ANTÍGENOS DE ASPERGILLUSAspergillus antigens 52942Aspergillus fumigatus antigens 52962Aspergillus fumigatus positive control serum 61681Aspergillus positive control sera 61682

SERODIAGNOSTICO DEL ASPERGILLUS PORREACCIONES DE INMUNOPRECIPITACION

IVD

1- VALOR CLINICOBio-Rad produce varios antígenos de aspergillus para el serodiagnóstico dela aspergilosis a través de la reacción de inmunoprecipitación.Es más fácil proceder al diagnóstico de la aspergilosis mediante lademostración de anticuerpos específicos en el suero de los pacientes que eldiagnóstico a través de la identificación directa del hongo.

2- PRINCIPIOLos antígenos Bio-Rad pueden utilizarse en diferentes reacciones deinmunoprecipitación.Estas son las dos técnicas que resultan particularmente útiles:• IINMUNOELECTROFORESIS (IEP)• ELECTROSINÉRESIS (ES) Las técnicas de inmunoprecipitación aumentan más la precisión deldiagnóstico de la aspergilosis gracias a la identificación de anticuerposespecíficos para las dos enzimas, la quimotripsina y la catalasa, presentesen los extractos antigénicos. Su actividad enzimática se revela a través de losarcos de precipitación.

3- PRESENTACION• Aspergillus fumigatus antigens (Antígenos de Aspergillus fumigatus),

código 529622 frascos de antígenos liofilizados para reconstituir en 1 ml de aguadestilada estéril (aproximadamente unas 10 reacciones).- Aspergillus fumigatus metabolic antigen- Aspergillus fumigatus somatic antigen

• Aspergillus antigens (Antígenos de Aspergillus), código 529424 frascos de antígenos liofilizados para reconstituir en 1 ml de aguadestilada estéril (aproximadamente unas 10 reacciones).- Aspergillus flavus metabolic antigen- Aspergillus nidulans metabolic antigen - Aspergillus niger metabolic antigen- Aspergillus terreus metabolic antigen

• Aspergillus fumigatus positive control serum (Suero de control positivo delAspergillus fumigatus), código 616811 frasco de suero de conejo liofilizado anti-Aspergillus fumigatus parareconstituir en 1 ml de agua destilada estéril.

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• Aspergillus positive control sera (Suero de control positivo del Aspergillus),código 616821 frasco de suero de conejo liofilizado anti-Aspergillus para reconstituir en 1 ml de agua destilada estéril.- Aspergillus flavus positive control serum- Aspergillus nidulans positive control serum- Aspergillus niger positive control serum- Aspergillus terreus positive control serum

4- COMPOSICIONAntígenos (dos tipos):

• Antígeno metabólico, obtenido por filtración de cultivos tras 10 días deincubación a 30ºC.

• Antígeno somático o celular obtenido de jóvenes cultivos miceliales (3días, sin esporas) que son prensados y removidos a 30°C.

5- ALMACENAJEEn forma liofilizada, los reactivos almacenados a +2-8ºC, en un lugar seco,se mantienen estables hasta la fecha de caducidad que se indica en el kit.Tras la reconstitución: el antígeno puede almacenarse varios meses a –20ºCen varias partes alícuotas. No descongelar / congelar el antígenorepetidamente.

6- MUESTRAS1. Realice las pruebas únicamente con muestras de suero procedentes de

tubos secos.2. Observe las siguientes recomendaciones para la manipulación,

procesamiento y almacenaje de las muestras de suero:- Recoja todas las muestras de suero siguiendo las precauciones

acostumbradas.- Deje que las muestras se coagulen totalmente antes de proceder a la

centrifugación. - Mantenga siempre los tubos tapados.- Tras la centrifugación, separe el suero y almacénelo en un tubo de

almacenaje tapado herméticamente.- Las muestras pueden almacenarse a +2-8ºC si van a examinarse en el

plazo de 24 horas.

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- Si no va a realizarse el ensayo en un plazo de 24 horas, o si van atransportarse las muestras, congélelas a – 20ºC o menos.

