Aplicaciones del procesamiento morfológico para la

Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas

Facultad de Ingeniería Eléctrica

Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la Información

TRABAJO DE DIPLOMA

Aplicaciones del procesamiento morfológico para la

segmentación de imágenes en el diagnóstico

computacional de la malaria.

Autor: Patricia Rodríguez Ribalta

Tutor: Dr. Juan V. Lorenzo Ginori

Cotutora: Ing. Lyanett Chinea Valdés

Santa Clara

2014

"Año 56 del Triunfo de la Revolución"

Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas

Facultad de Ingeniería Eléctrica

Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la Información

TRABAJO DE DIPLOMA

Aplicaciones del procesamiento morfológico para la

segmentación de imágenes en el diagnóstico

computacional de la malaria.

Autor: Patricia Rodríguez Ribalta, [email protected]

Dr. Juan V. Lorenzo Ginori

Profesor Titular Consultante, CEETI, [email protected]

Cotutora: Ing. Lyanett Chinea Valdés

Santa Clara

2014

"Año 56 del Triunfo de la Revolución"

mailto:[email protected]

Hago constar que el presente trabajo de diploma fue realizado en la Universidad Central

“Marta Abreu” de Las Villas como parte de la culminación de estudios de la especialidad

de Ingeniería en Automática, autorizando a que el mismo sea utilizado por la Institución,

para los fines que estime conveniente, tanto de forma parcial como total y que además no

podrá ser presentado en eventos, ni publicados sin autorización de la Universidad.

Firma del Autor

Los abajo firmantes certificamos que el presente trabajo ha sido realizado según acuerdo de

la dirección de nuestro centro y el mismo cumple con los requisitos que debe tener un

trabajo de esta envergadura referido a la temática señalada.

Firma del Autor

Firma del Jefe de Departamento

donde se defiende el trabajo

Firma del Responsable de

Información Científico-Técnica

i

PENSAMIENTO

Todo hombre que conozco es superior a mí en algún sentido. En ese sentido, aprendo de él.

Ralph Waldo Emerson

ii

DEDICATORIA

A mi mamá, la persona más maravillosa e importante en mi vida.

A mi papá y a Orlaine, por todo su cariño.

A mi novio y sus padres.

iii

AGRADECIMIENTOS

A mis padres, por todo su cariño y apoyo incondicional a lo largo de toda mi vida.

A mi novio y su familia, por compartir conmigo estos cinco años y brindarme todo su amor

y comprensión.

A mi familia, por su preocupación.

A mi tutor Juan V. Lorenzo Ginori y mi cotutora Lyanett Chinea Valdés, por permitirme

trabajar junto a ellos y brindarme toda su ayuda y confianza.

A todos los profesores de la Facultad de Eléctrica y en especial a los profesores del

CEETI.

A mis compañeros de la carrera, con los cuales compartí momentos muy especiales.

A todos los que contribuyeron a la realización de este proyecto.

iv

TAREA TÉCNICA

I. Realización de una revisión bibliográfica sobre el tema, sistematizando la

información obtenida y haciendo un análisis crítico de la misma.

II. Implementación en Matlab de algoritmos de segmentación mediante el empleo de

umbrales y empleando la transformada watershed.

III. Evaluación de la efectividad de los algoritmos programados mediante medidas de la

calidad de segmentación.

IV. Realización de un análisis estadístico de los algoritmos de segmentación propuestos.

Firma del Autor Firma del Tutor

v

RESUMEN

La malaria es una enfermedad producida por parásitos del género Plasmodium, responsable

de la muerte de millones de personas anualmente. El examen de microscopía celular es el

método estándar para el diagnóstico de esta enfermedad. El mismo requiere mucho tiempo

de análisis debido a la numerosa cantidad de imágenes de frotis de extendidos sanguíneos

que se analizan para determinar el nivel de infestación. Varias herramientas auxiliares se

han proporcionado para la realización del diagnóstico automatizado mediante el

Procesamiento Digital de Imágenes y Visión Computacional. En las mismas se plantea el

proceso de segmentación de imágenes como una de las tareas fundamentales a realizar. En

el presente trabajo se implementan algoritmos de segmentación en escala de grises

mediante el empleo de umbrales y empleando la transformada watershed. Para ello se

utilizó el lenguaje de programación del software Matlab. Además se obtuvieron máscaras

manuales, utilizadas como referencia, para realizar la evaluación cuantitativa de los

algoritmos de segmentación propuestos a partir del cálculo de los índices de Jaccard.

También se realizó un análisis estadístico para determinar si existían diferencias

estadísticamente significativas entre los métodos propuestos. El estudio contribuirá con un

aporte significativo en el campo de la salud, dado que es una potencial aplicación en el

diagnóstico de la malaria.

vi

TABLA DE CONTENIDOS

PENSAMIENTO................................................................................................................. i

DEDICATORIA ................................................................................................................ ii

AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... iii

TAREA TÉCNICA ........................................................................................................... iv

RESUMEN ........................................................................................................................ v

TABLA DE CONTENIDOS ............................................................................................. vi

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1

Organización del informe ............................................................................................... 3

1 INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO

TÉCNICAS DE PDI Y VC. ................................................................................................ 4

1.1 Análisis de la malaria utilizando imágenes de microscopía celular ........................ 4

1.2 Procesamiento automatizado de las imágenes en los estudios sobre malaria .......... 7

1.3 Técnicas empleadas en el PDI .............................................................................. 8

1.3.1 Procesamiento morfológico de imágenes ....................................................... 8

1.3.2 Negativo de la imagen ................................................................................... 9

1.3.3 Compensación de la iluminación no uniforme ............................................... 9

1.3.4 Realce de imágenes ..................................................................................... 10

1.3.5 Suavizado.................................................................................................... 10

vii

1.4 Segmentación de imágenes en los estudios sobre malaria que emplean PDI/VC . 11

1.4.1 Segmentación mediante umbralado ............................................................. 12

1.4.2 Segmentación mediante la transformada watershed (TW) ........................... 13

1.4.2.1 Uso del gradiente ................................................................................. 14

1.4.2.2 Uso de marcadores ............................................................................... 15

1.4.2.3 La transformada watershed de área mínima .......................................... 16

1.5 Evaluación de la calidad de la segmentación ...................................................... 17

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................ 18

2.1. Materiales utilizados .............................................................................................. 18

2.1.1 Adquisición y características de las imágenes utilizadas .............................. 18

2.2 Descripción de los algoritmos de segmentación propuestos ..................................... 19

2.3 Pre-procesamiento de la imagen .............................................................................. 20

2.4 Doble umbral ..................................................................................................... 21

2.4.1 Método 1A ....................................................................................................... 23

2.4.2 Método 1B ....................................................................................................... 24

2.4.3 Método 1C y Método 1D ................................................................................. 25

2.5 Otsu adaptativo .................................................................................................. 28

2.6 Transformada watershed de área mínima (TWAM) ............................................ 28

2.7 Post-procesamiento ............................................................................................ 29

2.8 Validación de los algoritmos de segmentación propuestos .................................. 30

2.8.1 Análisis estadístico........................................................................................... 30

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................... 31

3.1 Introducción ....................................................................................................... 31

3.2 Resultados obtenidos mediante el empleo del doble umbral (Método 1) .................. 31

viii

3.2.1 Método 1A ....................................................................................................... 31

3.2.2 Método 1B ....................................................................................................... 32

3.2.3 Método 1C y Método 1D ................................................................................. 33

3.3 Resultados obtenidos mediante el empleo de Otsu adaptativo (Método 2) ............... 34

3.4 Resultados obtenidos mediante el empleo de transformada watershed de área mínima

(Método 3) ................................................................................................................... 35

3.5 Estadísticos descriptivos ..................................................................................... 36

3.6 Análisis estadístico ............................................................................................. 37

3.7 Tiempo promedio de ejecución de los algoritmos implementados ....................... 39

Tiempo promedio (s) .................................................................................................... 39

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................ 40

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 41

ANEXOS ......................................................................................................................... 45

Anexo I Códigos de los algoritmos programados en Matlab...................................... 45

Anexo II Códigos de funciones programadas en Matlab ......................................... 49

Morph_area_granulometry ........................................................................................... 49

INTRODUCCIÓN 1

INTRODUCCIÓN

Según las estadísticas de la Organización Mundial de Salud (OMS), en la actualidad la

malaria o paludismo es uno de los mayores problemas de salud que enfrenta el planeta; con

una tasa anual de morbilidad de 300 a 500 millones de personas y una cifra nada alentadora

de 1.5 millones de casos en mortalidad. El 90% de las personas que mueren corresponde a

niños menores de 5 años, aunque las mujeres embarazadas son también vulnerables. Las

estadísticas precisas se desconocen porque muchos casos ocurren en áreas rurales, donde

las personas no tienen acceso a hospitales o a recursos para garantizar cuidados de salud.

Como consecuencia, la mayoría de los casos permanecen indocumentados [1].

Más de 100 países o zonas con riesgo de transmisión de malaria son visitados por más de

125 millones de viajeros internacionales cada año. Muchos de ellos contraen paludismo en

los países de riesgo, notificándose, más de 10 000 enfermos al volver a casa. En América

hay transmisión de paludismo en nueve países de la región que comparten la selva

amazónica, y en ocho países de América Central y el Caribe. Las características de

transmisión son muy variables entre regiones, incluso en un mismo país [2]. El Plasmodium

falciparum transmite la especie más peligrosa de malaria con los índices más altos de

complicaciones y mortalidad, productor del 80% de todas las infecciones de malaria y el

90% de las muertes por la enfermedad. Su prevalencia predomina en el África

subsahariana, más que en otras áreas del mundo. Al picar a la persona, la hembra del

mosquito inocula los parásitos Plasmodium en el cuerpo de esta. Estos atacan los glóbulos

rojos (ver figura1) y se multiplican, iniciando el cuadro clínico en el paciente.

INTRODUCCIÓN 2

Fig.1: Glóbulo rojo infestado con Plasmodium Berghei.

Lo anteriormente expuesto condujo a la búsqueda sistemática de un tratamiento efectivo

contra este parásito; sin embargo, la misma ha sido infructuosa. Uno de los inconvenientes

relacionados con esta parasitosis es la resistencia desarrollada a los fármacos empleados en

su tratamiento. El relativo éxito de estos compuestos se ha visto mermado por los efectos

secundarios que se presentan en los pacientes infectados, especialmente los referentes a la

función cardiovascular [3].

El examen de microscopía celular es actualmente el método estándar para el diagnóstico de

malaria, pero el mismo requiere mucho de tiempo de análisis. Debido a la numerosa

cantidad de imágenes de eritrocitos que se analizan en una aplicación dada, un proceso

manual resulta ser en muchos casos: lento, tedioso y vulnerable a errores intra- e inter-

analistas.

Los estudios en el tema proporcionaron para la realización del diagnóstico automatizado

varias herramientas auxiliares mediante el Procesamiento Digital de Imágenes (PDI) y

Visión por Computadora (VC); desarrollando técnicas basadas en el procesado general de

la imagen y en morfología matemática. La detección del parásito es su función

fundamental, así como el reconocimiento de las etapas de desarrollo de vida del mismo [4].

