1

ANALISIS MUTASI GEN CATp PADA BAKTERI Salmonella Typhi YANG RESISTEN TERHADAP KLORAMFENIKOL

ANALYSIS OF CATp GENE MUTATION IN Salmonella typhi BACTERIA WHICH RESISTANT TO CHLORAMPHENICOL

Andi Salsa Anggeraini

P1506211008

KONSENTRASI MIKROBIOLOGI PROGRAM STUDI BIOMEDIK PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR 2013

2

ANALISIS MUTASI GEN CAT P PADA BAKTERI Salmonella Typhi YANG RESISTEN TERHADAP KLORAMFENIKOL

Tesis

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Magister

Program Studi

Biomedik

Disusun dan diajukan oleh

Andi Salsa Anggeraini

kepada

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2013

3

PERNYATAAN KEASLIAN TESIS

Yang bertanda tangan dibawah ini Nama : ANDI SALSA ANGGERAINI Nomor Mahasiswa : P1506211008 Pogram Studi : BIOMEDIK Menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang saya tulis ini benar-benar

merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan pengambilalihan tulisan atau

pemikiran orang lain. Apabila dikemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa

sebagian atau keseluruhan tesis ini hasil nkarya orang lain, saya bersedia menerima

sanksi atas perbuatan tersebut.

Makassar, OKTOBER 2013

Yang menyatakan

ANDI SALSA ANGGERAINI

4

PRAKATA

Bismillahirrahmanirrahim

Assalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh

Segala puji bagi Allah SWT penguasa alam semesta dan syukur Alhamdulliah

kami panjatkan kehadirat Allah SWT , yang telah menurunkan rahmat, hidayah dan

perlindungan-Nya. Serta tak lupa kami mengirimkan salam dan salawat kepada

junjungan kami Nabi besar Muhammad SAW beserta seluruh keluarga dan para

sahabatnya atas selesainya tesis ini.

Latar belakang penelitian ini berdasarkan pada pengamatan penulis terhadap

penggunaan antibiotik yang tak terkendali yang menyebabkan meningkatnya jumlah

kasus resistensi. Kasus resistensi ini juga banyak terjadi pada pasien demam tifoid

diseluruh dunia tak terkecuali Makassar. Jika kasus resistensi tidak mendapat

penanganan yang lebih maka jumlah angka kematian yang diakibatkan oleh demam

tifoid semakin meningkat.

Banyak kendala yang dihadapi oleh penulis dalam rangka penyusunan tesis ini,

yang hanya berkat bantuan berbagai pihak, maka tesis ini dapat diselesaikan.

Ungkapan yang tulus dan penuh rasa hormat pertama-tama penulis sampaikan

kepada Mama dan Papa tercinta yang telah memberi dukungan moril kepada

penulis sehingga dapat dapat menyelesaikan tesis ini.

Dalam kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-

besarnya dan sedalam-dalamnya kepada Prof.dr.Mochammad Hatta, SpMK, Ph.D

5

selaku Ketua Komisi Penasehat yang telah menyediakan waktu, tenaga dan pikiran

disela –sela kesibukan beliau untuk membimbing dan memberi dorongan demi

penyelesaian pendidikan saya dan Prof.Dr.dr.Asa’ad Maidin,MSc, SpMK selaku

Anggota Komisi Penasihat.

Ucapan terimakasih selanjutnya kami sampaikan kepada Prof.dr.Rosdiana

Natzir, Ph.D, Dr.dr.Khaerani Rasyid, MKes, SpPD, KGH,SpGK, dan

dr.Rahmawati Minhajat,SpPD, Ph.D selaku penguji yang telah memberikan

masukan dan saran demi kelengkapan tesis ini.

Terima kasih yang tak terhingga penulis haturkan kepada Pak Markus yang

telah sabar dan banyak membantu peneliti di laboratorium, kak Romi Usman yang

telah banyak berpartisipasi dalam penelitian ini, dan Pak Mus.

Terima kasih juga kepada Dr.Irwan Akib, S.Pd, M.Pd selaku Rektor

Universitas Muhammadiyah, Ir. Muh Syaiful Saleh M.Si selaku Ketua BPH

Universitas Muhammadiyah Makassar dan dr. Mahmud Ghaznawie, SpPA (K),

Ph.D selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Makassar, dan

kepada Pembantu Rektor 1,2,3 dan 4. yang telah memberikan ijin kepada penulis

untuk melanjutkan Sekolah dan memberikan dukungan materiil sehingga penulis

dapat menyelesaikan studinya.

Tak lupa penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya buat

Prof.dr.Budu,SpM,KVR,Ph.D, MMed yang selalu memberikan dorongan moril

kepada Penulis untuk melanjutkan kuliah.

Akhirnya ungkapan terima kasih, penghargaan yang setinggi-tingginya penulis

sampaikan kepada suami tercinta dr.Agussalim Bukhari,Ph.D yang telah memberi

dorongan dan semangat hingga akhirnya penulis dapat menyelesaikan tesis ini serta

6

kedua anak-anakku, Muhammad Rais Buana Sakti dan Nabila Azzahra. Terima

kasih telah menjadi anak-anak yang baik dan tidak merepotkan selama ini.

Kepada seluruh pihak yang tidak sempat disebutkan satu persatu dalam

menyelesaikan tesis ini, semoga Allah SWT Yang Maha Pengasih dan Maha

Penyayang senantiasa melimpahkan karunia dan Rahmat-Nya.

Wassalamualaikum Wr Wb,

Makassar, Oktober 2013

Andi Salsa Anggeraini

7

8

9

DAFTAR ISI

Halaman Pengajuan ii

Halaman Persetujuan iii

Prakata iv

Abstrak vii

Abstract viii

Daftar Isi ix

Daftar Tabel xii

Daftar Gambar xiii

Daftar Lampiran xiv

BAB 1 PENDAHULUAN 1

A. Latar Belakang 1

B Rumusan Masalah 4

C Tujuan Penelitian 4

D Manfaat Penelitian 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. DEMAM TIFOID 5

DEFINISI 5

EPIDEMIOLOGI 5

GEJALA KLINIS 5

B. SALMONELLA TYPHII 6

C. UJI DIAGNOSTIK SALMONELLA TYPHII 8

D. KLORAMFENIKOL 9

E. GEN CATP 10

F. PCR 11

10

G UJI SENSITIFITAS METODE KIRBY-BAUER 14

BAB III KERANGKA KONSEP 17

BAB IV METODE PENELITIAN 18

A. RANCANGAN PENELITIAN 18

B. TEMPAT DAN WAKTU 18

C. POPULASI 18

D. KRITERIA INKLUSI DAN EKSKLUSI 18

E. SAMPEL PENELITIAN 19

F. ALAT DAN BAHAN PENELITIAN 19

G. LANGKAH KERJA 21

Pencatatan 21

Penilaian Klinis dan Laboratorium 21

Pengambilan spesimen 21

Isolasi DNA 21

DNA sequencing method 22

Elektroforesis hasil PCR 23

H. IDENTIFIKASI VARIABEL 24

I. ALUR PENELITIAN 25

J. DEFINISI OPERASIONAL 26

K. ANALISA DATA 26

L. IJIN PENELITIAN DAN ETHICAL CLEARANCE 26

11

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 27

A. HASIL 27

B. PEMBAHASAN 34

BAB V I PENUTUP 37

A. KESIMPULAN 37

B. SARAN 37

DAFTAR PUSTAKA 38

LAMPIRAN

12

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

Tabel. 1 Salmonella spp pada media gula 8

Tabel. 2 Tes Biokimia Salmonella spp 9

Tabel 3 Interpretasi Zona Penghambatan Uji Kultur 16

Tabel 4 Tabel Hasil Uji Sensitifitas Salmonella typhii 31

Tabel 5 Tabel ekspresi mutasi gen CAT P pada Salmonella

Typhii yang resisten dan Sensitif 33

13

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

Gambar. 1 Skema Mekanisme Kloramfenikol 10

Gambar. 2 Mekanisme inaktivasi kloramfenikol 10

Gambar. 3 Skema Tahap PCR 13

Gambar 4 Plat Kirby Bauer 15

Gambar 5 Ilustrasi Uji Sensitivitas 16

Gambar 6 Isolat Salmonella typhii negatif 27

Gambar 7 Isolat Salmonella typhii positif 28

Gambar 8 Media TSIA 28

Gambar 9 Tes TSIA Positif 29

Gambar 10 Uji Sensitifitas Positif 30

Gambar 11 Uji Sensitifitas Negatif 30

Gambar 12 Ekspresi Gen CAT P Positif 32

Gambar 13 Ekspresi Gen CAT P Negatif 33

14

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Reverse Primer Product PCR

Lampiran 2 Forward Primer Product PCR

Lampiran 3 Synthetic construct trap vector for isolation of bacterial IS elements, aminoglycoside-3:adenyltransferase(aadA), neomycin phosphotransferase (neo), chloramphenicol acetyl transferase (cat), beta-lactamase (bla) genes, complete cds

15

BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Demam tifoid merupakan masalah kesehatan didunia terutama di negara

berkembang seperti yang ditemukan secara endemik di seluruh Afrika, Amerika

Selatan, Asia Timur dan khususnya di Asia Selatan . Tifoid merupakan penyakit

sistemik akut yang disebabkan oleh infeksi Salmonella typhi berbagai serovars.

(Haque A et al.,2005)

Diperkirakan setiap tahun terdapat lebih dari 20 juta kasus demam tifoid, yang

mengakibatkan 700.000 kematian di seluruh dunia . Di negara maju, angka kasus

kejadian dan kematian telah jauh menurun hal ini disebabkan oleh kombinasi dari

peningkatan sanitasi dan kebersihan, vaksin, dan terapi antimikroba yang efektif.

(Mirza et al., 2000). Dua hal pertama sulit bahkan tidak mungkin untuk diterapkan di

negara berkembang, dan sayangnya efektivitas terapi antimikroba juga menjadi

terkikis oleh munculnya resistensi antibiotik di negara berkembang, antibiotik yang

paling tersedia untuk pengobatan tifoid adalah kloramfenikol, ampisilin, dan

kotrimoksazol.( Mirza et al., 2000)

Dengan jumlah penduduk yang lebih kurang 224.904.900 dan luas wilayah 8,3

juta km2 dan mempunyai 17.504 pulau , Indonesia memiliki angka kematian akibat

infeksi tifoid lebih tinggi daripada di negara-negara lain di Asia Tenggara selain

Papua New Guinea dan menjadi masalah kesehatan utama. (Hatta et al., 2007).

