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Área de Enfermedades Infecciosas 2015

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

Dra. María Catena

Vet. María Laura Chiapparrone

Vet. Juliana Cantón

Vet. Claudia Cagnoli

Vet. Carolina Daglio

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Área de Enfermedades Infecciosas

2015

Trabajo práctico

Toma de muestras y diagnóstico de

las principales enfermedades

infecciosas

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TOMA Y REMISIÓN DE MUESTRAS

El diagnóstico de las enfermedades que afectan a las diferentes especies animales es de fundamental importancia para la aplicación rápida de medidas terapéuticas y de control. La validez del resultado de un análisis de laboratorio para confirmar la sospecha de una enfermedad está directamente relacionada con la calidad de las muestras remitidas para el diagnóstico. El profesional tiene la responsabilidad de seleccionar, recolectar, preservar y enviar adecuadamente las muestras a fin de optimizar el diagnóstico virológico, bacteriológico, micológico y serológico de las enfermedades infecciosas, se recordarán pautas básicas de extracción y manipulación de las mismas.

La muestra o grupo de muestras debe estar perfectamente identificada y acompañada de la siguiente información:

1) Nombre, dirección, teléfono, e-mail o fax del veterinario. 2) Nombre, dirección, teléfono, e-mail o fax del establecimiento y del

propietario. 3) Tipo de explotación y sistema de producción. 4) Descripción de los animales muestreados: especie, raza, sexo, edad,

estado fisiológico y nutricional; cada muestra con un número o identificación individual.

5) Descripción de las condiciones de extracción de la muestra. 6) Se debe incluir una historia clínica con:

a) Número de animales del rodeo y categoría, número de animales expuestos y número de animales afectados.

b) Duración de la enfermedad, morbilidad, mortalidad. c) Pasturas sobre las que se encuentran los animales y tipo de forraje o

alimento (silo, concentrados, minerales) que hayan consumido. d) Descripción de los signos y hallazgos de necropsia si los hubiera. e) Tratamientos, resultados obtenidos y vacunas aplicadas. f) Otras enfermedades que se hayan observado en los días precedentes. g) Indicar si el animal estaba muerto o fue sacrificado. h) Hallazgos de necropsia. i) Diagnóstico presuntivo. j) Análisis o estudios solicitados. En el caso de pequeños animales el protocolo de envío de muestra debe

contar con los siguientes datos: 1) Nombre, dirección, teléfono, e-mail o fax del veterinario. 2) Nombre, dirección, teléfono, e-mail o fax del propietario de la mascota. 3) Nombre del animal, especie, raza, sexo, edad, estado fisiológico y

nutricional. 4) Descripción de las condiciones de extracción de muestra. 5) Número y especie de animales con los que convive y número de animales

afectados. 6) Duración de la enfermedad.

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7) Descripción de los signos clínicos y hallazgos de necropsia si los hubiera. 8) Tratamientos, resultados obtenidos y vacunas aplicadas. 9) Otras enfermedades que se hayan observado en los días precedentes. 10) Diagnóstico presuntivo. 11) Análisis o estudios solicitados.

En cualquier situación, las mejores muestras provienen de la necropsia de

un animal enfermo sacrificado o de animales vivos en distintos estadíos de la enfermedad. Se debe recordar que en el estado agónico ocurre invasión de bacterias intestinales las que se difunden en los tejidos y por ende el diagnóstico bacteriológico e histopatológico se puede complicar, ya que algunos de dichos organismos son patógenos potenciales.

Para la toma de muestras (tanto in vivo como en la necropsia) es necesario contar con una vestimenta adecuada (mameluco, delantal, guantes, botas de goma, barbijo, etc.); recordar SIEMPRE el cambio de la indumentaria una vez finalizada la tarea.

BACTERIOLOGÍA

El diagnóstico microbiológico debe comenzar mucho antes que determinada muestra sea recogida. De la mayoría de los microbios que se han determinado como patógenos, probablemente el 90% de ellos pueden ser identificados si se tiene en cuenta la especie involucrada, los signos clínicos, lesiones y otras circunstancias que rodean al proceso tales como localización geográfica, época del año, edad y el sistema de cría, entre otros. El conocimiento de los microorganismos con relación a estos aspectos es esencial para una eficiente utilización de las técnicas de diagnóstico en el laboratorio y la correcta interpretación de los resultados.

Las muestras para estudios bacteriológicos deben tomarse ANTES de la administración de antimicrobianos, si esto no fuera posible se deberá esperar y tomar la muestra luego de una semana de suspendido el tratamiento.

Los órganos enviados deben proceder de animales vivos, sacrificados por el veterinario o muertos recientemente (2 a 4 horas máximo) y refrigerados de inmediato. Deben ser animales que hayan manifestado signos de la enfermedad aunque idealmente no deben estar moribundos. Los animales con fiebre y los que comienzan a manifestar los primeros signos son los más adecuados para muestrear.

Siempre debemos usar material estéril. Para evitar que la muestra se deshidrate y lograr una adecuada conservación, es necesario utilizar medios de transporte o PBS (solución buffer fosfato). Los envases utilizados para el envío de muestras deben ser en lo posible irrompibles, herméticos y de dimensiones adecuadas. Las precauciones a considerar varían con la clase de muestra, temperatura ambiente, transporte y duración del viaje; en líneas generales, el tiempo entre la obtención de la muestra y su llegada al laboratorio no debe extenderse más de 24 horas, especialmente cuando no se utilizan medios de transporte.

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Las muestras seleccionadas (leche, sangre, suero, fetos, órganos, hisopados, etc.) deben enviarse con el medio de transporte más específico y estar acompañadas del informe del veterinario.

En bacteriología, NUNCA utilizar formol para tomar o enviar la muestra. El éxito y valor final de analizar una muestra clínica en el laboratorio de

bacteriología, depende inicialmente del cuidado ejercido en la selección, recolección y envío de la misma. La muestra seleccionada debe ser aquella que contenga el agente causal y evitar su contaminación con organismos del medio ambiente. Materiales Envases estériles con cierre hermético: recipientes de vidrios de boca ancha, limpios y enjuagados con agua destilada, secados en estufa y estériles. El esterilizado se puede lograr en autoclave a 121° C durante 20 minutos o de lo contrario en horno seco a 160° C - 180° C durante 2 horas. Los envases de uso culinario, frascos de dulce, mayonesa, etc. provistos de tapa a rosca pueden adaptarse perfectamente, como así también la olla de presión que eventualmente reemplazaría al autoclave.

El material de vidrio envuelto en papel y esterilizado en el horno de cocina, estará estéril cuando el papel adquiere color “caramelo”. Este material de vidrio una vez estéril debe guardarse en cajas conservando sus propiedades por largo tiempo.

Existen en el comercio recipientes colectores de plástico, descartables, estériles, prácticos y accesibles. El instrumental (pinzas, tijeras y bisturí) que se utiliza para la extracción de muestras debe estar limpio, seco y bien afilado. Previo a su uso, se sumergen en un recipiente con alcohol y se flamean, logrando así asegurar la asepsia. Se deben descartar los desinfectantes químicos (cloroxilenol, iodo, etc.) que impiden el cultivo bacteriano posterior. Tubos estériles y cierre hermético, Para extracción de sangre se puede utilizar tubos estériles tipo Venojet:

- Sin anticoagulante: para envío de sueros, leche, orina y otros líquidos.

- Con anticoagulante: * Heparina, para envío de sangre si se solicita cultivo bacteriano o cultivo de células linfoides (viremias, tuberculosis, entre otras).

* EDTA o Heparina para búsqueda de hemoparásitos y envío de líquido articular o cefalorraquídeo. Jeringas y agujas estériles: para la extracción de sangre, líquido articular, líquido cefalorraquídeo, contenido estomacal, etc. Bolsas herméticas: para incluir órganos o fetos. Las bolsas de congelación de alimentos de un plástico fino y resistente son muy prácticas. Es importante dejar escurrir el órgano para eliminar líquidos y hacer varios nudos para optimizar la hermeticidad del cierre. En ningún caso mezcle diferentes órganos en la misma bolsa y recuerde identificar cada una de ellas. Hisopos con medio de transporte (Amies, Stuart, etc.): el medio de transporte evita la desecación de las células y limita el deterioro de la muestra. Son muy

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prácticos porque permiten tomar muestras de animales vivos (hisopados rectales, nasofaríngeos, vaginales, oculares, cutáneos, etc.) o de órganos durante una necropsia. Su transporte es barato y disminuye riesgos biológicos. Para colocar en forma correcta la muestra tomada con un hisopo, debemos hacerlo girar sobre sí mismo, frotando contra las paredes tisulares para descamar células. Guantes: para proteger al operador y evitar la contaminación de las muestras con las manos del mismo, además se pueden utilizar para enviar muestras, ej. heces, simplemente dando vuelta el guante después de tomar la muestra anudando la boca del mismo. Cajas de telgopor: siempre que se envíen muestras refrigeradas se recomienda utilizar estas cajas. No son totalmente estancas, por lo que se deberá asegurar que el contenido interior esté debidamente embalado. Se recomienda que las muestras sean enviadas en un envase irrompible dentro de la caja de telgopor (ver triple envase, en remisión de muestras) y consultar con las empresas transportadoras si existen requisitos determinados (ej: tamaño de cajas). Bloques de hielo-gel: imprescindibles para los envíos refrigerados. No utilizar nunca agua congelada. Rotulador indeleble o lápiz de grafito: para poder identificar los recipientes, las bolsas de plástico, los tubos o los hisopos. Protocolo de de toma de muestras: es un componente muy importante del envío y sin embargo con frecuencia está ausente, lo que plantea graves problemas a la hora de decidir los análisis o estudios que se deben realizar en el laboratorio. Material de necropsia: Guantes, bisturí, pinzas, tijeras, mechero, desinfectante, barbijo, mameluco, botas, costótomo, sierras, jeringas y agujas. Para el caso del transporte de animales vivos: utilizar una caja resistente, hacer suficientes orificios de aireación en la caja, especialmente en verano, no poner agua ni comida, colocar en el fondo de la caja material absorbente para los excrementos, se recomienda enviar a última hora de la tarde. Muestras

Tejidos y órganos: la muestra se tomará al abrigo de la llama, con las mejores condiciones ambientales de asepsia y como máximo una hora después de la muerte del animal en climas con alta temperatura y 12 horas como máximo en climas con bajas temperaturas. El tamaño de las muestras debe ser de 3 x 3 cm como mínimo, se debe quemar la superficie con una espátula previamente flameada, luego abrir el tejido con tijeras u hojas de bisturí estériles y cortar una pequeña porción del mismo. Las muestras se colocan en bolsas individuales de polietileno u otros recipientes estériles. Enviarlas refrigeradas al laboratorio en un lapso no mayor de 4 horas. Los órganos de elección son en general, bazo, pulmón, hígado, riñón y hueso largo. Las muestras de intestino se envasarán por separado y con sus extremos anudados para mantener su contenido intacto. Las muestras de cerebro deben enviarse refrigeradas. Se recomienda enviar piel en casos de piodermias profundas y de aquellas que no respondan a tratamientos, en las lesiones superficiales generalmente no se toman muestras para cultivo.

Hisopados: los hisopos son la forma de elección para tomar y enviar muestras de secreciones (nasal, faríngea, ocular, cutánea, cervical, vaginal, etc.),

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exudados, contenido de abscesos, etc. La muestra se debe tomar con hisopos de algodón estériles. Raspar la zona afectada evitando el contacto con cualquier otra parte, introducir dentro de un tubo estéril con por lo menos 3 mL de medio de transporte adecuado (por ejemplo AMIES o STUART) o en solución fisiológica estéril otorgándole así las condiciones necesarias para mantener viables a los gérmenes. Embeber adecuadamente la muestra con el medio de transporte y romper el mango del hisopo para eliminar la parte que ha estado en contacto con las manos, tapar el tubo evitando contaminar su interior. Identificarlo y enviarlo al laboratorio refrigerado.

Este tipo de muestra es muy útil en animales vivos o en necropsias. Permiten recoger muestras de exudados con alto contenido en células en cavidades:

Nasal

Traqueobronquial (evitar arrastrar mucus traqueobronquial)

Endocervical y vaginal, evitar arrastrar mucus vaginal introduciendo el hisopo en el hueco del espéculo hasta el cérvix.

Conjuntival (frotar suavemente el fondo de saco conjuntival)

Óticos: en otitis (sobre todo en pequeños animales) se recomienda realizar hisopados para hacer tinciones de Gram o cultivos. Estos son muy útiles en casos de otitis media. Se puede detectar levaduras (Pityrosporum canis) o bacterias de los géneros Proteus, Pseudomonas, entre otros.

Rectal (evitar arrastrar heces, vaciando previamente el recto)

Heridas abiertas y exudados: se debe previamente lavar y secar la zona.

En necropsias: se pueden tomar muestras de órganos introduciendo el hisopo profundamente en la cavidad y frotando contra las paredes haciéndolo girar sobre sí mismo.

Heces: las muestras de materia fecal pueden provenir tanto de un animal

vivo como muerto, deben ser recolectadas directamente del recto para evitar contaminación, puestas en bolsas de polietileno o en un envase hermético donde puede colocarse directamente el contenido intestinal o bien un trozo de intestino. Debido a la alta probabilidad de contaminación se debe evitar el envío de excretas expuestas al ambiente.

En caso de animales grandes, la muestra puede ser recolectada del recto del animal colocándose previamente un guante plástico que cubra inclusive el brazo. La manga del guante puede ser invertida y luego del cierre enviar al laboratorio.

La muestra se envía refrigerada, no congelada y con mínimo tiempo de transporte. Este tipo de cultivo se hace para detectar fundamentalmente enterobacterias y requiere la utilización de medios selectivos para inhibir la flora normal. Se utiliza el cultivo fecal cuando se sospecha de la presencia de patógenos específicos tales como Salmonella spp., Escherichia coli, Rhodococcus equi, Campylobacter spp. o Clostridium perfringens, entre los más frecuentes; agentes virales y otros.

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Los hallazgos de necropsia pueden proveer buenos datos si se obtienen en sitios precisos de las lesiones en el intestino, especialmente para el aislamiento y conteo de Clostridium spp.

