Anticuerpos anti HLAMétodos de Detección

TM. Manuel Jimenez S.

Laboratorio de Histocompatibilidad

Subdepartamento de Enfermedades No TransmisiblesDepartamento Laboratorio Biomédico

Introducción

Las técnicas de Histocompatibilidad en el trasplante de órganossólidos ha ido evolucionando desde que la técnica de Crossmatchfue descrita por primera vez por el Dr. Paul Terasaki. Sin embargo, elobjetivo final de estas técnicas se mantienen inalterables en eltiempo:

“Entregar una estimación confiable del riesgo inmunológico de unreceptor para trasplante, en el contexto de sus potencialesdonantes”, como un complemento a la evaluación clínica.

De esta manera se hace imperativo para los servicios clínicosentender la compleja e interactiva naturaleza de las técnicasdisponibles en el laboratorio de Histocompatibilidad.

Anticuerpos anti-HLA• Los anticuerpos HLA específicos presentes en el

receptor al momento del trasplante o que se desarrollancomo producto de este, son serios factores de riesgoque disminuyen la función del injerto y la sobrevida delpaciente.

• Hasta un tercio de los pacientes en lista de espera paratrasplante poseen anticuerpos preformados anti HLA.

Francia 25% Chile > 50% PRAE. Unidos 32% (2007) 30%J Am Neprhrol 21:1398-1406, 2010 (2008) 26.5%

(2009) 26.9%(2010) 29.7 %

Trasplantation Proceedings, 43, 3324-3326 (2011)

Vías de sensibilización

• Receptores de trasplante pueden sensibilizarse por tres vías:

Transfusiones

Trasplantes previos

Vacunas, Infecciones

bacterianas, virales, fúngicas

Embarazos

Métodos de detección

Técnicas celulares Técnicas de fase sólida

-PRA CDC (anticuerpos linfocitotóxicos)

-ELISA - Flow PRA-Lúminex (X-MAP)

-Crossmatch CDC-Crossmatch Citometría de Flujo

Detección de anticuerpos linfocitotóxicos PRA-CDC

• El suero a estudiar se enfrenta a un panel celular. Correspondena linfocitos tipificados para antígenos HLA ABDR. Estoslinfocitos son conservados en nitrógeno líquido a -192ºC.

• Este panel debe ser representativo de la distribución deantígenos HLA de la población.

• Detecta la presencia de anticuerpos linfocitotóxicos anti HLAclase I.

• El suero del receptor es mezclado con los linfocitos del panel en pocillos individuales.

• Se añade complemento y un colorante vital.

• Si el suero posee anticuerpos que se unen a la superficie celular con suficiente densidad: se activa el complemento.

• Se produce la muerte celular que es identificada mediante el colorante vital.

• Se lee en microscopio

Lectura de Placas de PRA-CDC

“1”Reacción “2”Reacción

“8”Reacción

“4”Reacción

“6”Reacción

0-10%Células muertas 11- 20%Células muertas 21- 50%Células muertas

81-100%Células muertas51- 80%Células muertas

(Negativa) (Negativa) (Positiva)

(Positiva) (Positiva)

Nº de células con reacción positiva x 100 % de PRANº total de células del panel

Interpretación CDC c/s DTT

DESVENTAJAS

-El % de PRA en un mismopaciente puede variar dependiendodel panel que se esté usando, locual no significa un cambio en lacantidad de anticuerpo.

-Paneles comerciales pueden nonecesariamente representar lafrecuencia HLA de la población.

-Baja sensibilidad

-Falsos positivos resultantes de laparticipación de anticuerpos noHLA, autoanticuerpos (anticuerposIgM)- Falsos negativos en el caso debajos títulos de anticuerpo (no seactiva el complemento)

VENTAJAS

-Criticada por su baja sensibilidad, el PRA es una medida de la sensibilización anti HLA.

-Es un indicador útil para estimar el riesgo de rechazo agudo y potencial rechazo hiperagudo.

-Es una buena técnica para detectar Ac IgG que fijan complemento (IgG1-IgG3).

-Equipamiento “sencillo”

-Bajo costo en comparación con otras técnicas.

-Refleja mejor que otros test la situación que ocurre “en vivo”.

Detección de Anticuerpos anti-HLA por métodos de fase sólida

• Estas metodologías de fase sólida utilizan únicamentemoléculas de HLA solubles o recombinantes.

• Ofreciendo así la disponibilidad de discriminar entreanticuerpos anti HLA de los no HLA, como tambiéndiscriminar entre anticuerpos clase I de Clase II.