Prevalensi di Indonesia pada tahun 2007 adalah 358 sampai 810 per 100.000 atau

kira-kira sekitar 64% penduduk Indonesia menderita demam typhoid dalam kurun

waktu 3 sampai 19 tahun . Tingkat kematian bervariasi antara 3,1-10,4% dalam

kurun waktu sepanjang tahun.(Hatta et al., 2008)

16

Sulawesi adalah salah satu dari lima pulau terbesar di kepulauan Indonesia dan

memiliki populasi 42.708.400 , prevalensi penderita demam tifoid di Selatan-Sulawesi

merupakan salah satu yang tertinggi , rate untuk kasus tahun 1991 adalah dari 100

ribu penduduk 257 orang penduduk terkena demam typhoid dan pada tahun 2007

menjadi meningkat menjadi 386 per 100 ribu penduduk. Demam tifoid merupakan

salah satu penyakit endemik di Sulawesi selatan dan merupakan empat penyakit

infeksi tersering yang dilaporkan dari 24 kabupaten di Sulawesi Selatan. Tifoid dapat

menyebabkan septikemia, dan dilaporkan insiden rata-rata sekitar 2.500 per 100.000

penduduk. (Hatta et al., 2007)

Sebelum tahun 2001 tingkat resistensi antibiotik pada Salmonella Typhi yang di

laporkan dari Indonesia khususnya Sulawesi selatan sangat rendah yaitu kurang

dari 1% dan kloramfenikol tetap menjadi obat pilihan, namun sejak tahun 2001

resistensi telah meningkat dan pada tahun 2007 sekitar 6,8% dari isolate salmonella

typhii telah resisten terhadap ketiga obat lini pertama yaitu: ampicillin, kloramfenikol,

dan kotrimoksazol. (Hatta et al., 2007). Resistensi beberapa obat (MDR) merupakan

masalah utama dalam pengendalian dalam kasus tifoid, karena dikaitkan dengan

peningkatan morbiditas yang mengarah ke toksisitas demam tifoid yang dapat

mengakibatkan angka kematian meningkat secara signifikan. (Haque A et al., 2005)

Resistensi obat pada demam tifoid ini merupakan suatu hal yang serius di

Indonesia , karena dibutuhkan obat pengganti yang cukup mahal untuk terapi tifoid.

Sebuah usaha serius diperlukan dengan pelayanan medis untuk mendapatkan

diagnosis yang benar sehingga pengobatan atau vaksinasi dapat digunakan untuk

mengendalikan penyebaran resistensi obat-obatan tifoid ini. (Hatta et al., 2008)

Resistensi Plasmid-encoded kloramfenikol pertama kali dilaporkan tahun

1970, dengan peningkatan jumlah resistensi di Amerika Tengah. (Mirza et al., 2000) .

Mekanisme resistensi terhadap kloramfenikol ada tiga , yaitu penurunan

17

permeabilitas membran, mutasi sub unit ribosom 50S, dan penguraian kloramfenikol

asetiltransferase. Sangat mudah untuk memilih mengurangi permeabilitas membran

terhadap kloramfenikol secara in vitro dengan passage bakteri secara serial, dan hal

ini merupakan mekanisme yang paling sering dari resistensi kloramfenikol level

rendah. Resistensi level tinggi biasanya karena gen CAT, gen ini mengkode enzim

kloramfenikol asetiltrasferase, dimana enzim ini menginaktivasi kloramfenikol lewat

ikatan secara kovalen dengan satu atau dua grup asetil yang berasal dari asetil-S-

koenzim A, dengan grup hidroksil pada molekul kloramfenikol. Asetilasi mencegah

kloramfenikol berikatan dengan ribosom. Resistensi terkait mutasi pada subunit

ribosom 50S merupakan hal yang jarang

Resistensi terhadap kloramfenikol (Cm) diperantarai oleh enzim yang terletak

pada plasmid yang disebut Acetyltransferase kloramfenikol (CAT). Enzim CAT

dikodekan oleh family gen CAT yang terdapat dalam bakteri Gram negatif (Nogrady

et al., 2005)

Resistensi kloramfenikol yang terkait dengan analisis mutasi pada gen CAT P

pada Salmonella typhii sebagai penyebab demam tifoid belum banyak diketahui,

khususnya di Indonesia, untuk itu diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai hal ini.

B. Rumusan Masalah

Apakah mutasi gen CAT P menyebabkan Salmonella typhii menjadi resisten

terhadap kloramfenikol pada penderita demam tifoid ?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan umum

1. Mengetahui terdapat mutasi atau tidak pada gen CAT P pada Salmonella

typhii yang resisten terhadap kloramfenikol pada penderita demam tifoid

18

Tujuan khusus

1. Mengukur sensitifitas kloramfenikol terhadap isolat Salmonella typhii

menggunakan metode konvensional

2. Mendeteksi mutasi gen CAT P pada isolat Salmonella typhii yang resisten

3. Mendeteksi mutasi gen CAT P pada isolat Salmonella typhii yang sensitive

D. Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi ilmiah mengenai mutasi gen CAT P yang terjadi pada

isolate Salmonella typhii yang resisten terhadap kloramfenikol pada demam

tifoid.

19

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Demam Tifoid

Definisi

Demam tifoid atau typhoid adalah penyakit yang disebabkan oleh bakteri

Salmonella enterica, khususnya turunannya yaitu Salmonella typhii. Penyakit ini

dapat ditemukan di seluruh dunia, dan disebarkan melalui makanan dan minuman

yang telah tercemar oleh feses. (Parry C M, M.B,.2012., Gaind R.,2006)

Epidemiologi

Demam tifoid telah menjadi masalah yang cukup penting di beberapa negara.

Pada hampir seluruh dunia, diperkirakan 17 juta orang menderita penyakit ini per

tahunnya. Hampir sebagian besar terjadi di kota-kota dengan pendepatan

pertahunnya rendah, terutama di Asia Selatan, Afrika, Amerika Latin.(Chau TT.,

2007). Di Sulawesi Selatan, demam tifoid merupakan salah satu penyakit infeksi

yang penting. Penyakit ini endemik hampir di seluruh wilayah dan dilaporkan

merupakan empat besar penyakit tersering pada 24 kabupaten di Sulawesi

Selatan.(Hatta et al., 2011)

Gejala Klinis

Gejala klinis demam tifoid pada anak biasanya lebih ringan jika dibanding dengan

penderita dewasa. Masa inkubasi rata-rata 10 – 20 hari. Setelah masa inkubasi maka

ditemukan gejala prodromal, seperti rasa tidak enak badan, lesu, nyeri kepala,

pusing dan tidak bersemangat. Selain itu, gejala klinis yang biasa ditemukan, yaitu:

(Parry CM, M.B,.2012)

20

Pada kasus-kasus yang khas, demam berlangsung 3 minggu. Bersifat remiten

dan suhu tidak berapa tinggi. Selama minggu pertama, suhu tubuh berangsur angsur

meningkat setiap hari, biasanya menurun pada pagi hari dan meningkat lagi pada

sore dan malam hari. Dalam minggu kedua, penderita terus berada dalam keadaan

demam. Dalam minggu ketiga suhu tubuh berangsur-angsur turun dan normal

kembali pada akhir minggu ketiga. (Parry CM, M.B,.2012)

Umumnya kesadaran penderita menurun walaupun tidak seberapa dalam, hanya

apatis sampai somnolen. Jarang terjadi sopor, koma atau gelisah. (Parry CM,

M.B,.2012)

Hampir sebagian besar pasien yang telah diterapi tetap mengeksresikan patogen

selama sebulan setelah gejala klinis menghilang, dan hampir sekitar 5% berlanjut

hingga lima bulan kemudian. Sekitar 3% menjadi carier dan tetap berlanjut

mengeksresikan organism tersebut sepanjang hidupnya. Carier akan berkembang

setelah adanya infeksi asimptomtik. (Hatta et al., 2011)

B. Salmonella typhii

Salmonella enterica serotip typhii merupakan family Enterobacteriaciae.

Salmonella typhii dapat tumbuh baik pada suhu antara 35 0C dan 37 0C, tapi juga

dapat tumbuh pada suhu sekitar 450C. Bakteri ini dapat tumbuh pada kisaran pH 3.8

sampai 9.5, memiliki aktivitas minimal di air pada kadar 0.94, selain itu dapat juga

tumbuh dengan ada atau tidak adanya oksiden.

Salmonella typhii dapat mati dengan pemanasan pada suhu 700C selama satu

menit atau kurang. Pertumbuhan bakteri ini akan berkurang pada suhu kurang dari -

21

150C. Bakteri ini dapat mengalami transisi menjadi status VNC (Viable but Non-

Culturable) di air , hidup tapi tidak bisa dikultur ((Parry CM, M.B,.2012) ;

Bakteri ini memiliki serologi positif terhadap antigen lipopolisakarida O9 dan O12,

antigen flagellar protein Hd, dan antigen kapsular polisakarida Vi. Antigen kapsular

sebagian besar terbatas pada S.typhii, walaupun dapat ditemukan pada beberapa

strain S.enterica serotip hirscfeldii (paratyphi C) dan Dublin, serta Cirobacter freundii.

Tipe Flagella yang unik, Hj ditemukan pada beberapa isolate S.typhii di Indonesia.

( Hatta et al., 2011)

Pada area yang endemik dengan penyakit ini, kontak dengan pasien atau carrier

dapat diduga sebagai faktor risiko utama, tetapi faktor risiko lainnya seperti

kemiskinan, tingkat pendidikan yang rendah, kondisi higiene yang buruk dan faktor

suplai air, serta makan di luar rumah. (Hatta et al., 2007)

Bakteri ini berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, motil,

berkapsul dan mempunyai flagella (bergerak dengan fili). (Parry.C.M, M.B,.2012) .

