los compuestos fenólicos totales y analizar la relación de los
metabolitos observados con respecto al tratamiento de estrés hídrico.
3.3.1. EXTRACCIÓN DE MUESTRAS Los compuestos fenólicos en muestras de plantas son extraídos por medio de diferentes
estrategias de preparación y extracción, los métodos más comunes son: maceración,
extracción por Soxhlet, extracción asistida por ultrasonido, extracción asistida por
microondas, extracción de fluidos supercríticos, extracción por líquidos presurizados y
extracción acelerada por solvente. La técnica de extracción por líquidos presurizados
“PLE” difiere de otros métodos en que la combinación de su empleo de altas presiones
(3.3 - 20.3 MPa) y temperaturas (hasta 200°C) proporciona extracciones más rápidas (Dai
y Mumper, 2010).
En general PLE utiliza menor cantidad de disolvente en comparación con otras técnicas
de extracción dirigidas a compuestos fenólicos. PLE busca utilizar solventes de baja o
nula toxicidad por lo cual es considerada una técnica de extracción verde. El disolvente de
extracción por lo general consiste en agua a temperaturas superiores al punto de
ebullición pero inferiores al punto crítico, en mezcla con un segundo compuesto que suele
ser: etanol, metanol, ácido acético o ácido fórmico (Dai y Mumper, 2010).
En las metodologías de extracción por PLE de compuestos bioactivos, el elemento clave
en la optimización del método radica en la temperatura de extracción, ya que este
parámetro afecta los pasos del procedimiento. Para la extracción por PLE de compuestos
fenólicos se observa un empleo de temperatura de extracción entre un rango de 90 a 150
61
°C. El flujo y tiempo de extracción son también importantes más son parámetros
secundarios en el proceso de optimización de extracción de un analito (Plaza y Turner,
2015).
Otras ventajas del empleo de PLE en comparación con otras técnicas de extracción
consisten en el manejo de pequeñas cantidades de muestra y en el resultado de menor
cantidad de desperdicios (Plaza y Turner, 2015).
Previo a la extracción de las muestras se elaboraron lotes de 410mg de peso liofilizado en
polvo para un manejo sencillo y homogéneo de la muestra. El extracto total obtenido se
colectó en viales de vidrio, los cuales oscilaba entre un volumen de 23ml de extracto. El
extracto etanólico total presentaba una separación por precipitación de fases en donde la
parte superior era transparente y gradualmente cambiaba a un color verde oscuro y con
aspecto de presentar algunos grumos (Figura 3.2). Las características del color del
extracto fueron iguales en las réplicas de muestras y entre los tiempos de estrés con
excepción del día 12 de sequía. Los extractos del día 12 eran de un color verde menos
intenso, con tonalidades a un color café.
Figura 3.1. Celda de extracción del método de extracción por Agua caliente presurizada
(PLE). Dentro de la celda fue colocada por capas la muestra junto con las perlas.
62
Figura 3.2. Extractos etanólicos totales en los viales de recolección del método PLE , las
muestras corresponden a diferentes puntos de estrés. De izquierda a derecha: Día 12, 6
y 0 de sequía.
Figura 3.3. Matraz aforado con el que se lleva a a un volumen de 50ml los extractos
etanólicos.
63
Después de la extracción las muestras fueron llevadas a un volumen de 50ml mediante un
matraz aforado, adquiriendo un color verde homogéneo como se observa en la Figura 3.3.
Antes de la inyección de muestras al equipo de HPLC, se filtraron 2ml del extracto total a
través de filtros PTFE de 0.5micras. Las muestras fueron almacenadas a oscuridad a -20°
C hasta su manipulación para la separación cromatográfica.
Se calculó el valor de rendimiento de la extracción en promedio para cada muestra entre
los tres tiempos de estrés. El peso seco promedio recuperado después de la extracción
PLE oscila entre 3,5mg/ml de extracto etanólico total (Cuadro 3.1). El cálculo del
rendimiento fue tomado con los datos del análisis de peso seco de la muestra, en donde
se tomo un 1ml del volumen aforado a 50ml y se dejó secar hasta medir la diferencia
arrojada por el peso del extracto completamente seco. Se observa que para el día 12 hay
un menor porcentaje de rendimiento (354 mg/g) y que el mayor valor de rendimiento
corresponde al día control (442 mg/g). Este patrón quizá este relacionado con la menor
concentración de agua disponible en el tejido de papaya para el día 12 en comparación
con los otros dos días.
Cuadro 3.1. Valores de la extracción de compuestos fenólicos totales obtenidos a través
del método por PLE. Recuperación de muestra (mg de peso seco /ml extracto etanólico
total) y Rendimiento de extracción (mg del compuesto en el extracto/ g hoja liofilizada).
Días Media (mg/ml) D.S. mg/g
0 3.628 0.136 442.3780
6 3.407 0.116 415.4472
12 2.990 0.061 364.6341
Si bien no se obtuvieron altos porecentajes (80-100%) o altos valores del rendimiento de
extracción, estos datos no afectan a los resultados puesto que el objetivo de este trabajo
no recae en realizar una optimización método.
64
3.3.2. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA Y CARACTERIZACIÓN
DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS El método de separación fue basado en previos estudios de compuestos fenólicos (Plaza
et al., 2016; Plaza et al., 2014) con algunas modificaciones a las condiciones de gradiente
de elución. Los parámetros que arrojaron la mayor resolución de picos para las muestras
se describen en la sección 3.2.2. Previo a la identificación por espectrometría de masas,
se realizó una clasificación preliminar de los picos obtenidos en el equipo HPLC-DAD-
ECD.
Después del paso de los analitos por la columna C18 una fraccion de la elución pasa al
detector de arreglo de diodos (DAD), mientras que la otra pasa por el detector de captura
de electrones (ECD) simultáneamente. Los resultados de ambos detectores permitieron
una caracterización inicial de los compuestos fenólicos así como su patrón diferencial a
largo del periodo de estrés.
El detector de arreglo de diodos (DAD) fue programado para registrar señales a 280, 350,
370 y 520nm. Los compuestos observados en el cromatograma fueron detectados a una
longitud de onda de 280nm y 350nm. Se detectó un total de 28 compuestos en la suma
de los tres días de estrés hídrico. Los tiempos de retención para cada compuesto pueden
observarse en la Figura 3.4. El cromatograma con diferencias más significativas recae en
el día 12. Los compuestos: 1, 2, 8, 12 y 28 aparecen en el día 12 de estrés pero no son
registrados en los cromatogramas del control y día 6.
