8 Vol. XVI, Nº 1, 2004

Los liposomas: usos y perspectivas Manuel González Pérez

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente

IntroducciónLos liposomas son vesículas, cuya constitución

química básica es un tipo de fosfolípido o varios, ycolesterol, integrados en una o más bicapas,encerrando un espacio acuoso central y,ocasionalmente, otros espacios interlaminares. Sobreesta estructura básica se pueden insertar otros lípidos,proteínas, anticuerpos, biomoléculas diversas marcadascon isótopos radiactivos, sustancias fluorescentes,etcétera. Esta versatilidad estructural le permite al

investigador diseñar los liposomas de acuerdo con losobjetivos para los que serán utilizados, como porejemplo, transportar sustancias quimioterapéuticasanticancerígenas hacia órganos específicos, sin queafecten a otros órganos o tejidos corporales.

Los sustratos por encapsular se ubicarán en losespacios acuosos, en la fase lipídica, o adoptarán unaparticipación estructural comprometida en ambasfases, según sea su naturaleza lipofílica, hidrofílica oanfifílica.

Resumen

En este trabajo se abordan los aspectos generales sobre los liposomas. También, se indican losresultados obtenidos en nuestro laboratorio. Los datos que caracterizan a estos liposomas aparecen envarias tablas, mientras que la acción de la peroxidación sobre los lípidos de la membrana liposomal semuestra en las gráficas. En el experimento se utilizaron liposomas MLVs y la inmovilización de lasvitaminas A, E y C en ellos.

Además, los liposomas serán ampliamente utilizados en muchas formas y métodos en el futuro. Alfinal de este reporte, se indican diferentes aplicaciones alternativas.

Palabras clave: liposoma, la tecnología liposomal, MLV.

Abstract

This work outlines a study performed making MLVs liposomes to entrap vitamins A, E and C in orderto reduce the chance of oxidation to a minimum. The general concepts of the liposomes are offered. Thedata which characterize this liposomes are found in some tables whilst the action of the peroxidationprocess on the liposomal membranous lipids is show in the graphs.

The liposomes will be widely used in more modes and methods in the future. Different alternativeuse are indicated in this report at the end.

Key words: liposomes, MLVs, inmovilization, vitamins.

?

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En la actualidad la tecnología liposomal se desarrollafundamentalmente a nivel de laboratorio, aunque yaexisten en el mercado varios productos basados en suaplicación, fundamentalmente, en las áreas de lamedicina y cosmetología.

Consideraciones teóricas

La palabra liposoma se ha formado a partir de dosraíces griegas; la primera se refiere a los cuerposgrasos (lipo) y la segunda a una estructura (soma).Esta etimología traduce exactamente qué son losliposomas, unas vesículas cuya membrana estáformada por una doble capa o bicapa de moléculaslipídicas que incluyen un pequeño volumen de disolventeen el que han sido preparadas. La inclusión de unsoluto en estas estructuras recibe el nombre deencapsulación La elección de un protocolo deencapsulación está determinada por factores talescomo la relación fármaco/lípido, eficacia deencapsulación, capacidad de retención del fármaco,facilidad de preparación, esterilidad y estabilidad delliposoma y del medicamento.

La mayor parte de las técnicas son deencapsulación pasiva, basadas en la capacidad delliposoma de englobar un determinado volumen acuosoy los solutos en él contenidos durante el proceso deformación.

Las moléculas se clasifican en dos categorías: lasque son solubles en disolventes polares, ejemplocloruro de sodio en agua, y las que son solubles endisolventes orgánicos apolares, como las grasas enéter de petróleo. Sin embargo, existen moléculassolubles en ambos tipos de disolventes, nombradasanfifílicas, ejemplo los fosfolípidos y los esfingolípidos;estas moléculas tienen partes lipofílicas, insolubles enagua (hidrófobas), y otras partes hidrofílicas, máscompatibles con el agua que con disolventes orgánicos.

Los jabones o los detergentes son buenos ejemplos,pero como veremos, estos compuestos existen,naturalmente, en los lípidos de las membranasbiológicas. Estas moléculas, llamadas también agentestensoioactivos, están formadas por una cabeza polar(un grupo hidroxilo OH, carboxilo o sulfato), y unalarga cadena apolar formada por una cadenahidrocarbonada.

La cabeza y la cola garantizan, respectivamente,la solubilidad en el agua o en el disolvente orgánico. Ensolución, estas moléculas forman unas estructurasordenadas llamadas miscelas; las cabezas polares delas moléculas constituyen una capa protectora entrela solución acuosa y las colas apolares de las moléculas.Estas moléculas se agrupan hacia el centro de laestructura con el fin de aislarse del contacto del agua.

En las membranas biológicas, las moléculasanfifílicas son fosfolípidos; su cabeza polar posee ungrupo fosfato. No obstante, los fosfolípidos no puedenadoptar fácilmente la estructura micelar clásica de lasmoléculas anfífilicas, un problema considerable esque cada cabeza polar incluye dos cadenas dehidrocarburos muy voluminosas. Por tanto, losfosfolípidos se agrupan en capas biomoleculares. Lascadenas hidrocarbonadas, apuntando unas hacia otras,forman una doble capa aislada del medio acuoso porlas cabezas polares. Este tipo de estructura plana noes estable, y se repliega sobre sí mismo para formarestructuras cerradas más estables, esféricas u ovales;estas estructuras son, precisamente, los liposomas.

En dichos sistemas, los componentes mayoritariosson siempre lípidos polares como la fosfatidilcolinas olecitinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas,etcétera. Esta estructura de bicapa lipídica no esexclusiva de los liposomas, puede encontrarse tambiénen todas las membranas biológicas, y fue descrita porprimera vez por Danielly y Dawson en l935.

Aunque muchos investigadores produjeroninvoluntariamente liposomas, no es hasta principio delos años sesenta, que se llega a descubrir que losliposomas incluían una parte del disolvente, y fueentonces cuando Baghman y sus discípulos estudiaronlos liposomas, demostrando que la dispersión defosfolípidos en un medio acuoso originaba vesículascuyas moléculas de fosfolípidos se acomodan de talmanera que sus cadenas hidrofóbicas de ácidos grasosevitan el contacto con el agua, formando bicapaslipídicas, donde la cabeza polar se orienta hacia laparte externa de cada bicapa, mientras que las cadenasde ácidos grasos se orientan hacia el interior, ydirectamente opuestas entre sí.

En la actualidad, ya se han desarrollado muchastécnicas de obtención de liposomas, las que estánperfectamente establecidas.

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Con ellas, se pueden obtener muchos liposomasdiferentes en cuanto a tamaño, forma, número debicapas lipídicas, volumen interno, etiquetados en lassuperficies, durabilidad de los mismos, permeabilidad,etcétera. Así, diseñando protocolos de trabajo en losque se emplean estas metodologías, se obtienendiversos tipos de liposomas denominados según susnombres en idioma inglés. Los más frecuentementeutilizados en los trabajos de investigación son losMLVs (vesículas multilaminares), los SUVs ( vesículasunilaminares pequeñas) y los LUVs (vesículasunilaminares grandes).

Las técnicas de preparación de liposomas son muyvariadas, e incluyen no sólo diferentes métodos deobtención, sino la correspondiente selección portamaños, clasificándose de la siguiente forma:hidratación del fosfolípido y dispersión simple,sonicación, extrusión, métodos que modifican elproceso de hidratación, congelación-descongelación,prensa de French, fase reversa y ciclos dedeshidratación controlada.

El método de elección depende, en cada caso, deltipo de liposoma que se desea obtener y su tamaño.Influye también el tipo de fosfolípidos que se utilice yla aplicación que se pretende.

El método de hidratación y dispersión simple es unprocedimiento originalmente descrito por Baghman, yconsta de las siguientes etapas: disolución del lípido enun disolvente orgánico, evaporación a presión reducidadel solvente con movimiento rotatorio simultáneo,hasta obtener una película delgada y perfectamenteseca en las paredes del matraz y adición de la faseacuosa y formación del MLV mediante agitación.

Para la obtención de liposomas unilaminares apartir de MLV se pueden emplear los procedimientosde sonicación, de la prensa de French y de la extrusiónsecuencial. El método de sonicación puede realizarsecon sondas o baños ultrasónicos. Este método aportaaltos niveles de energía a la suspensión de lípidos, yes necesario lograr la exposición de MLV a lairradiación ultrasónica, siendo el método másfrecuentemente usado para obtener pequeñasvesículas. La extrusión de membranas liposomales,permite reducir el tamaño de los liposomas, pasandoéstos a través de un filtro de membrana de poros de

tamaño definido. Éstos pueden ser ejecutados conpresiones mucho más bajas (100 psi), que se requierenpara la presión celular, y pueden dar poblaciones en lacual es posible escoger sobre el tamaño límite,dependiendo del poro exacto del filtro particular,usado para inmovilizar solutos lábiles y proteínas.

Existen métodos que modifican el proceso dehidratación para mejorar el por ciento de encapsulación;uno de ellos es la congelación-descongelación.

La técnica de congelación-descongelación consisteen someter una preparación de MLV a sucesivosciclos de congelación en N2 líquido, y descongelaciónen un baño termostatado, formándose los FATMLV(Frozen and Thawed MLV). En este caso se lograuna mayor eficiencia de encapsulación y una menorheterogeneidad de tamaños de partículas, de maneraque el diámetro promedio se desplaza hacia valoresinferiores. Permite, además, incrementar el volumeninterno de los MLV desde 0,5 L/mol fosfolípido, hastaaproximadamente 10 L/mol fosfolípido, si se utiliza lalecitina de huevo, y hasta 15 L/mol si incluye un 10 %de fosfatidilserina en la composición lipídica.

El mecanismo, a través del cual el ciclo decongelación modifica el estado de hidratación dellípido, es desconocido. Existen evidencias que apuntanhacia un efecto de rotura mecánica de la estructuralaminar causada por los cristales de hielo, que daríalugar a la formación de vesículas entre láminas durantela fase de calentamiento. Prensa de French. El métodode French consiste en la inyección de cierto volumende suspensión de MLV en el cilindro de una celda depresión de French y la recuperación de la muestradespués de sucesivos ciclos de extrusión bajo altapresión (20 000 psi). La velocidad de flujo oscila entre20 y 40 min, y se pueden procesar volúmenes entre 30y 40 mL, obteniéndose un rendimiento de 70 % en laproducción de MLVs.

Fase reversa. Los liposomas unilaminares sepueden obtener de sistemas bifásicos agua-solventeorgánico mediante los métodos de inyección y deinversión de fase (REV). El método de inyección sebasa en la formación espontánea de LUV, mediantela inyección de una solución orgánica (éter o etanol)del lípido en un medio acuoso tamponado. En lainyección con etanol ocurre la dispersión de las

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moléculas de fosfolípidos instantáneamente al entraren contacto con el agua. Este procedimiento tiene lasventajas de su extrema simplicidad y su bajo riesgo dedegradación lipídica. Su mayor limitación está en lasolubilidad de los lípidos en etanol y el volumen deetanol que puede introducirse en el medio acuoso, locual limita la cantidad de lípidos que se puedendispersar. Otra desventaja es la dificultad de extraercompletamente las trazas de etanol de las membranasliposomales.

Cuando los lípidos se encuentran disueltos en éter,se inyectan lentamente en una fase acuosa a unatemperatura en la cual el solvente orgánico se evaporadurante el proceso. Con este método, se corre un pocoel riesgo de causar degradaciones oxidativas de loslípidos, y se puede introducir cantidades mayores deestas moléculas. La desventaja es el tiempo necesariopara hacer la preparación liposomal y el cuidadosocontrol para introducir la solución lipídica, requiriéndoseun sistema mecánico para bombear la solución etérea.