Orina: se debe tener mucho cuidado en la toma de este tipo de muestra pues es importante no sólo aislar el germen sino también en algunos casos, hacer recuento de colonias. La muestra ideal es la tomada por cistocentesis. El sondeo vesical y la orina de chorro medio por micción espontánea puede contaminarse. Se deben utilizar jeringas, agujas y sondas estériles. En el caso de aquellas especies en las que se puede realizar cistocentesis se debe rasurar y realizar una limpieza y desinfección minuciosa del área a punzar. Dos ó tres mililitros es un volumen de muestra suficiente. Se debe enviar en un recipiente estéril, hermético y refrigerada, nunca congelada. Las bacterias pueden multiplicarse o morirse rápidamente en la orina según la acidez, por este motivo se requiere rapidez en el procesamiento. El cultivo de esta muestra debería ser rutinario, especialmente en casos donde no hay respuesta a los tratamientos, generalmente debido a resistencia a los antimicrobianos de los gérmenes involucrados.

Fluidos, exudados y aspirados: se debe rasurar, lavar y desinfectar el sitio de la punción, recolectar la muestra con jeringa y aguja estéril. Introducir la aguja en forma perpendicular a la zona de punción y a la profundidad necesaria de acuerdo al caso. Aspirar la muestra hasta obtener una cantidad suficiente (1-2 mL). Cuando la muestra no puede ser aspirada por la densidad del material, se puede inyectar en el sitio solución salina estéril. Identificar y enviar refrigerado al laboratorio en tubos estériles con tapa a rosca, de no ser posible enviar en la jeringa (con su capuchón). Se pueden usar catéteres estériles para muestras profundas. Si se pudiera elegir, los aspirados o raspados son mejores que los hisopados pero más difíciles de realizar. Conviene tomar al menos dos hisopados, y destinarlos uno para cultivo y otro para observación microscópica. Por ejemplo en casos de piotórax o pleuritis se hacen aspirados y con ellos se pueden hacer frotis y cultivos.

Líquido cefalorraquídeo o sinovial: tomar muestra con una jeringa estéril. Se debe procurar una asepsia óptima en el punto de inyección y evitar la contaminación con sangre. Enviar refrigerada y en tubos con anticoagulante.

Heridas, abscesos y drenajes: se pueden hacer cultivo y observaciones directas de la muestra o frotis coloreados con Gram u otra coloración específica. Las observaciones microscópicas pueden ser útiles en lesiones granulomatosas producidos por Nocardia sp., Actinomyces sp. o micosis.

Leche: las muestras de leche deben ser tomadas de animales que no hayan recibido tratamiento con antimicrobianos durante los últimos 10 días. Estas deben ser recolectadas en envases estériles bien cerrados y luego enviar refrigeradas al laboratorio en el menor tiempo posible.

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En los bovinos, ovinos y caprinos, lavar, enjuagar y secar la ubre, con una solución de alcohol al 70% desinfectarse las manos y con la misma solución utilizando un algodón desinfectar los pezones, dejar secar 2 minutos previos al muestreo. Eliminar los dos primeros chorros de leche antes de tomar la muestra. Ordeñar recogiendo en un recipiente estéril, sin tocar sus bordes, 3 mL aproximadamente tomando proporcionalmente de los cuartos afectados. En caso de que la infección esté localizada en uno de los cuartos o se requiera localizar el cuarto afectado, siguiendo las mismas recomendaciones, tomar de 2 a 3 mL de leche del cuarto afectado o de cada cuarto por separado. Identificar la muestra correctamente y mantenerla refrigerada hasta la llegada al laboratorio. Para cultivar, realizar frotis directos y tinción de Gram es necesario desgrasar la muestra.

Sangre: las técnicas de extracción de sangre venosa varían de una especie a otra, según la localización de los vasos sanguíneos y según el espesor y dureza de la piel. Se debe rasurar el área a punzar, limpiar muy bien con alcohol 70% y luego aplicar un hisopo o gasa con tintura de iodo al 2%. La asepsia debe realizarse en sentido contrario al crecimiento del pelo del animal y en forma circular del centro hacia la periferia. No tocar el lugar de punción con los dedos y utilizar aguja y jeringa estériles. También se puede utilizar el sistema de tubos al vacío (tipo Vacutainer), que por ser un sistema cerrado presta mayor garantía en cuanto a asepsia y preservación de las muestras. Una vez extraída la sangre sacar el aire de la jeringa y retirar la aguja antes de llenar el tubo donde se depositará la muestra, para evitar la ruptura de los glóbulos rojos (hemólisis). Homogenizar la sangre con el anticoagulante (heparina, EDTA, etc.) para evitar la formación de coágulos. Colocar en envase estéril y si tiene tapa de goma desinfectar con alcohol el exterior de la tapa.

Se debe enviar refrigerado entre 4 ºC y 8 ºC al laboratorio antes de las 24 horas de su extracción. Proteger los tubos de los golpes. Después de la punción el sitio debe quedar seco, limpio y libre de sangre, ya que la humedad y la materia orgánica favorecen las contaminaciones.

Sitios de punción

Especie animal Vena de elección

Rumiantes Vena yugular, caudal (bovinos) o mamaria

Equinos Vena yugular

Cerdos Vena de la oreja, coccígea y cava anterior

Perros Vena cefálica antebraquial o vena safena

Gatos Vena cefálica antebraquial o vena safena

Aves Vena radial o alar

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BOVINOS: se puede extraer sangre de las venas yugular, mamaria

(abdominal subcutánea) y caudales y de las arterias carótida, caudal y braquiales. La vena yugular puede ser ingurgitada presionando con los dedos el canal yugular. El vaso prominente se observa bien en la mayoría de las vacas y se palpa fácilmente en los animales obesos. Tiene aproximadamente 2 cm de diámetro. Se introduce en la vena una aguja larga calibre 14 y de 5 cm de longitud, o calibre 16 y 10 cm de longitud en un ángulo de 45° respecto a la piel y paralelo al vaso. Otra opción es introducir una aguja más fina, calibre 18 de 3,8 cm. Luego de introducir la aguja se hace una leve succión con la jeringa. Puede ocurrir que la aguja atraviese la vena y que la punta quede fuera del vaso, entonces retirando la aguja lentamente se ubicará la punta de la aguja dentro de la luz del vaso. Extraída la sangre, se quita la presión sobre la vena y se aplica presión manual, sin hacer fricción sobre el sitio de punción antes de sacar la aguja por 30 a 60 segundos después para evitar hemorragias y hematomas. La vena mamaria se punza en forma semejante. La vena caudal se encuentra muy cerca de la arteria, para realizar la punción se alza la cola y se clava una aguja pequeña calibre 20 ó 22 de 25mm y a 15 cm de la base de la cola verticalmente en la línea media hasta que penetre en el vaso. Se debe identificar la sangre como venosa o arterial; esta última es más roja y emerge con mayor presión.

OVEJAS: la vena yugular es la más usada pero la vena y arterias femorales son también fáciles de punzar. Se hace una partición en la lana, a veces previamente cortada, para exponer un área de piel limpia. Realizar la asepsia correspondiente. La vena yugular se encuentra con frecuencia debajo de la piel pero puede estar incluida en el tejido adiposo. La piel es blanda y la aguja (calibre 18-22 de 25 mm) penetra con facilidad, por lo que debemos evitar atravesar el vaso.

CABALLO: se aborda la vena yugular. Con el pulgar izquierdo en el surco yugular a la mitad de su trayecto en el cuello, se comprime y sujeta la vena. Se clava la aguja (calibre 18-20 de 38 mm de longitud) en ángulo aproximado de 15° con la piel 1 cm arriba del pulgar que está sujetando el vaso, se introduce 1 ó 2 cm bajo la piel, se aumenta el ángulo a 45° y se empuja para que entre en la vena. La punción debe hacerse en un solo movimiento suave y continuo. Esto ayuda a disminuir el sangrado al retirar la aguja. De la carótida puede obtenerse sangre arterial, este procedimiento requiere práctica y no debe ser intentado por una persona inexperta. Es más fácil obtener sangre de la gran arteria metatarsiana, situada en una canaladura sobre la cara antero-externa del corvejón, entre el tercero y cuarto huesos metatarsianos. Se inyecta en la piel un poco de anestésico local, después de unos minutos, se pincha la arteria con una aguja de calibre 20 y 25 mm, mantenida en ángulo recto con el vaso, firmemente encajado en el surco óseo.

CERDO: se usan las venas de las orejas, cola y cava anterior. De la oreja

se toma sangre por una incisión pequeña de la vena con bisturí o por punción con

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una aguja. La punción de la vena cava es peligrosa y deber ser practicada por una persona experta.

PERRO Y GATO: es muy útil el servicio de un ayudante experto en el manejo de animales. Las venas cefálica y safena son usadas comúnmente en el perro y en el gato. Con una mano el ayudante sujeta con suavidad la cabeza del animal y con la otra lo rodea por detrás, tomando el codo del mismo y extendiendo el miembro anterior. Con el pulgar y los otros dedos de esta mano se fija la piel para sujetar el vaso firmemente. El operador inmoviliza el vaso con el pulgar e inserta la aguja (calibre 18, 22, 25 o 38 mm dependiendo del tamaño del animal) arriba de este punto. También se puede extraer sangre de la vena yugular en el gato y menos frecuentemente en el perro; el procedimiento es semejante al descrito para otras especies.

La cantidad de muestra obtenida a través de la punción debe tenerse en cuenta en las diferentes razas, es así como para las razas de mayor tamaño puede obtenerse por punción sin causar trastornos hasta 15 mL de sangre, y en razas pequeñas la muestra no se puede exceder de 10 mL.

AVES: igualmente que para las otras especies la sujeción o inmovilización es de gran importancia para el éxito del procedimiento. Existen varios sitios de punción que serán elegidos de acuerdo a la experiencia del operador. La vena radial (alar), es el sitio de punción más comúnmente elegido por su facilidad; se elige una de las dos alas, se levanta, se sujeta el ala libre junto con las patas del animal, seguidamente quien realiza la punción inmoviliza con los dedos pulgar e índice la vena alar, previo a ésto se debe desplumar el recorrido de la vena con el fin de visualizarla mejor, con aguja número 21 se hace inserción sobre la vena en un ángulo de 15°, se debe tener cuidado de no extravasar ya que la pared de la vena es muy delgada y podría ocurrir con facilidad, observándose hematoma inmediatamente, si esto no sucede se procede a extraer la muestra, aproximadamente de 1 a 2 mL de sangre en aves de mayor tamaño, y en aves más pequeñas 0,5 mL ya que una cantidad mayor puede producir anemias en esta especie. Otros sitios de punción menos utilizados son la vena atlantooccipital ubicada entre el atlas y la región occipital, la inserción de la aguja debe hacerse perpendicular al sitio antes mencionado. La punción intracardíaca debe realizarse con mucho cuidado ya que un error en ella, al puncionar las aurículas puede causar la muerte inmediata del animal.

MICOLOGÍA

Las consideraciones para la toma de muestra son similares a las de bacteriología.

Micosis superficiales: si se sospecha de dermatofitos, realizar raspajes de

piel profundos y tomar muestras y pelo del centro y el margen de la lesión. La raíz de los pelos es muy importante en este caso. Desinfectar previamente con jabón (sin acción fungicida) seguido con alcohol. El instrumento con el que realicemos el

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raspaje debe estar estéril al igual que el recipiente que contendrá la muestra. Si no se observan lesiones, se recomienda usar un cepillo fino para recolectar pelos para cultivarlos. Deben ser enviados al laboratorio en un tubo estéril tapado con un algodón o sobre de celofán. No enviar la muestra en medio de cultivo porque proliferan los hongos contaminantes.

Micosis profundas: las muestras (tejidos y órganos) deben ser enviadas en

condiciones semejantes a las de bacteriología. Análisis de alimentos: los granos forrajeros, los balanceados o la cama

deben ser enviados, un mínimo de 50 grs., en fundas de papel al laboratorio. Si existe demora para su envío debe refrigerarse.

Fetos: si se sospecha de infección micótica es importante incluir una

muestra de líquido abomasal (cuarto estómago), tomada de la misma forma como se recolectan abscesos o líquidos articulares pero enviando la muestra sin refrigerar. Se debe además recoger una muestra mediante raspado cutáneo del feto, lavando la zona con agua y jabón, desinfectar con alcohol al 70% o un antiséptico adecuado, dejar secar por 2 minutos, con una hoja de bisturí, o una placa portaobjetos, raspar la zona afectada, si hubiese pelos afectados, éstos deben arrancarse desde su raíz, con la ayuda de pinzas. Enviar la muestra al laboratorio (en placa de Petri, sobre de papel o entre dos portaobjetos), sin refrigerar.

VIROLOGIA

El diagnóstico de enfermedades virales puede requerir el envío de muestras de suero (sangre sin anticoagulante) con el fin de llevar a cabo pruebas serológicas, sangre entera (sangre con anticoagulante), exudados y de tejidos para aislamiento y estudios estructurales.

OTROS LABORATORIOS AUXILIARES DE DIAGNÓSTICO

Histopatología: las muestras se colocarán en envases con formol al 10%,

en algunos casos se puede utilizar Bouin, conservando una relación uno en diez (una parte de muestra y 9 partes de formol), el formol debe cubrir a la muestra en su totalidad. Los trozos seleccionados tendrán que contener parte de tejido normal y parte de tejido afectado, deben ser de 1 x 1cm aproximadamente. Los recipientes para las muestras deben ser de boca ancha para que puedan salir íntegras y fácilmente. Las muestras para estudios histopatológicos no necesitan refrigeración y nunca deben congelarse. De acuerdo al caso se destinarán a estudios histopatológicos que permitirán poner en evidencia el agente infeccioso

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actuante, tanto por su presencia como por su efecto celular, o bien por la presencia de cuerpos de inclusión intracelulares (citoplasmáticos o nucleares).