La segmentación es una de las tareas previas que se realiza en el PDI. En años recientes,

han sido propuestas diferentes técnicas de segmentación, las que aún no son completamente

capaces de detectar o impedir infra- o sobre-segmentación sobre los objetos de interés. En

este trabajo se utilizarán diferentes variantes de segmentación con el objetivo de dar

solución a esta problemática. El mismo formará parte de un componente de hardware que

permitirá de una manera apropiada, capturar imágenes digitales de frotis sanguíneos y

luego procesarlas computacionalmente para determinar el grado de infestación con malaria

INTRODUCCIÓN 3

en animales de laboratorio.

Los algoritmos de segmentación implementados serán utilizados en un proyecto de

desarrollo de medicamentos antimaláricos, investigación que se lleva a cabo en el

laboratorio de histopatología del Centro de Bioactivos Químicos (CBQ) de la Universidad

Central “Marta Abreu” de Las Villas, conjuntamente con el Centro de Estudios de

Electrónica y Tecnologías de la Información (CEETI). Este contribuirá con un aporte

significativo en el campo de la salud, y una potencial aplicación en múltiples enfermedades.

Objetivos de la investigación

Objetivo general:

Implementar algoritmos de segmentación mediante el empleo de umbrales y la

transformada watershed.

Objetivos específicos:

1. Implementar el algoritmo de segmentación mediante el método de doble umbral.

2. Implementar el algoritmo de segmentación mediante el método de Otsu adaptativo.

3. Implementar el algoritmo de segmentación mediante la transformada watershed de

área mínima.

4. Evaluar la efectividad de los algoritmos programados mediante medidas de calidad

de la segmentación.

5. Comparar los resultados de los algoritmos programados a través de un análisis

estadístico.

Organización del informe

El informe de la investigación se estructurará en introducción, capitulario, conclusiones,

recomendaciones, referencias bibliográficas y anexos. En el capítulo I se realizó una

revisión de las fuentes bibliográficas, a fin de fundamentar los aspectos teóricos

relacionados con este trabajo. En el capítulo II se describen los materiales y métodos

empleados para el desarrollo de algoritmos de segmentación de imágenes en escala de

grises, mediante el PDI y VC. En el capítulo III se ilustran y discuten los resultados

obtenidos con los métodos de segmentación propuestos.

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA EMPLEANDO

TÉCNICAS DE PDI Y VC 4

1 INTRODUCCIÓN A LOS ESTUDIOS SOBRE LA MALARIA

EMPLEANDO TÉCNICAS DE PDI Y VC.

1.1 Análisis de la malaria utilizando imágenes de microscopía celular

La malaria se encuentra distribuida globalmente y representa un problema serio de salud

humana. Diagnosticar a tiempo esta enfermedad puede ser vital para el enfermo, ya que una

demora en iniciar el tratamiento puede dar lugar a la aparición de complicaciones. La

misma es causada por parásitos del género Plasmodium, siendo cuatro las especies que

pueden parasitar al hombre: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale

y Plasmodium malariae.

El descubrimiento del Plasmodium por Charles Louis, en 1880, y la demostración

experimental por R. Ross y B. Grass, en 1899, de que la hembra del mosquito Anopheles

pseudopunctipennis era la principal responsable de la transmisión del paludismo, condujo a

la búsqueda sistemática de un tratamiento efectivo contra el parásito [3].

El ciclo biológico del Plasmodium comprende tres fases [5]:

Ciclo sexual o Esporogónico: La transmisión natural de la enfermedad se produce

cuando un mosquito hembra del género Anopheles pica a un humano infestado y de

esta forma adquiere los gametocitos del Plasmodium (macho y hembra), que

ingresan al tubo digestivo del mosquito y tras la fecundación se reproducen en la

pared de este hasta adquirir la forma infectante denominada esporozoito. Los

esporozoitos recorren el cuerpo del mosquito y algunos llegan a las glándulas

salivales, para ser transmitidos a otro huésped sano. En el momento de la picadura,

los esporozoitos ingresan a la vía sanguínea del huésped, donde permanecen media

hora antes de penetrar en las células hepáticas.

Ciclo Exoeritrocítico: Esta fase se inicia en las células hepáticas, donde los

esporozoitos se reproducen en grandes cantidades hasta asumir la forma capaz de



invadir los glóbulos rojos. En el segundo día de esta fase, en el interior de los

hepatocitos se encuentran esquizontes tisulares que aumentan de volumen y se

dividen para formar millares de minúsculos merozoitos.

Ciclo Eritrocítico: Ocurre cuando los merozoitos se liberan del hígado, pasan en

grandes cantidades a la sangre e invaden los glóbulos rojos en forma de trofozoitos,

alimentándose de la hemoglobina y provocando su destrucción.

Fig1.1: Ciclo de vida del Plasmodium.1

1 Imagen obtenida de [5]



Las características morfológicas del parásito varían según el ciclo de vida de este, las cuales

se describen en la tabla 1.1.

Tabla 1.1: Características morfológicas de los parásitos palúdicos en extensiones sanguíneas finas (según

OMS).2

P. vivax P. ovale P. malariae P. falciparum

Glóbulo rojo

infestado

Tamaño

aumentado; puntos

de Schüffner

presentes.

Tamaño aumentado;

puede ser oval con

fimbrias; puntos de

Schüffner presentes.

Tamaño normal o

menor de lo normal.

Tamaño normal;

pueden observarse

hendiduras de Maurer.

Fase de

anillo

(trofozoito

precoz)

Bastante grande;

uno o dos puntos

de cromatina;

puede haber dos

anillos por

eritrocito.

Compacto;

raramente dos

anillos por

eritrocito.

Compacto; raramente

dos anillos por

eritrocito.

Pequeño y delicado; a

menudo dos puntos de

cromatina; a menudo

dos o más anillos por

eritrocito; formas

adheridas frecuentes.

Trofozoito

tardío

Grande; ameboide;

pigmento en forma

de bastones finos.

Pequeño; no

ameboide; pigmento

granuloso.

Pequeño; compacto;

a menudo en forma

de banda; pigmento

granuloso.

Tamaño moderado;

generalmente

compacto; pigmento en

granulos.

Esquizonte

maduro

Grande;

merozoitos

grandes (12-24);

pigmento

coalescente.

Más pequeño que P.

vivax; merozoitos

(6-12 merozoitos);

pigmento más

oscuro que en P.

vivax.

Pequeño; merozoitos

grandes (6-12);

aspecto de

“margarita”

característico;

pigmento granuloso.

Raro en la sangre

periférica; merozoitos

pequeños (8-26); masa

única de pigmento.

Gametocitos

Esféricos;

compactos; núcleo

único; pigmento

difuso y granuloso.

Parecidos a P. vivax

pero más pequeños.

Parecidos a P. vivax

pero más pequeños;

menos numerosos y

sin puntos de

Schüffner.

En forma semilunar,

núcleo único.

Las características clínicas de la malaria dependen de la especie del parásito, la

concentración de parásitos asexuales en sangre (parasitemia) y del estado inmunitario del

huésped. El cuadro clínico clásico consiste en escalofrío, fiebre y sudoración. El ataque

2 Extraída de [5]



agudo se inicia con accesos febriles precedidos por escalofrío y seguidos de intensa

sudoración que se repiten cada 48 o 72 horas según la especie de Plasmodium [2].

Desde que se describiera por primera vez, el diagnóstico de esta enfermedad se ha realizado

mediante la observación de las distintas formas del parásito en el examen microscópico de

frotis de sangre periférica teñidas con diversos colorantes. La tinción con Giemsa es la más

generalizada en esta aplicación y fue la empleada en las imágenes que se usan en este

trabajo. La toma de muestras se realiza mediante la punción con una lanceta estéril,

normalmente en la yema del dedo. Se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con

otro se realiza la extensión en capa fina. Para la gota gruesa se recogen 3 o 4 gotas sobre un

portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos rápidos, extendiéndose en

una capa gruesa y uniforme. Hoy día esta técnica sigue siendo el método de referencia. Sin

embargo, la laboriosidad que precisa el entrenamiento de un buen microscopista y la

dificultad que entraña observar parasitemias bajas ha impulsado el desarrollo de técnicas de

PDI y VC, para lograr el diagnóstico automatizado.

1.2 Procesamiento automatizado de las imágenes en los estudios sobre malaria

Durante los últimos años, varios grupos de investigación han enfocado la atención en el

desarrollo de sistemas informatizados que pueden analizar diferentes tipos de imágenes

médicas y extraer información interesante para el personal médico [6], [7]. El PDI y la VC

brindan herramientas que facilitan mediante métodos automatizados el diagnóstico de

disímiles enfermedades. En el caso del desarrollo de medicamentos antimaláricos, es

necesario analizar grandes cantidades de imágenes para determinar el grado de infestación

con malaria en animales de laboratorio. El empleo del PDI y la VC contribuyen a obtener

más rápidamente los resultados, haciendo el proceso más eficiente. Aunque ambos campos

tienen mucho en común, el objetivo final es diferente.

El PDI es el conjunto de técnicas que se aplican a las imágenes digitales con el objetivo de

mejorar la calidad o facilitar la búsqueda de información. Está enfocado a lograr una mayor

automatización de los procesos en una aplicación dada, para obtener resultados de forma

rápida, y con mayor grado de confiabilidad. El PDI incluye cinco componentes principales

[7]:

Adquisición: Es el proceso a través del cual se obtiene una imagen visual.



Pre-procesamiento: Incluye técnicas tales como la reducción de ruido y realce de detalles.

Segmentación: Es el proceso mediante el cual se subdivide una imagen en sus regiones

constitutivas u objetos [8].

Post-procesamiento: Puesto que las tareas de segmentación no suelen dar un resultado

exacto de la delimitación de los objetos o regiones de interés, se incluyen técnicas de

procesamiento morfológico para eliminar píxeles mal clasificados, bordes imprecisos de los

objetos o regiones que están solapadas.

Análisis de la imagen: Extraer información interesante para el profesional médico en

función del diagnóstico, la terapia, control y evaluación del paciente.

Un área muy ligada al PDI es la visión computacional. Su función principal es reconocer y

localizar objetos en una imagen mediante el procesamiento digital de esta. Permite extraer

características de una imagen y realizar su descripción e interpretación por la computadora

con capacidades similares a las humanas.

1.3 Técnicas empleadas en el PDI

La segmentación en el análisis de frotis de sangre humana constituye uno de los problemas

más desafiantes en el análisis automatizado de imágenes celulares. El problema implica

resolver la presencia de ruido, los cambios graduales de intensidad, la similitud de

intensidades entre diferentes estructuras anatómicas; así como infra- o sobre-segmentación

que pueden aparecer como inconvenientes al aplicar esta técnica.

El PDI incluye un conjunto de transformaciones que operan sobre la representación digital

de una imagen, con el propósito de destacar algunos de los elementos que conforman la

escena; de modo que se facilite su posterior análisis, bien sea por parte de un usuario

(humano) o un sistema de visión artificial. En general, estas transformaciones son aplicadas

cuando resulta necesario realzar o modificar una imagen para mejorar su apariencia, o

cuando se requiere: medir, contrastar o clasificar algún elemento contenido en la misma.

