ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORALDEL LITORAL

Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de la Producciónla ProducciónTesis de GradoTesis de Grado

Previo a la obtención del título dePrevio a la obtención del título de

INGENIERO AGROPECUARIOINGENIERO AGROPECUARIOPresentado por:Presentado por:

Omar Oswaldo Olvera VacaOmar Oswaldo Olvera VacaDirector: Rodolfo Maribona H.Director: Rodolfo Maribona H.

Guayaquil - EcuadorGuayaquil - Ecuador20032003

“INFLUENCIA DE FACTORES ABIÓTICOS SOBRE LA

EXPRESIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL BANANO (BSV) EN

PLANTAS DE BANANO”

ANTECEDENTESANTECEDENTES• En 1998, la superficie afectada por el “Fenómeno del

Niño” fue de 24.803 ha que afectó a la economía agrícola ecuatoriana.

• El estrés ocasionado por la saturación hídrica de los suelos y los cambios de temperatura provocaron el incremento de síntomas del BSV.

• Oficialmente la intensidad de esta epifítia no ha sido

monitoreada.

• En la actualidad, la presencia del BSV ha comenzado extendiéndose a lugares tales como: Patricia Pilar, Quevedo, Empalme, Valencia, La Maná, Vinces, Milagro, El Triunfo y Bucay.

ANTECEDENTESANTECEDENTES

-- EL BSV frecuentemente se confunde en las primeras EL BSV frecuentemente se confunde en las primeras etapas con la infección del Virus del Mosaico del Pepino etapas con la infección del Virus del Mosaico del Pepino (CMV), deficiencia de P. y variación somaclonal.(CMV), deficiencia de P. y variación somaclonal. -El efecto del cultivo de tejidos de meristema no logra un -El efecto del cultivo de tejidos de meristema no logra un saneamiento del BSV debido a que se integra al genoma saneamiento del BSV debido a que se integra al genoma de la célula de la planta (AAB).de la célula de la planta (AAB).

HIPÓTESISHIPÓTESIS

EXISTE INFLUENCIA DE FACTORES ABIÓTICOS QUE CAUSAN LA

EXPRESIÓN DEL BSV.

OBJETIVO GENERALOBJETIVO GENERAL- Establecer los síntomas típicos ocasionados por el Virus del - Establecer los síntomas típicos ocasionados por el Virus del Rayado del Banano (BSV) y su efecto sobre el vigor en plantas Rayado del Banano (BSV) y su efecto sobre el vigor en plantas de banano en distintas etapas de desarrollo sometidas a estrés de banano en distintas etapas de desarrollo sometidas a estrés abióticoabiótico..

OBJETIVOS ESPECÍFICOSOBJETIVOS ESPECÍFICOS- Establecer el diagnóstico diferencial visual en plantas adultas - Establecer el diagnóstico diferencial visual en plantas adultas de banano.de banano.- Estudiar los efecto del estrés térmico, hídrico y la influencia - Estudiar los efecto del estrés térmico, hídrico y la influencia hormonal en la expresión de los síntomas del BSV y vigor en hormonal en la expresión de los síntomas del BSV y vigor en plantas juveniles cultivadas plantas juveniles cultivadas in vitro.in vitro.- Detectar precozmente los síntomas del BSV en plantas - Detectar precozmente los síntomas del BSV en plantas procedentes de cultivo de tejido.procedentes de cultivo de tejido.- Confirmar la sintomatología mediante la comprobación de la - Confirmar la sintomatología mediante la comprobación de la presencia del BSV en las hojas de Banano por presencia del BSV en las hojas de Banano por Microscopía Microscopía electrónica.electrónica.

DESCRIPCIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL DESCRIPCIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL BANANO (BSV)BANANO (BSV)

Reichel, H., Belalcazar, S.