Baru-baru ini diketahui sekuens genom lengkap dengan estimasi 4599 sekuens

kode. Genom serotip S. typhi, enterik CT18 S. enterica serotip typhimurium LT2, dan

Escherichia coli pada dasarnya collinear, meskipun fakta bahwa E. coli dan S.

enterica berbeda sekitar 100 juta tahun yang lalu. Kebutuhan lingkungan yang sama

oleh bakteri ini mungkin menjelaskan hubungan gen keduanya. (Parry, M.B,.2012)

C. Uji Diagnostik Laboratorium Salmonella typhii

Prosedur laboratorium yang di gunakan pada diagnosis penyakit menular pada

manusia meliputi identifikasi morfologi gen dengan pewarnaan spesimen, isolasi

biakan dan identifikasi juga deteksi antigen. (Brooks,.2007)

22

Pada demam enterik dan septikemia, biakan darah sering positif dalam minggu

pertama penyakit. Biakan urine dapat positif setelah minggu kedua. Pada demam

enterik, feses akan memberikan hasil positf mulai minggu kedua atau ketiga pada

enterokolitis selama minggu pertama. (Brooks,.2007)

Biakan pada medium selektif; specimen diletakkan pada agar salmonella-shigella

(SS), agar Hektoen, XLD atau agar deoksilat-sitrat, yang membantu pertumbuhan

salmonella-shigella. (Brooks,.2007)

Uji aglutinasi pengenceran (tes Widal) : Interpretasinya : Titer O yang tinggi atau

meningkat (≥ 1:160) menandakan adanya infeksi akut. Dan Titer H yang tinggi (≥

1:160) menunjukan riwayat imunisasi atau infeksi masa lampau. Untuk titer antibodi

yang tinggi terhadap antigen vi timbul pada beberapa carier. (Brooks,.2007)

Untuk membedakan salmonella typhii dan salmonella spp lainnya kita

melakukan uji tes biokimia.

Tabel. 1 Media Gula

No Mikroorganisme Glu Lac Man Mal Suc H2S Ind Mot Citrat

1 S.typhosa + - + + - + - + -

2 S.para typhosa + g -/+ + - + + - + +

Ket : Glu : glukosa. Lac: laktosa, Man : mannitol, Mal : maltose, suc : sucrose, Ind : Indol, Mot :motility, cit : simmon’s citrate (Sumber : Brooks.,2007)

23

Tabel.2 Tes Biokimia

No mikroorganisme

ae

rob

an

ae

rob

ka

tala

se

oksid

ase

ure

a

ON

PG

ph

en

ilala

n

nitra

t

KC

N

Arg

inin

hydro

lysis

Gela

tin h

ydro

liis

de

ca

rbo

xyla

se

VP

MR

Glu

ko

na

t

1 S.typhosa + + - - - - + - d+ - +L - +

2 S.para typhosa + + - - - - + - + - +O - +

(Sumber : Brooks.,2007)

D. KLORAMFENIKOL

Kloramfenikol aktif terhadap organisme Gram (+) dan Gram (-) tetapi

karena toksisitasnya, penggunaanya dilarang pada infeksi yang letal. Mekanisme

kerja kloramfenikol mengikat ribosom bakteri sub unit 50s dan menghambat

sintesa protein pada reaksi transferase peptidil.

Meskipun pengikatan tRNA di daerah pengenalan kodon pada sub unit 30 S

ribosom terganggu, obat ini muncul untuk mencegah terjadinya ikatan dari asam

amino yang mengandung ujung tRNA aminoasil ke daerah akseptor pada 50S

subunit ribosom. Interaksi antara peptidyltransferase dan asam amino substrat tidak

bisa terjadi, dan pembentukan ikatan peptida dihambat. Resistensi bakteri gram

negatif terhadap kloramfenikol biasanya disebabkan oleh plasmid dan karena

adanya asetiltransferase tertentu yang menginaktivasi obat. (Smith A.,2004 ).

Spektrum antibiotik kloramfenikol adalah antibiotik spektrum luas, yang aktif tidak

hanya terhadap bakteri tetapi juga terhadap mikroorganisme lain. Kloramfenikol

sebagai obat pilihan pada pengobatan demam tifoid di Indonesia telah lama

24

digunakan sehingga memungkinkan terjadinya perubahan kepekaan Salmonella typhi

terhadap antibiotika tersebut. (Nurtjahyani ., 2012)

E. Gen CAT P

Kloramfenikol asetiltransferase (atau CAT) adalah enzim bakteri yang

mendetoksifikasi antibiotik kloramfenikol dan bertanggung jawab untuk resistensi

pada bakteri kloramfenikol. Enzim ini secara kovalen melekat pada gugus asetil dari

asetil-KoA untuk kloramfenikol, yang mencegah kloramfenikol mengikat ke ribosom.

(Smith A., 2004)

Gambar.1 Skema mekanisme aksi kloramfenikol (Sumber :Musdalifa I., 2012)

Gambar : 2 Mekanisme inaktivasi kloramfenikol (Sumber : Musdalifa I.,2012)

25

F. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknologi biokimia pada

biologi molekuler untuk menggandakan satu atau beberapa potongan DNA menjadi

beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan dari urutan DNA

tertentu. PCR ditemukan pertama kali pada tahun 1983 oleh Kary Mullis. (Yuwono.,

2006)

Hampir semua aplikasi PCR menggunakan DNA polimerase tahan panas, seperti

polimerase Taq, merupakan enzim yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.

Polimerase DNA enzimatik akan membentuk untai DNA baru dengan menggunakan

DNA beruntai tunggal sebagai cetakan dan DNA oligonukleotida (DNA primer),

dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA. Sebagian besar metode PCR menggunakan

siklus termal, yaitu pemanasan dan pendinginan secara bergantian pada suhu

tertentu. Siklus termal ini sangat dibutuhkan untuk memisahkan dua untai DNA heliks

ganda pada suhu tinggi yang disebut pemanasan DNA. Pada suhu yang lebih

rendah, setiap untai tersebut kemudian digunakan sebagai cetakan pada sintesis

DNA oleh DNA polymerase yang secara selektif mengkopi target DNA.

(Yuwono.,2006)

Biasanya PCR terdiri dari 20-30 perubahan suhu, disebut siklus, dimana setiap

siklus terdiri dari 2-3 tahap suhu yang berbeda. Siklus ini biasanya didahului tahap

suhu tunggal (hold) pada suhu tinggi (900C). Suhu yang digunakan dan lamanya

waktu yang diterapkan dalam setiap siklus tergantung pada berbagai parameter,

termasuk enzim yang digunakan untuk sintesis DNA, konsentrasi ion divalen dan

dNTP dalam reaksi, dan suhu leleh (Tm) dari primer. (Yuwono., 2006)

26

Proses amplifikasi terbagi menjadi 3 tahap termal tahap-tahap tersebut, yaitu :

Tahap initialisasi : langkah ini terdiri dari pemanasan reaksi dengan suhu 94-96 ° C

(98 ° C atau jika polimerase termostabil ekstrem digunakan), dilakukan selama 1-9

menit. Hal ini hanya diperlukan untuk polimerase DNA yang memerlukan aktivasi

panas dengan hot-start PCR.Tahap denaturasi : tahap ini merupakan siklus

pertama yang terdiri dari reaksi pemanasan 94-980C selama 20-30 detik, yang

menyebabkan pemanasan DNA dari cetakan DNA dengan merusak ikatan hydrogen

antara basa, menghasilkan molekul DNA untai tunggal. Tahap annealing : suhu

reaksi diturunkan ke 50-65 ° C selama 20-40 detik memungkinkan annealing primer

ke cetakan DNA untai tunggal. Biasanya suhu pada tahap ini sekitar 3-50C di bawah

Tm dari primer yang digunakan. Ikatan hidrogen Stabil DNA-DNA hanya terbentuk

ketika urutan primer sesuai urutan cetakan. Polimerase mengikat hibrida primer-

template dan mulai pembentukan DNA Tahap ekstensi/elongasi.Tahap ekstensi /

elongasi : suhu pada tahap ini tergantung pada polimerase DNA yang digunakan,

Taq polimerase memiliki aktivitas pada suhu optimum 75-800C, dan umumnya suhu

720C yang digunakan dengan enzim ini. Pada langkah ini polimerase DNA

mensintesis untai DNA baru melengkapi untai cetakan DNA dengan menambahkan

dNTP yang melengkapi cetakan dalam 5 'ke 3' arah, kondensasi gugus 5'-fosfat dari

dNTP dengan 3'-hidroksil kelompok di akhir untai (memperpanjang) DNA baru.

Waktu perpanjangan tergantung baik pada DNA polimerase yang digunakan dan

pada panjang fragmen DNA yang akan diperkuat. Pada suhu optimum, polimerase

DNA akan polimerisasi seribu basis per menit. Dalam kondisi optimum, yaitu bila

tidak ada keterbatasan karena substrat membatasi atau reagen, pada setiap langkah

ekstensi, jumlah target DNA dua kali lipat, yang mengarah ke eksponensial

(geometris) amplifikasi fragmen DNA spesifik. Elongasi terakhir : pada tahap ini

dilakukan pada suhu 70-740C selama 5-15 menit setelah siklus PCR terakhir untuk

27

memastikan bahwa setiap DNA beruntai tunggal tersisa sepenuhnya diperpanjang.

Final Hold : tahap ini dilakukan pada 4-150C untuk waktu yang tidak terbatas, dapat

digunakan untuk penyimpanan jangka pendek dari reaksi. (Yuwono.,2006)

Gambar 3. Skema tahap siklus PCR. (1) denaturasi pada 94-960C. (2)

Annealing pada 650C (3) Pemanjangan pada 720C (empat siklus

yang ditampilkan di sini). Garis biru mewakili template DNA yang

primer (panah merah) anneal yang diperpanjang oleh DNA

polimerase (lingkaran hijau muda), untuk memberikan produk

DNA pendek (garis hijau), yang sendiri digunakan sebagai

cetakan selama PCR berlangsung.