Toxicología: las muestras se enviarán refrigeradas y pueden ser:

a) Vegetales tóxicos: se enviará la planta entera en bolsas de plástico. b) Vegetales para determinación de oxalatos o ácido cianhídrico, en

este caso congelar inmediatamente de extraída la muestra. c) Órganos o tejidos: la muestra de aproximadamente 200 g se

colocará en bolsas de polietileno. d) Alimentos: granos, alimento balanceado para la determinación de

micotoxinas, la muestra es de 200 g y se coloca en bolsas de polietileno. e) Contenido ruminal o estomacal: 200 a 500 mL en recipiente de vidrio

o plástico. Bioquímica clínica: las muestras se enviarán refrigeradas y pueden ser

para:

a) Determinación de desórdenes metabólicos (Ca, P, Mg, otros). Muestra: 20 a 30 mL de suero limpio sin hemólisis.

b) Determinación de cobre en hígado. Muestra: trozos de 50 g del órgano en envases bien cerrados y enviar refrigerado.

c) Determinación de hematocrito, hemoglobina, recuento y fórmula. Muestra: sangre entera con anticoagulante y un frotis realizado en los primeros 15 minutos de extraída la sangre, enviar refrigerado.

d) Determinación de cuerpos cetónicos, densidad, glucosa, otros. Muestra: 150 mL de orina con cristales de timol o gotas de formol para evitar la descomposición.

e) Determinación de pH y sales minerales en agua: Muestra: 250 mL de agua en envase estéril.

Hematología: la muestra es sangre con anticoagulante (EDTA, oxalatos,

citrato de sodio, otros) en la proporción indicada para cada reactivo.

Parasitología: para el análisis de endoparásitos: se remiten muestras de materia fecal refrigeradas sin más agregados, siempre que lleguen dentro de las 24 horas al laboratorio, si esto no ocurre se añade formol al 5 %.

Para análisis de ectoparásitos: pulgas, piojos garrapatas, ácaros, etc. Se envían individualmente en alcohol 70 º o un raspado de piel, que se coloca en alcohol 70 º.

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PREPARACIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS

Las muestras deben ser protegidas del posible deterioro luego de recolectarlas. Se deben acondicionar para prevenir posible oxidación, secado, calentamiento, que produzcan un aumento de la actividad enzimática de la bacteria o de las células y fluidos de la muestra. Por supuesto, el modo más eficiente para evitar este deterioro es el envío y procesamiento del material lo más rápido posible. Los responsables de la toma de muestra, fundamentalmente en lugares lejanos a los laboratorios, deben conocer horarios de transportes para minimizar estos problemas. También es importante avisar al laboratorio receptor el horario esperado de arribo para acelerar el procesamiento. Una importante recomendación es, en lo posible, evitar feriados y si son de urgencia enviar al principio de semana.

Los medios de transporte bacteriológicos (Stuart, Amies, agar semisólido) no permiten el crecimiento pero proveen un ambiente húmedo, pH fisiológico, potencial reductor que otorgan mayor probabilidad de vida al microorganismo en tránsito. Existen productos comerciales (Culturette, etc.) que contienen hisopos descartables con una ampolla fácilmente rompible conteniendo medio de transporte Stuart. Para el caso de sospecha de agentes anaerobios, se pueden utilizar medios para anaerobios y en caso de distancias largas se recomienda sumergir los trozos de órganos en glicerina bufferada pH 7 al 30% estéril.

El acondicionamiento seguro de las muestras para el diagnóstico microbiológico es responsabilidad de todos los involucrados en el proceso: el profesional, el técnico de laboratorio y el personal de correos y/o transporte. El embalaje de materiales infecciosos debe evitar la fuga de los mismos por rotura o mal empaque del envío. El correcto acondicionamiento de los materiales infecciosos enviados genera menores riesgos de exposición accidental tanto para el personal de laboratorio como para toda persona que entre en contacto durante el envío. Por otra parte, se asegura que las muestras lleguen en las condiciones adecuadas lo que redundará en la calidad del estudio que se realice.

Los agentes infecciosos y el material de diagnóstico deben ser enviados en un “sistema triple básico” de embalaje de acuerdo a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3.

El sistema consta de tres envases: 1.- Recipiente primario: un recipiente estanco, a prueba de filtraciones, etiquetado, que contiene el espécimen (tubo pequeño o vial). Cada muestra deberá ser enviada en recipientes individuales y bien identificada. Entre cada frasco o recipiente que contenga la muestra, se coloca un material que amortigüe los golpes, mantenga fijas las muestras y absorba la humedad (especialmente cuando se use hielo seco como refrigerante). La parte externa del recipiente debe ser cuidadosamente examinada y debe limpiarse en caso que haya sangre, materia fecal u otros contaminantes antes de embalarlo para su envío. 2.- Recipiente secundario. Un segundo recipiente estanco, a prueba de filtraciones que encierra y protege el/los recipiente/s primario/s. Se pueden colocar varios

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recipientes primarios envueltos en un recipiente secundario. Se debe usar suficiente material absorbente para proteger a todos los recipientes primarios y evitar los choques entre ellos. 3.- Recipiente terciario o envoltorio externo: el recipiente secundario se coloca en un paquete de envío que protege su contenido de los elementos externos. Preferentemente el recipiente debe ser de un material aislante de la temperatura externa, siendo las más recomendadas las cajas de telgopor por su bajo peso y fácil manipulación. La caja externa se cierra de tal manera que todas las esquinas y/o tapas queden selladas con cinta adhesiva (aumenta la resistencia del recipiente y garantiza el aislamiento de las muestras). Si las condiciones lo permiten, envolver la caja externa con papel empaque, sellar con cinta adhesiva y colocar con letra grande y clara: Manéjese con cuidado. Material biológico refrigerado. Flechas u otros símbolos que indiquen la posición de la caja.

Para armar un sistema de envío se pueden utilizar los envases de toma de muestra, de reactivos de laboratorio o de alimentos que sean de material resistente.

Los datos del espécimen, notas y otro tipo de información que describan la muestra, se envían debidamente protegidos, dentro de un sobre y en funda plástica, entre el recipiente secundario y terciario.

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Diagnóstico de enfermedades infecciosas

DIAGNÓSTICO

DIRECTO O ETIOLÓGICO INDIRECTO O INMUNOLÓGICO

Detección del agente

etiológico/toxina

Detección de la respuesta inmunológica

Cultivo y aislamiento viral y

bacteriano: en placa y en

tubo. Pruebas bioquímicas

Coloraciones no específicas

y específicas

IFD

ELISA

Frotis/Extendidos

PCR

Microscopía electrónica

HUMORAL CELULAR

PRIMARIA SECUNDARIA TERCIARIA

IFI, ELISA, RIA

AGLUTINACIÓN (antígeno particulado) PRECIPITACIÓN (antígeno soluble)

Inmunodifusión en gel de agar

Fijación del complemento,

seroneutralización, inhibición

de la hemaglutinación

in vivo

Prueba de

tuberculina

in vitro

Detección

de

interferón

gamma

EN TUBO

SAT, 2-Mercaptoetanol

2-

EN PLACA

BPA

2-

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DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO

CULTIVO BACTERIANO

El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismos en un medio artificial después de la obtención una muestra de un sitio de infección potencialmente sospechosa (el ambiente in vivo), con los métodos de recolección de muestras, y el crecimiento de esas bacterias en el ambiente artificial del laboratorio (el ambiente in vitro). Una vez que los microorganismos crecen en el cultivo, en placa o en tubo, la mayoría de las poblaciones bacterianas se observan con facilidad y están presentes en cantidades suficientes para permitir la realización de pruebas bioquímicas para la identificación de laboratorio del microorganismo. AISLAMIENTO VIRAL

Los substratos más corrientemente empleados para la propagación de los virus son los cultivos celulares.

Un cultivo celular es obtenido de explantos de órganos o de embriones de animales. Estas células obtenidas asépticamente se disocian tratándolas con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspensión de células libres así obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren y multiplican formando una fina capa de células que se llama monocapa celular.

Esta monocapa de células crece en un medio de cultivo complejo que contiene albúmina, vitaminas, sales, glucosa, y demás, en un sistema buffer. Se previene la contaminación adicionándole al medio antibióticos adecuados y en algunos casos, antifúngicos.

Los cultivos celulares en monocapa son los más usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos).

Luego de inoculado con la muestra sospechosa, el cultivo se incuba a 37ºC por un período de tiempo variable y esperando la aparición de efecto citopático, toxicidad o degeneración celular, de acuerdo al virus considerado. El efecto se observa con microscopio.

Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparación con cualquier cambio morfológico observado en los cultivos inoculados.

El efecto citopático es la visualización de cambios morfológicos característicos en las células inoculadas producidas por la acción del virus sobre el cultivo celular. Cuando los virus no producen este efecto, se puede recurrir a técnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo. Las más usadas son: hemadsorción, hemoaglutinación y tinciones con anticuerpos monoclonales.

EXAMEN DE MUESTRAS AL MICROSCOPIO. Frotis sanguíneos y extendidos.

Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a observar y según los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tinción.

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Examen microscópico directo de las muestras

No se utiliza ningún tipo de colorante. La técnica consiste en el montaje directo de la muestra o examen en fresco: las muestras clínicas o de cultivos se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observación y posteriormente se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. El material que es demasiado espeso puede diluirse con igual volumen de solución salina fisiológica estéril para permitir la diferenciación.

Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (tinta china, azul metileno de Loeffler, azul de lactofenol)

El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite visualizar estructuras de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.

La tinta china o nigrosina permite observar células capsuladas. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos

Tinción Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. Los ejemplos clásicos son la tinción de Gram y la de Ziehl-Neelsen.

Los colorantes se utilizan para distinguir diferentes tipos de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, entre otros.

Los extendidos o frotis realizados sobre un portaobjetos generalmente son fijados antes de teñirlos. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Luego se prosigue con el proceso de tinción.

INMUNOFLORESCENCIA (IF)

Es una técnica utilizada generalmente para la detección de moléculas usando Ac marcados con colorantes fluorescentes como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina o la ficoeritrina. Estas sustancias al ser excitadas con una luz de longitud de onda del rango ultravioleta (190-380nm), emiten luz visible de longitud de onda mayor que se observa como una fluorescencia amarillo-verdosa o anaranjado rojizo, según se haya empleado isotiocianato o rodamina.

Esta técnica posee dos variantes: inmunofluorescencia directa e indirecta.

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Inmunofluorescencia directa (IFD)

Objetivo: prueba de interacción primaria que se realiza para detectar antígenos presentes en una muestra de tejido o células de una monocapa infectada mediante el uso de anticuerpos marcado con una sustancia fluorescente.

ENZIMAINMUNOENSAYO (EIA)

El enzimoinmunoensayo es una técnica versátil y muy sensible, que puede utilizarse para detectar y medir en una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la ß-galactosidasa.

Esta técnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza: cuando es en placa, se denomina ELISA; sobre tejidos, inmunohistoquímica y sobre células, inmunocitoquímica. ELISA

Existen muchas variantes de ELISA y su diseño depende de lo que se quiera determinar. Pueden utilizarse para detectar o cuantificar tanto antígenos como anticuerpos, pueden aplicarse fácilmente a diversos fluidos como leche u orina, requieren pequeños volúmenes de muestra y son relativamente rápidas.

El ELISA se realiza en placas de poliestireno de 96 pocillos y se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista (cualitativo) o mediante el uso de un

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espectrofotómetro expresándose como densidad óptica (cuantitativo). En cada placa se colocan controles del sistema y controles positivos y negativos de absorbancia conocida.

Los ELISA utilizados para detectar antígenos son:

ELISA directo: las placas se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Luego se coloca el Ac marcado con una enzima. ELISA sándwich o de captura: se liga a la placa un anticuerpo monoclonal o policlonal como captura de antígeno. Se agrega el material sospechoso de contener al antígeno y luego se añaden anticuerpos específicos antiespecie marcados con la enzima.

ELISA competitivo: puede utilizarse para determinar la concentración tanto de Ag como Ac. El método se basa en la competencia entre el Ag de la muestra y un Ag marcado con enzima, por la unión con el Ac de captura. El Ag de la muestra (Ag sin marcar) si tiene afinidad por el Ac de captura, desplaza al conjugado (Ag marcado), que se elimina con los lavados, disminuyendo así la cantidad de enzima presente en el pocillo y por consiguiente la cantidad de color generado al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno. Cuanto menor sea la intensidad del color generado, es decir menor absorbancia medida con el espectrofotómetro, mayor será la concentración de Ag en la muestra problema.

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Inmunohistoquímica (IHQ) e Inmunocitoquímica (ICQ)

Cuando el análisis se realiza sobre cortes de tejidos o células, se denomina inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, respectivamente. Estas pruebas se realizan sobre tejidos o células de manera similar a las IF.

La inmunohistoquímica permite evidenciar la presencia de un Ag específico sobre un corte de tejido determinado y ubicar en que estructuras del mismo se encuentra. Los métodos de IHQ pueden clasificarse en directos o indirectos. En el primer caso, el único Ac a utilizar se encuentra conjugado con la enzima reconociéndose la unión del mismo con el antígeno tras el agregado del sustrato cromógeno. En el segundo caso, existen distintos métodos: método de dos pasos (el Ac primario unido a su Ag es detectado mediante un segundo Ac marcado), método de tres pasos (se agrega un tercer Ac dirigido contra el Ac secundario), método de la avidina-biotina (conjugación del Ac secundario con biotina que permite la unión específica con la avidina conjugada con la enzima de interés). Esta prueba se lee con microscopio óptico, observándose una reacción positiva como un precipitado color (de acuerdo al revelador), sobre las estructuras histológicas que contengan el antígeno buscado.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular que amplifica un fragmento de ADN de bacterias, virus, animales y humanos, con el objetivo de aumentar las probabilidades de identificar los mismos.

Desde hace muchos años se utiliza esta técnica para investigaciones científicas. Actualmente se ha puesto a punto para el diagnóstico de rutina de muchas enfermedades infecciosas.

