Anticuerpos Mono y Policlonales

Inmunologa. Curso 2009-10. Tema 10

Dpto. de Sanidad Animal. www.ucm.es/info/saniani

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TEMA 10. Tcnicas inmunolgicas I. Anticuerpos monoclonales y sus aplicaciones. Reacciones antgeno-anticuerpo in vitro: tipos de inmunorreacciones. Concepto de sensibilidad y especificidad. Reacciones cruzadas. Ttulo srico.

OBJETIVOS Saber qu son y cmo se producen los anticuerpos monoclonales Conocer las aplicaciones que se ven mejoradas con el empleo de

anticuerpos monoclonales Comprender y diferenciar los conceptos de sensibilidad y especificidad Conocer el significado de la especificidad del anticuerpo y los

mecanismos responsables de la reaccin cruzada de los anticuerpos. Comprender el significado del ttulo de un suero.

OBTENCIN DE ANTICUERPOS PARA LAS TCNICAS INMUNOLGICAS 1. Policlonales (Sueros): por inmunizacin de animales de experimentacin

(conejos, cabras, quidos, etc.) con el antgeno deseado, siguiendo un protocolo adecuado, tras el que se extrae sangre y se obtiene el suero donde estarn los anticuerpos dirigidos frente al antgeno con el que se ha realizado la inmunizacin (frente a todos sus determinantes antignicos) y frente a otros antgenos a los que se haya enfrentado el animal.

2. Monoclonales (Khler y Milstein, P.N. Medicina 1984): Son los anticuerpos producidos por un clon, es decir, por un grupo de clulas derivados de una nica clula y, por lo tanto, con caractersticas idnticas (todas producen el mismo anticuerpo).

Ac POLICLONALES Ac. MONOCLONALES Mezcla heterognea Qumicamente puros Variacin entre los lotes (impredecibles) Invariables (predecibles) Irrepetibles Produccin limitada Es preferible utilizar Ag puros para su obtencin No se necesitan Ag puros Reconocen varios eptopos Muy especficos (pueden no

reconocer variantes antignicas) Multitud de isotipos (plasticidad funcional y efectora

Un solo isotipo

Fcil produccin Produccin compleja y larga Baratos Caros PROTOCOLO PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES (AcMo) 1. Inmunizar un ratn con el Ag deseado. 2. Tras un tiempo (varias semanas), extraer el bazo y disgregar para obtener

linfocitos B, que tienen una cortsima viabilidad en cultivo. 3. Fusionar los linfocitos B con clulas de mieloma, que tienen la

caracterstica de ser deficientes en la enzima hipoxantina guanina fosfo



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ribosil transferasa, HGPRT), implicada en la sntesis exgena de ADN, por lo que slo pueden seguir la va endgena.

4. Cultivar los productos de la fusin (hibridomas linfocito-mieloma), en medio selectivo HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). La aminopterina bloquea la va endgena, y slo las clulas que puedan sintetizar cidos nucleicos por la va exgena (que sean HGPRT+) sobrevivirn. Los hibridomas formados por la fusin entre un linfocito y una clula de mieloma son capaces de crecer en este medio.

5. Analizar los pocillos por ELISA. 6. Clonar los pocillos que contengan hbridos productores de anticuerpos de

inters, realizando diluciones para intentar tener una clula por pocillo, por lo que todas las que se deriven de ella secretarn el mismo anticuerpo.

7. Caracterizar los AcMo 8. Producir en gran escala:

a. Cultivo in vitro: los clones se cultivan en botellas o en biorreactores, encontrndose los AcMo en el medio de cultivo.

b. Produccin in vivo: los clones se inoculan en la cavidad abdominal de ratones para producir ascitis en donde se encuentran los AcMo mucho ms concentrados que en el caso anterior.

Actualmente las grandes empresas obtienen los AcMo por ingeniera gentica

Bazo Mieloma (HGPRT -)

FUSIN

HAT

ELISA (con epitopo de inters)

- + - - - - - -

SELECCIN

CLONACIN ELISA

- - - - - + - -

EXPANSIN

Antgeno (3 epitopos)

Clula de Mieloma

Linfocito B

Hibridoma LB/M



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APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES

En principio todo lo que se base en una reaccin antgeno-Anticuerpo:

Sistemas de deteccin de base inmunolgica Terapia frente al cncer?

Falta de AcMo de origen humano Estudios en microbiologa Etc.

CONCEPTOS Y NATURALEZA DE LA INTERACCIN Ag-Ac La interaccin Ag-Ac se caracteriza por:

1. Unin reversible por enlaces no covalentes

2. Unin especfica: Interaccin complementaria entre Ag-Ac (en ocasiones, puede darse reactividad cruzada con otro Ag).

ESPECIFICIDAD: Capacidad del Ac para discriminar e interaccionar diferencialmente con Ag de estructura similar. Cuando un Ac frente a un determinado Ag se une a otro Ag diferente pero estructuralmente relacionado se habla de reaccin cruzada.

3. Formacin de inmunocomplejos Ag-Ac estables

AFINIDAD: Fuerza o intensidad de la unin entre un determinante antignico y su sitio de unin al Ac

AVIDEZ: Fuerza total de la unin entre Ag-Ac (suma de fuerzas de atraccin y de repulsin).

CONCEPTO DE TTULO SRCO Se suele calcular haciendo diluciones del suero y determinando cul es la mxima dilucin de un suero que da una reaccin positiva por la prueba evaluada. Es una estimacin de la concentracin de anticuerpos que hay en el suero. CONCEPTO DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD Sensibilidad: capacidad de un mtodo para detectar positivos. Permite

que todos los positivos sean detectados. Especificidad: capacidad para diferenciar positivos de los negativos.

Capacidad para detectar negativos. Evita resultados falsos positivos (ningn negativo debe considerarse como positivo)



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Para clasificar a los animales en positivos o negativos se establece un punto de corte. Los individuos cuyos valores sean mayores que el establecido por el punto de corte se considerarn positivos y los que son inferiores, negativos.

TIPOS DE TCNICAS INMUNOLGICAS

Las inmunorreacciones se aplican al diagnstico para medir la respuesta inmune:

- Humoral (anticuerpos y complemento). - Celular (fagocitos y linfocitos, citoquinas).

DETECCIN DE LA RESPUESTA HUMORAL TCNICAS SEROLGICAS: detectan la interaccin Ag-Ac in vitro. Pueden clasificarse en 3 tipos:

1. Pruebas de unin primaria: Miden directamente la unin Ag-Ac. 2. Pruebas de unin secundaria: Miden los cambios fsicos de la

interaccin Ag-Ac tras la formacin del inmunocomplejo. 3. Pruebas terciarias: Miden el efecto protector real de la respuesta

inmune en un animal. PREGUNTAS

1. Qu es un anticuerpo monoclonal? 2. Por qu las clulas de mieloma empleadas para la obtencin de

hibridomas son HGPRT-? 3. Por qu es necesario clonar? 4. Por qu existen problemas para el empleo de anticuerpos

monoclonales con fines teraputicos en medicina humana y veterinaria? 5. Qu es ms indicativo de la capacidad efectiva de unin de un

anticuerpo a un microorganismo, su afinidad o su avidez? 6. En qu circunstancias se debe aplicar una tcnica que tenga alta

especificidad y baja sensibilidad? Y baja especificidad pero alta sensibilidad?

OBTENCIN DE ANTICUERPOS PARA LAS TCNICAS INMUNOLGICASPoliclonales (Sueros): por inmunizacin de animales de experimentacin (conejos, cabras, quidos, etc.) con el antgeno deseado, siguiendo un protocolo adecuado, tras el que se extrae sangre y se obtiene el suero donde estarn los anticuerpos dirigid...Monoclonales (Khler y Milstein, P.N. Medicina 1984): Son los anticuerpos producidos por un clon, es decir, por un grupo de clulas derivados de una nica clula y, por lo tanto, con caractersticas idnticas (todas producen el mismo anticuerpo).

APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALESEn principio todo lo que se base en una reaccin antgeno-Anticuerpo:Sistemas de deteccin de base inmunolgicaTerapia frente al cncer?Falta de AcMo de origen humano

Estudios en microbiologaEtc.DETECCIN DE LA RESPUESTA HUMORAL

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