Sumber : (Yuwono.,2006)

Untuk memeriksa apakah PCR dihasilkan fragmen DNA diantisipasi (amplimer

atau amplikon), agarosa gel elektroforesis digunakan untuk pemisahan ukuran

28

produk PCR. Ukuran produk PCR ditentukan oleh perbandingan dengan DNA ladder

(penanda berat molekul), yang berisi fragmen DNA ukuran diketahui, dijalankan pada

gel bersama produk PCR (Yuwono.,2006)

PCR spesifik untuk S. enteric serovar typhii yang dapat digunakan untuk

mendeteksi patogen ini pada sampel darah, urin, dan feses. Sensitivitas kultur darah,

PCR pada darah, urin, dan feses, serta tes widal berturut-turut adalah 61.8%,

84.5%, 69.3%, 46.9% dan 39.0%. (Hatta et al, 2007)

Pada penelitian yang dilakukan oleh Hatta dkk, sensitivitas PCR pada darah dan

urin lebih tinggi secara signifikan, dan sensitivitas PCR pada feses sama dengan

kultur darah. Kombinasi PCR pada urin dan feses menunjukkan hasil positif pada 16

dari 23 pasien tifoid. Dari studi tersebut, penulis menyimpulkan PCR darah

merupakan metode yang sensitive untuk mendiagnosis demam tifoid, dan PCR pada

urin dan feses dapat digunakan sebagai pemeriksaan tambahan. (Hatta et al, 2007).

G. Uji Sensitifitas Metode Kirby Bauer

Salah satu metode yang digunakan untuk menentukan kerentanan antibiotik

adalah disk sensitivitas metode Kirby-Bauer (dinamai W. Kirby dan A. W. Bauer di

1966). Dalam metode ini, antibiotik diserap paper disk dan kemudian ditempatkan

pada agar plate Mueller-Hinton agar plate menggunakan mekanisme dispenser atau

forcep steril. (Harley and Prescott.,2002)

Plat kemudian diinkubasi selama 16 sampai 18 jam, dan diameter zona

inhibisi diukur sekitar disk ke milimeter terdekat. Penghambatan zona diameter yang

dihasilkan akan menunjukkan kerentanan dari bakteri terhadap antibiotik. (Harley

and Prescott.,2002)

29

Gambar. 4 Plat Kirby-Bauer. S aureus diinokulasi pada plat agar Mueller-Hinton dan

berbagai antibiotik. Tampak diameter zona berbagai hambatan

Sumber : (Harley and Prescott.,2002)

Pola kerentanan antibiotik yang disebut antibiograms. Antibiograms dapat

ditentukan dengan membandingkan diameter zona yang diperoleh dengan zona

ukuran diameter untuk kerentanan.

Metode Kirby-Bauer tidak terbatas terhadap antibiotik. Hal ini juga dapat

digunakan untuk mengukur sensitivitas setiap mikroorganisme ke berbagai agen

antimikroba seperti sulfonamid dan kemoterapi sintetis.

30

Tabel . 3 Interpretasi Zona Penghambatan Uji Kultur

Sumber: Berdasarkan data dari Komite Nasional untuk Standar Laboratorium Klinik (NCCLS).

Gambar. 5 Ilustrasi Uji sensitifitas antimikroba Kirby Bauer

Sumber : (Harley and Prescott., 2002)

31

BAB III KERANGKA KONSEP

Keterangan

Variable bebas : Gen CAT P / (Variabel yang diteliti)

Variabel tergantung : resistensi kloramfenikol

Variabel antara : penurunan permebilitas membran dan

mutasi subunit ribosom 50S (variabel yang tidak

diteliti )

Variabel Perancu : Plasmid

Penurunan

permeabilitas membran

Faktor Ekstra kromosom

Plasmid

Resistensi Kloramfenikol Penguraian kloramfenikol

asetil transferase

GEN CAT P Mutasi sub unit

ribosom 50 S

32

BAB IV

METODE PENELITIAN

A. RANCANGAN PENELITIAN

Penelitian ini merupakan rancangan penelitian dengan metode cross sectional,

dimana pada penelitian ini dibagi menjadi kelompok isolat yang masih sensitif

terhadap kloramfenikol dan isolat resisten terhadap kloramfenikol.

B. TEMPAT DAN WAKTU

Penelitian dilakukan di bagian Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Universitas Hasanuddin, Makassar dan rumah sakit Syeh Yusuf Makassar, yang

akan dilaksanakan pada bulan Maret hingga Mei 2013.

C. POPULASI

Sampel penelitian ini adalah seluruh populasi yang memenuhi kriteria inklusi

dan tidak termasuk dalam kriteria eksklusi penelitian. Pengambilan sampel dilakukan

dengan cara puposive sampling.

D. KRITERIA INKLUSI DAN EKSKLUSI

Kriteria Inklusi :

1) Isolat Salmonella typhii yang resisten dan sensitif terhadap

khloramphenikol

2) Penderita menyetujui dan menandatangani informed consent.

33

Kriteria eksklusi :

Isolat Salmonella typhii yang terkontaminasi mikroorganisme lain

Isolat Salmonella spp selain Salmonella typhii

E. SAMPEL PENELITIAN

Penentuan besar sampel berdasarkan rumus proporsi finit.

N . Z2 . P .(1 - P)

n = -----------------------------------

d2 (N-1) + Z2 . P.(1 – P)

Keterangan :

n = Besar sampel

N = 30 (perkiraan jumlah pasien demam tifoid dalam 3 bulan

Z = Nilai standar deviasi normal (1.96)

P = Prevalensi salmonella typhii (0,25)

d = Tingkat ketelitian (0,05)

Berdasarkan rumus tersebut didapatkan perhitungan besar sampel sebesar

27,25. Dalam penelitian ini dibulatkan menjadi 30 sampel.

F. ALAT DAN BAHAN PENELITIAN

Alat- alat yang digunakan pada penelitian ini adalah:

4 150 × 15 mm Plat agar SS

Medium Broth

Agar miring TSIA

Antibiotik harddisk dispenser (BBL atau DIFCO)

31 swab steril

34

Inkubator 37 ° C ,

mistar pengukur, lilin pensil, 70% etil alkohol dan gelas,

Bunsen burner

Mesin PCR (Biorad), Gel DOC, Mesin Elektroforesis

-Sentrifuge

-Waterbath

-Laminal Flow

-BSC Tipe II

-Mikropipet (200 ul, 100 ul, 20 ul, 10 ul)

-Cetakan Agarosa

-Tips (1000 ul, 100 ul, 20 ul, 10 ul)

-Tabung efendorf

-Tabung PCR

-Erlenmeyer

-Gelas ukur

-Rak tabung

-Plat Steril

-Sarung tangan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah:

Primer spesifik CAT P CPRF U46780 CCGTTGATATATCCCAATGG dan

CPRR CTGGTGAAACTCACCCAGGG

623 bp

- Enzim PCR ( Go taq Master Mix Green )

- RNAse Free water

- Agarosa

- Ethidium Bromida

35

- TBE 0,5

- Loading Dey

- DNA Leader / Marker ( 100 bp )

G. LANGKAH KERJA

Pencatatan. Pasien demam tifoid yang datang ke RS dan Puskesemas yang

memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi akan diberi penjelasan dan diminta untuk

terlibat dalam penelitian setelah menandatangani informed consent. Pengisian

kuesioner mengenai data pribadi dan riwayat penyakit.

Penilaian klinis dan laboratorium. Kita melakukan Pemeriksaan fisik secara

umum dan Pemeriksaan Tes Widal

Pengambilan specimen. Spesimen darah diambil dan dilakukan kultur darah

untuk mendapatkan isolat S.typhi. Setelah itu dilakukan tes sensitivitas cakram

kloramfenikol untuk mendapatkan kelompok resisten dan sensitif terhadap

kloramfenikol. Isolat selanjutnya akan diuji dengan PCR lalu dilakukan Sequencing

untuk dilihat apakah terdapat mutasi gen CAT P.

Isolasi DNA dengan menggunakan BOOM prosedur. Isolat dicampur dengan

900 ml aqua steril dalam vial 1,5 ml dan di centrifus pada 1000 rpm selama 5 menit

dan supernatan dikumpulkan. Lalu supernatan di centrifused lagi 5.000 rpm selama

30 menit dan mengumpulkan sedimen. Centrifuge 10 menit pada 12.000 xg dan

supernatan dihapus oleh sistem hisap vakum. Isolat sedimen dilakukan sesuai

dengan metode Boom. Secara singkat, menempatkan 900 ul penyangga lisis L6

(melarutkan 120 g GuSCN (Fluka Chemie AG, Buchs, Swiss) dalam 100 ml dari 0,1

M. Tris-HCL, pH 6,4 Panaskan larutan pada 60oC untuk menghilangkan GuSCN

tersebut.Volume akhir dari solusi akan 200 ml. Tambahkan 22 ml larutan 0,2 M.

EDTA disesuaikan dengan NaOH sampai pH 8,0 dan 2,6 g Triton X-100 (Packard

36

Instrumen, USA), konsentrasi akhir akan menjadi sekitar 50 mM Tris-HCL, 5 M

GuSCN, 20 mM EDTA, 0,1% Triton X-100) ke dalam botol ml 1,5 dengan screwcap

(Sarstedt, Assist trading Co, Ltd, Jepang). Tambahkan 200 ul sedimen dan 20

suspensi diatom ul. Vortex campuran ini dan kocok pada rpm 100 gyrotary pengocok

selama 10 menit. Vortex lagi dan kemudian disentrifus dalam microfuge Eppendorf

(Sarstedt, Assist Trading Co, Ltd, Jepang) pada 12.000 xg selama 15 detik. Hapus

supernatan oleh sistem hisap vakum dan mencuci dua kali dengan 1 penyangga

mencuci L2 ml (melarutkan 120 g GuSCN dalam 100 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 6,4).

Cuci dua kali dengan 1 ml etanol 70% dan sekali dengan 1 ml aseton. Lepaskan

supernatan aseton. Keringkan botol terbuka dalam waterbath 56oC selama 10 menit.

Tambahkan 60 ul TE buffer elusi yang mengandung 1 mM EDTA dalam 10 mM Tris-

HCL, pH 8,0 dan menetaskan botol selama setidaknya 10 menit pada 56oC.

Centrifuge 30 detik pada 12.000 xg, mentransfer hati-hati tentang 50 ul dari

supernatan ke botol baru dan disimpan pada-20oC sampai PCR dilakukan tanpa

pengetahuan sebelumnya dari klasifikasi sampel.