Microscopía electrónica de transmisión y de barrido La microscopía electrónica es una técnica que requiere instrumentos de alta complejidad y personal altamente especializado. Si bien su uso se limita exclusivamente a actividades de investigación, la mayor utilidad de la microscopía electrónica de transmisión es en oncología, siendo útil en el diagnóstico de neoplasias malignas, ya que permite identificar el tipo y la diferenciación de una neoplasia. Por ejemplo, al demostrar elementos de diferenciación no apreciables a microscopía de luz como desmosomas, que se encuentran alterados en Fiebre Aftosa. Otras aplicaciones son la identificación de partículas virales intranucleares y citoplasmáticas, y en enfermedades respiratorias donde se ha detectado ultraestructuralmente un trastorno importante del transporte mucociliar donde se observan cilios con alteraciones en número y disposición del esqueleto ciliar microtubular. La microscopía electrónica de barrido permite el estudio de superficies celulares. La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra y se utiliza en el estudio de enfermedades del tallo piloso donde existen anomalías estructurales y de superficie de los pelos, que pueden identificarse fácilmente con esta técnica.

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DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO

INMUNIDAD HUMORAL

Pruebas serológicas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Una amplia variedad de enfermedades infecciosas pueden ser diagnosticadas mediante el empleo de pruebas serológicas. Para la realización de las mismas pueden tomarse muestras de sangre, plasma seminal, leche, mucus cérvico-vaginal, entre otros líquidos corporales así como líquido torácico o abdominal.

Para la extracción de la muestra es imprescindible utilizar materiales limpios y secos (agujas de calibre adecuado, jeringas, tubos rotulados correctamente, tapones) para evitar la contaminación y hemólisis de la misma. También es importante conocer qué diagnósticos se realizarán para determinar el volumen de la muestra a tomar.

Las muestras de sangre se colocan en un tubo sin anticoagulante, preferentemente de vidrio, se debe esperar la coagulación y la retracción del coágulo, por lo menos 20-30 minutos luego de extraída la muestra. Lo recomendado es esperar 1-2 horas a temperatura ambiente, cuanto más tiempo transcurra para que la retracción tenga lugar, mayor cantidad de suero se obtendrá, aunque la cantidad de suero no será nunca mayor a un 40% del volumen original de sangre. Debido a que tanto la coagulación como la retracción son procesos enzimáticos, se producirán más rápido si la sangre se incuba en estufa a 37°C durante 1-2 horas y luego se refrigera durante 30 minutos más. Obtenido el suero se separará el mismo con ayuda de una pipeta para su procesamiento inmediato o su conservación tanto refrigerado (no más de 7 días a 4°C) o congelado (-20°C) en alícuotas si se quiere conservar por un mayor período de tiempo. Nunca congelar los sueros con coágulo. El fraccionamiento de la muestra evitará la desnaturalización y agregación de las proteínas resultante de congelaciones y descongelaciones sucesivas. En caso de utilizar otras muestras como fuente de anticuerpos, deberán conservarse de la misma manera.

El suero o el plasma no debe conservarse por más de 6 horas en refrigeración sin ser separados de los demás componentes sanguíneos, ya que trae como consecuencia alteraciones en los diferentes metabolitos de la sangre a determinar y por lo tanto, errores en los resultados de laboratorio.

La utilización de suero está indicada para el diagnóstico de la mayoría de las enfermedades infecciosas que cuenten con técnicas serológicas estandarizadas. Para determinadas enfermedades (ejemplos: rinotraqueítis infecciosa bovina, diarrea vírica bovina, leptospirosis) es fundamental efectuar un doble muestreo con intervalo no inferior a 3 semanas, (muestreo pareado) a fin de determinar la seroconversión. Se entiende por conversión serológica, la variación en 3 o más veces el título de anticuerpos entre el primer y segundo muestreo.

Las características deseables de un suero es que sea translúcido e inodoro. Por lo tanto, no deben utilizarse para la realización de las pruebas serológicas sueros hemolizados o contaminados.

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Esquema general del momento óptimo para recolección de muestras

Agente Ac (anticuerpos)

S1 S2 Aislamiento

Días 0 10 25

Incubación Lesiones Convalescencia

S1 y S2: momentos óptimos para la extracción de muestras para serología (muestras pareadas)

Pruebas de interacción primaria

Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Objetivo: detección de anticuerpos en suero o demostración e identificación de antígenos en tejidos o cultivos celulares. Cuando por IFI deseamos detectar un anticuerpo, se emplea el antígeno que procede de un frotis tisular, un corte o un cultivo de tejidos colocado sobre un portaobjetos. Se utiliza como conjugado un anticuerpo anti-Ig marcado con sustancias fluorescentes para detectar la unión entre un anticuerpo no marcado con su antígeno específico. ELISA

Como se explicó anteriormente esta prueba puede utilizarse tanto para detección de Ag como para detección de Ac. El ELISA más comúnmente utilizado es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en una muestra problema, utilizando como conjugado un anticuerpo-antiinmunoglobulina (antiIg) marcado con una enzima. Para detectar la

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presencia de este conjugado, se agrega a la reacción un sustrato específico de dicha enzima y un cromógeno que permita observar la acción de la enzima sobre su sustrato. La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de anti-Ig marcada que se haya captado, y ésta a su vez será proporcional a la cantidad de Ac que se encuentren en la muestra problema.

Radioinmunoensayo (RIA) Objetivo: es una prueba de interacción primaria que utiliza un radioisótopo como marcador del conjugado. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar concentraciones muy pequeñas de una sustancia. Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los potenciales peligros para la salud y la contaminación ambiental que supone el manipuleo de sustancias radiactivas. Inmunoblotting. Western Blot Objetivo: identificar antígenos o anticuerpos en una muestra de composición heterogénea. El Western Blot combina la separación electroforética de proteínas de una mezcla de acuerdo a su peso molecular, con la detección inmunológica de Ag individuales mediante el uso de Ac específicos para esos Ag. También se pueden identificar los Acs generados contra diferentes fracciones de un patógeno, que componen una respuesta policlonal contra el mismo. Dada su alta especificidad, el Western Blot se utiliza en muchos casos como prueba confirmatoria (por ej: SIDA) y ha probado ser una herramienta muy útil para identificar los Ag más importantes en microorganismos complejos y parásitos.

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Pruebas de interacción secundaria

AGLUTINACIÓN

Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los Ac IgM e IgG a partir de la interacción entre anticuerpos bivalentes (IgG) o polivalentes (IgM) y un antígeno en solución sobre una superficie celular o sobre una partícula. Si los antígenos son particulados (bacterias, eritrocitos y otros) y están en suspensión, aglutinan al unirse a los Ac específicos, produciéndose un entrecruzamiento entre determinantes antigénicos de partículas adyacentes que origina la aglutinación que se observa macroscópicamente en forma de grumos. Los Ac IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que al ser moléculas pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión.

Estas pruebas se pueden leer a simple vista: macroaglutinación o bajo aumento (microscopio óptico o lupa) microaglutinación. La interpretación es similar para todas las pruebas de aglutinación: REACCIÓN POSITIVA presencia de aglutinado o grumos, indicando que el antígeno y el anticuerpo se encuentran presentes en la reacción y se han unido. REACCIÓN NEGATIVA ausencia de los mismos. El título de un suero se determina por la más alta dilución que causa un determinado grado de aglutinación.

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PRECIPITACIÓN

Inmunodifusión en gel de agar

Prueba de precipitación cualitativa que se realiza en medio semisólido (gel de agar o agarosa). La técnica de doble difusión puede utilizarse para identificar tanto la presencia de antígenos como la de anticuerpos solubles en los líquidos corporales. Al difundir el antígeno y el anticuerpo en el gel, se pondrán en contacto y precipitarán formando una banda o halo. Interpretación: REACCIÓN POSITIVA: formación de bandas de precipitación, sueros positivos. REACCIÓN NEGATIVA: no se forman bandas de precipitación en el gel de agar, sueros negativos.

Pruebas de interacción terciaria

Fijación de Complemento Objetivo: se basa en la capacidad del complemento para unirse a los complejos antígenos-anticuerpo (fijación). Se puede utilizar esta reacción para medir las concentraciones de anticuerpos semicuantitativamente.

La prueba se desarrolla en dos fases, una primera que es una reacción antígeno- anticuerpo en un medio líquido y una segunda consistente en la adición de complemento, una hemolisina dependiente de complemento y eritrocitos. Si en la primer fase se ha producido reacción antígeno-anticuerpo, es decir si el suero analizado contenía anticuerpos frente al antígeno, el complemento queda fijado y no puede activar la hemólisis de los glóbulos rojos. Si el suero no contenía anticuerpos el complemento se une a la hemolisina y lisa los eritrocitos. Pruebas de bloqueo de actividad viral

Estas pruebas detectan anticuerpos sintetizados contra los antígenos virales, mediante el bloqueo de la acción del virus.

Pruebas de neutralización: las pruebas de neutralización y en particular las de neutralización vírica, son uno de los estándares habituales para medir los niveles de inmunidad protectora frente a un patógeno. Normalmente la prueba se realiza en dos pasos. Primero se incuba el antígeno (patógeno) con el suero del animal a analizar y luego se inocula esta solución en un animal o en un cultivo celular. Si el suero contenía anticuerpos neutralizantes, se bloquea la capacidad infectiva del patógeno y; por lo tanto, no produce la infección del animal o del cultivo. Este mismo sistema puede utilizarse con toxinas o bacterias. Sin embargo no suele ser útil para diferenciar respuestas entre animales infectados y vacunados ya que la mayoría de las vacunas inducen anticuerpos neutralizantes.

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Inhibición de la hemoaglutinación: se basa en la capacidad de algunos patógenos para causar la aglutinación de los eritrocitos de mamíferos y de aves. Los anticuerpos contra dichos patógenos bloquean sus lugares de unión inhibiendo la aglutinación de los eritrocitos. La inhibición de este fenómeno por un anticuerpo se utiliza tanto como un método para identificar un virus específico, como para medir las concentraciones de anticuerpos en el suero. Inhibición de la hemoadsorción: los cultivos celulares infectados con ciertos tipos de virus (Orthomixovirs-Paramixovirus) pueden adsorber glóbulos rojos en su superficie por la presencia de proteínas virales específicas (hemoaglutininas), recientemente sintetizadas y que poseen afinidad para la unión a glóbulos rojos de varias especies. Es una técnica de fácil realización y permite detectar infecciones no citopáticas.

INMUNIDAD CELULAR

In vivo

Pruebas de hipersensibilidad tipo 4

Las reacciones de tipo 4 se caracterizan por la sensibilización de una población de las células T. En posteriores enfrentamientos con el antígeno esta población inicia una serie de reacciones inmunológicas que culminan con el aflujo de linfocitos y macrófagos al lugar del estímulo antigénico. Este aflujo se produce en un período de 24 y 72 h y por ello se denomina frecuentemente hipersensibilidad retardada.

La reacción de hipersensibilidad es in vivo. Por ejemplo, en un animal sensibilizado al Mycobacterium bovis la inyección intradérmica de un extracto purificado de la pared celular bacteriana provocará en el lugar de inyección una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, presentándose un infiltrado celular que provocará un engrosamiento dérmico.

Esta reacción inmunológica no está restringida a las micobacterias y es también característica de la respuesta inmunitaria a otras infecciones bacterianas, como Brucella, Neisseria, infecciones fúngicas como la blastomicosis y un amplio rango de enfermedades parasitarias, particularmente Schistosoma.

Prueba de tuberculina

Reactivo

Las tuberculinas que deben utilizarse en el diagnóstico de la tuberculosis en animales son:

1. El derivado proteico purificado (PPD) de tuberculina bovina, elaborada con Mycobacterium bovis (cepa «AN5») de 1mg/ml de concentración.

2. El derivado proteico purificado (PPD) aviar, elaborada con una cepa de Mycobacterium avium (cepa «D4») de 0,5 mg/ml de concentración.

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Las únicas tuberculinas PPD autorizadas en el país son las elaboradas por el SENASA y las producidas por los laboratorios particulares que fueron controladas y aprobadas por este Organismo.

La tuberculina PPD debe ser transportada y conservada en frío (+2 C° a +8 Cº) y protegida de la luz solar directa durante el trabajo de campo. Una vez utilizado parte del reactivo, el sobrante, si no se va a utilizar en el mismo día, debe descartarse, no se puede volver a utilizar.

BOVINOS

Las pruebas tuberculínicas que se aplican a bovinos son tres:

1. Prueba ano-caudal de rutina (con PPD bovina) considerada “prueba de rutina”. 2. Prueba cervical simple de saneamiento con PPD bovina 3. Prueba cervical comparativa (con PPD bovina y aviar).

“Para someter a los mismos animales a un nuevo examen, deben transcurrir un espacio de tiempo NO menor 60 días desde la última prueba”

1. Prueba ano-caudal de rutina (con PPD bovina) Técnica

La prueba tuberculínica de rutina es intradérmica, aplicada en el tercio medio del pliegue ano-caudal interno, a unos 6 cm de la base de la cola y en el centro del pliegue. Antes de la inyección se debe medir con el calibre el grosor del pliegue anocaudal interno. Luego se realiza la inoculación de 0,1 mL de del derivado proteico purificado (PPD bovina), previa limpieza de la región sin usar sustancias químicas irritantes. La aguja debe insertarse intradérmicamente en toda su longitud en las capas superficiales de la piel, retirarla un poco e inyectar la tuberculina. En una inyección bien aplicada aparecerá una pápula en el sitio inoculado.

Lectura La lectura de las reacciones se hará a las 72 h después de la inoculación, levantando la

cola hasta estirar ligeramente el pliegue. Con el dedo índice y el pulgar de la otra mano, se palpa el pliegue para comprobar si hay engrosamiento, tomando la medida exacta con el calibre. Se registran en el protocolo de tuberculinización las mediciones pre y pos inoculación y la diferencia entre las mismas, tomándose esta última como valor para su interpretación.

Ejemplo: pre inoculación: 2 mm, pos inoculación: 8mm. Lectura final: 6 mm.

Interpretación El profesional que realiza la prueba tuberculínica de rutina en un rodeo debe actuar con

criterio epidemiológico, tomando en cuenta la totalidad del rodeo y no interpretar los resultados considerando a los animales aisladamente.