- Preferiblemente, descongele las muestras una sola vez. Las muestraspreviamente congeladas deberían mezclarse a conciencia después dedescongelarlas y antes de someterlas a la prueba.

3. Se desconocen las interferencias debidas a unos elevados niveles dealbúmina o bilirrubina. No utilice muestras lipémicas o hemolizadas.

4. No caliente las muestras.

7- PROCEDIMIENTOA)METARIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS• Barbital sódico• Ácido clorhídrico• Agua destilada• Barbital• Glicina• Tampón tris 0,05M pH7• Azarosa• H2O2 30%• Éster naftil fenilalanina N-acetil-DL• Dimetilformamida• Diazoblue B

B) INMUNOELECTROFOROSIS (foto 1)La inmunoelectroforosis (Grabar) puede realizarse en portaobjetos de cristalpara el examen microscópico.• Prepare un gel utilizando agar purificado o agarosa al 1% mezclada con

una solución tampón de barbital con un pH 8,2 (añadiendo mertiolato1/10.000).

• Haga en el gel una ranura de 60 mm de largo por 2 mm de ancho y dosagujeros de 2 mm de diámetro en ambos lados de la ranura y a unadistancia de 4 mm (véase diagrama).

• Coloque 20 µl de antígeno no diluido en los dos agujeros laterales.• Durante una hora y treinta minutos, aplique un potencial de 5

voltios/centímetro en los extremos del portaobjetos.• Coloque el suero en la ranura central y deje que se esparza durante 48

horas en una atmósfera húmeda y a una temperatura ambiente (18-30°C).• Al tercer día, sumerja el portaobjetos durante 24 horas en una solución de

lavado.24

• Lea el portaobjetos al 4º día. Quizá necesite utilizar el coloranteCoomassie Blue para leer las características más sutiles de la reacción deprecipitación.

C) ELECTROSINERESIS (fig. 1)La electrosinéresis (Bussard) o contraelectroforesis puede efectuarseutilizando gel de agarosa o acetato de celulosa. Se trata de una sencillatécnica, muy sensible y rápida, que resulta de gran utilidad para examinargrandes cantidades de suero.• Si utiliza gel de agarosa y el portaobjetos de un microscópico, corte los

agujeros tal como se indica en el diagrama: los antígenos colocados en ellado del cátodo (-), el suero colocado en el lado del ánodo (+). Losagujeros deberán tener un diámetro de 2 mm y estar separados por unadistancia de 6 mm.

• Llene los agujeros de los antígenos con soluciones puras diluidas a la 1/2y a 1/4 parte. Llene los agujeros de los sueros con 20 microlitros.

• Aplique un potencial de 5 voltios/centímetro durante una hora y treintaminutos.

• Normalmente, la reacción se lee inmediatamente después de la migración.• Si se precisa el colorante Coomassie Blue, éste deberá ir precedido por

dos lavados consecutivos: en suero fisiológico (durante 1 noche) y despuésen agua destilada (24 horas), seguido por el secado.

Se recomienda probar paralelamente los controles positivos siguiendo elmismo procedimiento que en el caso de los antígenos.

D) IDENTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA EN DETERMINADOSARCOS DE PRECIPITACION

Los arcos observados con mayor frecuencia tras la inmunoelectroforesis sonlos C y J (véase diagrama) e indican la actividad enzimática (C: quimotripsina y J: catalasa). En las reacciones específicas (BIGUET et al.)(véase anexo) se ofrece una mayor evidencia de la presencia de estasenzimas.

E) PREPARACION DEL REACTIVO1) TAMPONES- VERONAL pH 8,2

Barbital sódico 15,85 gHCl 1N 23 mlH2O q.s.p. 1000 ml

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- BARBITAL- BARBITAL SÓDICO TRIS GLICINA (BBNa TG) pH 8,8A. Barbital sódico 65 g

Barbital 10,35 gH2O q.s.p 5000 ml

B. Glicina 281 gTris 226 gH2O q.s.p 5000 ml

Tras la mezcla de volúmenes equivalentes de las soluciones a y b, se obtieneun tampón con un pH de 8,8 y una osmolaridad de 0,08.

