ANTICUERPOS MONOCLONALES HEMOCLASIFICADORES

ANTICUERPOS MONOCLONALESANTICUERPOS MONOCLONALES

HEMOCLASIFICADORESHEMOCLASIFICADORES

Lic. René A. Rivero Jiménez, MSc.Lic. René A. Rivero Jiménez, MSc.

INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E INMUNOLOGIAINMUNOLOGIA

SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE MAYOR IMPORTANCIA CLÍNICAMAYOR IMPORTANCIA CLÍNICA

ABOABO

RHRH

Sistema ABOSistema ABO

1901: Primer sistema descubierto por Karl 1901: Primer sistema descubierto por Karl LandsteinerLandsteiner

Solo dos antígenos, Solo dos antígenos, AA y y BB podían podían explicar la existencia de 4 grupos: explicar la existencia de 4 grupos:

AA, , BB, , AABB, O, OPero los antígenos Pero los antígenos AA y y BB son el resultado del funcionamiento son el resultado del funcionamiento

sinergístico de dos sistemas genéticos independientes:sinergístico de dos sistemas genéticos independientes:

El El HhHh, donde el gen activo , donde el gen activo HH (cromosoma 19) (cromosoma 19) crea una enzima que funciona añadiendo crea una enzima que funciona añadiendo

azúcares a un substrato precursor, antes de la azúcares a un substrato precursor, antes de la acción de los genes acción de los genes AA y y BB (cromosama 9) (cromosama 9)


Antígeno HAntígeno H

Antígeno Antígeno AA

Antígeno Antígeno BB

Ceramida

Fucosa

Galactosa

Glucosa

N-acetilglucosamina

N-acetilgalactosamina


EritrocitosEritrocitos SueroSuero

GenotiposGenotipos FenotiposFenotiposaa AnticuerposAnticuerpos GlGluucosiltransferasascosiltransferasas

AA11AA11, A, A11AA22, A, A11OO AA11 Anti-BAnti-B -3-N--3-N-

aacetilgalactosaminilcetilgalactosaminil

AA22AA22, A, A22OO AA22 Anti-BAnti-Bbb -3-N--3-N-

acetilgalactosaminilacetilgalactosaminilcc

BB, BOBB, BO BB Anti-AAnti-A -3-galactosil-3-galactosil

AA11BB AA11BB ------ -3-N--3-N-

acetilgalactosaminil acetilgalactosaminil

y y -3-galactosil-3-galactosil

AA22BB AA22BB ------bb -3-N--3-N-

acetilgalactosaminil acetilgalactosaminil

y y -3-galactosil-3-galactosil

OOOO OO Anti-A Anti-A

y Anti-By Anti-B --------

Leyenda: aDefinido por antisueros anti-A, anti-B, y anti-A1. bAnti-A1 algunas veces

presente en el suero de individuos de los grupos A2 y A2B. cN-acetilgalactosaminiltransferasas en sueros del grupo A2 difieren en las propiedades cinéticas de las enzimas en sueros del grupo A1.

Fenotipo A1 Fenotipo A2

A H



Expresión antigénica:Expresión antigénica:

Forma soluble (secretores) Saliva y todos los Saliva y todos los líquidos líquidos corporales, corporales, excepto el LCRexcepto el LCR

Otras células sanguíneasOtras células sanguíneas Linfocitos, plaquetas Linfocitos, plaquetas (adsobidos (adsobidos del del plasma).plasma).

TejidosTejidos En casi todas la cel epiteliales En casi todas la cel epiteliales (epitelio glandular) y (epitelio glandular) y

sobre sobre células endoteliales. células endoteliales. Amplia Amplia distribución en distribución en tejidos tejidos

(Histo-(Histo- sanguíneos)sanguíneos)

Los heterocigotos no se distinguen de los homocigotos: A1A1, A1A2 y A1O: todos reaccionan igual

con Anti-A.