En la primera prueba, cuando se desconoce si el rodeo está infectado o no, RODEO CON SITUACION DESCONOCIDA, el veterinario acreditado debe aplicar la tuberculina a:

- todos los bovinos mayores de 3 meses de edad en establecimientos lecheros y cabañas

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- todos los bovinos mayores a 12 meses de edad en establecimientos de carne.

Se aplica el siguiente criterio general: Negativo: Un engrosamiento menor de tres (3) mm. Positivo: Un engrosamiento de la piel de cinco (5) mm o mayor. Sospechoso: Un engrosamiento de tres (3) mm o mayor y menor de cinco (5) mm.

Si todos los animales son negativos se considera RODEO NO INFECTADO. Cuando en un rodeo, a la primera prueba solo se encuentran reaccionantes

sospechosos (entre 3 y 5 mm) se considera RODEO SOSPECHOSO. Para dilucidar su estado se puede optar por remitir los animales sospechosos a sacrificio y si no se comprueban lesiones macroscópicas tuberculosas en el post mortem, ni diagnóstico positivo histopatológico y/o bacteriológico se debe considerar al rodeo como no infectado. Otra opción es repetir la prueba ano-caudal a los 60 días de la primera, en todos los animales que acusaron reacción aplicando los siguientes criterios: Positivo: si aumenta el tamaño de la reacción. Negativo: si estos animales presentan una pronunciada reducción en el tamaño de la reacción. Se puede considerar el rodeo como no infectado, siempre que en el grupo no hubiera otro animal reaccionante positivo. Sospechoso: Si persiste el mismo tamaño de la reacción. Se debe realizar un tercer examen definitivo a los 60 días del segundo. Esta tercera prueba es concluyente y todo animal que tuviera una reacción de 3 mm o mayor debe ser clasificado reaccionante y el RODEO INFECTADO, a menos que los animales sospechosos fueran sacrificados y no se comprobara la enfermedad.

Si existen antecedentes de infección en el rodeo se considera RODEO INFECTADO y se debe aplicar un criterio estricto: Positivo: Un engrosamiento de tres (3) mm o mayor. Negativo: Un engrosamiento menor a tres (3) mm.

En sistemas productivos de carne: En caso de obtener en el primer diagnóstico un resultado tuberculínico negativo de todos los animales, se debe realizar UNA segunda prueba, con la supervisión oficial de SENASA, que deberá confirmar el resultado negativo para obtener la certificación de ESTABLECIMIENTO OFICIALMENTE LIBRE.

En rodeos lecheros: En caso de obtener en el primer diagnóstico un resultado tuberculínico negativo de todos los animales, se deben realizar DOS pruebas tuberculínicas con resultados negativos consecutivos, con supervisión oficial de SENASA, para lograr la certificación de ESTABLECIMIENTO OFICIALMENTE LIBRE.

Si en cualquiera de los establecimientos anteriormente nombrados, en el primer diagnóstico da un resultado tuberculínico positivo de algún animal, se deben repetir las inoculaciones a todos los bovinos con un intervalo mínimo de 60 días y máximo de 90 días hasta obtener DOS resultados negativos consecutivos en el caso de sistemas productivos de carne y TRES resultados negativos consecutivos en el caso de rodeos lecheros, luego de esto el productor puede solicitar a SENASA la certificación como de ESTABLECIMIENTO OFICIALMENTE LIBRE.

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De no dar resultados negativos los animales positivos deben ser remitidos a faena.

Los establecimientos en los cuales se ha diagnosticado la enfermedad y el propietario realiza periódicamente las pruebas diagnósticas y la eliminación de reactores hasta obtener el certificado de establecimiento libre se denominan ESTABLECIMIENTOS EN SANEAMIENTO. 2. Prueba cervical simple

La sensibilidad de esta prueba es superior a la del pliegue ano-caudal, y se aplica con el fin de obtener una mayor seguridad en la eliminación de bovinos infectados, en rodeos en los que ya se ha comprobado la infección, como por ejemplo confirmar luego de 60 días a los animales que reaccionaron en forma dudosa a la prueba anocaudal.

El lugar de inoculación es el tercio medio del cuello. Se corta el pelo para indicar el lugar donde se aplicó la inyección en un área de 5 cm de diámetro y se mide con un calibre el espesor de la piel.

Se inyectan 0,1 mL de PPD bovina en las capas superficiales de la piel mediante la inserción de la aguja a 45º de la piel en toda su longitud.

La lectura se realiza a las 72 h. Se palpa la zona de inoculación para ver si existe induración y se mide con calibre el espesor de la piel. Positivo: engrosamiento igual o mayor a 3 mm Negativo: engrosamiento menor a 3 mm. 3. Prueba cervical comparativa (con PPD bovina y aviar). “Esta prueba se debe utilizar cuando en un establecimiento se detectan con la prueba ano-caudal, animales sospechosos en un área en erradicación o libre”.

El lugar de inoculación es en el tercio medio del cuello. Se corta el pelo para indicar el lugar donde se aplicó la inyección en un área de 5 cm de diámetro para cada una, a 10 cm del ligamento nucal PPD aviar y a 12 cm por debajo del mismo PPD bovina y se mide con un calibre el espesor de la piel.

Se inyectan 0,1 mL de PPD aviar y 0,1 mL de PPD bovina en las capas superficiales de la piel mediante la inserción de la aguja a 45º de la piel en toda su longitud.

La lectura se realiza a las 72 h. Se palpa la zona de inoculación para ver si existe induración y se mide con calibre el espesor de la piel.

La interpretación se debe realizar de acuerdo a los siguientes parámetros: a) Por diferencia de mm anterior y posterior a las inoculaciones se debe determinar la respuesta final de cada PPD. b) La interpretación debe estar basada en el tamaño de la respuesta a la tuberculina bovina comparada con la aviar. Positivo: aquel animal con 4 mm o más de respuesta a la PPD bovina que a la PPD aviar. Sospechoso: con más de 2 mm hasta 4 mm de respuesta a la PPD bovina que a la PPD aviar. Negativo: con una respuesta igual o menor a 2 mm.

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En otras especies

PORCINOS

Los cerdos son susceptibles a la infección con Mycobacterium bovis, M. tuberculosis y M. avium complex (MAC) por lo que en la prueba deben usarse ambas tuberculinas, PPD de origen bovino y PPD de origen aviar.

Se realiza la prueba en la base de oreja. Si esta región estuviera traumatizada o tuviera algún defecto, se pueden hacer las pruebas en los labios de la vulva de la cerda o en la conjunción de la piel y mucosa del ano del macho. Se debe inyectar 0,1 mL de PPD bovino en el lado derecho y 0,1 mL de PPD aviar en el lado izquierdo.

La lectura se hace a las 48 h. Toda reacción tisular comprobada por palpación se clasifica como reaccionante, debiéndose anotar si la misma se debe a tuberculina bovina o aviar.

CAPRINOS

Prueba ano-caudal de rutina (con PPD bovina) o prueba cervical simple (con PPD bovina). Se siguen las especificaciones del protocolo definido para bovinos.

OVINOS

Prueba axial comparativa con tuberculinas PPD bovina y PPD aviar, debido a que los

ovinos son también susceptibles a la infección con M. avium subsp paratuberculosis. Se inocula 0,1 mL de PPD bovina en la axila derecha y 0,1 mL de PPD aviar en la axila

izquierda. La lectura se realiza a las 72 hs por palpación y medida con el calibre. La interpretación se realiza de acuerdo a lo establecido para la prueba cervical comparativa de los bovinos. AVES

Las aves son susceptibles solamente al Mycobacterium avium por lo que en esta prueba se utiliza exclusivamente PPD aviar. El reactivo se inyecta vía intradérmica en una de la barbillas, la dosis es de 0,05 mL. La lectura se realiza a las 48 h de aplicada la inyección y toda edematización de la barbilla se interpreta como reacción positiva.

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In vitro

Prueba de interferón gamma

Es una prueba diseñada para detectar gamma interferón biológicamente activo, en el plasma bovino para el diagnóstico de tuberculosis a partir de muestras de sangre. Los animales infectados con Mycobacterium bovis tienen linfocitos circulantes sensibilizados a los antígenos micobacterianos. Éstos podrían responder in vitro a la estimulación con tuberculina PPD secretando gamma interferón, la que puede detectarse por esa prueba. Los linfocitos de animales no infectados no responden a la producción de gamma interferón y de ahí que la detección de la misma se correlaciona con la enfermedad.

Otra aplicación de este sistema para demostrar in vitro inmunidad mediada por células incluye el diagnóstico de otra enfermedad causada por Mycobacterium que es la enfermedad de Johne, conocida como Paratuberculosis. Se ha demostrado que el ganado infectado con Mycobacterium paratuberculosis puede identificarse detectando gamma interferón en el plasma recogido a partir de sangre cultivada con Johnina PPD como antígeno estimulante.

La prueba da gamma interferón provoca la estimulación de las células T previamente sensibilizadas por la infección con Mycobacterium bovis.

Para esta prueba se incuban pequeñas cantidades de sangre entera heparinizada con antígeno de PPD. Después de 24 horas de incubación se elimina el plasma y se prueba para gamma interferón usando un anticuerpo monoclonal de enzima inmuno ensayo.

Pruebas a campo realizadas en Australia durante 1989 y 1990 sobre 10.000 bovinos demostraron que el ensayo es significativamente más sensible y específico que la prueba de tuberculina sobre la piel.

Se puede realizar repetidas veces sobre animales sospechosos sin tener que esperar 60-90 días como en el caso de la tuberculina, y además los animales pueden analizarse todas las veces que sea necesario. Además se evita la interpretación subjetiva de la lectura de la prueba dérmica.

Es importante tener en cuenta que para realizar la prueba de gamma interferón los animales no se hayan sometido a la prueba intradérmica en los últimos 60 días. Las muestras de sangre se deben colocar en tubos heparinizados y transportarse a temperatura ambiente, debiéndose procesar dentro de las 16 horas siguientes a su obtención.

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ACTIVIDAD

1- a) Indique qué pruebas para diagnóstico etiológico observó durante el práctico. b) Esquematice los resultados observados. c) Explique la interpretación de la misma. 2- a) Indique qué pruebas de aglutinación observó durante el práctico. b) Esquematice los resultados observados. c) Explique la interpretación de la misma. 3- a) Indique qué pruebas de precipitación observó durante el práctico. b) Esquematice los resultados observados. c) Explique la interpretación de la misma. 4- a) Indique qué coloraciones observó al microscopio. b) Esquematice lo observado.

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Área de Enfermedades Infecciosas

2015

Trabajo práctico

Diagnóstico de enfermedades

reproductivas y evaluación de semen

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Diagnóstico de Enfermedades de la Reproducción

La remisión de las muestras junto a los antecedentes y datos del rodeo son

fundamentales para el diagnóstico, aunque a veces sólo se cuenta con el producto final: la vaca vacía o la muerte del embrión o feto.

En las enfermedades de la reproducción se considera un rodeo problema cuando se realiza el diagnóstico de gestación y se observa una disminución en el porcentaje de preñez con respecto al número de vientres inseminados o con servicio natural, cuando la edad gestacional es menor a la esperada de acuerdo al servicio, presencia de abortos, muerte perinatal y neonatal. A partir de allí, se debe realizar un estudio de la problemática presente.

En el rodeo problema se debe de tener en cuenta: - Número de animales afectados: la mayoría de las enfermedades de la reproducción son poblacionales. - Edad y sexo de los animales afectados. - Condición corporal de los animales. - Incorporación de animales al rodeo, cambios en la alimentación u otros aspectos del manejo. - Problemas reproductivos previos en el rodeo y en los mismos animales. - Examen genital y la palpación transrectal o ecografía para determinar secreciones, piómetras, anormalidades, edad de la gestación en la que se presentó la problemática, presencia de descargas vulvares, vaginitis, pústulas o petequias en vagina. - Signos en otros órganos o aparatos. - Examinar el 10% de los animales que presentaron problemas reproductivos (vacíos o con preñeces chicas). - Diagnóstico diferencial de acuerdo a las manifestaciones clínicas y de ser posible un diagnóstico presuntivo.

Para el diagnóstico de las enfermedades durante la gestación temprana se puede realizar la toma de muestras para identificación del agente causal mediante diferentes técnicas. Muestras 1- Mucus cérvico-vaginal (MCV), exudado uterino o vaginal. Metodología: Aspiración mediante jeringa de Cassou y vainas azules de IA.

Detección de agentes etiológicos como Brucella sp., Tritrichomonas foetus,

Campylobacter fetus, Trueperella pyogenes (ex­Arcanobacterium pyogenes), Histophillus

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somni, Mycoplasma bovis y bovigenitalium, Ureaplasma diversum, Chlamydophila spp., agentes virales como virus HVB-1 y 4 y VDVB.

Para el transporte y/o aislamiento de los agentes etiológicos se utilizan los siguientes medios:

Amies: Trueperella pyogenes (ex­Arcanobacterium pyogenes), Histophillus somni.

Cary Blair: Brucella abortus, Campylobacter fetus.

Caldo Brucella semisólido: Brucella abortus, Campylobacter fetus.

Medio Hank: virus HVB-1 y 4, VDVB y otros.

Stuart: Trueperella pyogenes (ex­Arcanobacterium pyogenes) y bacterias aerobias sin requerimientos especiales.

Medio TYM: Tritrichomonas foetus.

Torundas de alginato cálcico o dacrón (para clamidias), torundas de algodón, con varilla de plástico o madera, con medio de cultivo Amies, tubos con medio de "urea-arginina" (medio líquido de transporte para micoplasmas)

2- Suero

Se solicitarán muestras de suero para brucelosis y neosporosis, muestras pareadas en caso de sospecha de enfermedades virales y leptospirosis. También se puede solicitar serología de hembras preñadas del mismo lote para comparación de títulos serológicos, ya que muchas veces cuando se presenta el problema ya ha pasado demasiado tiempo del ingreso del agente causal. Otra opción es tener serotecas de establecimientos que presentan fallas reproductivas y así poder comparar nuestros resultados. Envío de las muestras

Las muestras para aislamiento e identificación serán remitidas rotuladas, refrigeradas (excepto el medio de transporte para Tritrichomonas foetus y la sangre para la obtención del suero) y en envases estériles o en los medios de transporte correspondientes a cada agente etiológico. En el caso de los sueros para pruebas serológicas se enviarán refrigerados o congelados (una vez separado el coágulo del suero obtenido) asegurando la cadena de frío. De los fetos se pueden enviar muestras de órganos en formol al 10% para el laboratorio de histopatología. Todo material se acompañará de una anamnesis y un diagnóstico presuntivo. Posteriormente se envasarán las muestras bajo las normas de bioseguridad. Recordar que algunos agentes son causales de enfermedades zoonóticas.