Bell Lockhart ESPOL 2000

INFECCION VIRAL DEL BSV EN INFECCION VIRAL DEL BSV EN UNA CELULA VEGETALUNA CELULA VEGETAL

SINTOMAS POR DIFICIENCIAS DE FOSFORO SINTOMAS POR DIFICIENCIAS DE FOSFORO Y ZINCY ZINC

Fig. a) Deficiencia de fósforo

INPOFOS 1995

Fig. b) Deficiencia de Zinc

INPOFOS 1995

SINTOMAS POR TOXICIDAD Y CMVSINTOMAS POR TOXICIDAD Y CMV

Fig. c) Toxicidad por herbicida

INPOFOS 1995

Fig. d) sintomas del Virus del Mosaico del Pepino (CMV)

(Dr H.J. Su, National Taiwan University, Taipei)

MATERIALESMATERIALESEtapa1. Identificación de los síntomas y

Purificación del BSV. • Muestras foliares del clon Valery• Tubos de ensayo, pipetas, papel filtro,

licuadora, balanza, peachimetro(Modelo 15) • Centrifuga (Hitachi SCR 208,Rotor RPR9-260,RPM

=8500).• Ultracentrifuga (Hitachi SSP-72,Rotor,RP65T-

627,RPM=65000)• Triton x-100,Mercaptoetanol,Tris, Polivinilpirrolidona

Etapa 2.Propagación in vitroEtapa 2.Propagación in vitro

• 30 hijuelos (Valery)• Herramientas de limpieza• Equipos de laboratorio• Medio normal de Murashige y Skoog• Reactivos: polietilen glicol(PEG),6-

bencilaminopurina(BAP) y temperatura• Equipo de computación• Literatura consultada

MÉTODOMÉTODOEtapa 1• Identificación de los síntomas de BSV en plantas adultas

de banano, en la Agrícola Martinica provincia de Los Ríos.• El diagnóstico visual fue confirmado por inmunoensayo

(Lockhart B.) y se comprobó por microscopía electrónica la presencia de la partícula viral.

• Se utilizó el protocolo del Dr. Lockhart 1986, se realizó ciertas modificaciones (Instituto Higiene Izquieta Pérez Guayaquil).

MÉTODOMÉTODO

Etapa 2• Se recolectó hijuelos de plantas madres enfermas y

sanas que estaban diagnosticadas.• Estos hijuelos fueron micropropagados en el

laboratorio de SEBIOCA-ESPOL.• Las plántulas asintomáticas, obtenidas por

micropropagación, cultivadas in vitro en condiciones de estrés por frío, estrés hídrico y hormonal.

Plantas adultas de banano Rayado amarillo en hojas inferiores

Etapa 1: Recolección del material en el campo. •Identificación de las plantas adultas de banano del clon Valery con los síntomas foliares causados por el BSV.

OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL VIRUS PARA EL DIAGNÓSTICO.VIRUS PARA EL DIAGNÓSTICO.

Tomar hojas inferiores con síntoma de BSV

Incubar a 4º C Extraer 125g / tejido 4 volúmenes de Tampón de extracción

1 (*) 2 3

Homogenizar 1minuto/3 veces

Filtrar con gaza doble

Mezclar extracto con 1/3 v /cloroformo (-4º C)

4 5 6

Agitar por 1 minuto

Centrifugar 10' /10.000g

Dializar y concentrar con Polietilen glicol/

hasta 100ml (-4º C)

7 8 9 (*)

Ultracentrifugar concentrado 1h/136.000g

Conservar precipitado a (-20º C)

Observar por Microscopía-electrónica de transmisión.

10 11 12

Etapa 2. Propagación in vitro de plantas Etapa 2. Propagación in vitro de plantas sanas e infectadassanas e infectadas

Explantación PropagaciónIntroducción

Plántulas en invernadero

ESQUEMA DEL PRECESO DE LOS ESQUEMA DEL PRECESO DE LOS TRATAMIENTOS IN VITROTRATAMIENTOS IN VITRO

Tratamientos correspondientes a la investigación

Medios de cultivos T E M P E R A T U R A

7 18º C 26º C 18° C a 34º C

Enfermas Sanas Enfermas Sanas Enfermas Sanas

1. m1=PEG 1 (3%) 20 20 20 20 20 20

2. m2=PEG 2 (6%) 20 20 20 20 20 20

3. m3=PEG 3 (9%) 20 20 20 20 20 20

4. m4=Sin BAP en el medio 20 20 20 20 20 20

5. m5=5 veces menor /dosis 20 20 20 20 20 20

6. m6=Testigo /dosis normal 20 20 20 20 20 20

7. m7=5 veces mayor /dosis 20 20 20 20 20 20

T O T A L P L A N T A S 840

Variable evaluadasVariable evaluadas

Los parámetros de crecimiento que se evaluaron en los periodos de estrés, enraizamiento y adaptación fueron:

• Área foliar (ancho por largo cm2) • Altura desde la base del pseudo tallo hasta la ¨ V ¨ foliar

en cm.• Peso de todas las plantas de cada tratamiento en gramos • Se valora en cruces (X hasta 4X) el crecimiento radical de

cada tratamiento. Los valores son los siguientes:

X 0-1 raíz

2X 2-3 raíces

3X 4-5 raíces

4X 6-7 raíces

ANÁLISIS ESTADÍSTICOANÁLISIS ESTADÍSTICO• Se utilizó un diseño completamente al azar con un arreglo

factorial, 7 (medios de cultivos) x 2 (presencia – ausencia del virus) x 3 (tipo de temperaturas de 18º C, 26º C y 18º C a 32º C)

Factores en estudio: • Medio de crecimiento• Tipo de planta• Temperatura de crecimiento Interacciones presentes:• Medios de cultivo por tipo de planta• Medios de cultivos por temperatura de crecimiento• Tipo de planta por temperatura de crecimiento• Medio de cultivo por tipo de planta por temperatura de

crecimiento

RESULTADOSRESULTADOSDescripción de las plantas adultas con síntomas.

Los síntomas diferenciales de plantas adultas enfermas en el campo fueron el rayado amarillo que se torna en café oscuro y la presencia de lesiones necróticas en las nervaduras de las hojas inferiores y moteado clorótico. Estos síntomas fueron confirmados por inmunoensayo y microscopia electrónica

Fig. a) Un rayado amarillo .

Fig. c)Lesiones necróticas Fig. b) Un rayado café oscuro

Síntomas atípicos del Virus del Rayado del Banano (BSV)

Fig. a) Los síntomas empiezan desde el borde de la hoja

Fig. b) Síntomas locales en las hojas inferiores

Fig. c) Síntomas del moteado clorótico

Evaluación de síntomas en hijuelosEvaluación de síntomas en hijuelos

Los hijuelos no presentaron ningún rayado amarillo en las hojas antes de la introducción in vitro (Fig. a)

Fig. a) hijuelos asintomáticos

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

m1

i1t1

m1

i1t3

m1

i2t2

m2

i1t1

m2

i1t3

m2

i2t2

m3

i1t1

m3

i1t3

m3

i2t2

m4

i1t1

m4

i1t3

m4

i2t2

m5

i1t1

m5

i1t3

m5

i2t2

m6

i1t1

m6

i1t3

m6

i2t2

m7

i1t1

m7

i1t3

m7

i2t2

Stress Enraizamiento Adaptación

ÁREA FOLIAR EN LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS IN VITRO

**: ALTAMENTE SIGNIFICATIVA

** m4i2t2 , m4i1t1 , m6i1t1 (interacción) ; ns periodo de enraizamiento y adaptación

** 18° C , 26° C

ALTURA DE LAS PLANTULAS ALTURA DE LAS PLANTULAS Evolución Altura de Plantas pos Tratamiento

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Stress Enraizamiento Adaptación

** m4i1t1 ; m4i1t2 ; m6i1t1 ; m4i2t1 (interacción) -ns en el periodo de enraizamiento y adaptación

ns 18° C a 34° C valores bajo de crecimiento.