DNA sequencing method

Cycle Sequencing . Reagen yang digunakan adalah ABI PRISM BigDye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Komponen reagen dalam boks: Ready

Reaction Mix (BigDye Terminator), pGEM -3Zf(+) double-stranded DNA sampel

Template: 0.2 uglul = 200 nglul (sebagai sampel DNA) . Letakkan pada suhu ruang

dan simpan diatas es sebelum dipakai. Aliqout reagen dalam voleme kecil untuk

mencegah kerusakan reagen fluoresen akibat terlalu sering di freeze-thaw dan

terkena cahaya selain untuk menghindari terjadinya kontaminasi, masukkan pipet

reagen kedalam tube PCR 0,2 ml, campur merata lalu spin sebentar (sentrifuse ), set

Program PCR sebagai berikut:

37

*Siklus (30 X) :

- 940 C, 1 menit

- 940C. 1,5 menit

- 50°C, 1 menit

- 72°C , 1 menit

- 72°C, 1 menit sampai siap dipurifikasi , letakkan tube sampel pada

instrumen PCR (Thermal cycler), Set volume reaksi = 20 ul , run (Start).

Elektroforesis hasil PCR

Pembuatan gel. Agarose ditimbang 1,5 gr dan dilarutkan dalam 100 ml TBE

Buffer 0,5 untuk mendapatkan larutan agarose 1,5 % lalu campuran agarosa dan

TBE Buffer 0,5 dipanaskan hingga larut kemudian ditunggu hingga agak dingin

kemudian ditambah 2 μl Ethidium Bromida. Larutan agarosa dituang ke dalam

cetakan dan ditunggu hingga beku.

Pembuatan DNA marker. Sebanyak 25 µl DNA 100 bp ladder dimasukkan ke

dalam tube berisi 1 ml Blue Juice Loading Dye, dan dicampur untuk marker

kemudian Laber tube dilepas dan diganti menjadi marker

Persiapan running elektroforesis. Gel yang telah beku dimasukkan ke dalam

elektroforesis dan direndam dalam larutan TBE 0,5x. Sebanyak 8 μl amplikon hasil

PCR ditambah dengan 2 μl Blue Juice Loading Dye (tanpa marker), dicampur dan

dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel sebanyak 10 μl. Pada lubang pertama

tambahkan 10 μl DNA leader 100 bp dimasukkan ke dalam sumur di dekat kontrol

positif.

Running elektroforesis. Elektroforesis dihidupkan dan dijalankan dari muatan

negatif (katoda) ke muatan positif (anoda) pada 100 A dan 40 menit. Setelah

38

elektroforesis dilihat pita yang terbentuk. Apabila pita sejajar dengan kontrol positif

berarti hasil positif.

39

H. Identifikasi Variabel

Variabel bebas : mutasi gen CAT P

Variabel tergantung : kloramfenikol

Variabel perancu : plasmid

Variabel antara :penurunan permeabilitas, mutasi subunit ribosom 50S

40

I. Alur Penelitian

Identifikasi Isolat S.typhi

Penderita demam tifoid

Kultur darah

sensitif

Subyek

PCR

Kriteria inklusi dan eksklusi

Resistensi obat adalahperlawanan

yang terjadi ketika

bakteri, virus dan parasit lainnya

secara bertahap kehilangan

kepekaan terhadap obat yang

sebelumnya membunuh mereka.

Saat obat lebih banyak digunakan,

risiko resistensi obat meningkat

karena kasus penggunaan antibiotik

yang tidak tepat atau putus obat

meningkat Resistensi obat adalah

perlawanan yang terjadi ketika

bakteri, virus dan parasit lainnya

secara bertahap kehilangan

kepekaan terhadap obat yang

sebelumnya membunuh mereka.

Saat obat lebih banyak digunakan,

risiko resistensi obat meningkat

karena kasus penggunaan antibiotik

yang tidak tepat atau putus obat

meningkat Resistensi obat adalah

perlawanan yang terjadi ketika

bakteri, virus dan parasit lainnya

secara bertahap kehilangan

kepekaan terhadap obat yang

sebelumnya membunuh mereka.

Saat obat lebih banyak digunakan,

risiko resistensi obat meningkat

karena kasus penggunaan antibiotik

yang tidak tepat atau putus obat

meningkat

Tes biokimia

Tes sensitifitas cakram kloramfenikol

Resisten

Mutasi gen CAT P/tidak

Analisis data

Laporkan data

Sequencing

http://kamuskesehatan.com/arti/obat/http://kamuskesehatan.com/arti/virus/http://kamuskesehatan.com/arti/obat/http://kamuskesehatan.com/arti/virus/http://kamuskesehatan.com/arti/obat/http://kamuskesehatan.com/arti/virus/

41

J. DEFINISI OPERASIONAL

Isolat salmonella typhii : isolate yang diuji dengan tesTSIA (+), mengeluarkan H2S

pada medium tampak berwarna hitam.

Pasien demam tifoid : pasien yang di diagnosa oleh dokter dengan anamnesa,

pemeriksaan fisik dengan tes widal dengan titer 1/320 sebagai penderita demam tifoid.

Resistensi : perlawanan yang terjadi ketika bakteri, virus dan parasit lainnya secara

bertahap kehilangan kepekaan terhadap obat yang sebelumnya membunuh mereka. R : ≤

12 mm, I : 13-17mm, S : ≥ 17 mm

K. ANALISIS DATA

Data hasil penelitian diolah dan disajikan dalam bentuk gambar, tabel, dan

narasi.

L. IJIN PENELITIAN DAN ETHICAL CLEARANCE

Permintaan ijin dari pasien untuk dijadikan sampel penelitian serta

persetujuan dari Komisi Etik Penelitian Biomedik pada Manusia Fakultas

Kedokteran Universitas Hasanuddin

http://kamuskesehatan.com/arti/virus/

42

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL

Penelitian ini dilakukan selama periode bulan Juni - Agustus 2013 di RS.Syech Yusuf

dan PKM Maros Makassar. Dari 100 sampel yang diperoleh, 31 sampel yang memenuhi

kriteria inklusi dan dilakukan uji sampel di Laboratorium Mikrobiologi Universitas

Hasanuddin Makassar . Penelitian ini menggunakan metode penelitian purposive

sampling. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melihat ekspresi gen CATp pada

Salmonella typhii yang positif dan negatif.

Pengumpulan Sampel dan Kultur bakteri. Sampel yang dikumpulkan berupa darah

sebanyak 5cc dan dimasukkan dalam medium broth lalu diinkubasi selama 24 jam.

Setelah di Inkubasi sampel dikultur dalam medium agar SS dan di Inkubasi kembali

selama 24 jam. Tampak koloni bulat, putih, licin. berukuran kecil dan sedang. Hasil yang

diperoleh terdapat 31 koloni sampel Salmonella typhii.

Gambar 6. Isolat Salmonella Negatif. Tak tampak koloni

Koloni (-) Koloni (-)

Koloni (-)

43

Gambar 7. Isolat Salmonella Positif. Tampak koloni berwarna putih . Warna hitam

merupakan gas yang dibentuk oleh S typhii

Tes Biokimia. Untuk membedakan apakah isolate yang ditemukan merupakan isolate

Salmonella typhii bukan salmonella yang lainnya kita melakukan uji biokimia. Uji biokimia

yang kita lakukan adalah tes TSIA dengan cara menanam isolate yang ditemukan

kedalam agar miring TSIA, dan di inkubasi pada suhu 37 °C. Hasilnya dapat kita baca

setelah 24 jam. Hasil yang diperoleh terdapat 31 sampel positif S typhii.

Gambar 8. Media TSIA

Koloni (+)

Koloni (+)

Koloni (+)

44

Gambar 9. Tes TSIA Positif. Pada gambar terlihat warna hitam yang merupakan ciri khas

S typhii. Mengeluarkan gas.

Uji sensitivitas. Uji ini dilakukan untuk melihat sensitivitas isolat terhadap antibiotik,

antibiotik yang digunakan adalah kloramfenikol menggunakan Metode Kirby Bauer. Isolate

S.typhi yang telah di tes TSIA dilakukan uji sensitivitas terhadap kloramfenikol dengan

menggunakan disk cakram kloramfenikol 30µg. Sebelumnya isolat Salmonella typhii di

apus dalam medium agar dengan menggunakan kapas lidi, setelah merata , disk cakram

diletakkan pada isolate yang telah diapus dalam medium agar. Kemudian medium

diinkubasi selama 18-24 jam. Dari hasil penelitian diperoleh 1 strain S.typhi yang resisten

dan 30 strain S.typhi yang sensitif terhadap kloramfenikol .

Redish basa

(alkaline)

Slight H2S

Yellow butt (acidic)

45

Gambar 10. Uji Sensitivitas. Pada gambar terlihat zona sensitvitas pada Sampel S12,S14.

Gambar 11. Uji Sensitivitas. Pada gambar terlihat zona sensitvitas pada Sampel MMS049

Dan pada sampel MMS 030 tidak tampak zona sensitivitas atau resisten

Untuk hasil Uji Sensitivitas Salmonella typhii terhadap kloramfenikol dapat dilihat pada

tabel 4

Resisten (1mm) Sensitif (27 mm)

Sensitif (27mm)

Sensitif (25mm)

46

Tabel 4. Tabel hasil uji sensitivitas salmonella typhii

Sampel Uji Sensitivitas Diameter

1 S 27 mm 2 S 24 mm 3 R 1 mm 4 S 29 mm 5 S 31 mm 6 S 25 mm 7 S 25 mm 8 S 30 mm 9 S 33 mm 10 S 26 mm 11 S 30 mm 12 S 27 mm 13 S 20 mm 14 S 27 mm 15 S 25 mm 16 S 30 mm 17 S 25 mm 18 S 26 mm 19 S 24 mm 20 S 25 mm 21 S 26 mm 22 S 28 mm 23 S 24 mm 24 S 24 mm 25 S 35 mm 26 S 27 mm 27 S 27 mm 28 S 27 mm 29 S 25 mm 30 S 23 mm 31 S 29 mm

PCR. Setelah didapatkan hasil uji sensitivitas tahap selanjutnya melihat mutasi gen

CAT P dengan menggunakan PCR. Sebelum 31 sampel dilihat ekspresi mutasi gen CAT

P kita menguji 10 sampel secara acak dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk

memastikan apakah sampel yang ada benar salmonella typhii dengan melihat ekspresi

47

gen Salmonella typhi. Dengan siklus 90°C selama satu menit , 94°C selama 45 detik,

57°C selama 45 detik, 72°C selama 1 menit 30 detik selama 40 kali. Hasil yang diperoleh

semua sampel yang diuii yaitu 10 sampel semuanya positif mengekspresikan gen

Salmonella typhii.