-Las moléculas purificadas de HLAse encuentran adheridas a mediosde fase sólida (plataformas ELISA) oa microesferas (Lúminex o FlowPRA).

-Estas unirán sólo anticuerpos antiHLA presentes en el suero delreceptor.

-Para detectar estos anticuerposunidos al antígeno purificado, seutiliza un conjugado enzimático(ELISA) o un conjugado deanticuerpos anti IgG marcados conun fluorocromo. (microesferas)

-Esta detección de anticuerpos antiHLA se reflejará por densidad óptica(ELISA) o detección de fluorescencia(microesferas). Estas últimas puedenser analizadas por Citometría de flujo(Flow PARA) o sobre la plataformade Lúminex.

Lúminex

Tecnología XMAP

Tecnología XMAP

Tecnología XMAP

Red laser reads the bead, i.e. the target

Green laser detects the amount of the target

Detección de Anticuerpos anti HLA Lúminex

• Screening: Determina cualitativamente Clase I y/o II entregando resultados: Positivo o Negativo para ac. Anti HLA clase I Positivo o Negativo para ac. Anti HLA clase II

• Especificidad IDEspecificidad Clase I50 haplotipos de diferentes individuosEspecificidad Clase II30 haplotipos de diferentes individuos

• Especificidad con Antígenos IndividualesSingle Clase I93 antígenos purificados de líneas celularesSingle Clase II70 antígenos purificados de líneas celulares

Estudio con Antígenos Individuales

Luminex Single / PRA virtual

Programa de calculo de PRA utilizando la frecuencia de antígenos HLAABDR en la población cadavérica donante de órganos en Chile

Ejemplos

• R1 vPRA: 5%Anti: A25, A34, A43, A66, B37, DR103

• R2 vPRA: 62%Anti: A2, DR4

• R3 vPRA: 0%Anti DQ2, DQ4, DQ5(1), DQ6(1), DQ8(3)

Anticuerpos anti HLA en Anticuerpos anti HLA en LuminexLuminex

VentajasVentajas

Discrimina entre anticuerpos anti HLA

clase I y II

Detecta Anticuerpos fijadores y no fijadores

de complemento

Permite análisis complejos perfiles de anticuerpos en

pacientes hipersensibilizados

Otorga la posibilidad de definir mismatch aceptable y no

aceptables“Crossmatch Virtual”

Eficaz herramienta monitoreo post trasplante

Basic Histocompatibility Testing Methods, Kathryn J. Tinckam,

En 1969 un artículo publicado por Patel y Terasaki, demostraroninequívocamente que el factor de mayor riesgo en el rechazo hiperagudo enel trasplante de órganos sólidos, fue la presencia de DSA en el suero delreceptor.

Esto se convirtió en el mayor descubrimiento para los Laboratorios de HLA,estableciendo el Crossmatch citotóxico en LT como un requisito técnico antesde trasplantar. Resultados positivos se establecieron como unacontraindicación a trasplantar.

La técnica original poseía una estimación de falsos positivos de un 20%,demostrando que no era los suficientemente especifica ni sensible paradetectar los anticuerpos relevantes.Desarrollando a través del tiempo ensayos que fueran solucionando estaslimitantes.

Crossmatch

Crossmatch por citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

-El Crossmatch corresponde a una reacción entre el suerode receptor y los linfocitos del donante en presencia decomplemento y colorante vital.

-Al igual que en Screening citotóxico, el resultado esconsiderado positivo si una considerable población celularmuere con la activación del complemento.

-Frente a la problemática de la incapacidad de detectarbajos títulos de anticuerpos, se han hecho mejoras paramejorar su sensibilidad. Así, la globulina anti humana(AHG), es añadida a la reacción, la cual se une a los acunidos en la superficie celular, aumentado la densidadpermitiendo que el complemento se active.

Interpretación Resultados de XM CDC

Linfocitos TLinfocitos T(AHG)(AHG)

Linfocitos Linfocitos BB

Anticuerpos presentesAnticuerpos presentes

Negativo Negativo No se detectan ac. contra antígenos HLA del donante.

Positivo Positivo Ac. Anti HLA clase IAc. Anti HLA clase I y II

Ac. No-HLANegativo Positivo Ac. Anti HLA clase II

Ac. Anti HLA clase I débil.Ac. No-HLA

Positivo Negativo Probablemente Ac. No-HLA

Contraindica Trasplante

Crossmatch por Citometría de Flujo

-Fue descrito por primera vez en 1983.

-Detecta anticuerpos independiente de si fijan o no complemento.