Algunas transformaciones de uso frecuente se describen a continuación.

1.3.1 Procesamiento morfológico de imágenes

El procesamiento morfológico es una rama del PDI que toma su nombre a partir de la

morfología matemática, para extraer y procesar componentes de la imagen que resultan



útiles en la representación y descripción de las formas, tales como: límites, esqueletos y

cascos convexos. Esta teoría basada en el álgebra de conjuntos ofrece buenos resultados y

un costo computacional mínimo convirtiéndose en una herramienta de gran ayuda en

imágenes médicas [9]. En el PDI las operaciones morfológicas son de gran utilizad tanto en

el pre-procesamiento como en el post-procesamiento. Las mismas, originalmente fueron

concebidas para su aplicación en imágenes binarias, pero pueden ser extendidas al caso de

las imágenes en escala de grises. Algunas operaciones de procesamiento morfológico en

imágenes son: erosión, dilatación, apertura y cierre [10].

1.3.2 Negativo de la imagen

La idea es convertir aquellas porciones de la imagen que son claras en oscuras y las que son

oscuras en claras. La complementación de la imagen, puede resultar de utilidad cuando se

quiere apreciar los detalles en las porciones brillantes de una imagen, pues el ojo humano,

es capaz de discernir mejor los detalles en áreas oscuras de una imagen que en las áreas

más brillantes (ver figura 1.2).

Fig.1.2: a) Imagen es escala de grises e b) Imagen es escala de grises complementada.

1.3.3 Compensación de la iluminación no uniforme

El efecto de una iluminación de fondo no uniforme en las imágenes ocurre frecuentemente

en aplicaciones tales como la microscopía óptica, donde el campo luminoso puede no

presentar una intensidad uniforme. La transformación morfológica en escala de grises “top

hat” tiene como principal objetivo estandarizar la visualización de los objetos en cada

imagen [11]. Para lograr la uniformidad de iluminación del fondo de las imágenes, se

utiliza un elemento estructurante lo suficientemente extenso como para que con la apertura

(Ia) solamente quede presente el fondo no uniforme, que al restarse de la imagen original

(I) devuelve el mapa de intensidades con una distribución adecuada (ver figura 1.3).



Fig.1.3: Transformación morfológica del top hat.

1.3.4 Realce de imágenes

Una de las imperfecciones más comunes de las imágenes digitales, es el pobre contraste

resultante de un rango de intensidad reducido en comparación al rango disponible de

niveles de gris (por ejemplo de 0 a 255 niveles). El contraste de una imagen, puede

mejorarse mediante el re-escalamiento de la intensidad de cada píxel, de manera que la

calidad diagnóstica final de la imagen destacada es muy superior a la imagen simple (ver

figura 1.4). Para ello se emplean técnicas como ajuste de la intensidad o bien ecualizaciones

o especificaciones de histograma. Muchas operaciones de realce de imágenes se hacen en la

vecindad de los píxeles o regiones de interés. Esto se debe a que las regiones cercanas al

píxel en cuestión pueden proporcionar información valiosa acerca de los niveles de

iluminación y los detalles de la escena [12].

Fig.1.4: a) Imagen complementada en escala de grises y b) Realce de la imagen.

1.3.5 Suavizado

Se le denomina “suavizado” o filtro de ruidos, a la operación de filtrado que se usa para

eliminar el ruido de una imagen y provocar el efecto con el cual la imagen aparezca algo

borrosa (difuminada); por eso usualmente se le denomina suavizado. Se trata, en cuestión,

de un filtro paso-bajo. Estos consisten en atenuar las componentes de la imagen con alta

frecuencia espacial, dejando pasar componentes de baja frecuencia. Esto es útil en el pre-



procesado para eliminar pequeños detalles antes de la extracción de un objeto grande y el

relleno de pequeños espacios entre líneas o curvas [13].

Fig.1.5: a) Imagen en escala de grises y b) Suavizado de la imagen.

1.4 Segmentación de imágenes en los estudios sobre malaria que emplean PDI/VC

Diversos estudios describen sistemas que emplean PDI y VC para la detección y

clasificación de parasitemias. Para la obtención de resultados satisfactorios en el análisis

mediante PDI se necesita realizar, como una de las tareas fundamentales, un buen proceso

de segmentación de las imágenes, ya que este es uno de los elementos más importantes en

cualquier sistema automatizado de visión [14].

La segmentación es una etapa del procesamiento digital de imágenes que ubica y destaca

algunos de los elementos de una imagen. El objetivo de esta es simplificar y/o cambiar la

representación de una imagen en otra más significativa y fácil de analizar. El proceso de

segmentación de una imagen presenta una gran relevancia, puesto que de la calidad del

resultado de la misma depende el desempeño de la extracción de características y

clasificación de los objetos presentes en la imagen [12].

En el análisis de imágenes de microscopía celular donde los eritrocitos se encuentran

infestados con malaria autores como Mandal [15], Makkapati y Rao [16] utilizan

algoritmos de segmentación basados en la información del color. Otros autores como Di

Ruberto [18] Ross [19] y Tek [4] proponen técnicas de segmentación en escala de grises. El

umbralado y la utilización de la transformada watershed son métodos clásicos que han sido

utilizados por estos y otros autores.

Existe una gran variedad de técnicas de propósito general para la segmentación de

imágenes. Dado que no existe una solución general para el problema de la segmentación, a

menudo se tienen que combinar varias técnicas para resolverlo eficazmente.



1.4.1 Segmentación mediante umbralado

Los algoritmos de segmentación se basan generalmente en la similitud y discontinuidad de

las intensidades de los píxeles. Uno de los algoritmos basados en similitud más utilizados

es el umbralado a partir de los niveles de gris [8]. Este algoritmo es de simple

programación y rápida ejecución.

Mediante umbralado, el valor del nivel de gris de cada píxel de la imagen debe ser

comparado con el umbral, para decidir si el mismo pertenece al objeto o al fondo. La

imagen de salida, es una imagen binaria en la cual aquellos píxeles cuyo valor es 1,

pertenecen al objeto y los píxeles cuyo valor es cero, pertenecen al fondo.

La selección del valor del umbral, se realiza generalmente a partir del histograma de la

imagen. Por ejemplo, en una imagen compuesta de un objeto y el mismo aparece en la

escena sobre un fondo, es de esperar que su histograma sea bimodal. Si el fondo y el objeto

tienen niveles de gris diferentes, en el histograma aparecerán dos picos.

La selección automática del umbral, es un problema difícil, debido a que el histograma no

siempre es bimodal; en cuyo caso resulta necesario combinar la información espacial

presente en la imagen, con la información referente al nivel de gris. Para el caso del

histograma bimodal, existen técnicas de detección automática del umbral, una de las cuales

fue ideada por Otsu [19]. La misma ha sido reseñada por Haralick y Shapiro [20] y se basa

en la maximización de la varianza entre clases. El procedimiento se basa en buscar un

umbral global entre los picos del histograma (ver figura 1.6). En la figura 1.6, así como en

las figuras 2.3, 2.6 y 2.7 se muestran la sección del histograma donde se encuentran los

picos de intensidad para una mejor observación de los mismos; los valores de intensidad

desde 0 hasta 0.65 son nulos.

Otsu no ofrece resultados satisfactorios cuando hay cambios en la intensidad en la imagen,

lo cual puede estar ocasionado por una iluminación no uniforme presente en la escena. Por

ello se recurre a la utilización del método de Otsu adaptativo. El carácter adaptativo está

dado en este caso por la aplicación previa de una corrección de la iluminación no uniforme

presente en la imagen. Este método consiste en imponer un umbral global sobre una

transformación de la intensidad de los píxeles en una imagen.



Fig.1.6: Histograma bimodal en el que se determina el umbral global.

Otra técnica consiste en el operador de doble umbral (DU), mediante el cual se realiza el

umbralado de la imagen de entrada tomando dos rangos de valores de intensidad en escala

de grises, donde uno incluye al otro. El rango estrecho ( ) se utiliza como semilla para

realizar la reconstrucción morfológica ( ( ) ) sobre el rango amplio ( ):

( ) ( ) ( ) (1.1)

El resultado es una imagen binaria más nítida que la obtenida con un único umbral (ver

figura 1.7) y se mantiene estable ante ligeras modificaciones de los valores de umbrales

[10].

Fig.1.7: Algoritmo para aplicar doble umbral: a) Imagen en escala de grises, b) Imagen obtenida a partir del

rango estrecho, c) Imagen obtenida a partir del rango amplio y d) Imagen resultante de la reconstrucción

morfológica.

1.4.2 Segmentación mediante la transformada watershed (TW)

El significado de la operación de watershed se encuentra en su notación en lengua francesa

como la ligne de partage des eaux (línea de separación de aguas) [21]. Se considera una

técnica de segmentación orientada a regiones, debido a que clasifica los píxeles según: su



proximidad espacial, el gradiente de sus niveles de gris, y la homogeneidad de sus texturas.

Por ello, se toma como una técnica de detección de contornos y crecimiento de regiones al

mismo tiempo [22].

Esta transformación consiste en simular la inundación de la imagen numérica (vista como

un mapa topográfico) a partir de los mínimos regionales (ver figura 1.8). El agua es

introducida desde los mínimos regionales, hasta que llega un momento, en el cual el

proceso de inundación hace que las cuencas contiguas se unan. Las líneas de unión, que

representan las fronteras de regiones homogéneas, son las que constituyen el esqueleto

geodésico. El resultado es un conjunto de contornos que identifican las regiones de la

imagen [23], [24].

Fig. 1.8: Inundación de la imagen a partir de los mínimos regionales.3

1.4.2.1 Uso del gradiente

En la práctica, el proceso de segmentación morfológica suele partir de la imagen gradiente,

aplicándose a esta última la TW, pues se pretende identificar el contorno de los objetos y no

su zona de influencia. Los mínimos proceden, en este caso, de la imagen gradiente.

En el presente estudio se emplean los gradientes morfológicos. Estos en comparación con

los gradientes lineales convencionales, son significativamente menos sensibles al ruido y

permiten su aplicación a imágenes complejas, con un bajo costo computacional. Autores

como Boqiang [25], González [26], Chinea [27] y Pastore [28] han obtenido resultados

satisfactorios con su utilización. El gradiente morfológico o de Beucher generalizado ( )




es resultado de realizar la resta entre el resultado de la dilatación ( ) y de la erosión ( )

de la imagen en escala de grises, como se define en 1.2:

(1.2)

En comparación con los gradientes morfológicos internos y externos, el gradiente

morfológico generalizado tiene la ventaja de dar como resultado contornos más anchos y

siempre continuos.

1.4.2.2 Uso de marcadores

El resultado de utilizar la TW en imágenes reales suele conducir al fenómeno de sobre-

segmentación, porque la presencia de mínimos locales en la imagen gradiente puede ser

bastante alta. Para evitar este inconveniente uno de los métodos más comunes es la

determinación de marcadores unívocos para cada uno de los objetos de interés. El nuevo

algoritmo resultante se denomina watershed controlado por marcadores, el cual se define en

la figura 1.9 [23].

