UNIVERSIDAD VERECRUZANAFACULTAD DE CIENCIAS QUIMICASAPUNTES DE CROMATOGRAFIA

La cromatografía puede definirse como una técnica que separa una mezcla de

solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos

que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a

través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual

puede ser líquida o sólida. Las propiedades de los componentes de una mezcla

determinan su movilidad entre sí y con respecto a la fase móvil. La base de la

separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la migración de los

mismos.

Principios  La palabra Cromatografía significa Escribir en Colores, porque cuando fue

desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una

técnica o método físico de separación basado en las diferentes velocidades con

que se mueven los solutos disueltos en un disolvente  llamado eluente (fase

móvil) a través de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se

distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil o fluido que pasa a través

o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla

presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la

separación se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la

estacionaria y de la distribución de las sustancias entre las dos fases. Las

moléculas que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídas más rápido

que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que

tienden a quedar retenidas. En resumen se

fundamenta en la separación entre la fase

estacionaria sólida o liquida y la fase móvil liquida o

gaseosa

Los fenómenos rectores del proceso de retención y

separación son la adsorción y la absorción.

El primero queda delimitado a la superficie

interfacial es decir se refiere a la fijación o retención

de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas

químicas y físicas que dependen de  la naturaleza de la sustancia absorbida,

temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno

determina la retención de una especie química por parte de una masa y

depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar

químicamente con la misma.

Clasificación de la Cromatografía

Existen muchas maneras de clasificar los métodos cromatográficos, según su

fase móvil se clasifica en  Cromatografía de gases que puede ser a través de

dos sistemas, gas- líquido y gas-sólido y Cromatografía líquida donde el

eluente es un líquido y puede ser líquido-liquido, liquido-sólido. Por el

mecanismo de retención-separación, es decir el tipo de equilibrio implicado en

la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografía de

reparto, de adsorción y de exclusión. Según la forma de contacto entre las

fases se denomina de columna o superficie plana. También se puede clasificar

teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala física y

gradientes.

Técnicas cromatográficas

Según el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la

estacionaria, se distinguen dos técnicas:

Columna  Se usa un tubo cilíndrico 

Plana: El soporte es una placa plana o

los intersticios de un papel 

Capa fina

Papel (partición)

Cromatografía en capa fina.

Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para

análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina

adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie

por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes

de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes más  utilizados son gel

de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del

adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas

placas tienen indicador de fluorescencia : f254 ó f366.

  La placa seca se coloca en el tanque

cromatográfico o cámara, en el cual debe

encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil

líquida).El eluente ascenderá o desplazara

por capilaridad en la placa y arrastrará los

componentes a lo largo de ésta produciendo

“manchas” que representan a los

componentes, la separación se da por

migración diferencial, es decir que la fase

móvil arrastra a las substancias apolares y

aquellas más polares son retenidas por la

fase estacionaria dando lugar a la separación.

Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza  por medio de

métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados

coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico

para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos

ópticos utilizando radiación UV o luz visible.

    El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero

se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre

otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e

intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración

conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión

a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde

la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.

Cromatografía en papel. El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de

papel cromatográfico en el tanque cromatográfico.

Cromatografía en Columna.

Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de

Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual

queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en

plástico o vidrio. La fase móvil se encuentra formada por la solución que

lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de

la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra

desde un contenedor por la parte superior de la columna.

 La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se

encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que

cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se

separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la

separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la columna. La

banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a

procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la resolución.

Cromatografía de gases. Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un Gas

(llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido

(Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición

(Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte

(Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases esta constituido

normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de

inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara

termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar,

registrar e imprimir el cromatógrama.

La muestra se introduce a través del sistema de

inyección dentro de la columna que es el sitio donde

ocurre la separación. La columna  de aluminio,

acero inoxidable, vidrio o teflón  contiene la fase

estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la

superficie por un soporte que es generalmente de

sílice. La fase móvil o gas portador transporta los

componentes de la muestra a través de la columna,

por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase

estacionaria, y  ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la

columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las

sustancias,  midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las

sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico, que posteriormente se

amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el

momento en que salen de la columna los componentes.  La salida  de la

sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan

medidas como la altura y el área del pico.

Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).Es una Cromatografía de alta presión es

decir se aplica el flujo a presión (entre 1500

a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre

3 y 10 micras, la longitud de la columna es

entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo

sofisticado. Se pueden analizar muestras

proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el

interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas,

aumentando por tanto la resolución.

El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una

bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de

sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la

mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y

el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se

coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta  o de fluorescencia y

si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un

colector.

En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan

mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la

cromatografía, identificar  la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su

contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con

estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla.

La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la

curva del pico correspondiente.

Cromatografía de intercambio iónico.