El perfil de absorbancia UV-Vis contribuyó a la clasificación de los compuestos fenólicos
en dos familias: Hidroxicinámicos y Flavonoles. Los espectros caracterisiticos de los
compuesots hidroxicinámicos corresponden a los picos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 14,
16, 24 y 26. Los espectros caracterisiticos de los compuestos flavonoles corresponden a
los picos: 7, 10, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27 y 28. El espectro referente al pico 11
no fue resuelto a una de las dos familias debido a falta de resolución en la lectura.
La identificación de los picos a través de los espectros de absorbancia registrados fueron
comparados con los espectros de UV-Vis en bases de datos y bibliotecas del programa
Chromaleon y trabajos donde se estableció un método de cuantificación e identificación
de compuestos fenólicos a través de HPLC acoplado a un detector DAD (Farag et al.,
2013; Oszminanski et al., 2011; Singh et al., 2010; Sakakibara et al., 2003).
65
La visualización y edición de los espectros se realizó a través del programa Chromaleon
v6.8. El perfil cromatográfico señala a una tendencia a que los ácidos hidroxicinámicos
aparecerzcan al inicio de la separación , lo cual indica que los compuestos son de una
polaridad de moderada a alta. Los compuestos flavonoles tienden a aparecer hacia el final
de corrida de la separación (Figura 3.4).
En la figura 3.5. se observa el esquema general del espectro de absorbancia
característico de los compuestos hidroxicinámicos y flavonoles. Los compuestos
hidroxicinámicos se caracterizan por emitir una longitud de onda entre 230 – 330nm. Se
encuentran entre los compuestos más polares de los polifenoles y el esqueleto de su
estructura consiste en un solo anillo aromático. Para estos compuestos, la señal de
espectro de mayor intensidad es la que corresponde al anillo aromático, misma región a la
que se asocia la transición electrónica de la molécula (Andersen y Markham, 2006). En el
ejemplo de la Figura 3.5, A) la señal a 312nm es la correspondiente al anillo aromático del
compuesto. La señal a 227nm corresponde a la emisión de los grupos hidroxilo de la
molécula.
Los flavonoles emiten una longitud de onda entre 300-550 nm y su estructura se
compone por tres anillos aromáticos y en estado natural casi siempre se encuentran
glicosilados (Harnly et al., 2007; Sakakibara et al., 2003).
De acuerdo a Marby et al. (1970), los compuestos de la familia de los flavonoles se
caracterizan por emitir dos señales dentro del espectro de 240 - 400nm. La primera curva
del espectro (300 – 380 nm) corresponde a la absorbancia del anillo B, mientras que la
segunda curva del espectro (240 – 280 nm) corresponde al anillo A del anillo benzoico. En
la Figura 3.5 B) se observa un ejemplo de la absorbancia resgistrada de los compuestos
de la familia de los flavonoles. La señal a 344nm corresponde al anillo B del esqueleto de
los flavonoles el cual suele constar de tres grupos hidroxilo, la señal a un espectro de
264nm corresponde al anillo aromático A de la molécula.
66
Figura 3.4. Perfil cromatográfico por HPLC-DAD a 280nm de hojas de C. papaya bajo
condiciones de estrés por sequía. En el eje de las x: el tiempo de corrida en minutos. En
el eje de las y: detección medida en mili-unidades de absorbancia (mAU). A) día 0 o
control B) 6 días C) 12días.
A
B
C
67
Figura 3.5. Espectro Uv-Vis caracteristicos de los compuestos fenólicos observados en la
detección HPLC-DAD. A) ácidos hidroxicinámicos, 230 – 330nm. B) flavonoles, con señal
a dos bandas, la primera de 230-285 y la segunda de 300-550nm.
El sistema de bombeo dual del HPLC permitio que se registrará la corrida del
cromatograma DAD al mismo tiempo que el cromatograma de la actividad eléctrica de los
analitos a través de la detección del equipo electroquímico (ECD). Los analitos son
separados en la columna analítica del HPLC y en el proceso, las moléculas liberan cargas
de corriente como resultado de reacciones de oxidación o reducción. El sensor
electroquímico del equipo ECD detecta en que momento de la separación cromatográfica
un analito de la mezcla reacciona con el electrodo del equipo. Cada carga de corriente
registrada en el equipo ECD es característica de un analito en particular. La sensibilidad
de ECD permite la identificación de compuestos de carácter antioxidante y permite su
cuantificación en caso de usar estandares internos (Andersen y Markham, 2006).
Las lecturas de amperometrîa del detector de captura de electrones (ECD) (Figura 3.5)
indican la presencia de cuatro o cinco compuestos fenôlicos con actividad antioxidante a
lo largo de los tres puntos de estrês (0, 6 y 12 días). El día de estrés que demuestra más
diferencia en patrón con respecto a los demás puntos es el día 6 de sequía.
68
Del grupo de compuestos clasificados como hidroxicinámicos, aquellos que presentaron
actividad antioxidante en el perfil de amperometría son los correspondientes a los
compuestos 3 (tr= 9.36min) y 24 (tr= 17.13min); mientras que entre los compuestos
clasificados como flavonoles, los compuestos 10 tr= 11.6min), 15 (tr= 13.76min) y 22 (tr=
16.22min) señalan actividad antioxidante.
La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos se encuentra en gran medida
relacionada al número de grupos hidroxilo presentes en la molécula (Cramer et al., 2011).
Los resultados del cromatograma por el equipo ECD en conjunto con el perfil de
absorbancia Uv-Vis, sugieren que los compuestos flavonoles 10, 15 y 22 contienen
alrededor de tres grupos hidroxilo en su molécula.
69
Figura 3.6. Amperograma correspondiente al análisis HPLC-ECD señalanado la actividad
antioxidante en hojas de C. papaya bajo condiciones de estrés por sequía. En el eje de
las x: el tiempo de retención en minutos. En el eje de las y: el voltaje de corriente en
microampers (uA). A) día 0 o control B) 6 días y C) 12días
A
B
C
70
3.3.3. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Se realizó una identificación tentativa de compuestos fenólicos en hojas estresadas de
Carica papaya a 0, 6 y 12 días de una exposición a estrés hídrico. La columna C18
utilizada para la separación cromatográfica en el equipo HPLC-DAD-ECD fue la misma
que se manipuló para esta sección. La determinación de los analitos se logró a través del
método cromatográfico HPLC-ESI-qTOF-MS, con la suma de resultados de de la
comparación de tiempos de retención, espectros de absorbancia UV-Vis, masa molecular
exacta de las moléculas deprotonizadas y el patrón de fragmentación de los iones de la
molécula.
