1.9 APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

Los conocimientos generados y las técnicas empleadas por la ingeniería genética y la biología molecular, han tenido un importante alcance en el desarrollo de otras áreas como: la medicina, ciencias forenses, la agricultura, la ganadería, la farmacia, entre otras. En la agricultura los alimentos transgénicos y en la ganadería (la mejora de las razas) derivan de los organismos genéticamente modificados. En el campo de la medicina los adelantos en diagnósticos clínicos más precisos y en tiempos cortos, se deben al uso de las últimas técnicas y equipo empledo en biología molecular generando incluso la rama de biomedicina, en está area también se trabaja la terapia génica con proteínas recombinantes y uno de los proyectos más ambiciosos de los últimos años la secuenciación del Genoma Humano. Otra importante área es la genética forense que se conoce como una especialidad que engloba la aplicación de las técnicas de biología molecular para análisis del DNA y la relación con el poder judicial.

1.9.1. ESTUDIO EN LA EXPRESIÓN GENÉTICA MEDIANTE GENES REPORTEROS.

Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de simple detección. Se usan para reemplazar productos génicos difíciles de medir y determinar actividad promotora.

Genes reporteros

CAT (cloramfenicol acetiltransferasa). Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracción orgánica.

GAL ( -galactosidasa). Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo que se cuantifica.

SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase). Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible.

LUC (luciferasa). Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay diferentes luciferasas dispoinibles.

GFP (green fluorescent protein) .Fluoresce por irradiación con UV – se observa con microscopio de fluorescencia.

Ejemplo del diseño básico de un gen reportero utilizando la Luciferasa-Dual.

-El estudio comienza por clonación de los elementos de regulación del gen de interés de la luciferasa.

Los elementos reguladores pueden incluir los posibles promotores, promotores desconocidos, porciones del promotor o respuesta conocida y elementos potenciadores.

- Esto se puede lograr usando variedad de plásmidos, incluyendo los vectores pGL4.

Unión con el plásmido.

-El plásmido con los elementos reguladores se transfecta en la línea celular de elección.

-En este momento, un plásmido de control que contiene luciferasa de Renilla es co-transfectada.

Este plásmido un promotor constitutivamente activo y proporciona una diferencia para comparar los resultados en contra. El uso de este plásmido de control reduce el error debido a las variaciones experimentales, tales como la transfección y la manipulación de células.

-El ARNm es transcrito por los promotores activos una vez que el plásmido se encuentra en el núcleo.

ARNm

-Si el promotor no es activo o tiene muy poca actividad, entonces nada o muy poco ARNm será producido.

-Un promotor fuerte generará mayor cantidad de ARNm.

-Las vías de transducción de señales necesitan ser activadas con elementos reguladores para inducir una expresión adecuada.

Todos llegan aquí

-Cada ARNm reportero se traduce en proteína activa.

-La cantidad de luciferasa depende de la actividad del promotor o elemento regulador que se está estudiando.

-La

producción de luciferasa de Renilla es independiente del promotor experimental o actividad del elemento regulador.

La luciferasa de Renilla puede ser medida fácilmente utilizando el Dual-Luciferase (aparato con positos donde se pone el agente reactivo del mismo), y posteriormente leyendo los resultados en un luminómetro.

1.9.2. RATONES KNOCK-OUT, KNOCK IN Y TRANSGÉNICOS

RATÓN KNOCKOUT

Un ratón knockout o ratón KO, es un ratón modificado por una ingeniería genética para que uno o más de sus genes estén inactivados mediante una técnica llamada gen knockout.

Su propósito es comprender el papel de un gen que ha sido secuenciado pero del que se desconoce su función o se conoce de forma incompleta. Inactivando el gen y estudiando las diferencias que presenta el ratón afectado, los investigadores pueden inferir la probable función de ese gen.

Noquear la actividad de un gen proporciona información sobre la tarea normal de ese gen. Los seres humanos compartimos genes con el ratón. Por tanto, observar las características de un ratón knockout proporciona información que se puede utilizar para comprender mejor como un gen semejante puede provocar o contribuir a la aparición de enfermedades en humanos.