Frecuencia de los grupos ABO en Frecuencia de los grupos ABO en Cuba:Cuba:

GrupoGrupo % %

AA AA11 27,6727,67

AA22 8,268,26

variantes débilesvariantes débiles 0,750,75

BB 11,211,2

ABAB AA11BB 2,282,28

AA22BB 0,810,81

OO 49,0349,03

Becomo AA et al. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1997; 13(2): 124-131.

3,03,099

36,6836,68


Características Generales de los Características Generales de los Anticuerpos ABO:Anticuerpos ABO:

Alta importancia clínica.

Normalmente aparecen anticuerpos naturales en los individuos que no portan el antígeno en sus eritrocitos

(evento único en la serología de los grupos sanguíneos).

Se usan de forma habitual para la determinación de los grupos sanguíneos (grupo reverso).

Son aglutininas frías usualmente clase IgM.

Activan el Complemento.

Causan hemólisis cuando son activos a 37 C (calientes).



Anticuerpos ABO:Anticuerpos ABO:

Desarrollo con la edad:Desarrollo con la edad: En sangre de cordón umbilical Anti-A y Anti-B clase IgG de

origen materno.

Se detectan en lactantes entre 3-6 meses de nacidos (clase IgM).

Mayor titulo se alcanza entre 5 y 10 años de edad.

exterior

interior

membrana

Banda 3 transportador de aniones

Banda 4 transportador de glucosa

Cadena lateral

Cadena lateralProteína Rh

Epitopo D

Se descubrió en 1940 por Weiner y Se descubrió en 1940 por Weiner y Landsteiner.Landsteiner.

Después del ABO, el más Después del ABO, el más importante en la clínica:importante en la clínica:

Anti-Rh causa reacción Anti-Rh causa reacción transfusional hemolíticatransfusional hemolítica

Incompatibilidad madre-hijo: Incompatibilidad madre-hijo: enfermedad hemolítica del feto y enfermedad hemolítica del feto y del recien nacido.del recien nacido.

Se han descrito hasta 52 antígenos.

Antígeno D: define condición de POSITIVO.

Otros antígenos: C,c,E,e,d.

Antígeno D: mosaico antigénico, determinado por epitopos.

Sistema RhSistema Rh


Expresión:Expresión:

Eritrocitos de sangre de cordón.Eritrocitos de sangre de cordón.

No formas solubles.No formas solubles.

Tejidos: Específicos de la línea Tejidos: Específicos de la línea eritroide.eritroide.

Cromosoma: 1p36.13-p34.3Cromosoma: 1p36.13-p34.3

Nombre de genes: Nombre de genes: RHD, RHCERHD, RHCE

Nombre del producto de los genes: polipéptido Nombre del producto de los genes: polipéptido RhD, polipéptido RhCE.RhD, polipéptido RhCE.

No. de exones: No. de exones: RHDRHD 10, 10, RHCERHCE 10. 10.


•El polimorfismo del RhD es único.El polimorfismo del RhD es único.

•La mayoría de los que portan el gen D, tienen La mayoría de los que portan el gen D, tienen un polipéptido D completo.un polipéptido D completo.

•Pero existen variantes débiles, por expresión Pero existen variantes débiles, por expresión disminuída o incompleta.disminuída o incompleta.

Anticuerpos vs. Rh(D):Anticuerpos vs. Rh(D):

. Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes . Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes por su origen (no naturales).por su origen (no naturales).

Clase IgG, usualmente IgG1 y o IgG3.Clase IgG, usualmente IgG1 y o IgG3.

Pocas veces fijan ComplementoPocas veces fijan Complemento

Aparecen en individuos D negativos o en D Aparecen en individuos D negativos o en D parcialesparciales

Producción de reactivos Producción de reactivos hemoclasificadores basados en hemoclasificadores basados en sueros humanos policlonales:sueros humanos policlonales:

Cada lote es una mezcla diferente de moléculas obtenidas de distintos donantes.

Cada lote se comporta de forma diferente frente a las expresiones débiles del Ag.

Hay diferente avidez.

Pueden presentar poli aglutinación frente al antígeno críptico Tn.

Se requiere obtener un policlonal anti A,B, para corroborar la reactividad del Anti-A y del Anti-B.