Se utilizó el cromatograma de iones totales (TIC) para la medición de abundancia relativa
de cada analito. Nuestro método registró un total de 18 compuestos en los
cromatogramas de los tres tiempos de estrés, de los cuales 10 picos fueron resueltos y
caracterizados (Cuadro 3.2). Los compuestos de la familia de hidroxicinámicos
tentativamente identificados son: ácido caffeoylmálico, ácido p-coumárico, ácido
feruloylmálico y ácido p-coumaroylmálico. Los compuestos de la familia de los flavonoles
tentativamente indentificados son: kaempferol-3-O- glucopiranosido, quercetina-3-O-
rutinosido (rutina), un derivado glicosilado de quercetina y kaempferol-3-O-rutinosido
(nicotiflorina).
El resultado de los valores masa/ratio así como el patrón de fragmentación de iones de
los picos obtenidos del equipo fueron comparados con los valores disponibles en la base
de datos HMBD (The Human Metabolome Database) (Wishart et al., 2013) y la biblioteca
de espectrometría de masas proporcionada por Waters (versión 4.1. Manchester, UK).
Asímismo se utilizó como referencia las tablas de identificación publicadas de compuestos
fenólicos reportados en diversas especies vegetales (Gong et al., 2016; Plaza et al., 2016;
Lin et al., 2014; Farag et al., 2013; Oszmianski et al., 2011; Regos et al., 2009; Seeram et
al.,2006; Schütz et al., 2004).
La caracterizacion de los compuestos 1, 4, 5, 7 y 8 fue resuelta gracias a la comparación
de nuestro análisis con antecedentes de C. papaya en la literatura (Gogna et al., 2015;
Spinola et al., 2015; Julianti et al., 2014; Afzan et al., 2012; Canini et al., 2007).
71
La señal de los diez picos caracterizados aparecen en el cromatograma a partir de los 7 a
11.5 min. El orden de separación de nuestros compuestos es similar al observado en el
trabajo de Afzan y colaboradores (2012).
El compuesto 2 (tr = 8.107 min) fue tentativamente caracterizado como un derivado
glicosilado de quercetina de acuerdo a su masa isotópica de 755.2188 m/z y su patrón de
fragmentación de iones 300, 271, 255. El valor de su masa así como el valor de parte de
los fragmentos de la molécula coinciden con el compuesto quercetina-3-O-
glucopiranosido o también denominado Manghaslin (Spinola et al., 2015; Julianti et al.,
2014). Sin embargo hace falta mayor resolución del cromatograma para asegurar que se
trata de este compuesto.
El compuesto 9 (tr = 9.914min) apunta ser específico al punto de estrés de 6 días, y el
compuesto 10 (tr = 11.472min) específico al punto de estrés del día 12. Ambos
compuestos aún no han sido identificados debido a la falta de resolución de la separación
cromatográfica, más sin embargo en el Cuadro 3.2 se describen algunas de sus
caracteristicas anotadas después del análisis de datos.
En la Figura 3.7. se ilustra la ruta del patrón fragmentación de los compuestos
tentativamente identificados como: A) Ácido caffeoylmálico, B) Kaempferol 3-O-
glucopiranosido, C) Ácido p-coumárico, D) Ácido feruloylmálico, E) Rutina y F)
Nicotiflorina. La reconstruccion de la molécula fue elaborada por el software MassLynx™
v. 4.1, y la graficación de moléculas realizada a partir de la plataforma ChemDraw. El
patrón de fragmentación confirma la localización de los grupos hidroxilo y posición de los
glicosidos en los compuestos flavonoles, datos que subsecuentemente refuerzan la
identificación del compuesto.
En el espectro de MS, el compuesto 2 (tr= 8.107min) exhibió un ion molecular protonado
[M – H]- a un 755 m/z con fragmentos a 300 m/z, 271 m/z y 255 m/z, valores que son
característicos al de un flavonol O/C-glicosilado; más sin embargo no se logró determinar
la posición exacta de los grupos glicosilados al esqueleto del flavonol, a lo cual su
nomenclatura queda establecida como un compuesto glicosilado derivado de quercetina.
El compuesto 6 (tr = 9.104min) caracterizado como ácido p-coumaroylmálico presenta una
masa isotópica de 279..0579 m/z y fragmentación de iones a 163, 133 y 119 que van de
72
acuerdo con los valores reportados en el trabajo de Afzan y colaboradores (2012). Este
compuesto es el único en el cual se observa una variación entre los tratamientos de
estrés, aparece en el cromatograma correspodiente al día 0 y 6 pero su señal no se
registra en el día 12 de estrés hídrico. El resto de los compuestos fenólicos se observan
presentes en los tres puntos de medición de estrés: 0, 6 y 12 días; por lo que no se
observa una relación aparente con los efectos de estrés hídrico.
A pesar que en el Cuadro 3.2 se describe el análisis de únicamente 10 picos, en las
lecturas de cromatogramas se observan picos adicionales, algunos de ellos apareciendo
en forma de “shoulders” encima de otros picos. Sin embargo estas señales no pudieron
ser caracterizadas con más detalle debido a su baja resolución, pero sí nos sugieren que
los 10 picos identificados no son los únicos relevantes.
Los cromatogramas obtenidos del equipo HPLC-qTOF-MS no salieron como a lo
esperado y el patrón de separación así como número de picos no es exactamente igual al
observado en el equipo HPLC-DAD-ECD (Figura 3.4 y 3.6). La correlación entre ambos
equipos se basa principalmente en las similitudes de los valores de espectros Uv-Vis. De
modo que la correlación entre los tiempos de retención (HPLC-DAD-ECD) y la
identificación de masas (HPLC-qTOF-MS) no es la más fiable. Para corroborar la fidelidad
de los resultados, se espera repetir la confirmación de datos mediante la repetición de
lectura de muestras empleando las mismas condiciones pero manejando otro equipo y
columna analítica.
Cuadro 3.2.Caracterización de compuestos fenólicos de las muestras de hojas de C. papaya sometidas a un estrés por sequía (0d,
6d y 12d) analizadas por HPLC-ESI-QTOF-MS.