-A la incubación de células y suero se le añade un conjugado deac anti IgG humana y fluorocromo, el cual se unirá solo a los acunidos a la superficie celular.

-Anticuerpos dirigidos contra proteínas especificas de linfocitos TY B marcados con distintos fluorocromos pueden ser añadidospermitiendo definir célula blanco.

-Los resultados son expresados como positivo o negativobasados en la diferencia de fluorescencia entre el suero pacientey el suero control negativo.

Expresión de resultados:

Diferencia de fluorescencia

Linfocitos T

Linfocitos B

Valores de referencia positividad Alo Crossmatch Citometría de Flujo- ISP. Mediana +2DS

Sangre, Ganglio, BazoRMF MESF

LT CD3 + > 1.0 > 1876

LB CD19 + > 2.0 > 4595

RMF: Ratio en Mediana de Fluorescencia: Suero Paciente/Suero Control Negativo

Ventajas de FCXM

• Sensibilidad, 5-10x sobre XM-CDC/AHG• Se analiza mayor número de linfocitos con mayor

pureza.• Puede cuantificarse la concentración de los

anticuerpos que producen positividad (ratio-MESF)

• Detecta anticuerpos fijadores, y no fijadores de complemento

• Detecta bajos niveles de anticuerpos• Utilidad en receptores de riesgo inmunológico

Interpretación de los resultados

Transplatation Reviews, 23 (2009) 80-93

Interferencias en FCXM

Drogas Inmunosupresoras Resultado Falso Positivo/Negativo

Modificación FCXM

Tymoglobulina LT Beads M-280

Rituximab LB Aumento Concentración Pronasa

IgIV LT/LB Aumento Lavados post incubación

Anticuerpos NO HLA Resultado Falso Positivo

Modificación FCXM

Autoanticuerpos (IgG) LT/LB Auto XM

Agregados de IgG LB Inactivación suero 56ºC

Basic Histocompatibility Testing Methods, Kathryn J. Tinckam,

DSA: Relevancia Clínica

El reciente desarrollo de las técnicas de fase sólida para la detección de anticuerpos ha mejorado la resolución y la especificidad de los resultados.

Es importante que interacción de todas estas técnicas permitan determinar la relevancia clínica de los resultados, identificando el impacto real en la sobrevida del injerto.

-92 XM

-52 sueros

-Fuerte correlación FCXM vs. MFI

- >3000 MFI FCXM (+)

Correlación de resultados en la detección de anticuerpos anti HLA entre el Crossmatch por Citometría de Flujo y

Lúminex.

Laboratorio de HistocompatibilidadDepartamento Biomédico

Instituto de Salud Publica de Chile

FCXM Donante VivoFCXM

PositivosFCXM

Negativos

• DSA= 46 (93.9%) • No DSA= 3 (6,1%)

• DSA= 1 (0,4%) • No DSA= 265 (99.6%)

FCXM Donante CadáverFCXM

PositivosFCXM

Negativos

• DSA= 24 (75.0%) • No DSA= 8 (25,0%)

• DSA= 3 (3,1%) • No DSA= 94 (96.9%)

Conclusiones del Trabajo

• Del análisis general de los datos, se puede observar una buenacorrelación entre el estudio de anticuerpos y el FCXM.

• En el 98,9 % de los casos frente a FCXM (-) no se detectaron DSA.En 87,8 % de los casos un FCXM (+) se correlaciona con ladetección de DSA por Lúminex en el suero del receptor.

• De las discrepancias observadas, principalmente por FCXM FalsosPositivos, al correlacionarlos con antecedentes clínicos y otroselementos diagnósticos de laboratorio, disminuyen de un 2,5% (11casos / n=444) a un 1% (4 casos / n=444).

Conclusiones

• Cada test en el laboratorio de Histocompatibilidad posee suspropias fortalezas y debilidades, pero ningún test puede predecirpor si solo el riesgo inmunológico del trasplante.

• Los valores de cutoff establecidos por cada laboratorio no indicarelevancia clínica del anticuerpo

• Incluyendo en nuestros resultados, garantías de calidad y unamejora constante en las técnicas de histocompatibilidad, ellaboratorio sigue teniendo el marco ideal para involucrar losresultados de sus ensayos directamente con la práctica clínica

• El Laboratorio de Histocompatibilidad tiene el compromiso de seguirevolucionando de un “laboratorio de Crossmatch” a uno capaz deproveer mejores elementos para el aseguramiento del riesgoinmunológico al equipo clínico.

Gracias