Fig. 1.9: Algoritmo de watershed controlado por marcadores.

La inundación del gradiente en vez de la imagen original y la determinación de marcadores

unívocos son las dos diferencias entre la TW clásica y la TW por marcadores. Estas

modificaciones verdaderamente incrementan la precisión de la TW para detectar los

contornos de interés. La figura 1.10 muestra la inundación de la topología de la imagen a

partir de estos marcadores.



Fig. 1.10: Algoritmo de inundación de la TW a partir de marcadores.4

Los resultados de la TW son independientes de la ubicación de los marcadores, siempre y

cuando estos se coloquen en el interior del objeto y el contorno de los objetos sea

significativo respecto de los gradientes internos del objeto. Se debe marcar los objetos a

segmentar (marcadores internos) y el fondo (marcadores externos) para obtener los

contornos buscados.

La transformada de Hough ha sido ampliamente usada en la búsqueda de marcadores. Es un

algoritmo empleado en reconocimiento de patrones en imágenes, que permite encontrar

ciertas formas dentro de una imagen, como líneas, círculos, etc; el cual usa la información

de la imagen gradiente o de los bordes. Su desventaja aparece al variar la forma y la

apariencia de los objetos en la imagen. Estas variaciones causan picos que traen consigo la

detección inexacta.

Recientemente se ha demostrado que la transformada Radon también se puede utilizar para

el propósito de encontrar marcadores y es de menor costo computacional [29], [4].

1.4.2.3 La transformada watershed de área mínima

La transformada watershed de área mínima (TWAM) es una transformación de la TW

original, la cual asegura el área de “las regiones etiquetadas” por encima de un umbral

dado. La misma usa varios operadores basados en la morfología matemática para ser

desarrollada y es utilizada como un operador inicial de segmentación. La información del

área de la célula, la cual es estimada aplicando la granulometría de área (el espectro del

patrón de área), es usada como un atributo. El método es planteado para dar solución a la

sobre-segmentación que se obtiene en ocasiones al aplicar la TW clásica [4]. El algoritmo




emplea operadores morfológicos para realizar el cierre por área en escala de grises con el

objetivo de eliminar mínimos existentes en la imagen gradiente (ver figura 1.11).

Fig. 1.11: a) Imagen gradiente y b) Cierre por área de la imagen gradiente.

1.5 Evaluación de la calidad de la segmentación

Para evaluar la eficiencia de un método de segmentación se llevan a cabo experimentos de

validación. Una valoración subjetiva consiste en realizar una simple inspección visual entre

la imagen resultante de la segmentación realizada y una imagen segmentada de referencia o

ground-truth. Esta última puede lograrse por medio de una segmentación manual realizada

por un especialista o bien mediante simulaciones computacionales. Sin embargo, esto no

garantiza una validación debido a la gran variabilidad inter e intra-analistas.

Por esta razón, es necesario establecer alguna medida de calidad, para cuantificar la

precisión y exactitud del método de segmentación [28]. El cálculo del índice de Jaccard es

una herramienta ampliamente usada en diferentes aplicaciones [30], [31]. El mismo, es la

proporción entre el número de píxeles en la intersección y en la unión, respectivamente, de

la imagen binaria resultante(A) al ser comparada con una imagen binaria de referencia (B),

donde |.| representa la cardinalidad del conjunto. El mismo se define en la expresión 1.3.

| |

| | ( ) (1.3)

El índice de Jaccard con un valor de 1 indica una coincidencia perfecta entre A y B; un

valor igual a cero sugiere ausencia total de coincidencia entre ambas imágenes.

Para evaluar la calidad de los resultados de la segmentación cuantitativamente se puede

utilizar también el cálculo del coeficiente Dice [32], que se define como:

( ) | |

| | | | ( ) (1.4)

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS 18

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Materiales utilizados

El algoritmo se implementó en una computadora personal con sistema operativo Windows

7 Home Premium, microprocesador Pentium(R) Dual-Core CPU E5300 @ 2.60 GHz, 2

MB de caché L2 y 2 GB de memoria RAM. Se utilizó el lenguaje de programación del

software Matlab en su versión 7.10.0 (R2010a) y el Toolbox correspondiente a PDI [33].

Las principales funciones empleadas fueron: rgb2gray, adapthisteq, imadjust, imerode,

imdilate, aclosegray, aopengray imreconstruct, findpeaks, im2bw, watershed, imfill,

bwareaopen, imclearborder.

También se utilizaron otros software disponibles en la plataforma de Windows como el

Adobe Photoshop CS2 en su versión 9.0 y el IBM SPSS (Statistical Product and Service

Solutions) en su versión 20. Mediante el Adobe Photoshop CS2 se obtuvieron las máscaras

de referencia para realizar la evaluación cuantitativa de los algoritmos de segmentación

propuestos a partir del cálculo de los índices de Jaccard. En este caso los índices de Dice

no se utilizaron ya que aportaron información muy similar a los índices de Jaccard. El IBM

SPSS se utilizó para realizar el análisis estadístico al aplicar pruebas de hipótesis que

permitan estimar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los algoritmos

propuestos de segmentación.

2.1.1 Adquisición y características de las imágenes utilizadas

Para el desarrollo de este estudio se emplearon imágenes microscópicas de extendidos

sanguíneos a partir de muestras de sangre tomadas a roedores infestados con Plasmodium

Berghei. La adquisición de las imágenes se realizó mediante un microscopio en el

laboratorio de histopatología del CBQ. El microscopio es marca Zuzi dotado de tres

oculares, dos oculares de 10x/20mm, para visualizar las muestras a escala microscópica, y


un tercer ocular, al que se conecta un equipo de fotomicrografía. El objetivo utilizado en la

observación de las imágenes fue el de 100x.

El dispositivo de adquisición utilizado corresponde a una cámara digital del modelo

UCMOS031100KPA, de la misma marca que el microscopio. Esta cámara posee un sensor

CMOS, que permite obtener las imágenes de colores con una profundidad de 8 bits en cada

canal de color y se conectada a una PC a través de un puerto USB [34].

En la Tabla 2.1 se muestran los datos de las imágenes que se utilizaron para el desarrollo

del experimento, en las cuales se encuentran presentes eritrocitos aislados así como

aglomerados.

Tabla 2.1: Datos de las imágenes utilizadas.

Nombre de la

imagen

Tipo de

imagen

Tamaño en

píxeles

Formato de la

imagen

Tinción

utilizada Objetivo

29 Real 2048x1536 TIF Giemsa 100x






2.2 Descripción de los algoritmos de segmentación propuestos

La implementación de los algoritmos de segmentación propuestos siguió como patrón el

diagrama de flujo que se muestra en la figura 2.1. Como primer paso se realizó una etapa de

pre-procesamiento sobre la imagen adquirida. Este pre-procesamiento se aplicó

indistintamente según la variante de segmentación que el mismo precedía. A continuación

se mencionan las técnicas empleadas:

Corrección de la iluminación no uniforme (transformación “top hat”).

Realce (maximización del contraste).

Suavizado a través del filtro Erosión-Reconstrucción-Dilatación-Reconstrucción

(ERDR).

Posteriormente, sobre la imagen resultante del pre-procesamiento se efectuó la

binarización, implementándose los siguientes métodos para su ejecución:


Doble umbral (Método 1).

Otsu adaptativo (Método 2).

Transformada watershed de área mínima (Método 3).

Se toma el criterio de denotar cada uno de los algoritmos de segmentación propuestos como

método 1, método 2 y método 3, siguiendo el orden en que serán explicados.

Una vez obtenidas las máscaras de segmentación para cada uno de los métodos antes

mencionados, se aplicaron técnicas de procesamiento morfológico sobre la imagen binaria a

fin de eliminar píxeles mal clasificados o bordes imprecisos de los objetos en la escena. Lo

anterior expuesto se corresponde con la etapa de post-procesamiento. Finalmente se obtiene

la imagen segmentada.

Fig. 2.1: Diagrama de flujo de los algoritmos implementados.

2.3 Pre-procesamiento de la imagen

La gran variabilidad en los parámetros de las imágenes adquiridas, como son: su tamaño,

coloración, iluminación, entre otras, hace que sea necesario realizar un pre-procesamiento

cuyo principal objetivo es estandarizar la visualización de los objetos en cada imagen.

Para aplicar las técnicas de pre-procesamiento implementadas se realizó inicialmente la

conversión a escala de grises de la imagen de entrada, la cual se encontraba en el espacio de

color verdadero RGB. Inicialmente se realizaron pruebas preliminares con diferentes

variantes, como tomar el plano verde en la imagen en RGB, utilizar el método decolarize

[35] o el plano de intensidad en la imagen convertida a HSI usado por González & Woods

[36]. Cada una de estas variantes, de forma independiente, no mantenían un


comportamiento óptimo en todos los algoritmos propuestos. Por esta razón se decidió

utilizar la función rgb2gray ya que con su utilización los resultados fueron cualitativamente

satisfactorios (ver figura 2.2). Su sintaxis se muestra a continuación:

Igray= rgb2gray (I)

donde:

I: Imagen de entrada en RGB, convertida a doble precisión utilizando la función im2double.

Igray: Imagen en escala de grises.

Fig.2.2: a) Imagen de entrada en RGB y b) Imagen de entrada convertida a escala de grises.

Para la corrección de la iluminación no uniforme del fondo de las imágenes, se le aplica a

las mismas la transformación top hat. Para ello se utiliza la función imtophat, la cual tiene

la siguiente sintaxis:

Ith= imtophat (Igray, EE)

donde:

Igray: Imagen con iluminación no uniforme en escala de grises.

EE: Elemento estructurante tipo disco con radio 100, valor que se deriva del análisis

granulométrico de la imagen. El elemento estructurante se crea utilizando la función strel.

Ith: Imagen con uniformidad de iluminación del fondo.

La maximización del contraste de la imagen en escala de grises se realiza mediante la

función adapthisteq, con la cual se ecualiza su histograma. Además se recurre a la función

imadjust para re-escalar la intensidad de la imagen de manera que ocupe todo el rango

dinámico.

2.4 Doble umbral

Para la implementación del método de doble umbral se recurre a la utilización del

histograma de la imagen sin complementar, a la cual se le realiza previamente la corrección


de la iluminación no uniforme. De esta forma, el primer lóbulo es representativo de los

niveles de intensidad que poseen los objetos en el primer plano (eritrocitos) y el segundo

lóbulo de los niveles de intensidad presentes en el fondo de la imagen (ver figura 2.3). A

partir del mismo se determinan cuatro umbrales (u1, u2, u3, u4 si se ordenan de menor a

mayor según su valor de intensidad en un rango normalizado entre 0 y 1).

Fig. 2.3: Histograma bimodal sobre el que se determina el rango amplio y el rango estrecho.