ID Rt (min) Compuesto propuesto UV-Vis (nm) [M-H] (m/z) Error (mDA) Fórmula
Masa Monoisotopica (Da) Fragmentos (m/z) 0d 6d 12d
1 7.304 Ácido Caffeoylmalico 230, 328 295.0536 7.3 C13 H12 O8 296.230 179, 133, 115 X X X 2 8.107 Quercetin derivado 255, 353 755.2188 -9.8 C41 H40 O14 756.7479 300, 271, 255 X X X
3 8.673 Kaempferol 3-O-
Glucopiranósido 264, 320,
349 739.2266 16.3 C33 H40 O19 740.6593 284,255, 163,119 X X X 4 8.85 Ácido p-coumárico 230, 313 163.0578 7.0 C9 H8 O3 280.2302 163, 119
X X X
5 8.934 Rutina 230, 255, 354 609.1486 17.2 C27 H30 O16 610.153381
300; 271, 255, 179, 151 X X X
6 9.104 Ácido p-Coumaroylmalico 230, 309 279.0579 0.0 C13 H12 O7 280.2302 163, 133, 119 X X 7 9.442 Ácido feruloylmálico 238, 328 309.0704 7.3 C14 H14 O8 310.256 193, 133, 115
X X X
8 9.605 Nicotiflorina 232, 265, 332 593.1662 15.6 C27 H30 O15 594.5181
309, 285, 255, 193, 134 X X X
9 9.914 No identificado 226, 350 767.3962 - - - 651, 607,370,285,
133
X
10 11.472 No identificado 242, 312, 410 675.2891 - - -
643, 599, 557, 319, 152
X
74
75
76
Figura 3.7. Patrón de fragmentación de los compuestos identificados por HPLC-ESI-QTOF-MS
a [M-H]. Con flechas se indica la ruta tentativa de rotura de la molécula junto con la masa del
fragmento. A) Ácido caffeoylmálico, B) Kaempferol 3-O-glucopiranosido, C) Ácido p-coumárico,
D) Ácido feruloylmálico, E) Rutina y F) Nicotiflorina. La reconstruccion de la molécula por el
software MassLynx™ v.4.1, edición de moléculas en la plataforma ChemDraw.
77
3.4. DISCUSIÓN
El objetivo de este capítulo consistió en identificar los compuestos fenólicos en hojas
estresadas por un déficit hídrico de Carica papaya y observar si se presentaba una variación en
la presencia de dichos metabolitos a lo largo de los puntos de estrés medidos. Hojas de C.
papaya fueron liofilizadas, las extracciones de los compuestos se realizaron a través de la
técnica por PLE, se llevó a cabo una separación cromatográfica por HPLC con detección por
absorbancia UV-Vis y detector de captura de electrones, se midió la actividad antioxidante y se
caracterizaron los compuestos a través de espectrometría de masas.
El método de extracción ejecutado en este trabajo fue la técnica de extracción por líquidos
presurizados (PLE) considerada una técnica de extracción verde ya que en comparación con
métodos convencionales de extracción, utiliza una menor cantidad de disolvente y extracto
(Jaime et al., 2010). Se decidió hacer uso de la técnica de extracción PLE puesto que sus
condiciones han demostrado resultados positivos en el análisis de compuestos fenólicos en
diversas especies vegetales (Plaza y Turner, 2015). Además es una técnica rápida, sencilla de
operar y los residuos de extracción pueden liberarse a la atmosfera sin daños mayores.
Otra ventaja recae en que las condiciones de extracción para extractos fenólicos por medio de
la extracción PLE maneja condiciones similares, empleando disolvente al 70% etanol y una
temperatura de extracción de 120 a 150°C (Plaza y Turner, 2015; Rajha et al., 2014; Howard y
Pandjaitan, 2008; Chaves et al., 2007). Nuestras condiciones de extracción así como los
parámetros de la separación cromatográfica del equipo HPLC-DAD-ECD fueron basadas en el
trabajo de Plaza et al., (2016) y Plaza et al., (2014). Las condiciones en estos estudios han
sido exitosas para la identificación de compuestos fenólicos en manzana (Malus domestica) y
Myriciaria jaboticaba, una planta cuyo fruto es consumido en Sudamérica.
Los compuestos fenólicos son moléculas de carácter polar, por lo cual su separación requiere
de una partición cromatográfica en fase reversa. Columnas con una fase estacionaria
compuesta con hidrocarburos C18 (n-octadecyl), son las comúnmente empleadas (Iswaldi,
2012). El espectro Uv-Visible permitió la caracterización preliminar de los compuestos en el
equipo HPLC-DAD basándose en los tiempos de retención y patrón del espectro.Los espectros
de absorbancia registrados del detector DAD fueron analizados a 280nm y 350nm 360nm y
520nm por medio del software Chromaleon.
78
Los espectros de absorbancia de los picos registrados fueron comparados con los espectros de
UV en bases de datos y trabajos donde se estableció un método de cuantificación e
identificación de compuestos fenólicos a través de HPLC. (Farag et al., 2013; Oszminanski et
al., 2011; Singh et al., 2010; Sakakibara et al., 2003).
Las propiedades de absorbancia de longitud de onda detectadas en el equipo HPLC-DAD son
las esperadas a compuestos fenólicos. Los resultados del cromatograma de HPLC acoplado al
detector DAD demuestran un total de 28 picos visibles a longitudes de onda de 280 y 350nm
(Figura 3.4). Las caracteristicas de los espectros de absorbancia dividen a los compuestos que
aparecen en el cromatograma en dos familias: Hidroxicinámicos y Flavonoles. Los espectros
caracterisiticos de los compuesots hidroxicinámicos corresponden a los picos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8,
9, 12, 13, 14, 16, 24 y 26. Los espectros caracterisiticos de los compuestos flavonoles
corresponden a los picos: 7, 10, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27 y 28. El espectro
referente al pico 11 no fue resuelto a una de las dos familias debido a falta de resolución en la
lectura.
Algunos de los compuestos presentan mayor intensidad de absorbancia que otros (Figura 3.4)
como por ejemplo los picos de los compuestos 10, 13, 14 y 16. Cabe destacar sin embargo,
que la intensidad de absorbancia no esta relacionada con la concentración del compuesto, esta
característica es únicamente cualitativa a las características estructurales de la molécula. El
equipo cromatográfico HPLC-DAD-ECD cuenta con una bomba dual, lo que permite que una
fracción de la mezcla disolvente y soluto pase por el detector DAD y otra fracción pase al
detector ECD simultáneamente. Los cromatogramas de ambos detectores ocurren al mismo
tiempo, por lo que se puede comparar y correlacionar los tiempos de retencion de ambos
detectores.