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Esquema del momento óptimo para recolección de muestras durante la gestación

temprana

Aislamiento Ac S1 S2 Días 0 15 30 Muerte embrionaria o aborto

S1 y S2: momentos óptimos para la extracción de muestras para serología (muestras pareadas).

3- Fetos

En caso de encontrar el feto se debe preguntar al laboratorio si puede recibir el feto entero, en cuyo caso la necropsia no se realizaría en el establecimiento de origen.

Si se desconoce la fecha de servicio, la edad fetal se puede determinar considerando la medida desde el occipital hasta la punta de la cola y el peso, mediante el empleo de tablas estandarizadas.

A la necropsia las muestras a tomar son: líquido abomasal y toráxico, órganos como hígado, bazo, corazón, pulmón, cerebro y envolturas fetales para detección de los agentes etiológicos: Brucella abortus, Leptospira spp., Tritrichomonas foetus, Campylobacter fetus,

Trueperella pyogenes (ex­Arcanobacterium pyogenes), Histophilus somni, Mycoplasma bovis y bovigenitalium, Ureaplasma diversum, Chlamidophila psitacci, virus como VDVB y HVB-1 y 4; y anticuerpos en enfermedades como brucelosis, leptospirosis y neosporosis.

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BRUCELOSIS BOVINA

El diagnóstico inmunológico es la forma más común y difundida para el diagnóstico de la brucelosis. Sin embargo, hay que tener en cuenta que al ser ésta una forma indirecta de diagnóstico, los resultados deben ser interpretados con precaución. Recordar que la serología es una buena técnica diagnóstica a nivel de rodeo, pero a nivel de individuo sus resultados nunca son definitivos. Existen una serie de pruebas que pueden utilizarse solas o combinadas, dependiendo del objetivo de trabajo. Inicialmente se aplica una prueba de alta SENSIBILIDAD (habilidad de una prueba para identificar como positivos a los animales verdaderamente infectados), llamadas pruebas tamiz o de screening: BPA o ELISA. Todos los sueros que resulten positivos a esta prueba se los someterá a una prueba de alta ESPECIFICIDAD (habilidad de una prueba para identificar como negativos a los animales verdaderamente no infectados) llamadas pruebas confirmatorias: SAT, 2-Mercapto-Etanol, fluorescencia polarizada, ELISA por competición, fijación de complemento, ELISA indirecto.

Los animales que resulten positivos a las pruebas confirmatorias son clasificados como

infectados y deben ser descartados del rodeo, mientras que los que resulten negativos son catalogados como no infectados y permanecen en el rodeo.

Se deberán examinar a los reproductores machos mayores de 6 meses y hembras mayores de 18 meses con vacunación certificada. En Argentina de acuerdo a SENASA las pruebas oficiales incluidas dentro del Plan de Control y Erradicación de brucelosis bovina son las siguientes:

Prueba BPA (Buffered plate antigen)

Es una prueba tamiz de aglutinación en placa, cualitativa y rápida. Se fundamenta en la inhibición de las aglutininas inespecíficas a bajo pH. Detecta IgG e IgM específicos. Interpretación: REACCIÓN POSITIVA: cuando se forman grumos. REACCION NEGATIVA: la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos.

A los sueros positivos se les realizarán las pruebas complementarias SAT y 2-ME que se describen a continuación:

Prueba SAT o Wrigth (Seroaglutinación en tubo)

Es una prueba de aglutinación en tubo, cuantitativa. Se mezclan diferentes cantidades de suero con concentraciones constantes del antígeno en suspensión. Se incuba en estufa a 37°C durante 48 horas. Interpretación: REACCIÓN NEGATIVA: aglutinado en el fondo del tubo y líquido turbio. REACCIÓN INCOMPLETA: “botón” en el fondo del tubo y líquido turbio. REACCIÓN POSITIVA: “botón” en el fondo del tubo y líquido claro. Prueba 2 - Mercapto Etanol

Es una prueba de aglutinación en tubo, con las mismas características que SAT pero con el agregado de una concentración constante de 2 mercapto-etanol. Se trata de una

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prueba selectiva que detecta solamente la presencia de IgG. Se basa en que la IgM, con configuración de pentámero, se degrada en cinco subunidades semejantes debido a la acción del 2-Mercapto Etanol. Estas subunidades conservan sus características de antigenicidad pero al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como para aglutinar. La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de IgG. Interpretación: la lectura se efectúa de la misma manera que para la prueba de aglutinación en tubo y debe hacerse siempre en forma paralela con la prueba de aglutinación en tubo (SAT). La presencia de IgG se asocia generalmente con infección activa, por lo que toda reacción a esta prueba debe ser considerada como indicativa de infección. Los animales reaccionantes a esta prueba se deben considerar infectados.

Tabla de interpretación diagnóstica de brucelosis bovina

Hembras no vacunadas, machos mayores de 6 meses

BPA Wright/ SAT 2-ME Condición

- No se realiza No se realiza Negativo

+ 25 UI - Negativo

+ ≥ 50 UI - Sospechoso

+ 100 UI - Positivo

+ ≥ 25 UI ≥ 25 UI Positivo

Hembras vacunadas con Brucella abortus cepa 19, mayores de 18 meses

BPA Wright/ SAT 2-ME Condición

- No se realiza No se realiza Negativo

+ ≤ 50 UI - Negativo

+ I 100 UI - Sospechoso

+ 100 UI - Sospechoso

+ I 200 UI - Sospechoso

+ 200 UI - Positivo

+ ≥ 25 UI ≥ 25 UI Positivo

UI: unidades internacionales I: incompleto

Técnica de Polarización de Luz Fluorescente (FPA)

Más recientemente se ha desarrollado un método para detectar anticuerpo anti-PSO (polisacárido O) de Brucella por polarización de fluorescencia (FPA). Se trata de un inmunoensayo en el cual los anticuerpos, al unirse al antígeno, cambian la velocidad de rotación de la molécula. Al incidir en ella un haz de luz fluorescente polarizada, el ángulo de difracción cambia en función del anticuerpo unido. Este cambio es medido por un detector que lo traduce en una señal.

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ELISA por competición

La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS) sobre una placa de 96 pocillos. A continuación se añade la dilución de los sueros a analizar y el anticuerpo monoclonal de ratón, específico para un epítope de la cadena O del LPS. Luego, el conjugado de anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con enzima peroxidasa y el substrato/ cromógeno.

En ausencia de anticuerpos anti-Brucella (sueros negativos), el anticuerpo monoclonal se liga al epítope de la cadeno O del LPS, lo cual es indicado en la prueba por el desarrollo de color. En el caso de que el suero problema contenga anticuerpos (suero positivo), éstos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epítope e inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O, manifestándose por la ausencia de color en el ensayo.

Otras pruebas para el diagnóstico serológico de brucelosis bovina

Técnica de Fijación del Complemento

Es una prueba de interacción terciaria que permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos capaces de fijar el complemento (IgG1), cuya presencia en determinados niveles posee una gran correlación con el estado de animal infectado. Interpretación: la determinación cuali-cuantitativa se realiza midiendo la cantidad de complemento consumida por la relación antígeno-anticuerpo y dicha reacción se manifiesta, indirectamente, por la ausencia de hemólisis de los glóbulos rojos.

ELISA indirecto

Permite detectar la presencia de anticuerpos contra Brucella abortus en animales domésticos y salvajes. La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS) sobre una placa de 96 pocillos. A continuación se añade la dilución de los sueros a analizar y luego de una incubación de 30 minutos, se añade un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG1 bovina conjugado con una enzima peroxidasa. Luego de una segunda incubación de 30 minutos, se agrega un substrato/cromógeno y se lee la reacción por fotometría.

Si el suero problema contiene anticuerpos anti-Brucella (suero positivo), éstos se adhieren al antígeno LPS y al anticuerpo monoclonal anti-IgG1, por lo tanto al agregar la solución substrato/cromógeno, se producirá un cambio de color cuya intensidad estará directamente relacionada con la concentración de anticuerpos presentes en la muestra.

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Prueba de anillo en leche (PAL)

Es una prueba rápida en tubo, cualitativa, de rodeo que detecta la presencia de Ac en leche entera. Estos Ac reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno-anticuerpo que queda adherido a los glóbulos grasos de la leche y asciende con ellos a la superficie, formando una capa o “anillo” de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el grado de la reacción, desapareciendo parcial o totalmente la tinción de la columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras que la capa de crema forma un “anillo” de color blanco natural. El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor graso de la leche.

La PAL se usa como diagnóstico presuntivo para descubrir rebaños infectados en los cuales se consideran el número de animales para determinar los diferentes volúmenes de leche de tanque a emplear. La prueba es modificada para tanques muy grandes: para hacer la prueba más sensible se aumenta la cantidad de leche, manteniendo constante la cantidad de antígeno. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de control de la brucelosis.

Interpretación: anillo color violáceo en el extremo superior de la columna líquida indica presencia de anticuerpos anti-Brucella en leche.

- : anillo de crema, blanco; columna de leche, azul. + : anillo de crema y columna de crema del mismo color o casi igual. ++ : anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche. +++ : anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color. ++++: anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca.

Los animales de rodeos positivos a la PAL deben ser examinados por las pruebas

serológicas para identificar los infectados individualmente.

Modificación de la prueba para tanques muy grandes Para aumentar la sensibilidad de la prueba, aumentar la cantidad de leche,

manteniendo constante la cantidad de antígeno:

< 150 vacas 1 ml de leche

150 a 450 vacas 2 ml de leche

451 a 700 vacas 3 ml de leche

Para utilizar esta prueba en el diagnóstico individual de un animal, se deben realizar

diluciones de la muestra de leche.

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BRUCELOSIS OVINA

Inmunodifusión en gel de agar (IDAG)

Prueba de precipitación, cualitativa, que se realiza en medio semisólido (gel de agar o

agarosa) para la detección de IgM e IgG. Al difundir el antígeno y el anticuerpo en el gel, se pondrán en contacto y precipitarán formando una banda o halo. Interpretación: REACCIÓN POSITIVA: formación de bandas de precipitación, sueros positivos. REACCIÓN NEGATIVA: no presencia de bandas de precipitación.

Referencias. Inmunodifusión en gel de agar. Las bandas blancas de precipitación indican reacciones positivas.

BRUCELOSIS CANINA

Para el diagnóstico de la enfermedad en esta especie se utiliza la técnica de inmunodifusión en gel de agar, la técnica de microaglutinación en portaobjeto y el hemocultivo.

Técnica de microaglutinación en portaobjeto (RSAT)

Es una prueba tamiz, rápida, práctica, económica y cualitativa. La técnica emplea un antígeno preparado con una cepa de B. canis de características mucoides que tiene la particularidad de ser estable. En un portaobjeto se mezclan 10 microlitros de suero y 10 microlitros de antígeno (previamente homogeneizado a temperatura ambiente). Luego, se rota suavemente el portaobjeto con la mezcla, durante 1 minuto y se lee al microscopio (10X).

Interpretación: REACCIÓN POSITIVA: cuando se forman grumos. REACCION NEGATIVA: la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos.

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BRUCELOSIS PORCINA

Prueba Rosa de Bengala Es una prueba en placa, rápida y cualitativa, que mide anticuerpos en suero al

enfrentarlo sin diluir con una suspensión bacteriana del antígeno brucelar coloreado con rosa de bengala. Por su simplicidad es muy útil como prueba de screening. Interpretación: REACCION POSITIVA: aglutinación. REACCION NEGATIVA: ausencia de aglutinación.

Referencias. Prueba de Rosa de Bengala. Indica resultados positivos a la prueba.

BRUCELOSIS HUMANA Prueba de Huddleson

Prueba de aglutinación rápida en placa, cuantitativa, mide anticuerpos séricos.

NEOSPOROSIS BOVINA

Pruebas serológicas

Las pruebas serológicas más usadas son la inmunofluorescencia indirecta, aglutinación y ELISA.

La prueba de inmunofluorescencia indirecta se utiliza para detectar anticuerpos anti-N.caninum en el suero de las vacas que abortan o en el suero o líquidos fetales de fetos abortados.

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Inmunofluorescencia indirecta para detección de anticuerpos anti-Neospora caninum (IFI)

Se utiliza la técnica para la detección de anticuerpos anti-N. caninum en sueros de vacas y en líquidos de cavidades (líquido abdominal y pericárdico) y sueros fetales. Se emplea el antígeno específico (taquizoítos) adherido a un portaobjeto, el suero problema o líquido problema y un conjugado conformado por inmunoglobulina de conejo anti-IgG1-IgG2 bovina marcado con fluoresceína.

Referencias. Reacción positiva, se observa la fluorescencia de los taquizoítos (estadio parasitario de N. caninum). Reacción negativa, se observan los taquizoítos sin marcación.

Diagnóstico histopatológico

La detección de lesiones compatibles con las ocasionadas por N. caninum orientan el diagnóstico que se confirmaría definitivamente si el feto tiene serología positiva a IFI o con una reacción positiva por inmunohistoquímica.

LEPTOSPIROSIS

Macroaglutinación Es una prueba cuantitativa, rápida, que detecta IgM y utiliza un antígeno inactivado. A

pesar de tener gran valor diagnóstico, se recomienda complementarla siempre con la técnica de microaglutinación en tubo. Es útil para diagnósticos individuales o ante un brote de leptospirosis, pero carece de aplicación en estudios epidemiológicos de prevalencia. Interpretación: REACCION POSITIVA aglutinación. REACCION NEGATIVA ausencia de aglutinación. Microaglutinación de Martin y Petit (MAT)

Prueba cuantitativa que consiste en enfrentar diluciones de suero con igual volumen de una suspensión de leptospiras vivas de cada uno de los serovares que estén presentes en la región. La lectura se realiza en un microscopio óptico con condensador de campo oscuro y se observan los “soles” o “madres” de aglutinación. El suero se considera positivo cuando más del 50% de las leptospiras se observan aglutinadas.