Berikutnya ke 31 sampel baik yang sensitif dan resisten diuji untuk melihat ekspresi

mutasi gen CAT P di PCR dengan siklus 94°C selama 1 menit, 94°C selama 1,5 menit,

50°C selama 1 menit , 72 °C selama 1 menit dan 72°C selama 5 menit selama 30 kali dan

diperoleh 7 sampel yang mengekspresikan mutasi gen CAT P. Ekspresi gen dapat

dilihat pada gambar 12.

Gambar 12. Ekspresi Gen CAT P tampak pada sampel 1,2,3,10,11,12,13

48

Gambar 13. Pada sampel 17 sampai sampel 31 tidak nampak ekspresi Gen CAT P

Tabel 5. Tabel ekpresi mutasi gen CAT P pada Salmonela typhii yang resisten dan

sensitif

Disk Difusi

Gen CAT P Total

Positif Negatif

N % N %

R 1 100 0 0 1

S 6 20 24 80 30

Jumlah 7 22 24 77 31

Dari tabel 5 tampak mutasi gen CAT P tidak hanya terdapat pada yang isolate yang

resisten, namun mutasi juga didapatkan pada isolate yang sensitive. Prosentase

kehadiran mutasi gen CAT P pada isolate yang resisten 100% dan prosentase isolate

yang sensitive 20%. Total prosentase isolate yang mengalami mutasi gen CAT P adalah

22 %.

436

7

49

B. PEMBAHASAN

Demam tifoid merupakan masalah kesehatan di negara yang sedang berkembang.

Sampai saat ini untuk menegakkan diagnosis masih menggunakan standar baku yaitu

berdasarkan kultur darah . Metode diagnostik yang cepat, sederhana, dan murah sangat

dibutuhkan. Tes serologi Widal merupakan tes yang memenuhi kriteria tersebut, dan

hingga saat ini masih banyak digunakan. (Rahman A, Fatmawati.,2011)

Berdasarkan hasil penelitian ini sensitifitas dan spesifitas tes widal sangatlah

rendah. Dari 100 sampel yang dikumpulkan , pasien yang diuji dengan tes widal positif

dan titer H 1/320 dan dilakukan tes kultur darah yang memberikan hasil positif pada kultur

hanya 31(31%) sampel. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Rahman A

dan Fatmawati. Dalam penelitiannya mereka melaporkan untuk nilai spesifisitas tes

serologi Widal berdasarkan cut-off point adalah: Salmonella thypi O (10%), Salmonella

thypi H (16,667%).(Rahman A, FAtmawati., 2011)

Menurut penelitian yang dilakukan oleh Zulfikar A. Butta kultur darah mempunyai

nilai sensitifitas sebesar 40-80%. Dan pada daerah endemik memiliki nilai yang lebih

rendah, kemungkinan hal ini disebabkan karena tingginya penggunaan antibiotik.

(Rahman A, Fatmawati., 2011)

Di negara maju, angka kejadian infeksi Salmonella dan wabah telah meningkat

beberapa kali lipat selama beberapa waktu terakhir. Berdasarkan penelitian yang kami

lakukan dari 100 sampel kami berhasil mengumpulkan 31 (31%) sampel isolat salmonella

typhii dan dari penelitian ini isolat Salmonella typhii yang resisten didapatkan 1 isolat dari

31 jumlah sampel. Penelitian ini menunjukkan ada penurunan jumlah pasien yang

50

resisten terhadap khlormfenikol (3,2%). Karena pada penelitian sebelumnya data yang

telah dilaporkan oleh Smith pada tahun 2007 ada sekitar 6,8%. (Hatta dan Ratnawati.,

2008). Mungkin hal ini di dapat disebabkan oleh karena jangka waktu penelitian yang

singkat dibanding penelitian yang dilakukan oleh Smith.

Plasmid berperan sebagai perantara dalam produksi enzim CAT. Kloramfenikol

asetiltransferase (atau CAT) adalah enzim bakteri yang mendetoksifikasi antibiotik

kloramfenikol dan bertanggung jawab untuk resistensi pada bakteri kloramfenikol. Dari

hasil penelitian yang dilakukan didapatkan 1 sampel resisten yang positif mengekspreikan

gen CAT P (100%) dan 6 sampel yang sensitive mengekspresikan mutasi gen CAT P

(22%).

Menurut Sambrook., 2001 dan Wain dkk.,2003 gen yang bertanggung jawab terhadap

resistensi kloramfenikol terletak pada Tn 9 dengan panjang 1102 bp dan yang mengkode

enzim CAT panjangnya 293 bp. (Nurtjahyani ., 2012) Pada penelitian ini yang mengkode

enzim CAT p panjangnya 436 bp

Gen CAT p yang terdeteksi pada sampel 1,2,3,10,11,12,13 (7 dari 31 sampel) 23%

bukan merupakan gen tunggal yang menjadi penyebab reaksi terhadap kloramphenikol

hal ini mungkin di sebabkan juga oleh gen yang di sandi oleh plasmid gen resisten yang

dimiliki oleh kuman sehingga tetap tampak secara phenotypenya sensitif terhadap

khloramphenikol.

Adanya gen CAT P positif pada sampel no 1,2,10,11,12,13 yang sensitif terhadap

khloramphenikol disebabkan belum terekspresinya gen tersebut secara phenotype

sehingga belum terlihat adanya resisten pada sampel tersebut.

51

Pada sampel no 3 ditemukan gen CAT P dimana sampel tersebut telah terekspresi

phenotypenya yang dapat dinilai dengan menggunakan test disk difusi yang memberi

hasil khloramphenikol resisten dengan diameter disk difusi 1 mm.

52

BAB VI

PENUTUP

A. KESIMPULAN

1. Gen CAT P bukan merupakan satu-satunya faktor yang menyebabkan resistensi

pada khloramphenikol.

2. Gen CAT P dapat ditemukan pada isolate Salmonella yang resisten dan sensitive

B. SARAN

1. Perlu dilakukan penelitian dengan jumlah sampel dan waktu penelitian yang lebih

lama

2. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui bagaimana penggunaan

antibiotik seperti khloramphenikol dalam masyarakat.

3. Perlunya pertimbangan untuk mencari alat penegakan diagnosa yang lebih akurat

dan cepat selain tes Widal dalam menegakkan diagnosa di Puskesmas dan Rumah

sakit.

53

DAFTAR PUSTAKA

Brooks GF, Butel JS, Morse SA. 2004 Prinsip Mikrobiologi Kedokteran diagnostic.

Brooks,Melnick & Adelberg’s medical microbiology,(23), 717-18 Chau TT, Campbell JI, Galindo CM. 2007. Antimicrobial drugs resistance of Salmonella

enteric serovar typhi in Asia and molecular mechanism of reduced susceptibility to the fluoroquinolones. Antimic Agent Chemother, 51(12), 4315-23

Gaind R, Paglietti B, Murgia M, et al. 2006. Molecular characterization of ciprofloxacin-

resistant Salmonella enteric seroar typhi and paratyphi A causing enteric fever in India. J Antimic Chemother, 58, 1139-44

Hatta M, Smits HL. 2007. Detection of Salmonella typhi by nested polymerase chain

reaction in blood, urine, and stool samples. J Trop Med Hyg, 76(1), 139-43 Hatta M, Ratnawati. 2008. Enteric fever in endemic areas of Indoneisa: an increasing

problem of resistance. J Infect Develop Countries, 2(4), 279-82 Hatta M, Sultan AR, Pastoor R, Smits HL. 2011. New flagellin gene for salmonella enteric

serovar typhi from the ease Indonesian archipelago. Am J Trop Med Hyg, 1-6 Haque A, Haque A, Sarwar Y. 2005. Multiplex PCR for determination of drug resistance

against standard anti typhoid drugs in blood sampel of typhoid patients Mirza S, Kariuki S, Mamun KZ, Beeching NJ, Hart CA. 2000. Analysis of plasmid and

chromosomal DNA of multidrug resistant Salmonella enteric serovar typhi from Asia. J Clin Microbiol, 38(4), 1449-52

Musdalifah I 2012. Deteksi Gen Resisten Chloramphenicol dan Erytromycin pada Llasmid

Bakteri Asam Laktat dari Pangan Fermentasi Tradisional Indonesia. Jakarta ; FMIPA Program Studi Biologi -UI

N.Noogrady, I.Gado, P. Zsolt Fekete. 2005. Chloramphenicol resistance genes in

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium isolated from human and animal sources in Hungary. Vet. Med. – Czech, 50,(4): 164–170

Nurtjahyani D,S. 2012. Transformasi dna plasmid salmonella typhi resisten kloramfenikol

ke kultur salmonella typhi sensitif kloramfenikol. Prospektus, X(2) Parry CM, Hien TT, Dougan G, White NJ, Farrar JJ. 2002. Typhoid Fever. NEJM, 347(22) Prescott LM, Harley JP .2002. The Effects of Chemical Agents on Bacteria II:

Antimicrobial Agents (Kirby-Bauer Method) , 5((43), 257-61

54

Rachman, A.,Fatmawati. 2011. Uji Diagnostik Tes Serologi Wudal dibandingkan dengan kultur darah sebagai baku emas untuk diagnostic demam tifoid di RSUP dr.Kariadi Semarang. Semarang : Program Pascasarjana UNDIP

Smith A . 2004 . Hugo and Russell’s Pharmaceutical Microbiology, Seventh ed, Blackwell

Science. UK Yuwono T . 2006. Teori dasar PCR, PT Andi. Jogjakarta

55

Lampiran 1. Reverse : CTGGTGAAACTCACCCAGGG – complementary : ccctgggtgagtttcaccag

PCR product 436 bp

U46780:Synthetic construct trap vector for...