PESO DE LAS PLANTULAS PESO DE LAS PLANTULAS

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

m1i1

t1

m1i1

t3

m1i2

t2

m2i1

t1

m2i1

t3

m2i2

t2

m3i1

t1

m3i1

t3

m3i2

t2

m4i1

t1

m4i1

t3

m4i2

t2

m5i1

t1

m5i1

t3

m5i2

t2

m6i1

t1

m6i1

t3

m6i2

t2

m7i1

t1

m7i1

t3

m7i2

t2

Stress Enraizamiento

** m4, m5, m6 (medios)ns m2, m3, (Peg 6% y 9%)

CRECIMIENTO RADICULAR EN EL CRECIMIENTO RADICULAR EN EL PERIODO DE ESTRESPERIODO DE ESTRES

Crecimiento Radicular

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41

Tratamientos

Porc

enta

je

X 2X 3X 4X

m4,(19-24); m5,(25-30) mayor crecimiento radicular.

m7,(37-42) menor crecimiento radicular, m3,(13-18 Peg 9%)

Plántulas con síntomas precoces de BSV en cultivo in vitro en combinación con estrés de frío e hídrico

Fig. a) Plántulas con PEG al 3% a 18º C

Fig. b) Testigo.

Vitroplantas con síntomas precoz causado por el virus

Plántulas con síntomas por BSV en el periodo de invernadero

Fig. a) un rayado amarillo en las hojas

Fig. b) testigo.

Plantas de variación somaclonal

Fig. a) tipo variegado

Aislamiento, purificación y caracterización del virus Aislamiento, purificación y caracterización del virus mediante la tinción negativa al 1% de ácido mediante la tinción negativa al 1% de ácido Fosfotúngstico, de fracciones virales purificadas por Fosfotúngstico, de fracciones virales purificadas por CsCl, fueron observadas al microscopio electrónico CsCl, fueron observadas al microscopio electrónico

Partículas virales baciliformes del virus del rayado del banano (BSV).

CONCLUSIONESCONCLUSIONES• Los síntomas diferenciales de plantas adultas enfermas en

el campo fueron el rayado amarillo que se torna en café oscuro y la presencia de lesiones necróticas en las nervaduras de las hojas inferiores y un moteado clorótico en el área foliar. Esto síntomas permiten diferenciar el BSV de otras enfermedades.

• Existió un crecimiento vegetativo heterogéneo de las plantas sanas y enfermas en el periodo de estrés de los tratamientos in vitro de 18° C y 26° C. La presencia de concentraciones mayores de PEG de 6% y 9% disminuye el crecimiento vegetativo in vitro. En el periodo de enraizamiento y adaptación se recuperaron significativamente.

• Las plántulas enfermas en condiciones de cultivo in vitro presentaron síntomas de la enfermedad en un 20 %, cuando fueron sometidas al estrés combinado de frío y estrés hídrico. Estos síntomas aumentaron a un 50 %, cuando las plántulas fueron transplantadas y cultivadas en el invernadero, se observó que los síntomas resultaron semejantes a las que se presentan en plantas adultas enfermas con el BSV presencia de un rayado amarillo en las hojas.

• Por primera vez en el Ecuador se logró el aislamiento, purificación por ultracentrifugación en CsCl y caracterización por microscopia electrónica de un virus de planta realizado mediante modificaciones exitosas del protocolo descrito por Lockhart, 1986.

RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES• Difundir en la práctica agrícola bananera los síntomas

descritos en este trabajo que permiten diferenciar el BSV de otras enfermedades.

• Introducir en la práctica de la micropropagación comercial de banano el diagnóstico precoz establecido para plántulas en la fase de endurecimiento en invernadero.

• Descifrar los mecanismos moleculares que inducen la aparición de los síntomas de la enfermedad del BSV cuando las plántulas son sometidas al estrés combinado de frío e hídrico.

• Basado en el diagnóstico diferencial visual establecido para plantas adultas, monitorear la presencia de la enfermedad y erradicar las plantas enfermas.

AGRADECIMIENTO A:Dra. Sofia KornevaDr. Anselmo OteroDr. Amano GasupiDr. Miguel RamosDr. Sabino HernándezSr. Cyndrich MiljenkoIng. Bernardo ManzanoBiol. José FloresBiol. Miguel GutiérrezSr. Jorge VillavicencioMSc. Florence Malafose (INIBAP).• Dejo constancia de mi profundo aprecio por creer en la

juventud que sí podemos hacer investigaciones aplicadas para resolver problemas nacionales como es el Virus del Rayado del Banano (BSV), al Dr. Rodolfo Maribona, Director de mí Tesis, por su ayuda invaluable.