Con estos cuatro umbrales se forman dos pares. El primer par define el rango amplio, el

cual está formado por u1 y u4. El segundo par define el rango estrecho y está formado por

los otros dos restantes umbrales (u2 y u3). Luego la imagen de entrada es binarizada

(utilizando la función im2bw) comparando su intensidad con los dos umbrales que

conforman el rango amplio; y mediante intersecciones lógicas entre las imágenes binarias

resultantes se obtiene la imagen máscara. De igual forma se obtiene la imagen marcadora,

al binarizar en este caso, utilizando los umbrales que conforman el rango estrecho (ver

figura 2.4).

A partir de la imagen marcadora y la imagen máscara se realiza la reconstrucción

morfológica para obtener la máscara de segmentación utilizando la función imreconstruct:

Ireconst= imreconstruct (Imarker, Imask)

donde:

Imarker: Imagen marcadora.

Imask: Imagen máscara.

Ireconst: Imagen resultante de la reconstrucción morfológica (máscara de segmentación).

La imagen binaria resultante mantendrá las mismas dimensiones que la imagen original.


Fig.2.4: a) Imagen marcadora y b) Imagen máscara.

De la implementación del método de doble umbral (Método 1) se deriva: Método 1A,

Método 1B, Método 1C y Método 1D. Los dos primeros (Método 1A y Método 1B) son

aplicados cuando inicialmente el histograma de la imagen en cuestión es bimodal y difieren

en dependencia del criterio que se sigue al determinar los umbrales en el histograma. El

Método 1C y Método 1D son propuestos para el caso en que el histograma de la imagen no

tiene un comportamiento bimodal inicialmente. En este caso se le realiza un tratamiento a

la imagen para obtener una representación del histograma del primer plano y el fondo de la

imagen independientemente, a partir de los que de determinan los umbrales según las dos

variantes implementadas (ver figura 2.5).

Fig.2.5: Diagrama en bloques de los métodos que se derivan al aplicar doble umbral.

2.4.1 Método 1A

En este método se sigue el razonamiento expuesto por Tek [4] para determinar los umbrales

a partir del histograma de la imagen. Los dos primeros umbrales se tomarían como cero (u1

y u2); mientras que los valores del tercer y cuarto umbral (u3 y u4) se determinan a partir de

los valores de los picos máximos representados en el histograma. Estos picos se

corresponden con el primer plano (pfg) y el fondo (pbg).


Para obtener el valor de estos se obtiene el histograma de la imagen en cuestión utilizando

la función imhist, la que devuelve dos variables: "counts" y "x". En "counts" se evalúa la

proporción asociada a la intensidad de los píxeles para los diferentes niveles de grises

presentes en la imagen. Estos niveles de grises se almacenan en el vector "x". Luego se

utiliza la función findpeaks, la cual recorre el vector "counts" y almacena

descendentemente en la variable "locs" las posiciones del vector "x" que se corresponden

con los picos representativos en el histograma. La media entre ellos se denota como la

variable m. De esta forma el valor del tercero y del cuarto umbral se calcularía a través de

las expresiones 2.1 y 2.2 respectivamente:

m= (pfg+pbg)/2 (2.1)

u3= (pfg+m)/2 (2.2)

u4= (pbg+m)/2 (2.3)

Siguiendo este criterio los umbrales quedarían impuestos sobre el histograma como se

muestra en la figura 2.6.

Fig.2.6: Imposición de umbrales sobre el histograma de la imagen según la variante 1.

2.4.2 Método 1B

En este método se propone una alternativa para determinar los umbrales de forma diferente

a la propuesta en el método anterior. En este caso solo el primer umbral se hace igual a 0.

Las expresiones para determinar los restantes umbrales se definen a continuación:

u2=2pfg-(pfg+m)/2 (2.4)

u3= (pfg+m)/2 (2.5)

u4=m (2.6)


El algoritmo para determinar el nivel de intensidad de los picos que se corresponden con el

primer plano (pfg) y el fondo (pbg) se hace de forma análoga a la empleada en la variante

1. De esta forma la imagen marcador quedará determinada a partir de un rango más

estrecho, en comparación con el método 1A, el cual queda enmarcado alrededor del pico

representativo correspondiente al primer plano. Siguiendo este criterio los umbrales

quedarían impuestos sobre el histograma como se muestra en la figura 2.7

Fig.2.7: Imposición de umbrales sobre el histograma de la imagen según la variante 2.

2.4.3 Método 1C y Método 1D

El método 1C y el método 1D se implementaron para el caso en que el histograma de la

imagen no presentara un comportamiento bimodal, criterio que deben cumplir los métodos

de umbralado para que se obtengan resultados satisfactorios. En la bibliografía consultada

[37], se plantea un algoritmo mediante operadores de morfología matemática que permite

determinar una imagen representativa del primer plano y una imagen representativa del

fondo independientemente. De esta forma se precisan los picos máximos fácilmente sin

afectar la correcta determinación de los umbrales para la implementación del método de

doble umbral.

Para la obtención de las imágenes representativas del fondo y el primer plano se realiza

inicialmente sobre la imagen en escala de grises aperturas sucesivas con un elemento

estructurante adaptativo de tamaño creciente, tomando como atributo el área de los

eritrocitos. A partir del espectro patrón de área (ver figura 2.8) se estima el seudo-radio (r)

de los eritrocitos que no forman parte de aglomerados y su área (A_moda) a través de la

expresión 2.7:

(2.7)


Para obtener el espectro patrón se implementó una función acumulativa nombrada

morph_area_granulometry (ver su programación en Anexo 2).

Fig.2.8: Espectro patrón de la granulometría de área.

Luego se realizan dos aperturas sucesivas sobre la imagen inicial en escala de grises

utilizando la función aopengray, cuya programación es descrita en el Anexo 2. Su sintaxis

es la siguiente:

Aopen=aopengray (Ithn, inca)

Ithn: Imagen en escala de grises, con corrección de la iluminación y complementada.

inca: Incremento, cuya magnitud se realiza a partir del valor de área estimado a través del

espectro patrón.

Aopen: Imagen resultante de la apertura por área.

Con una apertura inicial es posible eliminar aquellos objetos de la imagen que no son de

interés para el analista (ruido, artefactos) y luego se eliminan todos los eritrocitos sin incluir

los aglomerados. Seguidamente se restan las imágenes resultantes de las anteriores

aperturas y utilizando un operador de comparación se obtiene una representación de una

máscara binaria del fondo (B), cuya expresión se define a continuación:

( ( ) ( ) ( )

( )) (2.8)

El algoritmo anteriormente descrito se muestra en la figura 2.9.


Fig.2.9: a) Apertura en la que se eliminan los elementos de menor área, b) Apertura en la que se eliminan

todos los eritrocitos independientes presentes en la imagen, c) Resta de las aperturas sucesivas y d) Máscara

previa para obtener la representación del primer plano/fondo.

Las imágenes representativas del primer plano (Ifg) y el fondo (Ibg) (ver figura 2.10) se

obtienen a partir de las siguientes expresiones:

(2.9)

(2.10)

Fig. 2.10: a) Imagen representativa del primer plano, b) Imagen representativa del fondo, c) Histograma

representativo del primer plano y d) Histograma representativo del fondo.

Al obtener los histogramas representativos del primer plano y el fondo independientemente,

se extraen los picos máximos (pfg y pbg).A continuación se prosigue con la binarización de


la imagen utilizando indistintamente las variantes expuestas en el epígrafe 2.4.1 y 2.4.2

para la determinación de los umbrales.

2.5 Otsu adaptativo

El método de Otsu adaptativo binariza la imagen, utilizando la función im2bw, con la

siguiente sintaxis:

BW= im2bw (Ith, umbral_global)

donde:

Ith: Imagen con uniformidad de iluminación del fondo.

umbral_global: Umbral global que devuelve la función graythresh, pasándole como

argumento Ith, para separar en clases los valores de intensidad de la imagen a partir de su

histograma.

BW: Imagen binaria resultante (máscara de segmentación).

La imagen binaria resultante tendrá valor 0 en los píxeles donde Ith sea menor que el

umbral global y 1 en el resto. Además, mantendrá las mismas dimensiones que la imagen

original.

2.6 Transformada watershed de área mínima (TWAM)

En la implementación de la transformada de watershed de área mínima se recurre a la

utilización de la imagen gradiente. Esta se obtiene a partir de la utilización del gradiente

morfológico generalizado (explicado en el subepígrafe 1.4.2.1 del capítulo anterior). Luego

se maximiza el contraste de la imagen gradiente. A la imagen gradiente resultante del

procedimiento anterior, se le realiza el cierre por área a través de la función aclosegray,

cuya programación se describe en el Anexo 2. A la misma se le pasa como argumento la

mitad del área perteneciente a un eritrocito.

Aclose=aclosegray (Ith_n, A_min)

donde:

Ith_n: Imagen en escala de grises, con corrección de la iluminación y complementada.

A_min: Área mínima, que se determina a partir de la mitad del valor de área estimado en el

espectro patrón.

Aclose: Imagen resultante del cierre por área.

Finalmente se aplica la transformada watershed a través de la siguiente sintaxis:


IWAM=watershed (Aclose)

donde:

IWAM: Imagen resultante de aplicar la transformada watershed de área mínima.

Para obtener la máscara de segmentación al aplicar la WAM se aplican una secuencia de

pasos sobre IWAM, la cual representa una imagen etiquetada. Primero se localiza la etiqueta

que se corresponde con el fondo y se igualan a cero los píxeles que la componen.

Seguidamente los píxeles pertenecientes a las restantes etiquetas son puestos en uno,

representando los objetos de interés. La imagen binaria resultante mantendrá las mismas

dimensiones que la imagen original.

2.7 Post-procesamiento

A las máscaras de segmentación obtenidas para cada uno de los algoritmos de

segmentación propuestos se le realizaron algunos pasos adicionales. Estos incluyen, la

eliminación de elementos que no forman parte de la estructura celular dado que no son de

interés para el analista; este es el caso de los artefactos producidos por el ruido presente en

el fondo de la imagen. Esto se realiza mediante la función bwareopen:

Mask_res= bwareopen (BW, Amin)

BW: Máscara resultante de la binarización.

Amin: Valor que se estima a partir del análisis granulométrico de la imagen.

Mask_res: Máscara de segmentación final.

Posteriormente se rellenan los centros de los eritrocitos. Además se eliminan los eritrocitos

cercanos a los bordes pues estos no son de información útil al analista ya que en su mayoría

aparecen recortados. Para ello se emplean las funciones imfill e imclearborder

respectivamente. De esta forma se obtiene la máscara de segmentación final (ver figura

2.11).

Fig.2.11: a) Máscara resultante de la binarización y b) Máscara resultante del post-procesamiento.


2.8 Validación de los algoritmos de segmentación propuestos

Para la validación de los algoritmos de segmentación propuestos se calculó el coeficiente

de Jaccard para 180 eritrocitos presentes en las imágenes utilizadas en el experimento, de

los cuales 68 eran eritrocitos infestados. Estos eritrocitos se escogieron indistintamente en

cada una de las imágenes, tomando no solo los que se encontraban aislados, sino aquellos

que formaban parte de aglomerados.