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Interpretación: títulos para las diferentes especies

Bovinos y cerdos: 1/200

Equinos: 1/400

Perro: 1/100

Hombre:1/50

RINOTRAQUEÍTIS INFECCIOSA BOVINA (IBR)

DIARREA VÍRICA BOVINA (DVB)

Muestras para IBR 1- Sueros pareados en animales que abortaron: primera muestra, en el momento del aborto y la segunda a los 30 días. A veces se necesita otro muestreo 2 meses después. También se debe tener en cuenta la historia del rodeo y los planes sanitarios implementados en el establecimiento. 2- Mucus cérvico-vaginal o de las lesiones en vagina: si no se aísla el agente se debe continuar con el rastreo serológico. Muestras para DVB 1- Sueros pareados de animales que abortaron: primera muestra, en el momento del aborto y la segunda a los 30 días. Suero y MCV en la vaca vacía, para relacionar con estado inmunitario. 2- Muestras de sangre con anticoagulante: para aislamiento viral a partir de células blancas.

Enfermedades de transmisión venérea

Campylobacteriosis y Tritrichomonosis genital bovina

Muestras para el diagnóstico

Estas enfermedades pueden ser diagnosticadas en los toros, vacas y vaquillonas, o fetos mediante análisis de laboratorio. El análisis habitual en forma conjunta para ambas enfermedades, es el que se efectúa en los toros mediante la toma de muestra prepucial pre-servicio/post-servicio (30-35 días), empleando distintos métodos de toma de muestra (raspaje, aspiración o por aspiro-raspaje). El número de muestreos necesarios a realizar en los toros se relaciona con los antecedentes sanitarios y reproductivos y la situación actual del rodeo. Cuando la situación del rodeo es desconocida por el veterinario se deben obtener tres muestreos consecutivos NEGATIVOS, mientras que cuando los antecedentes son conocidos, el número de muestreos NEGATIVOS se reduce a dos. El intervalo entre muestreos no debe ser menor a 10 días.

Las muestras prepuciales se transportan en medios que son provistos refrigerados por los laboratorios para ser llevados a la manga en el momento de la toma de muestra. Para campilobacteriosis genital bovina las muestras de colocan en solución fisiológica formolada al

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1% (SFF), en el caso de cultivo o para el diagnóstico en hembras se utilizan medios de transporte como Cary y Blair o caldo Brucella. Y para la Tritrichomonosis, medio de transporte y cultivo con alto contenido en hierro (ej. TYM, Plastrigue, caldo infusión, entre otros). Posteriormente, las muestras deben ser transportadas a temperatura ambiente para el caso de SFF y medio de transporte para T. foetus y refrigeradas para el caso de medio de preenriquecimiento para C. fetus.

CAMPYLOBACTERIOSIS GENITAL BOVINA

Inmunoflorescencia directa para detección de Campylobacter fetus (IFD)

En el caso de muestras prepuciales en SFF o MCV en preenriquecimiento se realiza inmunofluorescencia directa. Para la detección de la bacteria se utiliza como conjugado una gamma-globulina de conejo purificada anti- Campylobacter fetus marcada con isotiocianato de fluoresceína. La observación se realizará en microscopio de epifluorescencia con aumento (40 X y 100 X). Es importante corroborar no sólo la fluorescencia de la bacteria sino también su morfología.

En casos que así lo requieran se puede realizar el cultivo a partir del medio de preenriquecimiento PERO NUNCA A PARTIR DE LA SFF.

Referencias. Reacción positiva a la prueba de inmunofluorescencia directa para C. fetus. Se observa la fluorescencia de formas compatibles con C. fetus debido a la unión del conjugado (gamma-globulina de conejo purificada anti- Campylobacter fetus marcada con isotiocianato de fluoresceína).

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TRITRICHOMONOSIS GENITAL BOVINA

Cultivo

La muestra colocada en medio de transporte y cultivo (ej. TYM, Plastrigue, caldo infusión, entre otros) será incubada durante 7 días consecutivos con observaciones diarias y directas al microscopio óptico (10X y 40X). En las muestras positivas se reconocerán las formas características de Trichomonas foetus.

Referencias. T. foetus observadas al microcopio óptico. Tinción.

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Transmisión de patógenos microbianos en semen bovino

La IA tiene como objetivos mejorar la calidad genética y también prevenir o eliminar

enfermedades venéreas. Sin embargo la técnica no está exenta de riesgos, pues puede convertirse en vía de

diseminación o en fuente de propagación de enfermedades infecciosas a nivel nacional e internacional.

El semen criopreservado es un excelente mecanismo de control sanitario si se tienen en cuenta las siguientes premisas:

- Es necesario determinar el estado sanitario de los sementales utilizados como dadores.

- El semen puede vehiculizar bacterias, virus, hongos patógenos u oportunistas. - La mayoría de estos microorganismos sobreviven al proceso de congelación y a los

antibióticos que se añaden al diluyente. - Es posible controlar el eyaculado previo y a posterior de la congelación, para

determinar la presencia de gérmenes. La implementación de técnicas como PCR permite identificación de microorganismos no viables.

- De un eyaculado se obtienen generalmente muchas dosis de semen, por lo que el riesgo de diseminación de enfermedades en diferentes rodeos el elevado.

- En IA el semen es depositado en útero, por lo tanto, no es expuesto a los efectos bactericidas de las secreciones del cuello uterino y de la vagina durante el estro. Control en los centros de inseminación artificial

Para cumplir con las premisas señaladas, los Centros de IA deben efectuar cuarentena a los reproductores previo a su ingreso y controlar periódicamente que los mismos estén libres de enfermedades infecciosas. El personal debe estar debidamente entrenado siendo necesario adoptar medidas de higiene que permitan la obtención de pajuelas y/o pastillas de calidad.

En Argentina, antes de ingresar a un Centro de IA, todo reproductor debe permanecer aislado durante 60 días. Se realizan controles durante el período de cuarentena y posteriormente se llevan a cabo controles semestrales para asegurar que los reproductores estén libres de brucelosis, tuberculosis, paratuberculosis, leptospirosis, campilobacteriosis genital bovina, tritrichomonosis, rinotraqueitis infecciosa bovina, diarrea vírica bovina/enfermedad de las mucosas, leucemia bovina.

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Riesgo de transmisión de enfermedades del bovino en inseminación artificial (Eaglesome

y Garcia)

Categoría Enfermedad Presencia del agente

Lista de enfermedades OIE

1 Enfermedades con evidencia de riesgo alta o moderada

Brucelosis bovina + B Campilobacteriosis genital bovina + B Diarrea vírica bovina + - Estomatitis vesicular + A Fiebre aftosa + A Haemophilus somni + - Mycoplasmosis + - Rinderpest + A Rinotraqueitis infecciosa bovina + B Trichomoniasis + B Tuberculosis bovina + B Ubicuitarios (P.aeruginosa, + - Escherichia coli)

1 Enfermedades de bajo riesgo de transmisión

Lengua azul + A Leucemia bovina + B Fiebre efímera bovina NR - Virus Akavane + - Leptospirosis + B

2 Enfermedades con pequeña o ninguna información de riesgo de transmisión

a) Transmisión probable a través de inseminación artificial

Inmunodeficiencia bovina + - Paratuberculosis bovina + B Pleuroneumonía contagiosa bovina + A

b) Transmisión improbable a través de inseminación artificial

Lumpy skin disease + - Fiebre del valle de Rift NR A Fiebre Q + B Rabia NR - Septicemia hemorrágica NR B Fiebre catarral maligna NR B Encefalopatía espongiforme bovina NR B Listeriosis + - Anaplasmosis NR B Babesiosis NR B Chlamydia + - Hongos, levaduras + -

+: presencia del agente infeccioso en semen NR : No reportado

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Pruebas diagnósticas para la determinación del estado sanitario en sementales y semen Brucelosis Reproductores: serología Semen: aislamiento e identificación. Determinación de aglutininas en plasma seminal. Campylobacteriosis Reproductores: identificación antigénica o aislamiento e identificación Semen: ídem Tritrichomonosis Reproductores: cultivo para aislamiento e identificación Semen: ídem Leptospirosis Reproductores: serología para diferentes serovares Semen: PCR Histophilus somni (Trueperella somni) Semen: aislamiento e identificación Mycoplasmosis Semen: aislamiento e identificación Chlamydiosis Semen: aislamiento e identificación IBR Reproductores: serología Semen: aislamiento, PCR DVB Reproductores: serología Semen: aislamiento, PCR Patógenos potenciales Aislamiento, identificación. Unidades formadoras de colonia (UFC)

Para el caso de semen criopreservado los valores internacionales de referencia son: Parámetro evaluado Valor ________________________________________________________ Patógenos de la reproducción libre Gérmenes oportunistas(UFC) hasta 500 ________________________________________________________

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ACTIVIDAD

1- En un rodeo vacuno de la provincia de Buenos Aires sobre 150 vacas totales se detectan 20 vacas positivas a la técnica de BPA. Indique:

a) ¿Qué enfermedad se diagnostica con esta prueba? b) ¿Cuál es el destino de las vacas positivas y de las negativas? En caso de considerar la

posibilidad de realizar nuevas pruebas diagnósticas indique el nombre de las mismas, su fundamento y en qué casos se realizan. 2- ¿Cuál/es es/son la/s enfermedad/es de transmisión venérea más importantes en nuestra región? Indique la/s muestra/s a obtener para su diagnóstico, técnica/s diagnóstica/s de rutina para cada una de ellas y su fundamento.

3- ¿Cómo se evalúa la presencia de patógenos presentes en semen? ¿Qué metodología fue desarrollada en el práctico? 4- El semen evaluado en la fotografía estaría dentro de los valores aceptables? SI NO Fundamente.

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Dr. MV Juan Passucci

Área de Epidemiología

Facultad de Ciencias Veterinarias

UNCPBA

SENSIBILIDAD

Es la propiedad de un test de dar resultado POSITIVO cuando el animal

está realmente enfermo.

ESPECIFICIDAD

Es la propiedad de un test de dar resultado NEGATIVO cuando el animal

está realmente sano.

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DEL TEST DIAGNÓSTICO

Diagnóstico

de la prueba

Situación real

Enfermos Sanos Total

Positivo a b a + b

Negativo c d c + d

Total a + c b + d a + b + c + d

a: Verdaderos Positivos

b: Falsos Positivos

c: Falsos Negativos

d: Verdaderos Negativos

SENSIBILIDAD: a / a + c

ESPECIFICIDAD: d / b + d

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NEGATIVO POSITIVO

d a

c b

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Área de Enfermedades Infecciosas

2015

Trabajo práctico

Calidad de leche y diagnóstico de mastitis

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Calidad de leche y diagnóstico de mastitis

La mastitis es la respuesta inflamatoria de la glándula mamaria a infecciones microbianas principalmente, y a otros agentes no infecciosos. Es probablemente la más costosa de las enfermedades infecciosas endémicas que afecta a los bovinos y otras especies lecheras. Tiene impacto en la producción animal, en el bienestar animal y en la salud pública debido a la calidad de la leche producida.

De acuerdo con el grado de intensidad de la infección y la manifestación de los signos clínicos, la mastitis se puede clasificar como clínica y subclínica.

Mastitis clínica: la infección puede provocar inflamación de uno, varios cuartos o de toda la glándula, aumento de la temperatura en el área afectada, así como enrojecimiento de la zona y dolor, por lo tanto, se observan anormalidades visibles en la ubre y/o en la leche con alteración el color, presencia de sangre, grumos, pus, entre otros.

Mastitis subclínica: tanto la ubre como la leche tienen aspecto normal. Sin embargo, se observa disminución en la producción de leche, conteo elevado de células somáticas y contenido de microorganismos en leche.

Métodos de detección de la mastitis bovina

Diagnóstico de MASTITIS CLÍNICAS

Mientras se prepara la ubre para comenzar con el ordeño, se examinan los primeros chorros de leche. Este proceso comúnmente se denomina despunte y permite la detección de leche clínicamente anormal, que presenta alteraciones en la coloración, grumos, flóculos y aspecto “aguachento”. En las salas de ordeño, donde el piso se puede enjuagar fácilmente con agua, estos chorros pueden observarse directamente sobre el piso de concreto o en el drenaje ubicado debajo del animal. Los grumos y flóculos que se observan en la leche anormal están compuestos por células somáticas, fibrina y otros componentes de la sangre que se encuentran en el cuarto afectado para combatir la infección.

El diagnóstico presuntivo de este tipo de mastitis se realiza mediante la observación de los signos clínicos, confirmando el diagnóstico mediante el aislamiento y la identificación del patógeno involucrado.

PRUEBAS FÍSICAS

Estas pruebas sólo son útiles en casos de mastitis clínicas y no detectan mastitis subclínicas.

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Prueba del paño negro

Se realiza durante la preparación de la vaca para el ordeñe. Consiste en la detección de grumos en la leche haciendo pasar los primeros chorros a través de una malla negra.

Taza probadora (Strip cup)

Consiste en examinar los primeros chorros de leche de cada ordeñe al hacerlos caer sobre un recipiente de fondo (strip cup). Los coágulos, escamas, hilos, materia fibrosa, secreciones acuosas o color anormal indican alteraciones en la leche.

Referencias. Prueba de Strip cup al pie del animal. Obsérvese la presencia de coágulos.

Paleta negra Esta solamente posee un fondo oscuro por donde se desliza la leche al momento del despunte con el objetivo de evidenciar grumos, cambios de color en la leche y demás alteraciones observables a simple vista.

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Diagnóstico de MASTITIS SUBCLÍNICAS

Los métodos diagnósticos de mastitis subclínicas se basan en la detección de células

somáticas. Se define como células somáticas aquellas células del propio organismo, por tanto las células somáticas son células corporales. Éstas pasan a la leche procedente de la sangre y del tejido glandular. El contenido de células somáticas en la leche nos permite conocer el estado funcional y de salud de la glándula mamaria en período lactante. Debido a su estrecha relación con la composición de la leche, es un criterio de calidad muy importante.