Query ID

gi|1197593|gb|U46780.1|SCU46780

Description

Synthetic construct trap vector for isolation of bacterial IS elements, aminoglycoside-

3:adenyltransferase (aadA), neomycin phosphotransferase (neo), chloramphenicol acetyl

transferase (cat), beta-lactamase (bla) genes, complete cds

Molecule type

nucleic acid

Query Length

8097

Subject ID

lcl|44835

Description

None

Molecule type

nucleic acid

Subject Length

20

Other reports: Search Summary

Dot Matrix View

Plot of gi|1197593|gb|U46780.1|SCU46780 vs lcl|44835

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=Search&db=nucleotide&term=U46780.1&dopt=GenBankhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

56

Descriptions

Sequences producing significant alignments:

Select:AllNone Selected:0

Alignments Download Graphics Show/hide columns of the table presenting sequences producing

significant alignments

Sequences producing significant alignments:

Select for downloading or viewing reports Description Score Percent Ident Accession

None provided -16124.0 0% 44835

Alignments

Download Graphics Next Previous Descriptions

Sequence ID: lcl|44835Length: 20Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 1 to 20Graphics Next Match Previous Match

Alignment statistics for match #1

NW Score Identities Gaps Strand

-16124 20/8097(0%) 8077/8097(99%) Plus/Plus

Query 1 GGGGATCCGGTGATTGATTGAGCAAGCTTTATGCTTGTAAACCGTTTTGTGAAAAAATTT 60

Query 61 TTAAAATAAAAAAGGGGACCTCTAGGGTCCCCAATTAATTAGTAATATAATCTATTAAAG 120

Query 121 GTCATTCAAAAGGTCATCCACCGGATCAGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAGATTTTAATGCG 180

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alignInfohttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dsDownloadhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dsConfighttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dsConfighttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dsConfighttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Get&ALIGNMENTS=100&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&BLAST_SPEC=GlobalAln&DATABASE_SORT=0&DESCRIPTIONS=100&DYNAMIC_FORMAT=on&FIRST_QUERY_NUM=0&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_PAGE_TARGET=&FORMAT_TYPE=HTML&I_THRESH=&LINE_LENGTH=60&MASK_CHAR=2&MASK_COLOR=1&NUM_OVERVIEW=0&OLD_BLAST=false&PAGE=Nucleotides&QUERY_INDEX=0&QUERY_NUMBER=0&RESULTS_PAGE_TARGET=&RID=2ZVUWC7711N&SHOW_LINKOUT=yes&STEP_NUMBER=&WORD_SIZE=11&OLD_VIEW=false&DISPLAY_SORT=1&HSP_SORT=1http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_44835http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dlgDwnl_44835http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer/?RID=2ZVUWC7711N&id=lcl%7C44835&tracks=%5bkey:sequence_track,name:Sequence,display_name:Sequence,id:STD1,category:Sequence,annots:Sequence,ShowLabel:true%5d%5bkey:gene_model_track,CDSProductFeats:false%5d%5bkey:alignment_track,name:other%20alignments,annots:NG%20Alignments%7CRefseq%20Alignments%7CGnomon%20Alignments%7CUnnamed,shown:false%5d&v=1:20&appname=ncbiblast&link_loc=fromSubjhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dtr_44835http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer/?RID=2ZVUWC7711N&id=lcl%7C44835&tracks=%5bkey:sequence_track,name:Sequence,display_name:Sequence,id:STD1,category:Sequence,annots:Sequence,ShowLabel:true%5d%5bkey:gene_model_track,CDSProductFeats:false%5d%5bkey:alignment_track,name:other%20alignments,annots:NG%20Alignments%7CRefseq%20Alignments%7CGnomon%20Alignments%7CUnnamed,shown:false%5d&v=1:20&appname=ncbiblast&link_loc=fromHSP

57

Query 181 GATGTTGCGATTACTTCGCCAACTATTGCGATAACAAGAAAAAGCCAGCCTTTCATGATA 240

Query 241 TATCTCCCAATTTGTGTAGGGCTTATTATGCACGCTTAAAAATAATAAAAGCAGACTTGA 300

Query 301 CCTGATAGTTTGGCTGTGAGCAATTATGTGCTTAGTGCATCTAACGCTTGAGTTAAGCCG 360

Query 361 CGCCGCGAAGCGGCGTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGT 420

Query 421 GATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCG 480

Query 481 ATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCACGTATGACGGGCTGATACTGGGC 540

Query 541 CGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACCTCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTAC 600

Query 601 TGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTC 660

Query 661 GGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGG 720

Query 721 AACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGC 780

Query 781 TTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAG 840

Query 841 AATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGG 900

Query 901 AATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCC 960

Query 961 AGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAG 1020

Query 1021 CCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCAC 1080

Query 1081 TGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCC 1140

Query 1141 AACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATGATGTTTAA 1200

Query 1201 CTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACA 1260

Query 1261 TCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACCCCAAA 1320

58

Query 1321 AAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGT 1380

Query 1381 CAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGCTTACGAACCGA 1440

Query 1441 ACAGGCTTATGTCCACTGGGTTCGTGCCTTCATCCGTTTCCACGGTGTGCGTCACCCGGC 1500

Query 1501 AACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAACGAGCGCAAGGT 1560

Query 1561 TTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCT 1620

Query 1621 GTGCACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGAAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCC 1680

Query 1681 GGTGGTGCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCG 1740

Query 1741 TTTGTTCGCCCAGCTTCTGTATGGAACGGGCATGCGGATCAGTGAGGGTTTGCAACTGCG 1800

Query 1801 GGTCAAGGATCTGGATTTCGATCACGGCACGATCATCGTGCGGGAGGGCAAGGGCTCCAA 1860

Query 1861 GGATCGGGCCTTGATGTTACCCGAGAGCTTGGCACCCAGCCTGCGCGAGCAGGGGAATTG 1920

Query 1921 ATCCGGTGGATGACCTTTTGAATGACCTTTAATAGATTATATTACTAATTAATTGGGGAC 1980

Query 1981 CCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAAATTTTTTCACAAAACGGTTTACAAGCATAAAG 2040

Query 2041 CTTGCTCAATCAATCACCGGATCCCCAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTG 2100

Query 2101 CTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCAC 2160

Query 2161 CGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCG 2220

Query 2221 GGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGC 2280

Query 2281 GTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCG 2340

Query 2341 CCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCAC 2400

Query 2401 ACCCGTCCTGTGGATCTGATCAAGAGACAGGATGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGAT 2460

59

Query 2461 GGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCA 2520

Query 2521 CAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCG 2580

Query 2581 GTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCG 2640

Query 2641 CGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACT 2700

Query 2701 GAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCT 2760

Query 2761 CACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACG 2820

Query 2821 CTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGT 2880

Query 2881 ACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC 2940

Query 2941 GCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTC 3000

Query 3001 GTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGA 3060

Query 3061 TTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACC 3120

Query 3121 CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGT 3180

Query 3181 ATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA 3240

Query 3241 GCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATT 3300

Query 3301 TCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCG 3360

Query 3361 GCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCGGGCTCG 3420

Query 3421 ATCCCCTCGCGAGTTGGTTCAGCTGCTGCCTGAGGCTGGACGACCTCGCGGAGTTCTACC 3480

Query 3481 GGCAGTGCAAATCCGTCGGCATCCAGGAAACCAGCAGCGGCTATCCGCGCATCCATGCCC 3540

Query 3541 CCGAACTGCAGGAGTGGGGAGGCACGATGGCCGCTTTGGTCGAGATTTTCAGGAGCTAAG 3600

60

Query 3601 GAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCAT 3660

Query 3661 CGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTT 3720

Query 3721 CAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCG 3780

Query 3781 GCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATG 3840

Query 3841 AAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAG 3900

Query 3901 CAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTA 3960

Query 3961 CACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGG 4020

Query 4021 TTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGAT 4080

||||||||||||||||||||

Sbjct 1 CCCTGGGTGAGTTTCACCAG 20

Query 4081 TTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTAT 4140

Query 4141 ACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGAT 4200

Query 4201 GGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGC 4260

Query 4261 GGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAA 4320

Query 4321 TAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAAC 4380

Query 4381 CCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTC 4440

Query 4441 TTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAG 4500

Query 4501 GACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTG 4560

Query 4561 CACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAG 4620

Query 4621 GCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACG 4680

Query 4681 CGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCC 4740

61

Query 4741 GCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGA 4800

Query 4801 TCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATT 4860

Query 4861 TATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATAC 4920

Query 4921 CTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATG 4980

Query 4981 GAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCT 5040

Query 5041 TGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCA 5100

Query 5101 TCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCA 5160

Query 5161 TGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGC 5220

Query 5221 AGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGA 5280

Query 5281 CCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGA 5340

Query 5341 AGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCT 5400

Query 5401 GTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCT 5460

Query 5461 GGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCAT 5520

Query 5521 GTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCC 5580

Query 5581 CCATGAACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGC 5640

Query 5641 CCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGA 5700

Query 5701 GCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCT 5760

Query 5761 TTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCT 5820

Query 5821 CCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGG 5880

62

Query 5881 CGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAG 5940

Query 5941 CGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCAT 6000

Query 6001 ATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCC 6060

Query 6061 GCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCT 6120

Query 6121 CACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATG 6180

Query 6181 TGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTC 6240

Query 6241 CATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA 6300

Query 6301 AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCT 6360

Query 6361 CCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTG 6420

Query 6421 GCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAG 6480

Query 6481 CTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTAT 6540

Query 6541 CGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAAC 6600

Query 6601 AGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAAC 6660

Query 6661 TACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC 6720

Query 6721 GGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTT 6780

Query 6781 TTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATC 6840

Query 6841 TTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATG 6900

Query 6901 AGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCA 6960

Query 6961 ATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCA 7020

63

Query 7021 CCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAG 7080

Query 7081 ATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGAC 7140

Query 7141 CCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGC 7200

Query 7201 AGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCT 7260

Query 7261 AGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATC 7320

Query 7321 GTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGG 7380

Query 7381 CGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATC 7440

Query 7441 GTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAAT 7500

Query 7501 TCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAG 7560

Query 7561 TCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGAT 7620

Query 7621 AATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGG 7680

Query 7681 CGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCA 7740

Query 7741 CCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGA 7800

Query 7801 AGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTC 7860

Query 7861 TTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATA 7920

Query 7921 TTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTG 7980

Query 7981 CCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATC 8040

Query 8041 ACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCT

64

Lampiran 2.

U46780:Synthetic construct trap vector for...