La Fase Estacionaria  es

una resina de intercambio

iónico que contiene grupos

cargados, teniendo la

propiedad de separar

especies ionizadas

(Cationes o Aniones); la

Fase Móvil es

generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía

de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la

carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad

de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el

pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que

compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la

proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH

y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un

gradiente de concentración.

Cromatografía por Permeabilidad en Gel.Es útil para la separación de proteínas.

La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel,

separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un

polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de

mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño

tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros

de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo

largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en

los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.

Cromatografía de Afinidad. La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por

su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las

proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen

específicamente a un ligando que previamente

se ha unido covalentemente a la matriz de la

columna. Después de que las proteínas que no

se unen al ligando son lavadas o eluidas a

través de la columna, la proteína de interés que

ha quedado retenida en la columna se eluye o

libera mediante el empleo de una solución que

contiene bien ligando libre u otro compuesto que

rompa la interacción entre el ligando y la

proteína.

 

Cromatografía de afinidad

Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la

que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores

enzimáticos, lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y

enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos

(analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva.

Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la

biología molecular.

Fundamento de la cromatografía de afinidad

En la figura  se muestra de forma esquemática el fundamento de las

separaciones mediante cromatografía de afinidad. Un volumen no

excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la

columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia

activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo

existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de

la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución

de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que

no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase

movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios

activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se

utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se

eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la

regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo

de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.

La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la

distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas

Alta selectividad en el mecanismo de retención

Campo de aplicación restringido

Separación de un solo soluto analito

Empleo de sistema de baja presión

Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica

Ligandos de afinidad

Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el

soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-

analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza,

pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de

biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente. Y según su

actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las

características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos grandes grupos:

Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo

soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos

bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.

Tipos de cromatografía

  Naturaleza de fase estacionaria  

Naturaleza de fase

estacionaria

Sólido Adsorción

Exclusión 

Cambio iónico

Afinidad

Líquido  Partición 

Naturaleza de fase

móvil

Liquido Líquido-líquido ((partición)

Líquido-sólido)adsorción, cambio iónico,

exclusión, Afinidad.

Gas Gas-líquido (CGL)

Gas-sólido (CGS)

Esquema de un cromatograma de afinidad.

Soportes El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con

el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran

superficie, tamaño del grano controlable, porosidad controlable, carácter

suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas

u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta

presión.

El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos

derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de

acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.

Inmovilización de ligandos

La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en

cada caso tiene connotaciones específicas.

El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento

de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo

reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de

bioadsorción.

El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa

del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.

La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos

etapas secuenciales:

Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes

reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que

secaracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad

de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre

la matriz de polisacárido. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes:

ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, según reacciones

uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente

orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando

que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente

con el soporte activado.

Metodos de elusiónSegún la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y

teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave

distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica:

La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado

inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo

peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula

biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos

de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una elución por

desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular

ligados o no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se

distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.

La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación

más frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida

por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que

es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del

analito, por lo que es retirada del sólido y eluida. Ejemplo, la purificación de la

lectina.

La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El

cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La

presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al

anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoproteína.

En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la denaturación del ligando

inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y

reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se

interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de

las causas que la provocan.

NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA TERMINO

Cromatografía. La cromatografía es un método físico de separación en el que

los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales

está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve

en una dirección definida.

Cromatógrafo. El instrumento empleado para realizar una separación

cromatográfica.

Cromatógrama. Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un

detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada

como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente

o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama" puede referirse al papel

o capa con las zonas separadas.

Fase Ligada. Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las

partículas de soporte o a la pared interior de la columna.

Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las

partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por

polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.

Fase Móvil. Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en

una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas

(Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido

Supercrítico). En la cromatografía de gases se uede usar la expresión Gas

Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para

la fase móvil la expresión Eluyente.

Eluir. Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede

detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho

cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se

prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas

anteriores de cromatografía plana.

Efluente. La fase móvil que abandona la columna.

Muestra. Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya

separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos

por la fase móvil.

Componentes de la Muestra. Los constituyentes químicamente puros de la

muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no

retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o

retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito

para un componente de la muestra

Métodos principales

Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa)

se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna

fase móvil adicional

Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil

contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que

los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema

en forma discreta, como una pequeña cantidad en un intervalo breve.

Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de

forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se

suministra al sistema de forma discreta, como una pequeña cantidad en un

tiempo breve.

Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico

Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho

estacionario está contenido dentro de un tubo. Las partículas de fase

estacionaria sólida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida,

pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar

concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta,

no restringida, para el paso de la fase móvil por el centro del tubo (Columna

Tubular Abierta).

Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está

en forma de plano o sobre un plano. Éste puede ser un papel, que sirva como

tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria

(Cromatografía en Papel), o una capa de partículas sólidas extendida sobre un

soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina, TLC). A

veces a la cromatografía plana se la llama también Cromatografía de Lecho

Abierto.

Literatura recomendada

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