ANTICUERPOS ANTICUERPOS ANTIFOSFOLANTIFOSFOLÍÍPIDO Y PIDO Y

SSÍÍNDROME NDROME ANTIFOSFOLANTIFOSFOLÍÍPIDOPIDO

María Belinchón Toral

Servicio Análisis Clínicos

Hospital Virgen de la Luz

INTRODUCCIINTRODUCCIÓÓNN

� Síndrome antifosfolípido (SAF): Patología origen autoinmune

� Trombosis arterial o venosa

�Morbilidad durante el embrazo

� Anticuerpos antifosfolípido (AAF)

Ac anticardiolipina (ACL) Ac antiβ2GPI

Anticoagulante lúpico (LAC)

� 1950 definición SAF: falsos positivos sífilis y inhibidor coagulación

� Falsos positivos sífilis: LES y EAI

� Inhibidor fosfolípidos cascada de coagulación: anticoagulante lúpico

antitrombótico in vitro y protrombótico in vivo

� Ensayos ACL: RIA y ELISA

� ACL trombosis morbilidad embarazo

� Actividad AAF depende β2glicoproteína I. No todos dependientes

� 1999. Clasificación clínica y serológica de SAF: Criterios de Sapporo

� 2006. Revisión. Criterios Sydney

� ISTH (Soc. Internac. trombosis y hemostasia): Determinación anticoagulante lúpico

EPIDEMIOLOGEPIDEMIOLOGÍÍAA� 20% trombosis venosa profunda (TVP)

� 10% abortos de repetición (principal causa conocida)

� 80% ACV en < 50 años

� 80% mujeres 20-40 años

INMUNOPATOGENIAINMUNOPATOGENIAPREDISPOSICIÓN GENÉTICA

� 10% SAF factor hereditario

� Estudios

� Aumento de ciertos alelos

� Genes de predisposición: polimorfismos gen β2GPI, HLA DRB1*14, DR *17, DR*4, alelos C4 nulos.

•concordancia en gemelos •agrupación familiar•incremento frecuencia en etnias

FACTORES AMBIENTALES

� Agentes infecciosos: sífilis, enf. Lyme, HCV, VIH...

� Fármacos:

� Neoplasias

•Fenotiazida•Hidralazina•Quinina,quinidina, •Penicilinas sintéticas, •Bloqueantes canales de calcio•Procainamida•β-interferón sólo o asociado con IL-2

MANIFESTACIONES CLMANIFESTACIONES CLÍÍNICASNICAS

ANTICUERPOS ANTICUERPOS ANTIFOSFOLANTIFOSFOLÍÍPIDOPIDO

•Anticoagulante lúpico (LAC)

•Anticuerpos anticardiolipina (ACL)

•Anticuerpos anti β2 glicoproteína I (β2GPI)

•Anticuerpos frente fosfolípidos neutros: Anti-fosfatidiletanolamina

•Anticuerpos frente fosfolípidos aniónicos:•Antifosfatidil-serina•Anti-ácido fosfatídico•Anti-fosfatidilinositol

CRITERIOS DIAGNÓSTICOS

DE LABORATORIO

ORIGEN ANTICUERPOS ORIGEN ANTICUERPOS ANTIFOSFOLANTIFOSFOLÍÍPIDOPIDO

� Defecto en aclaramiento de cél. apoptóticas:exponen fosfolípidos aniónicos

estimula producción AAF

proteínas (β2GPI y protrombina)

Alteración de la integridad de las membranas celulares

� Clones CD4 + autorreactivos

� Hipótesis de TLR: β2GPI oxidada-Ac + TLR

– CPA activan a CD4 activación LB

– LB autorreactivo proliferación + ↑ AAF

Estimulación LB autorreactivos yproducción AAF

MECANISMOS TROMBOSISMECANISMOS TROMBOSIS� Activación células endoteliales:

� Daño oxidativo del endotelio vascular:

β2GPI + LDL oxidado se une AAF activan MCF fagocitan LDLs oxidadasdaño células endoteliales