2) AGAROSA 1% (PESO/VOLUMEN)Agarosa 10 gH2O 500 ml

Lleve a ebullición y a continuación enfríe (a unos 60 °C.)Añada :

Tampón de barbital pH 8,2 500 mlO

Tampón de BBNa TG pH 8,8 500 ml(diluido al 50% con agua destilada).

3) CATALASAH2O2 30%, diluida en tampon de TRIS 0,05M pH7 (0,3 ml de H2O2 + 50 mlde tampón) en la azarosa de la inmunoelectroforesis.Reacción positiva: burbujas alrededor del arco específico.

4) QUIMOTRIPSINA- SOLUCIÓN A

Éster naftil fenilalanina N-acetil-DL 5 mgDimetilformamida 2 ml

- SOLUCIÓN BDiazoblue B 10 mgTampón de Tris 0,05 M pH 7,4 18 ml

Antes de utilizar la solución mezcla A* & B*, incube la membrana deelectrosinéresis durante 30 minutos a 37ºC en esta mezcla.Elimine la mezcla, incube durante toda la noche a 37ºC en 18 ml dereactivo B.Lave las membranas con agua.Reacción positiva: los arcos de color violeta corresponden a una actividadquimotrípsica.

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F) TABLA DE RESUMENP.J. SVENDSEN MANUAL DE INMUNOELECTROFORESIS CUANTITATIVA,FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. EDITORES: EXELSEN KROLL-WEEXE. Análisisde los ANTÍGENOS DE ASPERGILLUS (Tabla).

* Vease procedimiento 6 (preparacion de los reactivos e)

8- INTERPRETACIONLa presencia de los arcos de precipitación que utilizan las técnicas deinmunoprecipitación contra un antígeno de Aspergillus indica la existenciade aspergilosis infecciosa.Debido a su mayor rapidez, para el examen es preferible la electrosinéresisque la inmunoelectroforesis. No obstante, los suero que se revelen positivoscon esta técnica deberán confirmarse con la inmunoelectroforesis. Laactividad enzimática de la quimotripsina y de la catalasa en determinadasprecipitaciones ofrece una mayor evidencia de su especificidad.En caso de aspergilosis broncopulmonar o difusa, las pruebas se demuestranpositivas en el 80-90% de los casos y generalmente se observan arcosespecíficos.

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Tampones Voltaje Duración Colorantes

Inmunoelectroforesis Agarosa 1%/ 5 V / cm 90 mnTampón de veronal pH 8,2 Coomassie

Agarosa 1%/ 25 V / cm 60 mnBlue

Tampón de BBNa-TG pH 8,8

Electrosinéresis Agarosa 1%/ 5 V / cm 90 mnTampón de veronal pH 8,2 Coomassie

Agarosa 1%/ 10 V / cm 60 mn BlueTampón de BBNa-TG pH 8,8

Catalasa Agarosa 1%/ 5 V / cm 90 mn H2O2 diluido*Tampón de veronal pH 8,2 Reacción positiva:

Agarosa 1%/ 25 V / cm 60 mnburbujas alrededor

Tampón de BBNa-TG pH 8,8del arco J

Quimotripsina Agarosa 1%/ 5 V / cm 90 mn A* et B* reagentsTampón de veronal 8,2 Reacción positiva:

Agarosa 1%/ 25 V / cm 60 mn color violeta Tampón de BBNa-TG pH 8,8 del arco C

Pur O O O O O O1/2 O O O O O O1/4 O O O O O O

1 S 2 S 1 ou 2 Sr

photo 1

1 et 2 : AntígenosS : Suero colocadoSr : Suero de control

Fig. 1

photo 2

photo 3

En el aspergiloma, las reacciones son altamente positivas: normalmentepueden observarse de 5 a 10 arcos y el arco C.En la bronquitis alérgica de Aspergillus, la reacción es positiva en el 50% delos casos.La precipitación del anticuerpo aparece tarde en la infección: en determinadoscasos se observa en el segundo examen, un mes después del primer examen.