Query ID

gi|1197593|gb|U46780.1|SCU46780

Description

Synthetic construct trap vector for isolation of bacterial IS elements, aminoglycoside-

3:adenyltransferase (aadA), neomycin phosphotransferase (neo), chloramphenicol acetyl

transferase (cat), beta-lactamase (bla) genes, complete cds

Molecule type

nucleic acid

Query Length

8097

Subject ID

lcl|32329

Description

None

Molecule type

nucleic acid

Subject Length

20

Other reports: Search Summary

Dot Matrix View

Plot of gi|1197593|gb|U46780.1|SCU46780 vs lcl|32329

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=Search&db=nucleotide&term=U46780.1&dopt=GenBankhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

65

Descriptions

Sequences producing significant alignments:

Select:AllNone Selected:0

Alignments Download Graphics Show/hide columns of the table presenting sequences producing

significant alignments

Sequences producing significant alignments:

Select for downloading or viewing reports Description Score Percent Ident Accession

None provided -16124.0 0% 32329

Alignments

Download Graphics Next Previous Descriptions

Sequence ID: lcl|32329Length: 20Number of Matches: 1

Related Information

Range 1: 1 to 20Graphics Next Match Previous Match

Alignment statistics for match #1

NW Score Identities Gaps Strand

-16124 20/8097(0%) 8077/8097(99%) Plus/Plus

Query 1 GGGGATCCGGTGATTGATTGAGCAAGCTTTATGCTTGTAAACCGTTTTGTGAAAAAATTT 60

Query 61 TTAAAATAAAAAAGGGGACCTCTAGGGTCCCCAATTAATTAGTAATATAATCTATTAAAG 120

Query 121 GTCATTCAAAAGGTCATCCACCGGATCAGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAGATTTTAATGCG 180

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alignInfohttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dsDownloadhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dsConfighttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dsConfighttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dsConfighttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Get&ALIGNMENTS=100&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&BLAST_SPEC=GlobalAln&DATABASE_SORT=0&DESCRIPTIONS=100&DYNAMIC_FORMAT=on&FIRST_QUERY_NUM=0&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_PAGE_TARGET=&FORMAT_TYPE=HTML&I_THRESH=&LINE_LENGTH=60&MASK_CHAR=2&MASK_COLOR=1&NUM_OVERVIEW=0&OLD_BLAST=false&PAGE=Nucleotides&QUERY_INDEX=0&QUERY_NUMBER=0&RESULTS_PAGE_TARGET=&RID=2ZVKKS4011N&SHOW_LINKOUT=yes&STEP_NUMBER=&WORD_SIZE=11&OLD_VIEW=false&DISPLAY_SORT=1&HSP_SORT=1http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_32329http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgihttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dlgDwnl_32329http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer/?RID=2ZVKKS4011N&id=lcl%7C32329&tracks=%5bkey:sequence_track,name:Sequence,display_name:Sequence,id:STD1,category:Sequence,annots:Sequence,ShowLabel:true%5d%5bkey:gene_model_track,CDSProductFeats:false%5d%5bkey:alignment_track,name:other%20alignments,annots:NG%20Alignments%7CRefseq%20Alignments%7CGnomon%20Alignments%7CUnnamed,shown:false%5d&v=1:20&appname=ncbiblast&link_loc=fromSubjhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#dtr_32329http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer/?RID=2ZVKKS4011N&id=lcl%7C32329&tracks=%5bkey:sequence_track,name:Sequence,display_name:Sequence,id:STD1,category:Sequence,annots:Sequence,ShowLabel:true%5d%5bkey:gene_model_track,CDSProductFeats:false%5d%5bkey:alignment_track,name:other%20alignments,annots:NG%20Alignments%7CRefseq%20Alignments%7CGnomon%20Alignments%7CUnnamed,shown:false%5d&v=1:20&appname=ncbiblast&link_loc=fromHSP

66

Query 181 GATGTTGCGATTACTTCGCCAACTATTGCGATAACAAGAAAAAGCCAGCCTTTCATGATA 240

Query 241 TATCTCCCAATTTGTGTAGGGCTTATTATGCACGCTTAAAAATAATAAAAGCAGACTTGA 300

Query 301 CCTGATAGTTTGGCTGTGAGCAATTATGTGCTTAGTGCATCTAACGCTTGAGTTAAGCCG 360

Query 361 CGCCGCGAAGCGGCGTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGT 420

Query 421 GATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCG 480

Query 481 ATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCACGTATGACGGGCTGATACTGGGC 540

Query 541 CGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACCTCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTAC 600

Query 601 TGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTC 660

Query 661 GGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGG 720

Query 721 AACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGC 780

Query 781 TTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAG 840

Query 841 AATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGG 900

Query 901 AATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCC 960

Query 961 AGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAG 1020

Query 1021 CCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCAC 1080

Query 1081 TGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCC 1140

Query 1141 AACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATGATGTTTAA 1200

Query 1201 CTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACA 1260

Query 1261 TCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACCCCAAA 1320

67

Query 1321 AAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGT 1380

Query 1381 CAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGCTTACGAACCGA 1440

Query 1441 ACAGGCTTATGTCCACTGGGTTCGTGCCTTCATCCGTTTCCACGGTGTGCGTCACCCGGC 1500

Query 1501 AACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAACGAGCGCAAGGT 1560

Query 1561 TTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCT 1620

Query 1621 GTGCACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGAAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCC 1680

Query 1681 GGTGGTGCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCG 1740

Query 1741 TTTGTTCGCCCAGCTTCTGTATGGAACGGGCATGCGGATCAGTGAGGGTTTGCAACTGCG 1800

Query 1801 GGTCAAGGATCTGGATTTCGATCACGGCACGATCATCGTGCGGGAGGGCAAGGGCTCCAA 1860

Query 1861 GGATCGGGCCTTGATGTTACCCGAGAGCTTGGCACCCAGCCTGCGCGAGCAGGGGAATTG 1920

Query 1921 ATCCGGTGGATGACCTTTTGAATGACCTTTAATAGATTATATTACTAATTAATTGGGGAC 1980

Query 1981 CCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAAATTTTTTCACAAAACGGTTTACAAGCATAAAG 2040

Query 2041 CTTGCTCAATCAATCACCGGATCCCCAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTG 2100

Query 2101 CTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCAC 2160

Query 2161 CGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCG 2220

Query 2221 GGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGC 2280

Query 2281 GTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCG 2340

Query 2341 CCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCAC 2400

Query 2401 ACCCGTCCTGTGGATCTGATCAAGAGACAGGATGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGAT 2460

68

Query 2461 GGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCA 2520

Query 2521 CAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCG 2580

Query 2581 GTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCG 2640

Query 2641 CGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACT 2700

Query 2701 GAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCT 2760

Query 2761 CACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACG 2820

Query 2821 CTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGT 2880

Query 2881 ACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC 2940

Query 2941 GCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTC 3000

Query 3001 GTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGA 3060

Query 3061 TTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACC 3120

Query 3121 CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGT 3180

Query 3181 ATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA 3240

Query 3241 GCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATT 3300

Query 3301 TCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCG 3360

Query 3361 GCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCGGGCTCG 3420

Query 3421 ATCCCCTCGCGAGTTGGTTCAGCTGCTGCCTGAGGCTGGACGACCTCGCGGAGTTCTACC 3480

Query 3481 GGCAGTGCAAATCCGTCGGCATCCAGGAAACCAGCAGCGGCTATCCGCGCATCCATGCCC 3540

Query 3541 CCGAACTGCAGGAGTGGGGAGGCACGATGGCCGCTTTGGTCGAGATTTTCAGGAGCTAAG 3600

69

Query 3601 GAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCAT 3660

||||||||||||||||||||

Sbjct 1 CCGTTGATATATCCCAATGG 20

Query 3661 CGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTT 3720

Query 3721 CAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCG 3780

Query 3781 GCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATG 3840

Query 3841 AAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAG 3900

Query 3901 CAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTA 3960

Query 3961 CACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGG 4020

Query 4021 TTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGAT 4080

Query 4081 TTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTAT 4140

Query 4141 ACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGAT 4200

Query 4201 GGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGC 4260

Query 4261 GGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAA 4320

Query 4321 TAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAAC 4380

Query 4381 CCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTC 4440

Query 4441 TTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAG 4500

Query 4501 GACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTG 4560

Query 4561 CACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAG 4620

Query 4621 GCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACG 4680

Query 4681 CGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCC 4740

70

Query 4741 GCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGA 4800

Query 4801 TCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATT 4860

Query 4861 TATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATAC 4920

Query 4921 CTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATG 4980

Query 4981 GAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCT 5040

Query 5041 TGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCA 5100

Query 5101 TCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCA 5160

Query 5161 TGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGC 5220

Query 5221 AGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGA 5280

Query 5281 CCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGA 5340

Query 5341 AGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCT 5400

Query 5401 GTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCT 5460

Query 5461 GGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCAT 5520

Query 5521 GTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCC 5580

Query 5581 CCATGAACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGC 5640

Query 5641 CCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGA 5700

Query 5701 GCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCT 5760

Query 5761 TTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCT 5820

Query 5821 CCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGG 5880

71

Query 5881 CGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAG 5940

Query 5941 CGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCAT 6000

Query 6001 ATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCC 6060

Query 6061 GCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCT 6120

Query 6121 CACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATG 6180

Query 6181 TGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTC 6240

Query 6241 CATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA 6300

Query 6301 AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCT 6360

Query 6361 CCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTG 6420

Query 6421 GCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAG 6480

Query 6481 CTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTAT 6540

Query 6541 CGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAAC 6600

Query 6601 AGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAAC 6660

Query 6661 TACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC 6720

Query 6721 GGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTT 6780

Query 6781 TTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATC 6840

Query 6841 TTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATG 6900

Query 6901 AGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCA 6960

Query 6961 ATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCA 7020

72

Query 7021 CCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAG 7080

Query 7081 ATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGAC 7140

Query 7141 CCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGC 7200

Query 7201 AGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCT 7260

Query 7261 AGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATC 7320

Query 7321 GTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGG 7380

Query 7381 CGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATC 7440

Query 7441 GTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAAT 7500

Query 7501 TCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAG 7560

Query 7561 TCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGAT 7620

Query 7621 AATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGG 7680

Query 7681 CGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCA 7740

Query 7741 CCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGA 7800

Query 7801 AGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTC 7860

Query 7861 TTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATA 7920

Query 7921 TTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTG 7980

Query 7981 CCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAA