Artículo Arrabidae chica

UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

CENSALUD

INFORME FINAL

Utilización de extracto Arrabidaea chica (Mashashte) para la identificación de estructuras

morfológicas de microorganismos en Microbiología Médica. Mayo 2004-2006.

Dr. Msp Antonio Vásquez Hidalgo1

www.redisal.org.sv

Fig 1. Hoja y flor de Arrabidae chica.

1 La Investigación ha sido financiada con fondos de la Universidad de El Salvador. Centro América.

Estudio científico de la Planta Natural 2

Resumen

Objetivos del estu

dio: Encontrar propiedades de la Planta Natural Arrabidaea chica para la

identificación de estructuras morfológicas de microorganismos en Microbiología Médica.

Metodología: Se procedió en varias fases, la primera fase: preparación de microorganismos,

como: Parásitos, Hongos y Bacterias, entre ellos: 1. Protozoos Intestinales: Quistes y Trofozoitos

de Amebas, Giardia lamblia, Entamoeba coli, Trichuris trichiura; Strongyloides stercoralis2.

Micosis: M. canis, M. gypseum , 3. Bacterias: Escherichia coli, S. aureus, S. Epidermidis. La

segunda fase: preparación del colorante y la tercera fase: hacer las preparaciones microscópicas

con método de control como: Lugol en parásitos, Lactonefol azul algodón en micosis y Gram en

bacterias. Se prepararon 50 muestras de cada género y especie y 100 láminas de control. Relación

1:2.

Resultados: El extracto natural utilizado en pruebas in Vitro de parásitos su rendimiento es igual al utilizado con las prueba tradicionales como el lugol. Su preparación es factible y puede utilizarse a un bajo costo.. Tiene una Eficacia de 98 %, ya que mostró que tanto el grupo experimental como el control identificaron de forma estadísticamente significativa las estructuras morfológicas. Sin embargo no hubo diferencias en la eficacia entre el grupo experimental y el control P < 5.00. En el caso Pruebas in Vitro de hongos que tanto el grupo experimental como el control hay diferencias estadísticamente significativas, el grupo control identifica las estructuras morfológicas coloreadas sin dificultad que el grupo experimental P=0.20. En el caso pruebas in vitrio de bacterias no hay interacción, por lo que tanto el grupo experimental como el control hay diferencias estadísticas significativas entre los dos grupos, se concluye que el grupo control diferencia las bacterias Gram negativas de las Gram positivas que el grupo experimental, observando que las pruebas tradicionales son mejores que la del grupo experimental. P=0.02.

Conclusión: La Planta Natural puede ser utilizada como tinción de estructuras morfológicas de

parásitos, tiene igual de eficacia que los preparados comerciales con lugol.

.

Palabras clave: Arrabidaea chica, microorganismos, tinción.


INTRODUCCION

D

urante la colonia la planta natural conocida como Mashashte era utilizada por los

indígenas para colorear fibras y objetos artesanales de color rojo a negro.

La família Bignoniaceae está constituida por 113 géneros y 800 especies de plantas arbustivas,

entre ellas Arrabidaea chica.

En la actualidad esta planta no es considerada como un rubro nacional, así como la de encontrar

grandes plantaciones fue desapareciendo gradualmente, a excepción de la zona norte del país se

cultiva parcialmente. Sin embargo en Panamá es muy utilizada con grandes extensiones de

plantación por los indígenas del país como colorante.

La importancia en utilizar los extractos de Arrabidaea chica consiste en bajar los costos, debido a

que al preparar el colorante se necesita menor cantidad de reactivos que los colorantes

tradicionales ya que estos son de mayor costo como lugol, lactofenol y Gram, al comparar los

reactivos entre la muestra a utilizar y el producto tradicional, se diferencian en: para parasitos el

lugol tiene componentes como yodo y yoduro de potasio al 1 %; para bacterias en el caso de Gram

se compone de cristal violeta, lugol para Gram, alcohol acetona y safranina; y para hongos en el

caso lactofenol azul algodón tiene cristal fenol, jarabe o acido láctico, colorante azul de algodón,

glicerina y agua destilada. En el caso de la preparación natural se usa el colorante de la planta,


agua destilada y dilución con reactivo X ya que permite la destrucción de materia orgánica. La

preparación de la planta natural se utilizan menos reactivos que los preparados convencionales.

Con la preparación de las cepas, se identifica las siguientes estructuras morfológicas en general:

Parásitos: la morfología, blastomeras, núcleos, forma de la pared, membrana, si es quiste o

trofozoito; en el caso de hongos: se busca morfología, hifas, conidias; en el caso de bacterias, se

busca: pared, morfología y reacción al Gram.

En general la planta natural Arrabidaea chica tiene otros sinónimos, entre ellos: Adenocalymma

portoricensis A. Stahl, Arrabidaea acutifolia, Arrabidaea cuprea, Arrabidaea larensis, Arrabidaea

rosea, Bignonia chica., Bignonia cuprea, Bignonia erubescens, Bignonia triphylla., Lundia chica,

Temnocydia carajura , Vasconcellia acutifolia. Nombres populares: carajurú, crajurú, chica, china,

cipó-pau, coá-piranga, cuica, guajurú, guajuru-piranga, guarajuru, oajuru, oajuru-piranga, piranga,

parirí, paripari. Constituyentes químicos: ácido anísico, alcalóides, bixina, carajurina, carajurone

(pigmentos flavônicos), cianocobalamina, cumarinas, 3-deoxiantociianidina, ferro assimilável,

flavonóides, genipina, pseudoindicanas, quinonas, saponinas, taninos, triterpenos. Propiedades

medicinales: adstringente, afrodisíaca, antianemica, antidiabética, antidiarréica, antidisentérica,

antileucemica, antiinflamatoria, cicatrizante, desinfectante, emoliente, expectorante, fortificante.

Indicaciones: afecciones de la piel, anemia, cólicos intestinales, conjuntivitis, diarrea,

enterocolitis, heridas, hemorragias, inflamación uterina, icterícia, leucemia. Parte utilizada: hojas,

flores.

Descripción de la planta; tiene hojas opuestas, compuestas; inflorescencia en panículos terminales

de color violáceo; fruto, una cápsula linear, aguda, achatada, con dos valvas;. De las hojas se


extrae colorante. Información etnobotánica y etnomédica. Las hojas en decocción producen una

pintura rojiza que tiene muchas aplicaciones como colorante para los diseños de sus vestidos y de

su pintura de piel.

Objetivos de la investigación.

GENERAL:

Determinar las propiedades naturales de la Planta Natural Arrabidaea chica ( Mashashte)

como método de tinción para estructuras morfológicas de microorganismos en microbiología

médica.

Objetivos ESPECIFICOS:

1. Realizar Pruebas in Vitro para demostrar coloración de las estructuras.

2. Determinar la concentración optima para tinción.

Hipótesis.

Hipótesis Nula: No existe eficacia de la Planta natural como tinción natural para estructuras

morfológicas en Pruebas in Vitro.

Hipótesis alternativa: Existe eficacia de la Planta natural como tinción natural para estructuras

morfológicas en Pruebas in Vitro


Diseño Metodológico.

Tipo de estudio. Se utilizó un diseño experimental, con un nivel de confianza del 95 % y un error

de estimación del 0.05%. Valor alfa de 0.05. Muestra de 50 láminas para parásitos, 50 en bacterias

y 50 en hongos, controles 100 por cada muestra. Relación 1:2

Población de estudio.

En el estudio se utilizó una muestra no aleatoria de cepas puras, entre ellas: 1. Protozoos

Intestinales: Quistes y Trofozoitos de Amebas, Giardia lamblia, Entamoeba coli, Trichuris

trichiura; Strongyloides stercoralis 2. Micosis: M. canis, M. gypseum,3. Bacterias: Escherichia

coli , S. aureus, S. Epidermidis, de los cuales son teñidos con el colorante natural .

Variables de estudio.

1. Plantas natural: Arrabidae chica

2. Cepas de microorganismos en microbiología médica.

Área de estudio.

Las pruebas se realizaron en CENSALUD (Centro de Investigaciones en Salud) y

laboratorios de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de El Salvador.

Selección de la muestra.

Se utilizó un muestreo no aleatorio, para determinar la muestra de estudio, así por ejemplo

entre los criterios de inclusión, se tienen: 1. cepas puras de microorganismos, 2. Planta natural

sea Arrabidaea chica 3. No contaminación de las muestras y 5. Exista método de comparación

entre la muestra y grupo control.


Entre los criterios de exclusión, están: 1. contaminación de otros géneros y especies 2.

Planta Natural sea otra, 3. Mal utilización de la técnica de laboratorio y 4. Control sea diferente al

control., 5. Mal control de calidad.

Preparación de frotis.

En el caso de una preparación de una muestra heces examen directo al fresco de heces, se

procedió así: se colocó una gota de lugol al lado izquierdo y una gota del preparado natural en lado

derecho, se diluye la gota con la mezcla de heces, se cubre las preparaciones con laminilla, se

busca estructuras morfológicas con 49 X y 100 X. ( 2 controles por cada medio con Quistes y

Trofozoitos de Amebas, Giardia lamblia, Entamoeba coli, Trichuris trichiura; Strongyloides

stercoralis).

En el caso de una preparación de una muestra de hongos, se procedió así: en una lamina de 3 x 1

limpias y desengrasadas, se coloca una gota de lactofenol azul algodón al lado izquierdo y una

gota del preparado natural en el lado derecho, con el asa estéril se toma un fragmento pequeño de

la colonia, se deposita sobre la gota del preparado natural y otra en el preparado tradicional, se

esteriliza la aguja de disección y se desmenuza con el asa en L, luego se cubre con una laminilla,

se examina con 40 X. ( 2 controles por cada medio con M. canis, M. gypseum)

En el caso de una preparación de una muestra de bacterias, se procedió así: se esteriliza el asa

bacteriológica, se toma una asada de la muestra en medio sólido, se coloca una gota de solución

salina 0.85 % estéril en la lamina, se mezcla ambos, se homogeniza la solución, se esteriliza el asa

y se coloca en su lugar, se espera a que se seque el frotis, luego se colorea con la técnica de Gram


y con el preparado del colorante natural. (2 controles por cada frotis del medio.). En la coloración

simple, se toma una asada del medio sólido de la placa, se coloca una gota al lado izquierdo de la

lamina de azul de metileno y una gota del preparado natural en el lado derecho, se mezcla y se

espera a que se seque, se observa a 100 X. (2 controles por cada frotis del medio con Escherichia

coli , S. aureus, S. Epidermidis)

La preparación del colorante, consistió en: De las hoja color marrón ( se descartan la de color

chocolate ) se machaca con mortero, se deja reposar un día antes en agua destilada, luego se

prepara 100 gramos de hoja seca, se diluye en reactivo x para precipitar el colorante , luego se

mezcla en balón de reflujo, se calienta por una hora, se extrae colorante por filtración y se hace

una dilución de 1:10 para colorear estructuras. La planta tiene bixina en bajas concentraciones por

lo que se aumenta la concentración dando un color rojo-amarillo.

Análisis de la Información.

Se utilizó Método Inferencial, Tablas de contingencia 2x2 .Se utilizó procesador de texto

en los software de Office 2000, Epidat 2, Excel entre otros.

Control de sesgos

Entre los principales sesgos a considerar fueron: 1. Selección inadecuada de la planta

natural, su control será por estudio fitoquímico y bromatológico; 2. preparación técnica

inadecuada, su control se hará por método estandarizado de laboratorio o por grupo control; 3.

Inadecuada selección de cepas puras, su control será por clasificación taxonómica; 4.

concentración inadecuada del extracto, su control se hará por dosis respuesta letal. 5. Sesgo de

información, su control se hará por validez y confiabilidad. 6. Sesgo del instrumentista al usar un


diseño de modelo mal elaborado, su control se hará por análisis de resultados verificando de nuevo

la técnica 7. Error de análisis, su control se hará por verificación de un experto.

Consideraciones éticas.

No se utilizaron o manipularon a sujetos de investigación, debido a que se utilizaron

pruebas in Vitro. El proceso y manipulación de las muestras se hizo de acuerdo a las normas

estandarizadas de bioseguridad de laboratorio.

Procedimiento metodológico.

En el estudio se procedió en tres fases: PRIMERA FASE: Análisis fitoquímico de la

planta natural, así como estudio bromatológico. Preparación del colorante, según pH. SEGUNDA

FASE: Preparación muestras de cepas en los laboratorios de microbiología de la Facultad de

Medicina sobre los microorganismos a utilizar. TERCERA FASE: preparaciones microscópicas

con el método de control que fue para el caso de protozoos Lugol, en el caso de hongos Lactofenol

azul algodón, en el caso de bacterias coloración de Gram. De estas 50 láminas para parásitos, 50

láminas para bacterias y 50 laminas para hongos. más 100 laminas de control con los reactivos

estandarizados según especie.

Resultados


Las propiedades encontradas en la utilización de la planta natural para la tinción de parásitos,

hongos y bacterias, se tienen los siguientes resultados según el cuadro comparativo No 1.

Cuadro 1 DIFERENCIAS ENTRE EL METODO NATURAL Y EL METODO TRADICIONAL

METODO NATURAL METODO TRADICIONAL

Trichuris trichiura Hymenolepis nana 40 X 100 X

Strengilodes stercolaris Hymenolepis diminuta

40 X 40 X

Entameba histolytica Entamoeba coli

40 X 100 X

Giardia lamblia Necator sp 40 X

40 X-100 X

100 X Staphylococcus aureus 100X NOTA: LAS FOTOS HAN SIDO AMPLIADAS HASTA 10 VECES


En el cuadro 2 se observa por diagnóstico parasitológico, bacteriológico las diferencias entre los

dos preparados:

Cuadro 2 DIFERENCIAS ENTRE EL METODO NATURAL Y EL METODO TRADICIONAL

METODO NATURAL METODO TRADICIONAL Se observan los tapones mucosos en los extremos Se observa la membrana.

Se observa los filamentos Se observa los pares de ganchos Es pequena la forma Se ve edematizado

Se observan los tapones mucosos en los extremos. Se observa la membrana

Se observa los filamentos Se observa los pares de ganchos Es pequena la forma

Trichuris trichiura

Hymenolepis nana 40 X

Trichuris trichiura

Hymenolepis nana 40 X

Se observa la larva No se observan los filamentos Se observan los pares de ganchos Es grande su forma Se observa edematizado

Se observa la larva No se observan los filamentos Se observan los pares de ganchos Es grande su forma

Strengilodes stercolaris 40 X

Hymenolepis diminuta Strengilodes stercolaris 40 X

Hymenolepis diminuta

-Se observa membrana quistica redonda Se observan los núcleos No se define las barras cromatoidales Cariosoma central Cromatina periferica regular No se observa glucogeno.

Se observa membrana quistica Se observa el núcleo pequeño No hay cuerpos cromatoidales Vacuola difusa grande

-Se observa membrana quistica redonda Se observan los núcleos Se define las barras cromatoidales Cariosoma excentrico Cromatina periferica irregular Se observa glucogeno.

Se observa membrana quistica Se observa el núcleo pequeño No hay cuerpos cromatoidales Vacuola grande compacta

Entameba histolytica (Quiste)

Entamoeba coli (Quiste)

40 X

Entameba histolytica (Quiste)

Entamoeba coli 40 X

Se observa membrana quistica Cariosoma grande, no se observa axonema Se observa núcleo No se define cuerpos mediales

Se observan 4 blastomeras Es traslucida extremo Se ve membrana vitelina.

Se observa membrana quistica Cariosoma grande, se ve axonema, cuerpos mediales. Se observa núcleo se define cuerpos mediales

Se observan 4 blastomeras Es traslucida extremo Membrana vitelina

Giardia lamblia (Quiste)

Uncinaria sp 40 X

Giardia lamblia

Uncianaria sp 40 X

Se observan cocos Color marron amarillo

Se observan cocos Color azul

Staphylococcus aureus 100X Staphylococcus aureus 100X


Entre las pruebas realizadas in vitrio de la planta natural, se tienen los siguientes resultados:

Tabla de contingencia No 1 Resultado Pruebas in Vitro de la planta Natural en Parásitos versus Método Tradicional

Lugol. 2005

Prueba Tradicional: Lugol + - Prueba de

estudio

+

49 1

- 1 99

Sensibilidad 98, Especificidad 0.99.. Chi 2 corrección de Yates 136,80 valor de P < 5.00

Tabla de Contingencia No 2 Resultado Pruebas in Vitro de la planta natural en Hongos versus Método tradicional

Lactofenol . 2005

Prueba Tradicional: Lactofenol + - Prueba de

estudio

+

3 1

- 47 99

Sensibilidad 0.06, Especificidad 0.99. Chi 2 corrección de Yates 1,57 valor de P= 0.20

Tabla de Contingencia No 3 Resultado Pruebas in Vitro de la planta natural en Bacterias versus método tradicional

Gram. 2005

Prueba Tradicional: Gram + - Prueba de

estudio

+

5 1

- 45 99

Sensibilidad 0.10, Especificidad 0.99. Chi 2 corrección de Yates 4,88 valor de P =0.02


Grafico 1. Pruebas in vitrio de la planta natural versus prueba tradicional lugol.

casos

casoscontroles

controles

020406080100120

1 2casos controles

En el gráfico 1. Hay interacción o asociación entre los parásitos y los controles en pruebas

naturales y pruebas tradicionales con lugol.

Grafico 2. Pruebas in vitro de la planta natural versus prueba tradicional

lactofenol.2005

1

controles

controles

casos; 20

20

40

60

80

100

120

1 2casos controles

En el gráfico 2. No existe interacción entre hongos y los controles en pruebas naturales y las

pruebas tradicionales con lactofenol azul algodón.

Grafico 3. Pruebas in vitro de la planta natural versus pruebas tradicionales

Gram.2005

casos casos

controles

controles

0

50

100

150

1 2casos controles

En el gráfico 3 no hay interacción entre las bacterias y los controles en las pruebas de la planta

natural y las pruebas tradicionales al Gram.


Discusión

La planta por su naturaleza posee un color rojo marrón, por lo que al momento de su preparación y

a diferente concentración del extracto puede alterar su color variando de un color marrón o rojo

tenue a café. Es importante en el momento de la recolección las hojas en su estado seco, si son de

color chocolate no se extraerá ningún colorante inactivando su principio activo. Al momento no se

tiene conocimiento de que la planta natural sea utilizada como reactivo, tiene otras propiedades

sobre todo culturales y medicinales.

Constituyentes químicos: triterpenos, bixina, alcalóides, carajurina, carajurone, pigmentos

flavônicos, cianocobalamina, cumarinas, 3-deoxiantociianidina, saponinas, flavonóides, ácido

anísico, genipina, quinonas, taninos.

FUENTE: Patrícia Mendonça Pauletti e Vanderlan da Silva Bolzani* Instituto de Química, Universidad Estadual Paulista, CP 355, 14801-970 Araraquara - SP


Fig. 2 Hoja Arrabidae chica ( hoja verde) Fig.3 Hoja Arrabidae chica ( hoja seca)

Las pruebas in Vitro muestran que la planta al ser utilizada en parásitos , los resultados dan una

sensibilidad de 98.0, por lo tanto el 98 % de los frotis coloreados con la planta natural se identifico

la morfología de parásitos y que un 2 % no se identificó la coloración de tinción en las estructuras.

Se observa además que el reactivo X07 destruye la materia orgánica aislando al parasito en la

preparación, por lo que la búsqueda en la lámina del parasito resulta una ventaja para su

identificación. Chi 2 no hay diferencias significativas y no son debidas al azar.

Es necesario denotar que en algunos parásitos como la H. nana e H. diminuta la preparación hace

edematizar o “Hinchar” las estructuras internas, por lo que el parásito se ve mas grande de lo

normal, el resto de parásitos no se observa tal fenómeno. En el caso de trofozoitos se dificulta su

identificación porque son muy lábiles es posible el pH esta influyendo en particular, no así en los

quistes que son mas resistentes al reactivo.

Fig.2 Hymenolepis nana


En el estudio se encontró que los protozoos intestinales, como: Entamoeba histolytica,, Giardia

lamblia, Entamoeba coli, Trichuris trichuria, Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta, pueden

identificarse sus estructuras morfológicas de igual forma que los coloreados con coloración

tradicional (lugol). No se hicieron pruebas en protozoos sanguíneos por la dificultad de

recolección de la muestra.

En el análisis del grafico 1 mostró que tanto el grupo experimental como el control identificaron

de forma estadísticamente significativa la estructuras morfológicas. Sin embargo no hubo

diferencias en la eficacia entre el grupo experimental y el control. Concluyendo, es tan efectivo la

prueba in Vitro como el efecto de la prueba tradicional.

En el caso de pruebas en Hongos su sensibilidad fue de 0.06, por lo tanto el 6 % de los frotis

coloreados con la planta natural se identifico la morfología de hongos y en un 94 % no se

evidenció o identifico la coloración de tinción, solamente se observa la estructura de los hongos

sin colorear. Chi 2 hay diferencias significativas.

En el análisis de la grafica 2 no hay interacción, que tanto el grupo experimental como el control

hay diferencias estadísticamente significativas, el grupo control identifica las estructuras

morfológicas coloreadas sin dificultad que el grupo experimental P=0.20.

En el caso de pruebas en bacterias su sensibilidad fue de 0.10, por lo tanto el 10 % de los frotis

coloreados con la planta natural se identificó su morfología de bacterias y en un 90 % no se

identifico o evidencio la coloración de tinción de estructuras morfológicas, así como clasificación


taxonómica de bacterias Gram. negativas de las bacterias Gram. positivas, en el estudio se

observan colonias incoloras y algunas de color marrón-amarillo, la tinción resulta tenue.

Fig. 3 Staphylococcus aureus Coloreada con planta natural y bixina

Las bacterias Gram + y Gram – no fijan el colorante, es decir no se colorean como lo hace el

Gram, debido a que el colorante no se fija con una intensidad mayor, tal como se observa en los

frotis, por lo que no se puede utilizar como clasificación taxonómica de bacterias Gram positivas

de Gram negativas. Chi 2 hay diferencias significativas.

En el análisis del grafico 3 no hay interacción, la líneas son paralelas, por lo que tanto el grupo

experimental como el control hay diferencias estadísticas significativas entre los dos grupos, se

concluye que el grupo control diferencia las bacterias Gram negativas de las Gram positivas que el

grupo experimental, observando que las pruebas tradicionales son mejores que la del grupo

experimental. P=0.02.

Conclusión

El extracto natural utilizado en parásitos, su rendimiento es igual al utilizado con las pruebas

tradicionales como el lugol. Su preparación es factible y puede utilizarse a un bajo costo. Tiene

una Eficacia es del 98 %.

Estudio científico de la Planta Natural

18

El extracto natural utilizado en bacterias como diferenciación taxonómica no se puede realizar

porque no diferencia bacterias Gram. positivas de las Gram. negativas.

Bibliografía.

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Salvadoreña: Edit. Universitaria: 1994:

2. Koneman, A. Et all. Diagnostico microbiológico.:edit.Panamericano:1988:

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7. Tsieh Sun. Diagnostic Parasitology. Color Atlas and textbook. Igaku-Shain Medical

Publishers INc. 1a edition. 1988.

8. Patrícia Mendonza Pauletti e Vanderlan da Silva Bolzani Instituto de Química,

Universidad Estadual Paulista, CP 355, 14801-970 Araraquara – SP.

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