La leche de una ubre sana presenta pocas células somáticas. En este caso se trata de células epiteliales de descamación y células inmunes (neutrófilos polimorfonucleares, granulocitos, macrófagos, linfocitos). Estos dos tipos de células constituyen el conteo de células somáticas (CCS) de la leche que comúnmente es expresada por mililitros. El porcentaje de los diferentes tipos de células somáticas en la leche de las glándulas mamarias sanas es: macrófagos (60%), linfocitos (25%), leucocitos polimorfonucleares (15%), mientras que en la leche de un cuarto infectado aproximadamente el 99 % serán leucocitos y el restante 1% células secretoras que se originan de los tejidos de la ubre.

El CCS es la medición más ampliamente utilizada para supervisar el estado inflamatorio de las glándulas mamarias, y puede ser realizado en la leche de cada cuarto, de vacas o de la producción láctea total del rodeo.

La infección intramamaria es el principal factor causante de cambios en la CCS en la leche. Cuando los microorganismos causantes de mastitis invaden un cuarto de la ubre, el sistema inmune responde con un proceso inflamatorio para combatir a dichos microorganismos causantes de la mastitis.

Referencias. Estructura de la glándula mamaria. Componentes tisulares. Dairy Management and Herd Health Certificate Program (Adapted from G.M. Jones).

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De acuerdo al nivel de precisión en la detección del número de células, los métodos diagnósticos pueden clasificarse en:

Cualitativos Prueba de Whiteside

Semicuantitativos California Mastitis Test Prueba de Wisconsin

Cuantitativos

Método de Breed Fossomatic

Counter Coulter

PRUEBAS QUÍMICAS

Conductividad eléctrica de la leche

La Prueba de Conductividad Eléctrica se ha utilizado como un indicador de la mastitis durante la última década. Se basa en el aumento de conductividad eléctrica de la leche debido a su mayor contenido electrolítico especialmente iones de sodio y de cloro.

Se le encuentra como parte de algunos equipos de ordeño computarizados dentro de las salas de ordeñe, como así también en forma de medidores portátiles, lo que permite el monitoreo individual por cuarto.

El dispositivo utilizado con mayor frecuencia se sostiene con la mano y tiene una “copa” empotrada donde se lanzan los chorros de la leche, proporcionando una lectura digital del resultado de la conductividad eléctrica.

Referencias. Dispositivo para medición de conductividad eléctrica en leche.

Papel indicador de pH

Este método consiste en dejar caer algunas gotas de leche directamente del pezón a un papel indicador de pH. Se consideran leches sospechosas aquellas cuya coloración corresponda a un pH igual o superior a 7.

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Prueba de Whiteside

La mezcla de leche con una solución de NaOH al 4% ocasiona que la leche gelifique formando grumos visibles. Los grumos serán más grandes conforme la leche contenga mayor número de células somáticas. Para hacer más visible la reacción es conveniente usar una placa de acrílico negra que puede tener dibujada 4 cuadros de 3cm x 3cm, uno por cada cuarto. Procedimiento: a) Colocar 5 gotas de leche fría en el centro del cuadrito y agregar 2 gotas de la solución de NaOH al 4%. b) Mezclar vigorosamente, dispersando la leche en el cuadrito por medio de un palillo. Continuar mezclando por alrededor de 20 segundos y dar lectura al resultado. c) Interpretar de acuerdo al siguiente cuadro:

Células somáticas / mL

Negativo 0 – 325.000

Traza 300.000 – 600.000

1+ 600.000 – 1.000.000

2+ 1.000.000 – 2.000.000

3+ más de 2.000,000

PRUEBAS BIOLÓGICAS

California Mastitis Test (CMT)

El California Mastitis Test (CMT) estima el número de células somáticas de la leche y puede realizarse al pie de la vaca para detectar mastitis. Los valores del CMT se relacionan con el número de células somáticas en la leche. El número es alto porque las células somáticas migran de la sangre hacia la leche como respuesta a la infección. Cuanto más severa es la infección, mayor será el número de células somáticas.

Cuando el mismo supera las 200.000/mL, estamos en presencia de condiciones anormales en la ubre. El número de células somáticas en la leche tiende a crecer durante el ordeño y permanece alto durante varias horas. Por eso, para obtener resultados confiables, el CMT debe realizarse justo antes del ordeño, pero después de la estimulación y el despunte.

El reactivo del CMT es un detergente que reacciona con el material nuclear de las células somáticas formando un gel. A mayor presencia de células se libera una mayor concentración de ADN, por lo tanto mayor será la formación del gel, traduciéndose en nuestra lectura e interpretación del resultado como el grado más elevado de inflamación. Es decir,

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permite determinar la respuesta inflamatoria con base en la viscosidad del gel que se forma al mezclar el reactivo (púrpura de bromocresol) con la leche, permitiendo evaluar cada cuarto independientemente. Esta reacción se clasifica en 0, T (Trazas), 1, 2, ó 3 dependiendo de la cantidad de gel formado. Muchos productores prefieren utilizar el sistema simplificado de: negativo para ausencia o trazas de gel, sospechoso para algo de formación de gel y positivo para gelificación marcada.

Escala de CMT

Rango relativo del nivel de células somáticas (cs/mL)

Negativo <200.000

Trazas 150.000 - 500.000

1 400.000 - 1.500.000

2 800.000 - 5.000.000

3 >5.000.000

Las investigaciones han demostrado que las reacciones del CMT se correlacionan bien

con el promedio del número de células en la leche. El CMT es un método de diagnóstico que posee una sensibilidad del 97% y una

especificidad del 93%. Es valioso para detectar infecciones subclínicas que, de no realizarse, podrían pasar por desapercibidas hasta alcanzar un estado más avanzado o clínico. Sin embargo, el CMT no señala qué vacas deben ser tratadas.

Pasos a seguir para la realización de la Prueba de California para Mastitis:

1. Se desecha la leche del pre-ordeño. 2. Se ordeñan uno o dos chorros de leche de cada cuarto en cada una de las placas de la paleta. 3. Se inclina la paleta de modo que se desecha la mayor parte de esta leche. 4. Se añade a la leche un volumen igual de reactivo. 5. Se mezcla el reactivo y se examina en cuanto a la presencia de una reacción de gelificación. Antes de continuar con la vaca siguiente se debe enjuagar la placa. Referencias. Reactivo de CMT y reacciones positivas a la prueba.

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Prueba de Wisconsin para Mastitis (WMT)

La Prueba de Wisconsin para mastitis (WMT), fue diseñada para el uso en el laboratorio, y es utilizada para estimar el contenido de células somáticas de muestras de leche fresca mezclada o leche de tanques de enfriamiento, así como para muestreo de vacas individuales. Se utiliza una solución similar a la que se emplea con la prueba de California (CMT), pero en contraste con esta última, los resultados se miden cuantitativamente dependiendo de la viscosidad, no cualitativamente o de estimarla como en el CMT.

La técnica consiste en utilizar un tubo graduado en milímetros en donde se depositan 2 mL de leche y una mezcla de 2 mL de reactivo para CMT con agua destilada (1:1) ambas a temperatura ambiente. Enseguida se agita durante 10 segundos, horizontalmente y de izquierda a derecha. Se deja reposar 10 segundos y posteriormente se invierten los tubos durante otros 10 segundos.

Una vez transcurrido el tiempo, se procede a realizar la lectura en el tubo por debajo de la espuma que se forma. Los resultados se relacionan con la escala graduada en mililitros del tubo y su valor de células somáticas, empleando para su interpretación una tabla específica para la prueba.

Referencias. Procedimiento WMT para el diagnóstico de la mastitis subclínica.

Método de Prescott - Breed

El recuento microscópico directo se realiza comúnmente sobre una muestra de leche.

Para obtener el perfil de un rodeo debemos considerar una serie de muestras con intervalos de 15 o 30 días.

Se hacen dos extendidos sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. Se trabaja con 0,01 mL de leche que extendemos sobre una superficie de 1cm2. Se seca, se desengrasa, se colorea y se hace el recuento con objetivo de inmersión (100 X). De cada uno de los dos

3ml leche + 3ml de reactivo,

dejar reposar 15 segundos Agitación durante 10

segundos

Voltear durante 15 segundos Lectura

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extendidos de 1 cm2 en un portaobjetos, se cuentan entre 20 y 50 campos (la mitad en forma horizontal y la otra mitad en forma vertical). Por lo tanto de cada muestra de leche contamos entre 40 y 100 campos microscópicos.

El total de las células somáticas contadas se dividen por el número de campos microscópicos contados para obtener el promedio de células somáticas por campo. Ese promedio se multiplica por el factor microscópico y así obtenemos el número de células somáticas por ml de leche.

Como reactivos se pueden utilizar tanto la solución Breed como la solución alcohólica de azul de metileno.

Referencias. Método de Breed. Observación microscópica. Con flechas se indica células somáticas y bacterias.

Método Somaticell

Es un método que puede ser utilizado para analizar la leche proveniente de una o muchas vacas. En el caso de las muestras individuales de leche, se determina la probablidad de la presencia de mastitis Se utiliza un kit con un procedimiento similar al de la prueba de WMT.

Referencias. Kit Somaticell.

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MÉTODOS DE CONTEO ELECTRÓNICO CELULAR

Los métodos electrónicos de recuentos tienen en la actualidad una aplicación universal,

sobre todo en usinas lácteas, laboratorios de control lechero o dedicados al diagnóstico o investigación de la mastitis, utilizándose el Bactoscan, Fossomatic (Foss Electric, Dinamarca) y el Counter Coulter (Coulter, Inglaterra). Referencias. Bactoscan, Fossomatic y Counter Coulter.

Método fluoro-opto-electrónico (Fossomatic) y Counter Coulter

Estos dos aparatos poseen alta correlación con la microscopia óptica, por lo que proporcionan una medida segura en el recuento de células somáticas. Sin embargo, se pueden presentar variaciones en el recuento en las mismas muestras cuando se realizan con los dos aparatos debido a la diferencia de operación de cada uno de ellos.

El Fossomatic basa su cálculo en la tinción fluorométrica del material nuclear, mientras que el Counter Coulter cuenta el número de impulsos eléctricos resultantes de las partículas que pasan entre dos electrodos. Es decir, cuenta partículas de un diámetro determinado, que para el caso serían las células, pero en el rango de recuento entrarían otras partículas, aumentando ligeramente el valor en comparación con el Fossomatic.

El Fossomatic es un contador específico de ADN basado en un principio óptico de fluorescencia. Debido a que el bromuro de etidio penetra en la célula y forma un complejo fluorescente con el ADN nuclear, cada célula produce un pulso eléctrico que se amplifica y se registra.

En los últimos años se han desarrollado equipos portátiles que funcionan a batería y

posee un medidor óptico de células somáticas de la leche. Los equipos utilizan casettes que se cargan con cantidades pequeñas de leche. Ya dentro de éstos, la leche se mezcla con reactivos que llegan al núcleo de las células somáticas, lo cual permite su conteo, mediante un sensor de fluorescencia, traduciéndose en el número de células somáticas en leche, el cual aparece rápidamente en la pantalla del equipo.

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PRUEBAS BACTERIOLÓGICAS PARA DETERMINACIÓN DEL AGENTE CAUSAL

Toma de muestra para cultivo y antibiograma En el laboratorio

Los cultivos en laboratorio son necesarios para identificar los organismos específicos que se encuentran involucrados en un caso clínico de mastitis. La fidelidad de los resultados de laboratorio depende de los cuidados sanitarios que se tengan durante la toma de muestra y su manipulación posterior.

Materiales necesarios para la toma de muestra • Tubos estériles de 5 a 15 ml de capacidad. • Alcohol al 70%. • Algodón embebido en alcohol al 70% dentro de un recipiente hermético. • Toallas de papel. ¿Cómo tomar las muestras?

Lavar y secar la ubre y los pezones si tienen barro. Descartar los primeros chorros de leche y desinfectar los pezones con algodón

embebido en alcohol al 70%. Recolectar las muestras en tubos estériles.

¿Cómo se envían las muestras?

Refrigeradas y rotuladas. En el tambo

Una práctica que algunos establecimientos lecheros han implementado en los últimos años, es realizar un cultivo rápido a partir de muestras de leche de vacas con mastitis clínicas.

La metodología para la toma de muestra es igual a la descripta en el ítem anterior. Las muestras obtenidas se siembran con hisopo en bi-placas o tri-placas, se incuban a

37 °C y el resultado se obtiene en 24 h. Las bi-placas están divididas en dos partes y poseen en un lado agar Factor y del otro agar Mac Conkey. A las tri-placas, se les agrega una tercera división para el agar TKT Modificado. En cada medio de cultivo crecen distintos patógenos, como se indica en las fotografías.

Esta metodología se ha desarrollado con el objetivo de administrar antibióticos sólo a aquellas vacas cuyas muestras demuestren crecimiento de microorganismos Gram (+) o se encuentren contaminadas. Las vacas cuyas muestras indiquen crecimiento de microorganismos Gram (–), no deben ser tratadas.

RECORDAMOS que esta técnica NO reemplaza el cultivo, asilamiento e identificación en un laboratorio especializado, ya que no podemos determinar el género y la especie del patógeno actuante, menos aún determinar la sensibilidad antibiótica de dicho agente. SOLO nos orienta al momento de decidir si tratar o no a la vaca, disminuyendo gastos en antibióticos y resistencias a los mismos por su uso indiscriminado.

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BI-PLACAS

Placa 1. Crecimiento en medio Factor con

crecimiento de Gram (+)

Placa 2. Crecimiento en MacConkey con

crecimiento de Gram (-)

TRI-PLACAS

Placa 3. Crecimiento en medio Factor con

crecimiento de Gram (+)

Placa 4.Crecimiento en medio Factor y TKT

Modificado con crecimiento de Gram (-)

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ACTIVIDAD PARA COMPLETAR 1) Para la prueba de CMT indique en el siguiente esquema qué fue lo que observó en cada uno de los pocillos y explique el fundamento de la prueba y su interpretación.