Previamente no se contaban con máscaras de segmentación de referencia que se tomarían

como ground-truth para el cálculo de los coeficientes de Jaccard; por lo que la obtención

de estas máscaras para el caso de las imágenes utilizadas en el experimento se realizó de

forma manual (ver figura 2.12). Para ello utilizó el software Adobe Photoshop CS2, el cual

a través de herramientas de selección semiautomáticas, permitió de forma interactiva

delinear el contorno de los eritrocitos de seleccionados, a partir del criterio expuesto por

expertos del CBQ. La selección semiautomática realizada se consultó con los expertos para

su validación.

Fig. 2.12: Máscara de segmentación manual.

2.8.1 Análisis estadístico

Para el análisis e interpretación de los coeficientes de Jaccard calculados se realizó un

análisis estadístico aplicando pruebas de hipótesis, para comprobar si existían diferencias

estadísticamente significativas entre los métodos de segmentación propuestos aplicando el

test de Friedman. Posteriormente se aplicaron pruebas post hoc, para determinar entre que

métodos de segmentación existían diferencias significativas, siendo en este caso el test de

Wilcoxon el utilizado.

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 31

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Introducción

En el presente capítulo se realiza un análisis de los resultados al aplicar los algoritmos de

segmentación propuestos: doble umbral (el cual incluye cuatro métodos), Otsu adaptativo y

transformada de watershed de área mínima. Cada uno de los métodos de segmentación será

comparado con los restantes, utilizando una imagen ilustrativa. Luego, mediante los índices

de Jaccard calculados, se evalúan los métodos de segmentación cuantitativamente a través

de estadígrafos descriptivos y se determina si existen estadísticamente diferencias entre

ellos.

Para realizar una valoración cualitativa de los métodos (de forma ilustrativa) se utilizó una

de las imágenes con las trabajó en la investigación. La misma se muestra segmentada, con

los bordes resaltados en verde, para cada uno de los métodos propuestos. En ella aparecen

destacadas, con líneas discontinuas y colores diferentes, cuatro regiones de interés sobre las

cuales se realizaron apreciaciones convenientes. El tamaño de estas regiones se encuentra

ampliado a la derecha de la imagen segmentada con bordes resaltados, en correspondencia

con el color de la región señalada con líneas discontinuas, para facilitar la visualización de

las mismas.

3.2 Resultados obtenidos mediante el empleo del doble umbral (Método 1)

A continuación se exponen los resultados obtenidos para cada uno de los métodos que

incluye el operador de doble umbral.

3.2.1 Método 1A

En la figura 3.1 se muestra la imagen segmentada, con los bordes resaltados, utilizando el

método 1A.


Fig. 3.1: Imagen segmentada con bordes resaltados por el método 1A.

En la región señalada en rojo se muestra uno de los artefactos presentes en el fondo de la

imagen, el cual no se segmentó. Esto se debe a que en la etapa de post-procesamiento, se

aplican métodos morfológicos, donde se eliminan los objetos que no son de interés para el

analista. La mayoría de los eritrocitos que estaban aislados (región señalada en azul) fueron

segmentados correctamente. Los resultados fueron satisfactorios en la detección de bordes,

observándose algunos casos de eritrocitos aglomerados que no pudieron ser separados,

sobre los cuales se pueden aplicar posteriormente algoritmos para su separación [14].

En la región señalada en negro se muestra un aglomerado compuesto por dos eritrocitos, el

cual es tomado por el método erróneamente, ya que una inspección visual muestra que se

encuentran separados en la imagen. Esto se debe, a que los umbrales que conforman el

rango estrecho en el histograma, el cual se determina para obtener la imagen marcador,

incluye niveles de intensidad que se corresponden con el fondo de la imagen. El eritrocito

que aparece enmarcado en la región señalada en amarillo no fue segmentado por el método,

mientras que los eritrocitos que se encuentran a su alrededor sí son segmentados

correctamente.

3.2.2 Método 1B


método 1B.


Fig. 3.2: Imagen segmentada con bordes resaltados para el método 1B.

La región señalada en rojo muestra dos eritrocitos que fueron segmentados correctamente

de forma independiente, no siendo así en el método anterior, el cual los toma aglomerados.

Esto se debe, a que en este caso los umbrales que conforman el rango estrecho, con el cual

se obtiene la imagen marcador, queda enmarcado alrededor del pico representativo del

primer plano, en el que se incluyen los niveles de intensidad de los objetos que son de

interés segmentar. Por lo que el algoritmo es menos sensible a extraer tras la binarización

ruido presente en el fondo de la imagen.

En la región señalada en azul se destaca como el método detecta correctamente los bordes

de los aglomerados presentes en la imagen. En la región señalada en negro el eritrocito que

se presenta es segmentado como un objeto independiente y no formando parte de un

aglomerado como en el método anterior. Sin embargo, este método falla en la detección

correcta del contorno del mismo. Además, en la región señalada en amarillo, aparece

segmentado correctamente el eritrocito que no había sido segmentado en la variante

anterior.

3.2.3 Método 1C y Método 1D

En las figuras 3.3 y 3.4 se muestran la imagen segmentada, con los bordes resaltados, al

aplicar el método 1C y el método 1D respectivamente.


Fig. 3.3: Imagen segmentada con bordes resaltados para el método 1C.

Fig. 3.4: Imagen segmentada con bordes resaltados para el método 1D.

Al igual que en los métodos anteriores, en las imágenes no aparecen segmentados los

artefactos presentes en el fondo de las mismas y los eritrocitos aislados, en su mayoría,

fueron segmentados correctamente. Se definen bien el contorno de los aglomerados, aunque

los métodos fallan en algunas ocasiones ya que algunos eritrocitos no son segmentados

completamente o toman parte del fondo. Se observa además al inspeccionar estas figuras

resultados similares entre el método 1A y 1C y los métodos 1B y 1D. Esto se debe a que

ambos métodos mantienen una correspondencia en el algoritmo implementado para la

determinación de los umbrales.

3.3 Resultados obtenidos mediante el empleo de Otsu adaptativo (Método 2)


método de Otsu adaptativo.


Fig. 3.5: Imagen segmentada con bordes resaltados para el método 5.

En la región señalada en rojo se muestra cómo el método no segmenta los objetos que

forman parte del fondo, sino solo aquellos que son de interés para el analista. Los bordes en

los eritrocitos aislados (región señalada en azul) y los bordes de los aglomerados (región

señalada en negro) son detectados correctamente, sin extraer en ambos casos información

del fondo de la imagen. Sin embargo, el método falla al segmentar el eritrocito mostrado en

la región señalada en amarillo.

3.4 Resultados obtenidos mediante el empleo de transformada watershed de área

mínima (Método 3)

En la figura 3.6 se muestra la segmentada, con los bordes resaltados, utilizando el método

de la transformada watershed de área mínima.

Fig. 3.6: Imagen segmentada con bordes resaltados para el método 3.


Aunque el método no segmenta artefactos presentes en el fondo de la imagen (región

señalada en rojo) y define correctamente el borde de los aglomerados; los resultados

cualitativos son inferiores a los obtenidos con los restantes métodos. Esto se debe a que

algunas regiones presentes en la imagen aparecen sobre-segmentadas, las cuales forman

parte del fondo de la imagen. Este comportamiento es destacado en la región señalada en

azul y la región señalada en amarillo.

Para eliminar las regiones sobre-segmentadas se hace necesario recurrir a la utilización de

marcadores, que sean capaces de definir cada eritrocito como un objeto independiente, para

de estar forma obtener resultados satisfactorios.

3.5 Estadísticos descriptivos

En la tabla 3.1 se muestran estadísticos descriptivos para cada uno de los métodos

implementados a partir de los coeficientes de Jaccard calculados para cada variante.

Tabla 3.1: Estadísticos descriptivos.

Estadísticos

descriptivos

Método

1A

Método

1B

Método

1C

Método

1D

Método

2

Método

3

Media 0.89 0.92 0.89 0.92 0.92 0.90

Mediana 0.93 0.94 0.93 0.93 0.94 0.91

Moda 0.95 0.94 0.95 0.93 0.94 0.91

Desv. est. 0.14 0.11 0.13 0.11 0.11 0.10

Mínimo 0.19 0.00 0.19 0.00 0.00 0.00

Máximo 0.98 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

La media aritmética nos revela que la tendencia que resulta de aplicar los métodos 1B, 1D,

2 y el 3 está por encima de 0.90. La mediana nos permite predecir que la mitad de los

índices de Jaccard calculados, están por encima de 0.94 en el método 1B, así como en el

método 2. Además, los valores que aparecen con mayor frecuencia están también por

encima de 0.90 para todos los métodos. Estos son estimados a través del cálculo de la

moda, siendo de 0.95 para los métodos 1A y 1C.

La desviación estándar, que presentan los datos en su distribución respecto de la media

aritmética de dicha distribución, es calculada ya que no solo basta conocer las medidas de


tendencia central para interpretar los resultados. La menor desviación estándar que se

obtiene es para el método de watershed de área mínima, la cual tiende a alejarse 0.098 de la

media del método.

Otros de los estadígrafos calculados es el valor mínimo que se obtiene de los índices de

Jaccard calculados, siendo 0 para los métodos 1B, 1D, 2 y 3 pues en algunos casos hubo

una ausencia total de coincidencia entre los eritrocitos presentes en la máscara de

segmentación manual y los eritrocitos presentes en la máscara de segmentación resultante

al aplicar estos métodos. El valor máximo fue de 0.98, en el método 1A.

3.6 Análisis estadístico

El test de Kolmogorov-Smirnov permitió contrastar la normalidad en la matriz que agrupa

los coeficientes de Jaccard para cada método. Al interpretar los resultados que se obtienen

al aplicar estas pruebas (ver tabla 3.2), se rechaza la hipótesis nula, pues al menos, los datos

de un método no provienen de una distribución normal. Este es el caso del método 3

(TWAM), en el cual nivel de significación es menor que el nivel de confianza que se tomó

(0.05) para realizar estas pruebas. Lo anterior expuesto justifica la utilización de una prueba

no paramétrica, en este caso la de Friedman, para comprobar si existen medias

significativamente diferentes entre los métodos de segmentación implementados.

Tabla 3.2: Pruebas de normalidad.

Kolmogorov-Smirnov

5

Estadístico gl Sig.

Método 1 0.15 12 0.206

Método 2 0.10 12 0.206

Método 3 0.21 12 0.17

Método 4 0.10 12 0.206

Método 5 0.16 12 0.206

Método 6 0.30 12 0.00

5 Corrección de la significación de Lilliefors. 6 Este es un límite inferior de la significación verdadera.


Al aplicar la prueba de Friedman, se comprobó que entre los grupos existen diferencias

estadísticamente significativas, ya que el nivel de significación es menor que el umbral

especificado de 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula de que no existen diferencias

entre los diferentes métodos (ver tabla 3.3).

Tabla 3.3: Prueba de Friedman.

Prueba de Friedman

N 12

gl 5

Sig. asintót. 0.00

El método que obtuvo mayor rango promedio al aplicar la prueba de Friedman (ver tabla

3.4) es el de Otsu adaptativo, siendo en este caso de 5.67.