Muchos de estos ratones modelo reciben el nombre del gen que se ha inactivado en ellos.

NOTA: esto es lo mismo que viene en las diapos, pero explicado mas sencillo, igual si quieren comparar y checar .

RATÓN KNOCKOUT CONDICIONADO

Los ratones knockout condicionados poseen una modificación en el gen de interés que podríamos denominar silenciosa. Dicha modificación consiste en un mecanismo interruptor que provoca la inactivación del gen que se está estudiando solo en un tejido o en un tipo celular concreto.

En la actualidad, los sistemas knockout condicionados están basados en la recombinación específica del sitio; en el caso de estos knockout condicionados, el sistema de recombinación más conocido y utilizado es el llamado Cre/loxP.

Este sistema de recombinación procede de un virus que infecta bacterias, en este caso el bacteriófago P1. La belleza del sistema radica, en su simplicidad: una recombinasa llamada Cre, que reconoce dos secuencias cortas iguales que flanquean el fragmento genético a recombinar, llamados sitios loxP. Utilizando un simil familiar, la recombinasa sería el equivalente a una tijera y a un pegamento al mismo tiempo, mientras que los sitios loxP serían las señales donde hay que cortar y pegar en la secuencia genética.

Para formar ratones condicionados, se necesita un ratón que tenga la recombinasa Cre y un ratón que tenga fragmento genétiico loxP. Bueno pues estas se combinan, llegando la proteína Cre a hacer un corte donde se desea modificar el fragmento genético. En este caso se removió uno de los fragmentos loxP del ratón y la función de dicho gen fue interrumpida. A partir de ese momento, todas las células llevan una copia del gen modificado loxP X, una copia del gen X knockout y genes Cre.

RATÓN KNOCKIN

Esta tecnología se basa en la inserción o reemplazo de una secuencia de DNA en un sitio definido del genoma del animal, utilizando, al igual que la tecnología de KO, la recombinación homóloga en células.

La humanización de ratones mediante la tecnología KI, se ha convertido en una herramienta muy importante para evaluar in vivo la eficacia, perfiles farmacocinéticos y toxicológicos de inumerables drogas. La tecnología KI también se utiliza para introducir mutaciones puntuales y modelar enfermedades humanas en el ratón, inactivar regiones esenciales de una proteína, como el dominio catalítico de una quinasa, o el sitio de unión a drogas de la proteína blanco.

Les pondré un ejemplo ya explicado, cualquier cosa me preguntan.

RATÓN TRANSGÉNICO

Un ratón transgénico es un ratón al que se le ha modificado su ADN y por tanto su información genética. Frecuentemente estas modificaciones consisten en la introducción o en la eliminación de un gen (fragmento de ADN que codifica la información para producir una proteína). Mientras que insertando un gen de otro organismo podemos obtener ratones que producen proteínas que antes no producían, eliminando un gen podemos averiguar qué función desempeñaba la proteína que codificaba.

Una de las técnicas más conocidas en el campo de la biomedicina y en la biología del desarrollo es la microinyección. Un gen de un organismo puede insertarse en un vector, que sirve como vehículo de transporte, y ser introducido en una bacteria. Sucesivas divisiones de la bacteria darán como resultado una población (un clon) que porta el vector con el gen que hemos introducido. Existen métodos sencillos de extracción de estos vectores. El gen puede ser liberado de nuevo de estos vectores empleando enzimas de restricción que catalizan el corte del ADN en puntos con secuencias específicas. Obtenemos de este modo un gran número de copias del gen que queremos insertar en el ratón. El ADN lineal que incluye el gen a estudiar es entonces inyectado en uno de los pronúcleos (generalmente el masculino, por ser de mayor tamaño) de un ovocito de ratón fecundado, en una fase anterior a la fusión pronuclear. El paso posterior es la fusión de los pronúcleos. El fragmento de ADN inyectado puede integrarse al azar en el ADN del ratón. El desarrollo del embrión conducirá a la obtención del ratón transgénico en aquellos casos en los que se den las condiciones adecuadas. 

Nota: Les dejaré un video donde explica exactamente lo que les acabo de poner. También pueden compararlo con la imagen del profe, es lo mismo .