El manejo del detector electroquímico ECD nos permitió que del total de compuestos fenólicos
podamos registrar la señal eléctrica característica a un compuesto en específico. Esta señal
representa la actividad electronegativa propia de un compuesto que porta actividad
antioxidante. El manejo de este tipo de detectores de captura de electrones se ha utilizado en
otros estudios para medir la actividad antioxidante de compuestos fenólicos y carotenoides
(Hoyos-Arbeláez et al., 2017, Plaza et al., 2016).
El potencial de oxidación de los compuestos fenólicos fue determinado sobre el principio
cíclico del voltamograma (Plaza et al., 2014). Los picos que aparecen en el amperograma son
el resultado de la oxidación de los grupos hidroxilo del total de compuestos fenólicos en los
79
extractos etanólicos. Los picos de C. papaya ocurren a una potencia de 0.55V. Mismo voltaje
que se ha utiliziado en trabajos anteriores para la determinación de la capacidad antioxidante
de compuesots fenólicos (Plaza et al., 2016; 2014).
Tradicionalmente se emplean ensayos de actividad antioxidante como ABTS y DPPH que
consisten en comparar la actividad del compuesto blanco con la actividad reductiva de un
compuesto conocido (Thaipong et al., 2006). No obstante estos ensayos arrojan la respuesta
antioxidante del total de compuestos en la muestra. Lecturas con un detector electroquímico
permiten asignar la actividad antioxidante a un compuesto específico. En caso de manejar
estandares internos, el detector electroquímico también permiten la cuantificación de la
actividad antioxidante de un compuesto en particular. Desfortunadamente, el método ECD no
brinda suficiente resolución como para identificar individualmente los compuestos (Hoyos-
Arbeláez et al., 2017).
De acuerdo a los resultados de este estudio, cuatro compuestos fenólicos del extracto etanólico
total presentan actividad antioxidante. Dos de estos compuestos tienen un espectro de
absorbancia correspondiente a la familia de los hidroxicinámicos; y los otros dos a la familia de
los flavonoles. El compuesto flavonol número 10 es aquel que demuestra mayor actividad
antioxidante, patrón que se observa en los tres puntos de estrés pero con mayor intensidad en
el día 12. Los compuestos 15 y 22 no demuestran diferencia significativa en intensidad de
actividad a lo largo de los puntos de estrés. El compuesto número 3 es aquel de menor
actividad antioxidante registrada, en particular durante el día 6 de estrés hídrico.
Los efectos por sequía generan la liberacion de radicales libres, un incremento en la
concetracion de compuestos fenólicos sugiere un mecanismo de proteccion para la planta
debido a que la actividad antioxdante de estos compuestos les permite reducir los daños
ocasionados por especies reactivas a oxigeno (Cartea et al ., 2011).
La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos va relacionada al número y posición de
grupos hidroxilo en la molécula. A mayor cantidad de grupos hidroxilo mayor es la actividad
antioxidante (Cartea et al ., 2011). La radiación UV es un efecto ligado a estrés por sequia, su
exposición resulta en un incremento de radicales libres y estrés oxidático en lso diferentes
tejidos de la planta y particularmente en las hojas. Se ha observado que ante la exposición
prolongada a radiación UV y altas temperaturas las hojas incrementan su concentración de
compuestos antioxidantes, entre ellos los fenólicos (Agati y Tattini, 2010).
80
La mayoria de los trabajos que afirman la relación entre los grupos fenólicos, antocianinas y
flavonoides con respecto al estrés abiótico (entre ellos el estrés por sequia) se basan en
estudios sobre la regulación de genes de enzimas que forman parte de la ruta de biosíntesis de
estos metabolitos; por ejemplo la expresión y regulación del gen de la chalcona sintasa, enzima
precursora clave en la síntesis de flavonoides (Savoi et al., 2016).
Flavonoides glicosilados en células epitelialtes de hojas han demostrado tener funciones de
protección ante radiación UV en diversas especies como por ejemplo Arabidopsis thaliana,
Brassica napus, Brassica oleracea, Zea mays (Andersen y Markham, 2006; Harbone y
Williams, 2000). De los compuestos fenólicos, las antocianinas son las que han sido más
estudiadas en relación al estrés abiótico de la planta, con estudios que sugieren que estos
compuestos brindan protección contra factores como radiación UV, luz, salinidad y sequía
(Chalker-Scott, 2002).
Julianti et al., (2014) y Mendiola et al., (2010) realizaron estudios de la actividad antioxidante
total de compuestos fenólicos en hojas de papaya. El total de compuestos registra una
actividad que va de media a alta. Pero no se determino la relación de la actividad ante un
estrés. Mendiola et al., (2010) no caracterizó individualmente cada compuesto pero clasifica a
los compuestos por familias en: ácidos cinámicos, ácidos fenólicos, flavonoles, antocianinas,
flavanonas e isoflavonas. Aquellos con la actividad antioxidante más alta fue el grupo de los
ácidos cinámicos y los ácidos fenólicos. La actividad antioxidante del total de compuestos
fenólicos oscila en los 71.49 ±0.52 ug/ml en valores de EC50 del ensayo DPPH.
La identificación de los compuestos fenólicos presentes en hojas de C. papaya sometidas a un
tratamiento de estrés hídrico se realizó a través del equipo HPLC-ESI-qTOF-MS. El sistema de
medición ESI-qTOF-MS proporciona informacion de masa exacta y permite la medicion de
relaciones isotópicas. En cojunto estas dos propiedades ayudan a determinar la composicion
elemental de la molécula (Rauniyar, 2010). Se decidió utilizar la fuente de ionización (ESI) en
modo negativo ya que este parámetro ha demostrado resultados más eficientes y sensibles
(Nguyen et al., 2015).
Nuestro método resgistró un total de 18 picos en los cromatogramas de ionización total (TIC)
de los tres tiempos de estrés, de los cuales 10 picos fueron caracterizados tentativamente
(Cuadro 3.2). Adicional a la información el equipo, la caracterizacion de algunos compuestos se
baso en la literatura, comparando el patrón de fragmentación, espectro UV-Vis y tiempo y orden
81
de separación. (Gogna et al., 2015; Spinola et al., 2015; Julianti et al., 2014; Afzan et al., 2012;
Gayosso-García Sancho et al. 2011; Canini et al., 2007).
Al igual que los resultados del equipo HPLC-DAD-ECD, los ocho compuestos putativos del
análisis de espectometría de masas pertenecen a la familia de los compuestos
hidroxicinámicos y flavonoles. Los compuestos de la familia de hidroxicinámicos tentativamente
identificados son: ácido caffeoylmálico, ácido p-coumárico, ácido feruloylmálico y ácido p-
coumaroylmálico. Los compuestos de la familia de los flavonoles tentativamente identificados
son: kaempferol-3-O-glucopiranosido, quercetina-3-O-rutinosido (rutina), un derivado glicosilado
de quercetina y kaempferol-3-O-rutinosido (nicotiflorina) (Cuadro 3.2).