Tabla 3.4: Rangos promedio.

Rangos promedio

Método 1A 1.83

Método 1B 5.00

Método 1C 2.83

Método 1D 3.67

Método 2 5.67

Método 3 2.00

La interpretación de los resultados al aplicar la prueba de Friedman conllevó a realizar una

prueba post hoc para determinar entre cuales de los métodos propuestos de segmentación

existían diferencias significativas. En este caso se utilizó la prueba de los rangos con signo

de Wilcoxon para comparar dos muestras relacionadas y determinar si existen diferencias

entre ellas. Para ello se pareó el método con el cual se obtuvo mayor rango promedio con

los otros restantes métodos. , tomando ahora como intervalo de confianza 0.01, ya que se

divide entre 0.05 (que era el intervalo de confianza con el cual se venía trabajando) entre el

número de comparaciones que se realizaron; en este caso fueron cinco comparaciones.

La prueba de rangos con signo de Wilcoxon arrojó que existían diferencias significativas

entre el método de Otsu adaptativo y los métodos 1A, 1C, 1D y el 3 respectivamente (ver


tabla 3.5). Sin embargo entre el método de Otsu adaptativo y 1B no existen diferencias

significativas entre su medias.

Tabla 3.5: Prueba de los rangos con signo de Wilcoxon

Prueba de los rangos con signo de Wilcoxon

Método 1A

- Método 2

Método 1B

- Método 2

Método 1C

- Método 2

Método 1D

- Método 2

Método 3 -

Método 2

Z -2.9037 -1.726

7 -2.903

7 -3.059

7 -3.059

7

Sig. asintót.

(bilateral) 0.004 0.084 0.004 0.002 0.002

3.7 Tiempo promedio de ejecución de los algoritmos implementados

El tiempo promedio de ejecución de los algoritmos implementados se midió para cada uno

de los métodos de segmentación propuestos desde que se carga la imagen hasta que se

obtiene la misma segmentada. En la tabla 3.6 se muestra el mismo, en segundos, para las

seis imágenes.

Tabla 3.6: Tiempo promedio de ejecución de los algoritmos implementados.

Métodos de segmentación implementados

Método

1A

Método

1B

Método

1C

Método

1D

Método

2

Método

3

Tiempo

promedio (s) 8.96 8.01 23.09 22.78 4.32 45.56

El método de Otsu adaptativo demanda el menor tiempo de ejecución, mientras que el

mayor tiempo lo demanda el método de transformada watershed de área mínima. Por su

parte el tiempo del método 1C es mayor con respecto al método 1A, a pesar que ambos

algoritmos incluyen la misma etapa de binarización y post-procesamiento, debido al

tratamiento que se le realiza a la imagen en el método 1C cuando el histograma de la

misma no es bimodal.

7 Basado en los rangos positivos.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 40

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Conclusiones Generales:

1. El estudio realizado permitió establecer la importancia de la etapa de pre-

procesamiento de las imágenes en estudio, así como la etapa de post-procesamiento

sobre las máscaras de segmentación obtenidas para cada uno de los métodos.

2. La transformación top hat permitió realizar una correcta corrección de la

iluminación no uniforme presente en el fondo de la imagen, cuyo uso mejoró la

calidad de la segmentación.

3. Los resultados obtenidos para los métodos 1B y 2 permitieron valorar la efectividad

y precisión de los mismos como satisfactorios, pues la media aritmética de los

coeficientes de Jaccard calculados en ambos métodos fue superior a 0.90. Además,

la implementación de estos métodos mostró menor tiempo de ejecución en

comparación con los restantes.

4. Los experimentos realizados mostraron cómo el método en el que se utiliza la

transformada watershed de área mínima requería la utilización de marcadores

unívocos para reducir el efecto de sobre-segmentación.

Recomendaciones:

1. Implementar algoritmos para la separación de aglomerados sobre los resultados de

los algoritmos de segmentación propuestos.

2. Implementar algoritmos para la búsqueda de marcadores unívocos para mejorar los

resultados al aplicar la transformada watershed de área mínima.

3. Realizar una interfaz gráfica para la aplicación de los algoritmos implementados.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 41

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] World Malaria Day-Emerging Infections Disease. (2013). Center for Disease control

and Prevention, consultada en abril 2014.

[2] Murillo, O. L. et. al. (2012). Desafíos en la prestación de servicios de salud en zonas

rurales de Colombia: experiencia del proyecto malaria fondo mundial. PhD Thesis,

Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá D.C, Colombia.

[3] Martínez, E. et. al. (2010). “De la infección parasitaria al modelaje computacional”,

Elementos, 17 (Abril): 33.

[4] Tek, F. B. (2007). Computerised diagnosis of malaria. PhD Thesis, School of Life

Sciences, University of Westminster, Westminster.

[5] García, R. G. (2011). Estudio técnico de viabilidad para diagnóstico de la malaria

por telepatología y procesamiento de imágenes. PhD Thesis, División de Ingeniería

Electrónica, Universidad Politécnica de Madrid, Madrid.

[6] Costrarido, L. (2005). Medical image analysis methods: Medical image processing

and analysis for CAD systems. Taylor & Francis, USA; 51-86.

[7] Adollah, R. et. al. (2008). Blood Cell Image Segmentation: A Review, 4th Kuala

Lumpur International Conference on Biomedical Engineering 2008, Kuala Lumpur,

Malasia: 141-144.

[8] Gonzalez, R. C. and R. E. Woods (2002). Digital Image Processing. 2nd Edition,

Pearson Prentice Hall, New Jersey.

[9] Dougherty, E. R. y R. A. Lotufo (2003). Hands-on morphological image processing.

SPIE, Washington, USA.

[10] Soille, P. (2004) Morphological Image Analysis: principles and applications. 2nd

Edition, Springer , Germany.


[11] Lorenzo, J. V. (2011). A method to determine the size of the structuring element in

morphological correction of non-uniforom illumination, 18th IEEE International

Conference on Image Processing, Brussels, Belgium.

[12] Azpiroz, J. et. al. (2000). Procesamiento de imágenes biomédicas. 1era Edición,

Ciudad de México.

[13] Llobregat, R. (2011). Procesado digital de imágenes de video para la detección de

humo. PhD Thesis, Universidad Politécnica de Valencia, Departamento de

Comunicaciones, Gandia.

[14] Chinea L. y J.V. Lorenzo. (2013). “Segmentación de agregados en imágenes de

microscopía celular de eritrocitos empleando técnicas de procesamiento morfológico

de imágenes”, IFMBE Proceedings, 33: 999–1002.

[15] Mandal, S. et. al. (2010). Segmentation of Blood Smear Images using Normalized

Cuts for Detection of Malarial Parasites, Annual IEEE India Conference, India.

[16] Makkapati, V. and R. Rao. (2009). Segmentation of malaria parasites in peripheral

blood smear images, ICASSP, 09: 1361-1364.

[17] Di Ruberto, C. et. al. (2002). “Analysis of infected blood cell images using

morphological operators”, Image and Vision Computing, 20(2): 133-146.

[18] Ross, N. et. al. (2006). “Automated image processing method for the diagnosis and

classification of malaria on thin blood smears”, Medical and Biological Engineering

and Computing, 44(5): 427-436.

[19] Otsu, N. (1979). “A Threshold Selection Method for Gray-Level Histogram”,

Transactions on Systems, Man, and Cybernetics, 9(1): 62-66.

[20] Haralick R. and L. Shapiro. (1992). Computer and Robot Vision, Addison-Wesley, 1,

USA.

[21] Beucher, S. and F. Meyer (1993). The morphological approach to segmentation: the

watershed transformation, En: Mathematical Morphology in image processing, New

York.

[22] La Serna N. y L. Pró Concepción. (2010). “Watershed: un algoritmo eficiente y

flexible para segmentación de imágenes de geles 2-DE”, Revista de Investigación de

Sistemas e Informática, 7(2):35-41.

[23] Dueñas, C. P.(2007). Procesamiento morfológico, En: Apuntes de Visión Artificial, 6.


[24] Samboal, M. (2012). Detección de células Cancerosas en imágenes de Neoplasia

Intraepitelial Cervical (NIC). PhD Thesis, Dpto. de Tecnología Electrónica y de las

Comunicaciones, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid.

[25] Boqiang, L. et. al. (2007). Automatic Segmentation on Cell Image Fusing Gray and

Gradient Information, 29th Annual International Conference of the IEEE, Lyon.

[26] González, M. (2007). Segmentación morfológica watershed en imágenes médicas:

métodos de selección de marcadores. PhD Thesis, Facultad de Ingeniería,

Universidad de Mar del Plata, Mar del Plata.

[27] Chinea, L. (2010). Segmentación de imágenes para el análisis de eritrocitos en

microscopía celular. PhD Thesis, Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías

de la Información, Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Santa Clara.

[28] Pastore, J. I. (2009). Distancias no-euclídeas aplicadas al procesamiento de

imágenes médicas. PhD Thesis, Facultad de Ingeniería, Universidad de Mar del

Plata Mar del Plata.

[29] Van Ginkel M. et. al. (2004). “A short introduction to the Radon and Hough

transforms and how they relate to each other”, Quantitative Imaging Group

Technical Report Series.

[30] Ge, F., S. Wang, and T. Liu. (2007). “A new benchmark for image segmentation

evaluation”, Journal of Electronic Imaging, 16 (3).

[31] Chinea L. and J. V. Lorenzo. (2011). Evaluation of distance transform based

alternatives for image segmentation of overlapping objects, International

Conference of Computer Science and Informatics, Havana, Cuba.

[32] Quelhas P., A. M. Mendonc¸a and Au. Campilho. (2010). 3D cell nuclei

fluorescence quantification using sliding band filter, International Conference on

Pattern Recognition, Brasil.

[33] MATLAB and Image Processing Toolbox Release 2010a, The MathWorks, Inc.,

Natick, Massachusetts, United States

[34] Ferrera., D. (2013). Adquisición de imágenes de microscopía celular en estudios de

malaria. PhD Thesis, Centro de Estudios de Electrónica y Tecnologías de la

Información, Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Santa Clara.


[35] Grundland M. and N.A. Dodgson (2007). “Decolorize: fast, contrast enhancing,

color to gray scale conversion”, Pattern Recognition, 40: 2891 – 2896.

[36] Gonzalez, R. C., R. E. Woods and S. Eddins (2004). Digital Image Processing

Using Matlab. 4th Edition, Pearson Prentice Hall , New Jersey.

[37] Rao, K.N.R. and A.G. Dcmpster (2001). “Area-granulometry: an improved

estimator of size distribution of image objects”, Electronics Letters, 37(15): 950-

951.

ANEXOS 45

ANEXOS

Anexo I Códigos de los algoritmos programados en Matlab

Segmentación utilizando doble umbral

% Cargar la imagen y convertir la intensidad de la imagen a doble

precisión.