9- RESULTADOS / CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBAA) DEMOSTRACION DE LOS ARCOS DE PRECIPITACIONLos resultados de los antígenos del Aspergillus se controlan utilizando suerosde control positivo (suero de conejo anti-Aspergillus, obtenido gracias a lainmunización del animal con antígenos estándar mezclados del A. fumigatusy con antígenos estándar metabólicos del A. flavus, A. Níger, A. nidulans yA. terreus)

Demostración de los arcos de precipitación a través de la inmunoelectroforesis (pH = 8,2)

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Suero de control positivo del anti- A. fumigatus del anti- A. flavus del anti- A. nidulans del anti- A. niger del anti- A. terreus

Antíg. Somático +del A. fumigatus de 4 a 8 arcos - - - -

Antíg. Metabólico +del A. fumigatus de 3 a 5 arcos - - - -

Antíg. metabólico - +del A. flavus de 3 a 5 arcos - - -

Antíg. metabólico - - +del A. nidulans de 3 a 5 arcos - -

Antíg. metabólico - - - + -del A. niger de 3 a 5 arcos

Antíg. Metabólico - - - - +del A. terreus de 3 a 5 arcos

B) DEMOSTRACION DEMOSTRACION DE LA ACTIVIDADENZIMATICA DE LOS ARCOS DE PRECIPITACION

10- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTETodos los reactivos se someten a nuestro Control de Calidad, desde larecepción de las materias primas hasta la comercialización final delproducto. Todos los lotes se someten a las evaluaciones del control decalidad y únicamente se procede a su lanzamiento al mercado una vez se hademostrado su conformidad con los criterios de aceptación previamenteestablecidos. Los registros relacionados con la producción y el control detodos y cada uno de los lotes se efectúan con Bio-Rad.

11- LIMITACIONES DE USOLa candidiasis sólo puede diagnosticarse teniendo en cuenta los aspectosclínicos, radiológicos y biológicos (microbiológicos, histológicos, serológicos)e interpretando con cautela todos y cada uno de los elementos individuales.

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Inmunoelectroforesis (pH = 8,2) Electrosinéresis (pH 8,2)Demostración de la actividad +enzimática catalásica tras la adición de H2O2,

las burbujas alrededordel arco J respaldana actividad catalásica

Demostración de la actividad +enzimática quimotrípsica tras la incubación con los reactivos

A y B, el color violeta del arco C respalda la actividad quimotrípsica

12- REFERENCIAS1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification

d’une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables del’extrait antigénique d’Aspergillus fumigatus. Répercussion sur lediagnostic immunologique de l’Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967)31, pp. 317-328.

2. DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l’immunoprécipitationet de l’immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses broncho-pulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp. 379-395.

3. DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires aucours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24,pp. 99-116.

4. LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergydue to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp. 207-217.

5. SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire enmycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150pages.

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- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnosticin vitro)

- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnósticoin vitro)

- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

- For in vitro diagnostic use - Catalogue number- Pour diagnostic in vitro - Référence catalogue- Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro-Diagnostikum - Bestellnummer- Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo- Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro diagnostik - Katalognummer- In vitro diagnose - Katalognummer

- Manufacturer - Authorised Representative- Fabricant - Représentant agréé- Fabricante - Representante autorizado- Hersteller - Bevollmächtigter- Produttore - Distributore autorizzato- Fabricante - Representante Autorizado- Tillverkad av - Auktoriserad representant- Fremstillet af - Autoriseret repræsentant

- Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD- Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ- Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD- Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT- Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG- Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD- Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag- Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

- Storage temperature limitation - Consult Instruction for use- Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi- Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso- Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung- Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso- Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo- Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning- Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug

LOT

IVD

EC REP

REF

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The other languages which are required in conformity to the EuropeanDirective can be obtained from your local Bio-Rad agent.

Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponiblesauprès de votre représentant Bio-Rad local.

Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la DirectivaEuropea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.

Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVDDirektive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-RadNiederlassung.

Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europeepossono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.

As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a DirectivaEuropeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próximade si.

Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från dinlokala Bio-Rad-representant.

De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås vedhenvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.

Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 11/2003Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880011