El orden de separación de nuestros compuestos es similar al observado en el trabajo de Afzan
y colaboradores (2012). El ácido caffeoylmálico y ácido feruloylmálico han sido previamente
reportados en hojas de C. papaya y se encuentran entre los compuestos más polares del grupo
de hidroxicinámicos (Spinola et al., 2015). Referente a los compuestos de la familia de los
flavonoles, rutina ha demostrado presentar altas concentraciones en hojas y frutos de C.
papaya (Gogna et al., 2015; Julianti et al., 2014; Afzan et al., 2012). Mientas que nicotiflorin ha
sido previamente reportado en hojas de papaya (Julianti et al., 2014 y Afzan et al., 2012).
Los cuatro flavonoles identificados presentan la estructura característica de los flavonoides
(Figura 1.5) y además la molécula tiene secciones glicosiladas. Los flavonoides en la
naturaleza se encuentran principalmente de manera glicosilada (Agati y Tattini, 2010). En
Arabidopsis la acumulación de flavonoles es diferente de acuerdo al tipo de tejido, entre ellos
los derivados de Kaempferol se encuentran principalmente en hojas, tallos y flores (Yonekura-
Sakakibara et al., 2008).
Ninguno de los ocho compuestos caracterizados demuestra tener una variación en presencia o
ausencia en relación con los efectos de estrés hídrico, con excepción del compuesto 6 (tr =
9.104 min) identificado tentativamente como ácido p-coumaroylmálico. Este compuesto es el
único en presentar una variación entre los tratamientos de estrés, aparece en el cromatograma
correspodiente al día 0 y 6 pero su señal no se registra en el día 12 de estrés hídrico; por lo
que se sugiere puede ser un factor de referencia química al estrés por sequía en sus primeras
etapas.
Los compuestos hidroxicinámicos y flavonoles identificados en esta sección no han sido
previamente relacionados con mecanismos de defensa contra estrés abiótico en papaya. Hasta
82
nuestro conocimiento, en hojas de papaya se han realizado estudios en relación a las
condiciones de estrés abiótico y biótico e incluso actividad antioxidante de sobre los
compuestos fenólicos y/o flavonoides. Sin embargo estas observaciones engloblan a todo el
grupo de compuestos y sin realizar análisis a nivel de compuesto específico como es el caso
de Zhou et al. (2010).
Si bien no hay diferencia siginifcativa entre los puntos de estrés hídrico (0, 6 y 12 días) con
respecto a los compuestos fenólicos, existe la posibilidad que la variación de los compuestos
radique en su valor de concentración. Para descartar esta opción se necesitaría de un análisis
cuantitativo cuya sensibilidad permita registrar individualmente cada compuesto. Existen
reportes en diferentes especies vegetales donde las condiciones de un déficit hídrico de
intensidad moderada a severa conllevan a un incremento en la concentración de compuestos
fenólicos (Varela et al., 2016; Savoi et al., 2016; Grieser et al., 2015; delValle et al., 2015).
La resolución de los picos en el cromatograma del equipo HPLC-qTOF-MS no resultó ser la
más sencilla. Durante la separación, la columna analítica C18 presentó fugas de la fase
sólida. Se infiere que a consecuencia de estas fallas técnicas, algunos picos del cromatograma
se encontraban superpuestos y/o el ancho del pico carecia de alta resolución. Tampoco se
descarta la posibilidad que los erroes sobre la columa analítica hayan sido a causa de fallas de
presión en la bomba del equipo. Esto se ve reflejado en falta de caracterización de los
compuestos 9 y 10 (Cuadro 3.2), y en el sobrelapamiento de picos observado en los
cromatogramas de los tres tiempos de estrés.
83
3.5. CONCLUSIONES La extracción de líquidos presurizados PLE es una técnica satisfactoria para la extracción de
compuestos fenólicos de hojas de C. papaya.
Los extractos etanólicos de hojas de C. papaya se caracterizaron por la presencia de dos
familias: Hidroxicinámicos y Flavonoles
El equipo cromatográfico HPLC-DAD-ECD detectó un total de 28 picos visibles a longitudes de
onda de 280 y 350nm, de los cuales cuatro compuestos presentan actividad antioxidante.
En el equipo HPLC-ESI-qTOF-MS fueron caracterizados tentativamente ocho compuestos
fenólicos: ácido caffeoylmálico, ácido trans-p-coumárico, ácido feruloylmálico y ácido p-
coumaroylmálico, : kaempferol-3-O-glucopiranosido, rutina, un derivado glicosilado de
quercetina y nicotiflorina.
Solo el ácido p-coumaroylmálico presenta una variación entre los tratamientos de estrés, con
lecturas registradas en el día 0 y 6 de estrés hídrico.
84
85
CAPÍTULO IV. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES GENERALES
4.1. DISCUSIÓN GENERAL El objetivo del presente trabajo consistió en caracterizar y evaluar el daño en el tejido foliar
ocasionado por estrés hídrico e identificar los diferentes compuestos fenólicos encontrados a lo
largo del estrés.
El déficit hídrico es un factor determinante en la productividad de plantas y acumulación de
biomasa. (Jaleel et al., 2009). Para evitar los efectos ocasionados por el estrés, las plantas
activan mecanismos de defensa que les permiten resistir la ausencia de agua. En nuestros
resultados: el incremento en los niveles de prolina puede referirse a la acción de un mecanismo
dirigido a mantener la presión de turgencia de las células a consecuencia de la disminución de
agua como reflejan los resultados del contenido relativo de agua. Si el porcentaje del contenido
relativo de agua llegase a menos del 50%, se considera que la planta alcanza niveles de daño
críticos (punto de marchitez permanente) causando posiblemente daños irreversibles a la
fisiología de la planta (Bertolli et al., 2013; Lawlor y Cornic, 2002).
Queda claro que tras el estrés hídrico al cual las plantas de papaya fueron sometidas,
ocurrieron daños significativos en las hojas de la planta. Esta condición es respaldada por los
resultados observados en la disminución del contenido relativo de agua, y aumento de
concentración de prolina. Los efectos más significativos del estrés por sequía en hojas de
papaya ocurren durante el periodo del día 8 a 12.