I=im2double (imread ('C \68.tif'));

%Convertir la imagen en escala de grises. Igray=rgb2gray (I);

% Preprocesamiento (Corrección de la iluminación no uniforme) Ith=imcomplement (imtophat (imcomplement (Igray), strel ('disk', 100)));

%Compensar el efecto de iluminación no uniforme con elemento un

%estructurante tipo disco de radio 100.Para ello se debe complementar la

%imagen. [counts_Ith x1]=imhist(Ith);

%counts: proporción asociada a la intensidad de los píxeles para los %diferentes niveles de grises. x: niveles de grises.

% Preprocesamiento (Suavizado de la imagen: Filtro ERDR)

EE = strel ('disk', 3); %Elemento estructurante tipo disco con radio 3.

Ie = imerode (Ith, EE); % Erosión de la imagen con corrección de la

%iluminación

Iobr = imreconstruct (Ie, Ith);% Reconstrucción morfológica de la imagen

%con corrección de la iluminación y la imagen erosionada

Iobrd = imdilate (Iobr, EE); %Dilatación de la imagen reconstruida

Iobrcbr = imreconstruct (imcomplement(Iobrd), imcomplement(Iobr));

% Reconstrucción morfológica de la imagen dilatada y la reconstruida

Iobrcbr = imcomplement (Iobrcbr); % Imagen suavizada complementada

% Preprocesamiento (Filtro promediador)

%se le realiza al vector 'y'(counts_sIth) del histograma de la imagen

suavizada para eliminar máximos espurios

[counts_sIth x1]=imhist(Iobrcbr);% Histograma de la imagen suavizada

h= (1/5)*[1 1 1 1 1 ];% Máscara de convolución

counts_sIth=conv(counts_sIth,h,'same');% Filtrado promediador

[pks locs]=findpeaks(counts_sIth,'sortstr','descend');%Para obtener los 2

%picos máximos representativos en el histograma. pks: almacena los

valores máximos de los picos y locs las posiciones de estos máximos en

%counts_sIth.

ANEXOS 46

% Binarización de la imagen

pbg =x1(locs(1));%Localiza la primera posición del vector locs. Segundo

%pico (fondo).

pfg =x1(locs(2));%Localiza la segunda posición del vector locs. Primer

%pico (primer plano).

%Determinación de umbrales sin complementar la imagen

%Variante 1

threshold1=0; %Primer umbral

threshold2=0; %Segundo umbral

m= (pbg+pfg)/2; %Media entre los picos.

threshold3= (pfg+m)/2; %Tercer umbral

threshold4= (pbg+m)/2; %Cuarto umbral

%Variante 2

threshold1=0; %Primer umbral

m= (pbg+pfg)/2; %Media entre los picos.

threshold3= (pfg+m)/2; %Tercer umbral

threshold4=m;

threshold2=pfg-(threshold3-pfg);%Segundo umbral

BW1=im2bw (Ith, threshold2); %se binariza Ith con threshold2


marker=and (BW1,not(BW2));%Imagen marcadora



mask= and(BW3,not(BW4));%Imagen máscara

Ireconst=imreconstruct(marker, mask);%Reconstrucción morfológica de la

%imagen marcadora y la imagen máscara

% Post-procesamiento sobre máscara resultante de la binarización

Mask_res=imfill (Ireconst,'holes');%Rellenar los centros de los

%eritrocitos

Mask_res=bwareaopen(Mask_res,5000);%Eliminar artefactos

Mask_res=imclearborder(Mask_res);% Eliminar los eritrocitos cercanos a

%los bordes

%Tratamiento de la imagen para obtener independientemente el histograma

%representativo del primer plano y el fondo

%Área granulométrica de la imagen

% Obtener el valor de área de los eritrocitos presentes en la imagen que

%no forman parte de aglomerados (A_moda) a partir del espectro patrón

[intensity_area, intensity_area_prime, m1, dst, s, c, K,remain] =

morph_area_granulometry(Ith,'area_open',150,3);

[val ind]=max(intensity_area_prime);

s_radio=K(ind);

A_moda=s_radio*s_radio*3.14;

% Aperturas sucesivas en la imagen

e= (A_moda*30)/100;%incremento

Ith_n=imcomplement(Ith);%se debe hacer para realizar la apertura

A_open1=aopengray(Ith_n,(A_moda-e));% Apertura en la que se eliminan

%estructuras pequeñas(artefactos)en la imagen Ith

A_open2=aopengray(Ith_n,(A_moda+e));% Apertura que delimita el umbral de

%apertura del área ligeramente más alto que el valor de área estimado en

%la imagen Ith

ANEXOS 47

Sub_Aopen=A_open1-A_open2; %Se restan las aperturas A_open1 y A_open2

%realizadas anteriormente

Mask_Aopen_Prev=im2bw (Sub_Aopen,0.05);

% Post-procesamiento de la máscara obtenida

Mask_Aopen= imfill(Mask_Aopen_Prev,'holes');%Rellenar los centros

Mask_Aopen=bwareaopen(Mask_Aopen,5000);%Eliminar los difuminados

% Representación de los histogramas del primer plano y el fondo

Ifg=Ith.*Mask_Aopen;

Ibg=Ith.*imcomplement(Mask_Aopen);

[counts1, x2]=imhist(Ifg);

[counts2, x3]=imhist(Ibg);

counts1 (1)=0; %El primer valor del vector se hace 0 pues el mismo

%representa los píxeles que corresponden al fondo

counts2 (1) =0;

[xx_fg yy_fg]=size (counts1);

[xx_bg yy_bg]=size (counts2);

[val_fg ind_fg]=max (counts1 (2:xx_fg));

[val_bg ind_bg]=max (counts2(2:xx_bg));

Segmentación utilizando Otsu adaptativo


precisión. I=im2double (imread('C \68.tif'));

%Convertir la imagen en escala de grises. Igray=rgb2gray( I);

% Preprocesamiento (Corrección de la iluminación o uniforme) Ith=imcomplement (imtophat(imcomplement(Igray),strel('disk',100)));

%Compensar el efecto de iluminación no uniforme con elemento

%estructurante tipo disco con radio 100.Para ello se debe complementar la

%imagen. [counts_Ith x1]=imhist (Ith);

%counts: proporción asociada a la intensidad de los píxeles para los %diferentes niveles de grises. x: niveles de grises

% Binarización

umbral_global=graythresh(Ith);

Mask= imcomplement(im2bw(Ith,umbral_global));

% Post-procesamiento sobre máscara resultante de la binarización

Mask_res=imfill(Ireconst,'holes');%Rellenar los centros de los

%eritrocitos

Mask_res=bwareaopen(Mask_res,5000);%Eliminar artefactos

Mask_res=imclearborder(Mask_res);% Eliminar los eritrocitos cercanos a

%los bordes

Segmentación a través de la transformada watershed de área mínima


precisión. I=im2double (imread ('C \68.tif'));

%Convertir la imagen en escala de grises.

ANEXOS 48

Igray=rgb2gray (I);

% Preprocesamiento (Corrección de la iluminación o uniforme) Ith=imcomplement (imtophat(imcomplement(Igray),strel('disk',100)));

%Compensar el efecto de iluminación no uniforme con elemento

%estructurante tipo disco con radio 100.Para ello se debe complementar la

%imagen. [counts_Ith x1]=imhist(Ith);

%counts: proporción asociada a la intensidad de los píxeles para los %diferentes niveles de grises. x: niveles de grises

% Determinación de la imagen gradiente

aa =medfilt2(Ith,[5 5]);% Filtrado de mediana para eliminar ruido

presente %en el fondo

aag =imdilate(aa,strel('disk',3))-imerode(aa,strel('disk',3));%Gradiente

%morfológico.

aag = adapthisteq(aag);%Ecualización de la imagen gradiente

aag = imadjust(aag);% Re-escalar la intensidad de la imagen

aagf=medfilt2(aag,[5 5]);

%Área granulométrica de la imagen

% Obtener el valor de área de los eritrocitos presentes en la imagen que

%no forman parte de aglomerados (A_moda) a partir del espectro patrón

[intensity_area, intensity_area_prime, m1, dst, s, c, K,remain] =

morph_area_granulometry(Ith,'area_open',150,3);

[val ind]=max (intensity_area_prime);

s_radio=K (ind);

A_moda=s_radio*s_radio*3.14;

% Eliminar mínimos regionales

Aclose=aclosegray(aagf,(A_moda/2));%Cierre por área

W1= watershed(Aclose);% Transformada watershed

%Localiza la etiqueta del fondo

stats = regionprops(W1, 'Area');

sa=[stats.Area];

L=find(sa==max(sa));

W1(W1==L)=0;

W1(W1>L)=1; % Normalizando.

Mask_res = im2bw (W1, 0.5);

ANEXOS 49

Anexo II Códigos de funciones programadas en Matlab

Morph_area_granulometry

% Función para realizar la granulometría en escala de grises.

% Definición de parámetros:

x = imagen en proceso.

niter = número de iteraciones.

inc = incremento para cada iteración.

function [intensity_area, intensity_area_prime, m1, dst, s, c, K,remain]

= morph_area_granulometry(x,area_open,niter,inc)

if size(x,3)>1 % Convertir la imagen a escala de grises y a uint8 si es

%necesario.

x=rgb2gray(x);

end;

x=imcomplement(x);

x=medfilt2(x, [5 5]);

x = adapthisteq(x); %Ecualización del histograma.

x = imadjust(x); % Re-escalar la intensidad de la imagen

if nargin < 3, niter = 150; end

if nargin < 4, inc = 1; end

if isempty(niter), niter = 150; end

if isempty(SE), SE = 'disk'; end

intensity_area=zeros (niter, 1);

counter=1;

índice =1;

i=1;

while i

switch SE

case 'area_open'

SE_Area=pi*counter^2;

remain = aopengray(x, SE_Area);

otherwise

return

end

intensity_area(indice) = sum(remain(:));

if (intensity_area(indice)==0)||(counter>=niter)

i=0;

else

counter =counter + inc;

indice =indice+1;

end

end

intensity_area=intensity_area(1:indice);

intensity_area=intensity_area/sum(x (:));

intensity_area_prime= abs (diff (intensity_area));

intensity_area_prime= [0; intensity_area_prime];

Aopengray

% Función para realizar apertura morfológica en escala de grises.

function y=aopengray(Im,ath);

ANEXOS 50

if size(Im,3)>1

Im=rgb2gray (Im);

end;

Im=im2uint8 (Im);

Immax=max (Im(:));

for k=1:Immax+1

Imth=im2bw (Im,double(k-1)/256);

ccomp = bwconncomp(Imth);

% Cálculo de áreas

stats = regionprops(ccomp, 'Area');

idareas = find([stats.Area] < ath);

sel_areas = ismember(labelmatrix(ccomp), idareas);

Im(sel_areas==1)=k-2;

end

y=im2double (Im);

end

Aclosegray

% Función para realizar cierre morfológico en escala de grises.

function y=aclosegray(Im,ath)

if ~strcmp(class(Im), 'uint8')

Im=im2uint8 (Im);

end;

Im=imcomplement(Im);

ycomp=aopengray(Im, ath);

y=imcomplement(ycomp);

end

Documents

Aplicaciones del procesamiento morfológico para la