Se requieren técnicas manuales bien realizadas.

Generación Generación de de

hibridomashibridomas::

Ventajas de los Reactivos basados Ventajas de los Reactivos basados en AcM:en AcM:

Cada reactivo monoclonal es:Cada reactivo monoclonal es:

Una aglutinina directa.Una aglutinina directa.

Sólo una clase de Inmunoglobulina Sólo una clase de Inmunoglobulina (IgM, IgA o IgG).(IgM, IgA o IgG).

De sólo una especificidad De sólo una especificidad epitópica.epitópica.

De sólo una avidezDe sólo una avidez

No contiene Ac contaminantes.No contiene Ac contaminantes.

Producción de los AcM:Producción de los AcM:

Altamente laboriosa e intensiva en la Altamente laboriosa e intensiva en la etapa de generación de hibridomas, etapa de generación de hibridomas,

clonajes y caracterización de las líneas clonajes y caracterización de las líneas célulares.célulares.

Más simple en la etapa de producción a Más simple en la etapa de producción a gran escala.gran escala.

Cada reactivo puede ser:Cada reactivo puede ser:

Un único AcMUn único AcM

Una mezcla de AcMUna mezcla de AcM

Generalmente, los anti-A, anti-B y anti A,B Generalmente, los anti-A, anti-B y anti A,B son mezclas., para que funcionen mejor en son mezclas., para que funcionen mejor en los distintos métodos de hemaglutinación.los distintos métodos de hemaglutinación.

Especificaciones para Especificaciones para garantizar la calidad de los garantizar la calidad de los

reactivos hemoclasificadores reactivos hemoclasificadores basados en AcM:basados en AcM:Establecer la concentración o titulo de AcM y condiciones de la

solución amortiguadora (pH, conc. Salina).

Clonaje celular por 3 veces, garantía de la monoclonalidad.

Crear bancos de células semilla Maestros y de Trabajo.

Cada lote se debe generar a partir de un criotubo del hibridoma congelado. Cultivar y expandir las células mediante pases seriados por no mas de 3 meses. Después de este tiempo: desechar los cultivos.

Errores que se deben evitar:Errores que se deben evitar:1.1. AcM de alta afinidad: pueden detectar los fenómenos AcM de alta afinidad: pueden detectar los fenómenos

B(A) o A(B): cantidades muy pequeñas del antígeno B(A) o A(B): cantidades muy pequeñas del antígeno contrario presentes normalmente en algunos contrario presentes normalmente en algunos individuos. Solución: diluir los AcM.individuos. Solución: diluir los AcM.

2.2. Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no el Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no el B real sino una estructura estérica muy similar, que B real sino una estructura estérica muy similar, que produce alta reacción). Se adquiere por infecciones de produce alta reacción). Se adquiere por infecciones de algunas bacterias, enfermedades reumáticas, etc. algunas bacterias, enfermedades reumáticas, etc. Solución: formular el reactivo en pH alcalino.Solución: formular el reactivo en pH alcalino.

3.3. Algunos AcM producen reacción en monocapa en Algunos AcM producen reacción en monocapa en tubos y microplacas. Solución: Tratar microplacas y tubos y microplacas. Solución: Tratar microplacas y tubos con Tween. Añadir albúmina o gelatina a la tubos con Tween. Añadir albúmina o gelatina a la formulación en un bajo % (albúmina como máximo formulación en un bajo % (albúmina como máximo 3%, gelatina como máximo 1%). Mejor: albúmina 2-3%, gelatina como máximo 1%). Mejor: albúmina 2-3%, gelatina 0.05%. Ayuda a la estabilidad del 3%, gelatina 0.05%. Ayuda a la estabilidad del reactivo.reactivo.

Problemas para la obtención Problemas para la obtención del anti-D monoclonal:del anti-D monoclonal:

Mosaico D:Mosaico D:

Ag D es un mosaico de mas de 30 epítopos.Ag D es un mosaico de mas de 30 epítopos.

Cada AcM detecta un solo epítopo.Cada AcM detecta un solo epítopo.

No todas las células D+ expresan todos los epítopos de No todas las células D+ expresan todos los epítopos de D.D.