Para los días 5 y 8 se observa un incremento moderado de la concentración de prolina (Figura
2.4), dado que las plantas de estos dos puntos sobrevivieron tras la rehidratación y añadiendo
la información en la literatura del mecanismo de acción de prolina, se infiere que el incremento
en concentración de prolina tuvo un efecto positivo en hojas de papaya y auxilio a la
supervivencia de la planta. La acumulación de prolina debió de resultar a partir de la necesidad
causada por el estrés oxidativo. El estrés oxidativo continúo para el día de estrés 12, al igual
que el incremento en concentración de prolina. Si tras la rehidratación la planta no sobrevivió
quizá esto se deba a que el estrés superó las capacidades de defensa de prolina y su cascada
de señalización. El exceso de concentración de prolina podría tener efectos de toxicidad a nivel
celular, sin embargo esto hasta ahora no ha demostrado efectos nocivos en organelos como
mitocondria y cloroplasto (Borgo et al., 2015).
86
El contenido de prolina en plantas es de vital importancia para su supervivencia ante un estrés
hídrico debido a que en hojas estresadas tiene tres funciones destacadas: actúa como
osmoprotector, como compuesto antioxidante y molécula señal (Hayat et al., 2012).
Las propiedades de la prolina como osmolito compatible permiten que su concentración en la
planta facilite la entrada de agua a la célula. De esta manera, se mantiene la integridad celular
reduciendo la pérdida de agua así evitando que las proteínas sean desnaturalizadas. La prolina
también posee actividad antioxidante para disminuir los efectos negativos de las especies
reactivas a oxígeno. A mayor exposición al estrés, mayor es el estrés oxidativo (Das y Pandey,
2010). Para la célula es muy importante controlar los efectos de las especies reactivas a
oxígeno puesto que pueden llevar a la planta al proceso de muerte celular programada. Esta
propiedad ha sido caracterizada en un gran número de especies vegetales (Liang et al., 2013).
La señalización generada por la prolina induce la biosíntesis de ABA, calcio y fosfolipasa y
también promueve la activación de ciertos genes específicos como los factores de transcripción
NAC, WRKY, bZIP, MYB, etc., que en conjunto desenvuelven funciones que aumentan la
probabilidad de supervivencia a la planta (Szabadso y Savoure et al., 2009). También se ha
descrito a la prolina con funciones de molécula chaperona ya que se ha observado que a altas
concentraciones disminuye la agregación de proteínas en la célula y reducción la
termodesnaturalización de proteínas (Liang et al., 2013).
La expresión del gen TGA1 de la familia bZIP ha sido analizada bajo diferentes condiciones
relacionadas al estrés abiótico y biótico (Gatz, 2013, Guedes-Correa et al., 2010). El trabajo
aquí presentado del gen CpTGA1 es el primero realizado en C. papaya que dirige su
funcionalidad hacia la respuesta ocasionada por un estrés hídrico. Los resultados del perfil de
expresión indican que cuanto mayor es el efecto de estrés en hoja, mayor es la expresión del
gen CpTGA1 (Figura 2.8). El factor de transcripción CpTGA1 responde al estrés hídrico, por lo
que entre sus funciones podría estar involucrado mecanismos de tolerancia que contrarresten
los daños ocasionados por este estrés en C. papaya. Sin embargo aún falta por demostrar si
realmente el gen CpTGA1 desempeña alguna función de tolerancia hacia el estrés hídrico en
papaya.
Se comprobó por secuenciación que el gen CpTGA1 corresponde a la predicción realizada a
partir del genoma de Carica papaya. Asimismo, el análisis bioinformático señalo que el factor
de transcripción CpTGA1 posee alto grado de similitud con AtTGA1. Existen antecedentes
donde se observa que al tener dos secuencias homólogas altamente similares
87
estructuralmente, significa que comparten funciones similares entre diferentes especies
(Golldack et al., 2014). Por ejemplo, en un estudio de interacciones metabolómicas y
transcriptómicas en Arabidopsis, AtTGA1 demostró tener una regulación en estrés abiótico y la
biosíntesis de flavonoides (Lv et al 2014). De tal manera que existe la posibilidad que CpTGA1
tenga funciones similares a las observadas en AtTGA1 de Arabidopsis.
Con nuestros resultados; más los antecedentes en Arabidopsis de AtTGA1 y AtTGA4 (Zhong et
al., 2015; Alvarez et al., 2014), se sugiere que la función de CpTGA1 actúa en respuesta de
tolerancia ante un estrés hídrico. Para determinar certeramente la función de CpTGA1, queda
como perspectiva a trabajos a futuro generar mutantes sobre-expresantes del gen a través de
transformación por biobalística de embriones somáticos de papaya y comparar su desempeño
ante el estrés con la variedad silvestre.
La determinación de la severidad de un estrés abiótico en plantas es típicamente caracterizada
por experimentos que midan la respuesta fisiológica, bioquímica y/o molecular; sin embargo
cada vez hay más evidencia que demuestra que la presencia y concentración de metabolitos
específicos actúan en respuesta como mecanismo de tolerancia al estrés por sequía.
Trabajos anteriores del perfil metabólico de Arabidopsis durante un estrés hídrico afirman que a
consecuencia de la acumulación del ácido abscísico, incrementa la concentración de
aminoácidos, azúcares, carotenoides y flavonoides (Urano et al., 2009). En el estudio realizado
por Celeste-Varela et al. (2016) se realizaron correlaciones entre la presencia de compuestos
fenólicos y el daño oxidativo durante temporadas de secas en Larrea divaricata de la familia
Zygophyllaceae, una especie de arbusto típico de zonas semiáridas de la Patagonia. En el
análisis multivariado se observó que a mayor concentración de prolina, mayor actividad
antioxidante entre los fenólicos totales en las raíces de L. divaricata.
Se han descrto otras propiedades de los compuestos fenóilcos en relación a una respuesta por
estrés hídrico, como función en neutralizar los radicales libres de lípidos y prevenir conversción
de radiales libres a apartir de la descomposición hidro peróxidos (Li et al., 2006). Gulen y Eris
(2004) también afirman que la acumulación de estos metabolitos es un mecanismo de defensa
que las plantas llevan a cabo para que la pérdida de agua no repercuta severamente sobre el
metabolismo celular.
Una de las ventajas que podría resultar de la acumulación de grupos fenólicos durante periodos
de sequía en papaya, es el aprovechamiento de las propiedades antioxidantes de los
88
compuestos en las hojas como valor agregado a un cultivo que se maneja exclusivamente para
la comercialización del fruto. Por esta razón, es primeramente necesario evaluar el potencial
de las hojas de papaya como fuente de compuestos fenólicos durante periodos de sequía. La
capacidad antioxidante es una importante propiedad de estos metabolitos, su función
contribuye a disminuir los efectos de las especies reactivas a oxígeno y reduce el daño celular
(Agati y Tattii, 2010).
En otras especies vegetales, se han realizado estudios sobre la naturaleza y concentración de
los compuestos fenólicos ante las condiciones de un estrés hídrico. En cuanto a la respuesta
fisiológica, se ha observado que el valor de la cantidad relativa de agua se correlaciona
negativamente con la cantidad total de compuestos fenólicos (Jaafar et al., 2012), alcaloides
(Szabó et al., 2008), y glucosinolatos (Schreiner et al., 2009). De manera que cuanto menor es
el porcentaje del contenido de agua en hojas, mayor es la concentración de compuestos
fenólicos. En Vitis vinifera se ha observado que la producción de compuestos fenólicos
incrementa tras tratamientos de estrés por sequía particularmente de exposición de 6 a 8 días
(Griesser et al., 2015). Durante el tiempo del déficit hídrico se registró un incremento en la
formación de flavonoles glicosilados, entre ellos kaempferol-3-O-glucosilado, cianidin-3-O-
glicosilado, quercetina-3-O-glicosilada y kaempferol-3-O-glucurónido. En concordancia con lo
reportado por Griesser y colaboradores (2015), los flavonoles identificados tentativamente en
nuestro estudio son moléculas glicosiladas.
Se esperaba que los efectos del estrés hídrico reflejaran una variación en el número de
compuestos fenólicos de las hojas de C. papaya. De acuerdo a nuestros resultados, un periodo
de estrés por sequía de 12 días no afecta la biosíntesis y composición de compuestos fenólicos
específicos en planta que todavía no alcanzan su edad de maduración (3 meses a partir de su
germinación). Cabe la posibilidad que de realizar el mismo estudio bajo las mismas condiciones
pero con plantas en estadio de producción de frutos o de un estado de desarrollo más maduro
se observará una diferenciación de los compuestos fenólicos.
A pesar que la identificación de compuestos fenólicos realizada en este trabajo fue únicamente
cualitativa, de haber cuantificado la concentración de compuestos específicos es probable que
un patrón similar de aumento en concentración se presentará así como se reporta en los
antecedentes con otras especies vegetales de climas semi-áridos (Celeste-Varela et al. 2016;
Savoi et al., 2015; Hérnandez et al., 2006; de Abreu y Mazzafera, 2005’ Kirakosyan et al.,
2004). Análisis del contenido de compuestos fenólicos en plantas tropicales son escasos,
89
especialmente estudios que intenten demostrar su correlación de producción ante la exposición
de un estrés abiótico.
No obstante existe en la litertura algunos antecedentes con tejidos de C. papaya que
correlacionan el contenido de compuestos fenólicos con mediciones relacionadas a la
respuesta de un estrés abiótico. Maisarah et al. (2013) midieron la actividad antioxidante del
contenido de compuestos fenólicos totales en diferentes tejidos de C. papaya. De los diferentes
tejidos, las hojas jóvenes fueron las que obtuvieron mayor concentración de compuestos
fenólicos. Los resultados tambiên señalan que a mayor cantidad de compuestos fenólicos,
mayor es la actividad antioxidante.
Otro antecedente es el trabajo de Vuong y colaboradores (2013) donde sus resultados
corroborá que los compuestos fenólicos de extractos de hojas de C. papaya tienen alta
correlación con el perfil de la actividad antioxidante. El estudio clasificó a tres tipos de
compuestos: protoantocianidinas, flavonoides y polifenoles, de los cuales el último grupo es el
que arroja lecturas de mayor actividad antioxidante.
En ambos ejemplos la medición de los compuestos fenólicos es total, no identifica
específicamente cada compuesto. Nuestro estudio identifico tentativamente a cuatro
compuestos hidroxicinámicos y cuatro flavonoles glicosilados. De no haberse presentado las
fallas técnicas en la columna analítica, es probable que la actividad antioxidante del detector
ECD se hubiera podido correlacionar con los cromatogramas del detector DAD y espectometría
de masas.
Si bien no se identificó el total de compuesto fenólicos de los extractos etanólicos por falta de
resolución del cromatograma a consecuencia de las fallas del equipo y la columna analítica, los
metabolitos que se reportan en este estudio son los primeros de un análisis de correlación
durante los efectos de un estrés hídrico en hojas estresadas de C. papaya.
90
4.2. CONCLUSIONES GENERALES
Las hojas de C. papaya respondieron a lo esperado ante la exposición a un estrés hídrico, lo
que corrobora que la planta es capaz de resistir los efectos de estrés gracias a sus
mecanismos de defensa al menos hasta el día 8 de estrés.
Las observaciones morfológicas y los resultados del contenido relativo de agua, contenido de
prolina indican que la planta sufrió daños significativos pero reversibles hasta antes de llegar al
día 12 de estrés.
La expresión génica de CpTGA1 indica que el factor de transcripción responde al estrés
hídrico, por lo que su función(es) se encuentre posiblemente relacionada a los efectos de un
estrés por sequía en C. papaya.
Se caracterizaron compuestos hidroxicinámicos y flavonoles a partir de extractos etanólicos de
hojas estresadas de C. papaya, de los cuales cuatro compuestos presentan actividad
antioxidante.
Se identificaron tentativamente ocho compuestos fenólicos, entre ellos el compuesto
denominado ácido trans-p-coumárico el cual es por primera vez reportado en tejido foliar de C.
papaya.
No se observa una correlación de los compuestos registrados versus el estrés hídrico de un
periodo de doce días con excepción del ácido p-coumaroylmálico.
91
4.3. PERSPECTIVAS
Aún falta por demostrar si el gen CpTGA1 realmente desempeña alguna función de tolerancia
hacia el estrés hídrico en C. papaya.
Desarrollar plantas transgénicas sobre-expresantes del gen CpTGA1 con el fin de conocer las
rutas a las que está relacionado y los cambios de adaptación
Una propuesta para estudiar los cambios fenotípicos que la sobrexpresión de CpTGA1
ocasione, es generar plantas mutantes de Nicotiana tabacum a través de transformación
genética por infección de Agrobacterium tumefaciens. Otra alternativa es la transformación
genética de embriones somáticos de papaya.
Obtener los componentes químicos mayoritarios y minoritarios presentes en hojas de papaya,
examinar sus propiedades como marcadores quimiotaxonómicos y cuantificar los compuestos
fenólicos en cada fase del estrés hídrico.
92
93
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