El método de la fase reversa ha sido el másampliamente aceptado para la preparación de LUV.Este procedimiento consta básicamente de dos etapas:en la primera se forma la emulsión fase orgánica-faseacuosa (FO/FA) por sonicación de la mezcla agua-éter, en la que se encuentran disueltos soluto y lípido,

respectivamente. En segundo lugar, se procede a laeliminación del éter con formación de un gel estable,ruptura del gel e inversión de la fase mediante vacíoy agitación simultánea.

La encapsulación en MLV tiene como ventajafundamental la capacidad de retención de solutos,debido a su estructura multilaminar. En contrapartida,el pequeño volumen interno de estas preparacionesconduce a rendimientos bajos. Con los MLV sepueden obtener rendimientos de hasta un 38 %; pordeshidratación-rehidratación se alcanza hasta un50 %, y los más recientes rinden valores de hasta un88 % (congelación-descongelación).

Inmovilización de las vitaminasantioxidantesmediante las técnicas liposomales

Tamaño de los liposomas

Se utilizó la técnica de gel exclusión con SephadexG-75, la que permite dar un tamaño homogéneo a losliposomas. Al observar las cifras que aparecen en latabla 1, vemos que los liposomas mantienenaproximadamente el mismo tamaño con independenciadel soluto atrapado.

CONTENIDO

ATRAPADO

DIÁMETRO

(micras )

Vitamina A

Vitamina E

Vitamina C

2,02

2,1

2

TABLA 1. MEDIDAS DEL DIÁMETRO DE LOS LIPOSOMAS

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En la literatura, el rango de los liposomas oscilaentre 25 nm, y aquellos que pueden ser visibles bajola luz del microscopio con un diámetro de 1 000 nm omás igual a las dimensiones de una célula viviente.

Varios autores proponen determinadasdimensiones; por ejemplo, Chávez plantea la siguientedistribución: SUV diámetro 20-50 nm, MLV diámetro400-3 500 nm y LUV diámetro 70-200 nm, mientrasque Saviz y Chantres plantean que los liposomasoscilan los tres (SUV, LUV y MLUV) entre 0,02micrómetro y 3,5 micrómetro. Cada autor propone untamaño de acuerdo con las condiciones de trabajo,pero todos coinciden con que el tamaño de los liposomas,en sentido general, oscila entre pocos micrómetroshasta 10 micrómetros.

Composición química

Los constituyentes químicos determinan algunaspropiedades en los liposomas como fluidez de lamembrana, densidad de carga y permeabilidad.

Los lípidos componentes de la membrana celularson de diferentes clases de moléculas, con un ampliorango de funciones. Permiten un mejor entendimientode la barrera de permeabilidad entre compartimientossubcelulares y la célula y su medio ambiente.

Los lípidos desempeñan un papel importante en laregulación de la actividad de membranas asociadas aenzimas, además de ser almacén de reservas deenergías celulares, como forma de transporte decombustible metabólico y como agente de protecciónde las paredes celulares, y representan el 40 % de lamasa seca total, siendo los más comunes las moléculasde fosfatidilcolinas, conocidas como lecitinas.

Los esteroles son componentes importantes de lasmembranas, y entre ellos el predominante es elcolesterol, el cual se encuentra en una relación molarcon la fosfatidilcolina de 1:1 ó 1:2, dependiendo de laanatomía y la localización celular.

De acuerdo con el objetivo en este trabajo, y porexperiencias previas, la composición química de lasmembranas liposomales preparadas fueron de lecitinay colesterol en el rango de relacion molar 1:1, partiendode soluciones madres de 10 mg/mL para la lecitina yel colesterol, respectivamente, preparadas en unamezcla de cloroformo:metanol (2:1, v:v).

Índices evaluativos de lainmovilización de las vitaminas A, Ey C en los liposomas MLVs

Fueron utilizados los tres índices básicos que seemplean en los estudios de inmovilización debiomoléculas. A continuación se abordan cada uno deellos. Rendimiento de encapsulación

La fracción de vitamina incorporada al liposomacon relación al total añadido y multiplicada por 100,representa el por ciento de encapsulación. Lasvitaminas se utilizaron en las relaciones molares de0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1, respectivamente respecto a lacantidad de fosfatidilcolina. Se realizó la determinaciónespectrofotométrica antes y después de su purificaciónen Sephadex G-75 de las vitaminas A y E, y lavaloración en la vitamina C, midiendo la presencia devitamina en el sobrenadante y en el precipitado.

El cálculo de los valores se realizó mediante laexpresión:

Re dim %( ) ( )( )

n ientodeencapsulación en RE Moles encapsuldos o inmovilizados MEMoles aplicados o total MT

= ⋅ 100

Los resultados son mostrados en la tabla 2. Entodos los casos, el por ciento de encapsulación se

encuentra entre 52 y 65,4 %, valores que concuerdancon los datos de la literatura consultada.

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TABLA 2. VALORES PROMEDIOS DE LOS POR CIENTOS DE RENDIMIENTO DE ENCAPSULACIÓNDE LAS VITAMINAS A, E Y C, RESPECTIVAMENTE, EN LIPOSOMAS MLVS, EN DIFERENTES

RELACIONES MOLARES; SE COMPARA CON LOS LIPOSOMAS SIN VITAMINAS (S)

Relaciones molares

Condición

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

A

58,31 54,10 55,32 57,10 65,40

E

56,20 50,20 52,29 53,29 64,60

C

54,84 56,22 52,00 60,00 61,90

S

0 0 0,01 0 0

Para liposomas del tipo MLV, consideradosliposomas madres, a raíz de los cuales se parte pararealizar otras preparaciones liposomales, se tieneprevisto un por ciento de encapsulación desde un 30a un 60 %, que pueden ser mejorados por las técnicasantes mencionadas (congelación-descongelación,hidratación-rehidratación, etcétera).

En este trabajo, los por cientos de encapsulaciónsobrepasan la cifra de 30, y las vitaminas A y E secolocan en la bicapa lipídica, y la vitamina C en la capaacuosa.

El análisis estadístico demostró, que existendiferencias significativas entre las cantidades desustancias encapsuladas en los diferentes tratamientos,por lo que se decidió realizar el test de Duncan, el cualarrojó que la media muestral de la relación molar 1, essignificativamente diferente del resto, mientras quelas restantes medias muestrales son iguales.

En cuanto a la naturaleza hidrosoluble o liposolublede la vitamina, tampoco se encontró en nuestroexperimento diferencias del por ciento de rendimientode encapsulación, motivado esto, posiblemente, a quetodos los liposomas fueron MLVs, y diseñadosmediante la misma tecnología experimental y, además,con tamaños algo similares, según las medidasrealizadas luego de pasarlos a través de columna deSephadex G-75, lo que uniformiza sus tallas.

Eficiencia de encapsulación liposomas

Otro de los aspectos para tener en cuenta en lasinvestigaciones relacionadas con liposomas, es laeficiencia de atrapamiento. Este parámetro puede sermodificado atendiendo a la tecnología empleada,concentración y composición lipídica, utilizada en laobtención de esas vesículas. El cálculo de este índicese realza mediante la siguiente expresión:

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Por ciento de eficiencia de encapsulación Moles de sustratos encapsuladosMoles de lípidos de fosfolípidos

= ⋅( )

100

La tabla 3 relaciona los valores de eficiencias conlas relaciones molares, observándose que la eficienciacrece a medidas que aumenta la concentración devitamina añadida, logrando un valor máximo de79,01 % y un mínimo de 11,62 %. Este parámetro essimilar al reportado por Schimiddetk, el cual plantea,que los valores de eficiencia están entre 30 y 70 %, porlo que debe existir un compromiso entre lo encapsuladoy la eficiencia de atrapamiento.

El liposoma creado debe permitir un intercambiode la sustancia objeto de estudio con el exterior. Enesto, los enlaces que se hayan establecidos al formar

el liposoma, desempeñan un papel importante. Estosenlaces se consideran débiles cuando cada uno actúapor separado, pero que unidos son los que estabilizanel liposoma, requiriendo determinadas fuerzas para suruptura.

De la tabla 3 se hace evidente, que con el incrementode la relación molar existe un incremento en el porciento de eficiencia, similar en todos los casos, y queen la relación molar 1 alcanza los valores mayores,siendo estos resultados buenos, no así en las relacionesmolares menores. Se escoge la relación molar 1 comola de mayor eficiencia de encapsulación.

Relaciones molares

Condiciones 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

A 13,01 16,0 33,96 43,21 70,20

E 11,62 17,93 33,07 44,70 69,92

C 11,84 16,90 35,12 47,00 79,01

S 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

TABLA 3. VALORES EN % DE LA EFICIENCIA DE ENCAPSULACIÓN DE LOS LIPOSOMAS MLVs ENCINCO RELACIONES MOLARES DE FOSFATIDILCOLINA/COLESTEROL, Y

CON LA ENCAPSULACIÓN DE LAS VITAMINAS A, E Y C. SI INDICA, ADEMÁS, EN AUSENCIA DE VITAMINAS

El por ciento de eficiencia de encapsulación de lavitamina hidrosoluble C, atrapado en los liposomasMLVs, resultó significativamente diferente (p = 0,95)de los por cientos de encapsulación de las vitaminasliposolubles A y E , pero no entre las dos últimas, locual se supone que esté condicionado por las diferenciasde fases, de mayor empaquetamiento en la fase demembrana, que en la fase acuosa liposomal, y no a lassolubilidades en sí de las vitaminas empleadas.

Otro posible factor es el de los volúmenes físicosdiferentes que ocupan estas fases, teóricamenteesperados, la fase acuosa y la fase lipídica. Por últimoes necesario resaltar que las vitaminas A y E poseencaracterísticas estructurales a escala moleculardiferentes. Sin embargo, al no ser la eficiencia deencapsulación estadísticamente diferente, laconformación molecular per se, parece no estarinfluyendo en este porcentaje.

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Las medias de las vitaminas A, E y C son realmente diferentes entre ellas en la relación molar 1 y la deesta relación molar respecto a las demás relaciones molares. Que la relación molar 1 resultó de un mejorcomportamiento respecto a las demás relaciones molares, lo que es evidente cuando observamos gráficamentelos resultados:

EFICIENCIA DE ENCAPSULACION

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0,2 0,4 0,6 0,8 1

RELACI ON M OLA R

% D E EFIC I ENCI A DE ENCAP S ULAC ION

Vit amina A

Vit amina E

Vit amina C

Gráfica 1. Por cientos de eficiencia de encapsulación de las vitaminas A, E y C.

El eje X representa las relaciones molares de laPC/colesterol en orden creciente.

Estabilidad funcional y análisis de lapermeabilidad de los liposomas diseñados

En la caracterización liposomal no basta sólo elpor ciento de encapsulación y la eficiencia deencapsulación, sino que es necesario evaluar, al menos,algún parámetro que caracterice la estabilidad de lapreparación. Esto tiene aún mayor importancia cuandose trata de preparar liposomas de diferentes relacionesmolares.

En el estudio de estabilidad pueden utilizarsediferentes procedimientos, y uno de ellos es medir laliberación de una molécula indicadora encapsulada enla vesícula por almacenamiento en determinadascondiciones. La sustancia escogida en este caso es elcitocromo C, de peso molecular 12 500, y se leeespectrofotométricamente a 410 nm. La liberaciónfue cuantificada durante un período de 21 días,mantenidos a 4 ºC . De las muestras se tomó 1 mL alos 7, 14 y 21 d, y se analizó la presencia de citocromoC. Se observó, que al aumentar el período en díasexiste un mayor por ciento de liberación en cada unade las relaciones molares, teniendo el mayor valor deliberación la relación molar 1.

El citocromo C, se encapsula en la parte hidrofílica.Para poder ser llevado al exterior y detectarse, tieneque atravesar las membranas lipídicas, indicandorompimiento de láminas para liberar su contenido alexterior.

La estabilidad está estrechamente relacionadacon las características de los liposomas, mientras másestables son sus bicapas, menor es la cantidad desustancia que se libera al exterior, excepto por difusión,y está ligada de manera lineal con la temperatura detransición del fosfolípido (lecitina), que en este casoestá entre menos 15 ºC y menos 5 oC. Esta temperaturaes la de transición entre la fase gel ordenada y lalíquido-cristal más desordenada, Analizamos que eneste caso tienen todos las mismas posibilidades, puesla temperatura de almacenaje es de 4 oC, la cual estápor encima de la temperatura de transición (Tc).

En la tabla 4 se indican las cifras correspondientesal ensayo realizado con citocromo C en liposomas concinco relaciones molares de lecitina/colesterol. Elcontenido relativo del colesterol influye en la rigidezde la membrana y en su permeabilidad.

En el caso específico de los liposomas, dado sudestino, es necesario llegar a un equilibrio en el quelibere su contenido, pero que lo haga con una

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dosificación deseada en el órgano o tejido diana.Variando la cantidad y tipos de lípidos constituyentesen su membrana, se logran resultados satisfactoriosen cuanto a estos dos propósitos.

TABLA 4. LIBERACIÓN DE CITOCROMO C EN POR CIENTO DESDE LOS LIPOSOMAS MLVsDURANTE 21 DÍAS. LAS SEIS PRIMERAS COLUMNAS INDICAN LOS VALORES PROMEDIOS

ACUMULADOS, RESPECTIVAMENTE, Y EN LA ÚLTIMA LOS INCREMENTOS PARTICULARES ENCADA SEMANA

Relaciones molares Tiempo

( Días ) Incremento

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Promedio semanal

0

7

14

21

0 0 0 0 0 0 0

12 21,69 18,86 13,19 18,98 16,94 2,42

15,9 30,6 26,35 20,50 31,79 26,23 1,33

21,79 43,05 37,07 37,07 44,66 36,73 1,50

Las gráficas 2 y 3 resaltan aspectos cualitativos dela permeabilidad de los MLVs obtenidos. Así, midenla funcionabilidad de los MLVs, y también es uncriterio sobre la magnitud de la permeabilidad de lamembrana liposomal al citocromo C en el tiempo,independiente de las relaciones molares.

Para fin de los liposomas que se requieren en estetrabajo, hay que lograr que liberen el soluto atrapado.En este caso, por tratarse de vitaminas antioxidantes,cuyos efectos serán sobre los tejidos, especialmentesobre la dermis, es necesario una liberación delcontenido atrapado de forma controlada.

Al finalizar las tres semanas de almacenaje de losMLVs, se había liberado el 36,73 % de su contenido,lo que representa algo más de la tercera parte. Estopermitiría su comercialización al mantener su

El experimentador incide en los siguientes índicesde los liposomas: tamaño, número de láminas, volumeninterno, cantidad de captura, permeabilidad ydireccionabilidad de los mismos.

potencialidad aún a las tres semanas de creados, con2/3 de su contenido inicial, con las posibles variacionesesperadas cuando se trate de vitaminas en lugar delcitocromo C.

Un factor importante en el propósito anteriormenteindicado, y que influye directamente en lascaracterísticas y en la permeabilidad, en especial, delas membranas lipídicas y lipoproteícas, lo constituyenlas cantidades relativas de los fosfolípidos y elcolesterol. Un incremento relativo en el colesterol setraduce en una membrana más fluida y más porosa,mientras que una disminución de este índice resulta locontrario.