Du= D “normal” pero con bajo numero de sitios en Du= D “normal” pero con bajo numero de sitios en eritrocitos.eritrocitos.

Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningún AcM Anti-Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningún AcM Anti-D detecta a todas las variantes, todos dejan algo.D detecta a todas las variantes, todos dejan algo.

El problema es escoger al que detecta a los mas El problema es escoger al que detecta a los mas importantes epítopos para una importantes epítopos para una correcta correcta clasificación.clasificación.

Prueba de Anti-Globulina (Coombs): algunas variantes Prueba de Anti-Globulina (Coombs): algunas variantes raras de D pueden dar FALSO POSITIVAS. En realidad no raras de D pueden dar FALSO POSITIVAS. En realidad no se deben transfundir con SANGRE Rh+, ya que D se deben transfundir con SANGRE Rh+, ya que D completo inmuniza.completo inmuniza.

Ag D no es inmunogénico para ratones BALB/c: Ag D no es inmunogénico para ratones BALB/c: imposible obtener monoclonales murinos anti-D.imposible obtener monoclonales murinos anti-D.

Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase IgG Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase IgG (poco aglutinantes): se debe seleccionar moléculas (poco aglutinantes): se debe seleccionar moléculas IgG3: molécula mas abierta mejor aglutinante.IgG3: molécula mas abierta mejor aglutinante.

Producción de AcM anti-D humanos:Producción de AcM anti-D humanos:

Sangre de donantes inmunizados

Leucocitos + VEB

Línea celular B transformada + / -fusión

Clonajes

AcM Anti-D IgG - IgM

Reglas de Oro de la Calidad en Reglas de Oro de la Calidad en reactivos hemoclasificadores:reactivos hemoclasificadores:

Nivel seguro en el titulo de anticuerpos.

La especificidad, potencia, y avidez dependen de la concentración.

Medición de la concentración de Ac por ELISA. Ej. Uso de conjugado anti-IgM o IgG de ratón.

Garantía del pH final del producto: rango general 6.5-7.2.

Se adiciona HEPES cuando se cosechan los sobrenadantes.

Fortaleza iónica elevada, incrementa la actividad del reactivo.

ADITIVOS:ADITIVOS:

EDTA: previene la lisis, especialmente en eritrocitos no lavados. También previene la degradación por proteolisis

Gelatina: mejora la avidez, evita que los Ac formen monocapa con eritrocitos.

Colorantes: Coloración intensa puede afectar resultados en microplacas.

Control de CalidadControl de Calidad::

Chequeo sistemático para demostrar que todo se hizo correctamente en la producción:

Pruebas:

Especificidad Reacción completa: 4+

Potencia: A o B 1/64 con fenotipos fuertes A1 o B

Titulación con 2% de SAB 1/8-16 con fenotipos débiles: A2B o A1B

para mantener la conc. de

proteínas mientras se diluye.

Avidez: según protocolo 5-10 segundos.

Adicional: medir concentración de azida, conc. proteínas, pH y fuerza iónica.

Métodos de Producción:Métodos de Producción:En animales de experimentación: Liquido ascítico murino (LAM).

Ej. Anti-A, Anti-B.

En biorreactores de fibra hueca: Todos, pero en particular el anti-D.(Mejores que los tanques agitados para la concentración de Ac).

Chequear niveles de glucosa en el medio.

Comenzar con SFB 5% y disminuir hasta 1% en el espacio extracapilar (las células y el SBF deben estar en el EE, mientras el medio se bombea al espacio intracapilar.

La estabilidad de las líneas celulares mejora con los reclonajes.

NUEVAS TECNOLOGIAS:NUEVAS TECNOLOGIAS:Bibliotecas de fagos. Fragmentos de anticuerpos. Ingeniería de anticuerpos.

Nos vemos en Nos vemos en Hematología HabanaHematología Habana 2005!!2005!!

Mayo 16-20, 2005Mayo 16-20, 20054to Congreso de la 4to Congreso de la Sociedad Cubana de Sociedad Cubana de

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