↑ moléculas de adhesión, IL-1 e IL-6↑ prostaglandinas (prostaciclina) expresión factor tisular

� Activación plaquetas: Ac antiβ2GPI unido a β2GPI une a receptores (APOER2´ y GPIbα) de plaquetas activación celular ↑ TXA2

adhesión

� Coagulación

� Inhiben

� Interfieren con la vía intrínseca:

inhiben activación de factor XI y XII

� Inducen activación de la

cascada del complemento

Antitrombina

Proteína C y proteína C activada

Proteína S

Factor X y factor tisular

Formación de trombina.

COMPLICACIONES EMBARAZOCOMPLICACIONES EMBARAZOFigure 2 Main effects of aPL on placenta

Meroni, P. L. et al. (2011) Pathogenesis of antiphospholipid syndrome: understanding the antibodies

Nat. Rev. Rheumatol. doi:10/1038/nrrheum.2011.52

� Inflamación placenta

�Disrupción función trofoblasto

�Alteración quimiotaxis trofoblasto

�Alteración cociente citoquina/quimiocina

Pérdida fetal Preeclampsia

Retraso crecimiento

CRITERIOS DIAGNCRITERIOS DIAGNÓÓSTICOS STICOS SAFSAF

� Criterios Sapporo (1999)� Criterios de Sydney, revisión (2006)

No existen límites de intervalo entre los eventos clínicos y los hallazgos positivos en el

laboratorio

1 ó + criterios clínicos1 ó + criterios laboratorio

DIAGNÓSTICO DEFINITIVO

� Criterio Sapporo mantienen en Sydney excepto: isquemia cerebral transitoria yACV isquémico

�Más frecuente: trombosis venas profundas extremidades con/sin embolismo pulmonar

CRITERIOS CLCRITERIOS CLÍÍNICOSNICOS

CRITERIOS DE LABORATORIOCRITERIOS DE LABORATORIOANTICUERPOS ANTIFOSFOLÍPIDO

(AAF)� Grupo heterogéneo de Ac

� Test laboratorio:– Ensayos inmunoenzimáticos (ELISA)

– Ensayos coagulación: detección indirecta por efecto en coagulación

protrombina

proteína C y S

anexina V

trombomodulina

factor XII

β2GPI

�Modificaciones de Sydney:– Ampliación tiempo de confirmación desde detección de 6 a 12 semanas (excluye AAF temporales asociados a infección)

– Titulación:

� Limitaciones:

ACL >40 U/mL ó > 99 percentilAc antiβ2GPI > 99 percentil

Reproducibilidad EstandarizaciónRelevancia clínica

Anticuerpos anticardiolipinaAnticuerpos anticardiolipina� Isotipos IgM e IgG

� Valor dx: problemas metodológicos ensayo y calibración

� Factores de variabilidad condiciones pre, post- y analíticas

� Punto crítico estandarización: valor cutoff

� Criterio diagnóstico: títulos medios o elevados consigue mejorar especificidad

> 99 percentil> 40 U/mL

� Determinación por métodos inmunoenzimáticos

� Concentraciones de IgG o IgM en µg/L.

� Factor de conversión específico, resultados se convierten automáticamente U/mL

UNIDAD NEGATIVOPOSITIVO DÉBIL

POSITIVO

ACA IgG GPL U/mL < 10 10-40 > 40

ACA IgM MPL U/mL < 10 10-40 > 40

� Suero bovino 10% o suero fetal bovino:

– Agente bloqueante

– Diluyente

� Ac humanizados calibradores: valores en U GLP o MLP/mL

� QC: preparaciones Ac ó AcMo humanizados

Guidelines on the investigation and management of antiphospholipid syndrome

� ↑ sensibilidad

� ↓ especificidad

� Interferencia con factor reumatoide (IgM) con ACL IgM

elemento dx adicionalinterpretación basada en clínica

Anticuerpos antiAnticuerpos antiββ2GPI2GPI

� Isotipos IgM, IgG e IgA

IgA no en criterios dx SAF

� IgA: grupos étnicos (americanos africanos)

� Relacionados con trombosis

� Papel en mujeres con ACV isquémico

Cutoff > 99 percentil

� Asociados

� Complejo Ac - β2GPI receptor

señal intracelular procoagulante

proinflamatorio

preeclampsia eclampsia

aborto

� Receptores

� Activación

predisposición trombosis

cél. endoteliales

plaquetas

monocitos

apolipoproteína E2´

glicoproteína Ibα

anexina 2

TLR, megalina, receptor VLDL

proteínas receptor LDL

glicoproteína ligando de P-selectina

receptor plaquetario 4

� Determinación por métodos inmunoenzimáticos

� Concentraciones IgG e IgM en µg/L.

� Factor de conversión específico, resultados se convierten automáticamente U/mL

UNIDAD NEGATIVOPOSITIVO DÉBIL

POSITIVO

ß2-GPI IgG U/mL <7 7-10 >10

ß2-GPI IgM U/mL <7 7-10 >10

� Epitopos relevancia clínica depende de:– Pureza y estado oxidación Ag

– Placa microtitulación

� Ensayo con dominio I recombinante

↑ sensibilidad + especificidad

Guidelines on the investigation and management of antiphospholipid syndrome

� Desventajas:

– Únicos positivos

– 3-10% SAF Ac anti-ß2GPI única prueba positiva.

– Detecta todos Ac anti-β2GPI incluidos no patogénicos e independientes de fosfolípido

No puede ser test DX general

Otros datos confirmar dx

– Interferencia con factor reumatoide (IgM) con títulos de Ac antiß2GPI isotipo IgM

– Poca estandarización

– Conseguir disminuir presencia Ac de baja afinidad

�mejora especificidad

�correlación con riesgo trombosis

� Ventajas:

� > especificidad

� > concordancia diferentes ensayos

� Guías propuestas grupo europeo estandarización

� Títulos elevados asociados ↑ riesgo trombosis

� Mismo umbral en trombosis y complicaciones obstétricas

� Conformaciones β2GPI: circular y abierta

� Ac frente a dominio I de β2GPI mejor correlación con trombosis

¡No únicos patogénicos!

Isotipo de anticuerpos Isotipo de anticuerpos anticardiolipina y antianticardiolipina y antiββ2GPI2GPI

� C. Clínico + Título ↑ IgM e IgG

� IgM < asociación eventos clínicos

� Títulos ↑ IgM ACL, antiβ2GPI no asociación con trombosis

� Exclusivamente Ac anti-β2GPI IgA con manifestaciones clínicas

confirmar dx SAF

Anticoagulante lAnticoagulante lúúpico (LAC)pico (LAC)� Grupo Ac frente

� Inmunoglobulinas isotipos IgG, IgM, IgA

� Prolongan ensayos fosfolípido-dependientes de la coagulación

β2glicoproteína I, protrombina y anexina V

fosfolípidos aniónicos (cardiolipina, fosfatidilinositol,

fosfatidilserina…)

forman complejos

� Detección: actividad funcional por interferencia con pasos dependientes de fosfolípidos de cascada de coagulación

� Pasos determinación:

– Screening

– Confirmación

� Ventajas– Elevada especificidad dx SAF

– Asociado trombosis y pérdida fetal

� Desventajas: procedimiento complicado y laborioso

� 2009: especificaciones detección LAC y guías

� Plasma anticoagulante citrato sódico

� Especificaciones preparación y almacenamiento:– Doble centrifugación (3000 rpm, 10 min)

– Rápida congelación –70ºC

– Tiempo trombina y antifactor Xa: excluir heparina incluso con neutralizantes de heparina

plasma bajo plaquetas (< 10.000/µL)

� No calibración ni QC comerciales.

� Uso ratio normalizados en todos resultados

�Metodologia por consenso:� Screening: Prolongacion ensayo coagulación fosfolípido dependiente

� Evidencia de inhibidor demostrado por prueba de mezclas

� Confirmación: dependencia de fosfolípidos

� Descartar inhibición específica por factor de coagulación

compensar variabilidad inter e intraensayo

Screening: Detección de LAC� TTPA

� Tiempo caolín

� DVVT (Test veneno víbora Russell diluído)

Reactivo DVVT activa FX FXa

Positivo: prolongación

significativa tiempo

de coagulación fosfolípido

dependiente

fosfolípidos y calcio

Valor límite:

< 1,2 resultado negativo para LAC

> 1,2 DVVT confirmación

DVVT screening muestra/control =1,2

Test confirmación: Dependencia de fosfolípidos. Incremento fosfolípidos respecto screening (fosfolípidos de bicapa o fase hexagonal)

LAC +

Cutoff:

> 1,2 confirman LAC (resultado positivo)

tiempo de coagulación ↓↓vs DVVT screening.

DVVT screening/DVVT confirmación = 1.2

� Recomendaciones:

– Sistemas de test integrados

– Screening y confirmación en 1 ensayo:

Incremento precisiónMenos tiempo degradación

Concordancia interlaboratorio

Prueba de mezclas� Actividad inhibitoria de LAC

�Mejora especificidad

�Muestra + plasma 1:1

Corrige NEGATIVONo corrige o ↑ POSITIVO

� Interferencia

– INR <1.5: postponer

Cambiar TAO por HBPM y extracción >12h última administración

– Si INR entre 1.5 y 3: dilución

sensibilidad a terapia anticoagulante

� No en fase aguda de complicaciones tromboembólicas

� Cuantificación complicada

� No diferencia bien pacientes + con riesgo de trombosis

FR trombosis mejor que ACL

falta de estándar

� Títulos elevados discriminan pacientes con o sin complicaciones tromboembólicas

� ACL IgG y antiβ2GPI IgG junto a LAC ↑ especificidad

� Intensidad actividad

Establecer títulos altos y bajos

SAF CATASTRSAF CATASTRÓÓFICOFICO� Coagulopatía/vasculopatía aguda

� Fallo multiorgánico

� Títulos elevados AAF y ACL

� 25% CID

� 50% muerte por fallo multiorgánico

� Sospecha Anticoagulación intensa

Inmunomodulación PlasmaféresisIgG humanaCorticoidesRituximab

� CAPS REGISTRY (European Forum on antiphospholipid antibodies)

Registro internacional SAF catastrofico desde 2000

Management of refractory cases of catastrophic antiphospholipid syndrome. Espinosa G, Berman H, Cervera R

Autoimmun Rev. 2011 Sep;10(11):664-8.

INDICACIONES INDICACIONES DETERMINACIDETERMINACIÓÓN AAFN AAF

� Episodios repetidos de trombosis arterial y/o venosa� Hª Clínica TEP repetido� 1er episodio trombosis localización no habitual� < 50 años en 1er episodio trombótico arterial� > 50 años y episodios trombóticos arteriales sin ateromatosis

�Muerte fetal (<10S) o abortos repetición (>3)� Trombocitopenia persistente no filiada� Otros:

•LES•Serología luética falsamente positiva•Eclampsia o preeclampsia atípicas•Retraso crecimiento fetal intrauterino•Livedo reticularis•Úlceras cutáneas trombóticas no inflamatorias•Engrosamiento válvulas cardiacas o vegetaciones•Hemorragia suprarrenal bilateral•Corea no familiar•Microangiopatía trombótica

SOSPECHA CLÍNICA SAFCriterios clínicos

SUERO PLASMA

ANÁLISIS CLÍNICOS HEMATOLOGÍA

•Factor reumatoide:Falsos positivos ACL IgM y Ac anti-β2GPI IgM

•Ac AnticardiolipinaIgG e IgM

•Ac anti-β2GPI IgG e IgM

Anticoagulante lúpicoScreening y confirmación

POSITIVO Confirmación 12 semanas

¡¡MUCHAS GRACIAS!MUCHAS GRACIAS!