Cuando el biotecnólogo diseña un liposoma paraque cumpla su propósito deseado, tiene en sus manosla “herramienta” de poder variar las relaciones molares

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de los constituyentes de las membranas y su naturaleza.Con las relaciones molares ensayadas se encontró uncomportamiento que oscila entre un 30 % y un 45 %de citocromo C liberado, pero con un comportamiento

más estable en la relación molar 1 (es una línea recta).Otro aspecto analizable es el comportamiento de laliberación del soluto atrapado en los períodos detiempo.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 5 10 15 20 25

Dias

% d

e lib

erac

ión Rel. Mol. 0,2

Rel. Mol. 0,4Rel. Mol 0,6Rel. Mol. 0,8Rel. Mol. 1

Gráfica 2. Comparación de la liberación de citocromo C desde 0 a 21 días, a partir de los liposomas MLVs de cincorelaciones molares de la PC/colesterol.

En la gráfica 3 aparece, que en la primera semanase libera un por ciento de citocromo C superior al delas respectivas semanas siguientes.

En las semanas 1, 2 y 3 se liberaron 2,42 %,1,33 % y 1,50 %, respectivamente. Con esta salida delsoluto atrapado, se va equiparando la concentracióndel mismo dentro y fuera del liposoma.

Por los resultados que se indican en esta gráfica,se evalúan las relaciones molares de PC/colesterol deadecuadas, aunque existe una salida mayor del solutoen la primera semana.

Estadísticamente se diferencian del resultado de larelación molar en 0,8 el de los 7, 14 días, y en larelación molar 1. El de la relación molar 0,2 esdiferente del de 0,4 y 0,6. El de la relación molar 0respecto a 0,2 y 0,8.

Oxidación de los fosfolípidos liposomales

Todos los ácidos grasos sufren degradaciónoxidativa a causa del oxígeno atmosférico y laacción catalítica de varios agentes comunes en lossistemas biológicos (Hb, Fe, Zn, radicales libres,etcétera.).

Los ácidos grasos son partes constitutivas delos fosfolípidos, moléculas imprescindibles en lasbiomembranas. Los ácidos grasos insaturados yconjugados son los más proclives a la oxidación,aunque realmente todos se oxidan, incluyendo losinsaturados.

Estos eventos de oxidación de los fosfolípidosmediante la formación de hidroperóxidos yendoperóxidos, son eventos dañinos, ya que afectana la actividad de las membranas.

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PROMEDIO SEMANAL DE CITOCROMO C LIBERADO

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3

SEMANAS

% D

E L

IBE

RA

CIO

N

Gráfica 3. Comparación del promedio de citocromo C liberado en cada semana, independiente una de otra, desde los

liposomas MLVs de relación molar 1 de PC/colesterol.

Los agentes antioxidantes como las vitaminas A,E y C es proteger a las células de estos efectosdañinos. A continuación podemos observar el efectoprotector de estas vitaminas.

En la tabla 5 y el gráfica 4, se muestran losresultados de un experimento de 120 días de duracióncon las vitaminas A, E , C, y sin vitaminas en liposomasPC/colesterol y relación molar 1.

TABLA 5. RESULTADOS DE LA PEROXIDACIÓN DE LOS FOSFOLÍPIDOS DE LOS LIPOSOMAS (PC)HASTA LOS 120 DÍAS DE ALMACENAJE EN REFRIGERACIÓN A 4 ºC, EN PRESENCIA Y AUSENCIA

DE VITAMINAS A, E Y C, RESPECTIVAMENTE

Tiempo (Días)

Condición 0 3 12 21 72 120

A 1,99

2,04

2,48

2,49

3,24

3,94

E 2,03 2,17 2,40 2,52 3,20 3,80

C 2,02 2,31 2,78 2,93 3,66 4,05

Sinvitaminas 1,99 2,61 2,86 3,09 4,23 4,96

Con vitaminas 2,02 2,17 2,55 2,65 3,36 3,93

En las dos últimas filas aparecen los valores promedios sin y con vitaminas en general. El experimento sólo

responde a la relación molar 1.

19Vol. XVI, Nº 1, 2004

Cuando se comparan las muestras sin vitaminasrespecto con las que poseen vitaminas, partiendo deuna igualdad de condiciones, se nota una tendenciageneral, en todos los casos, de un incremento en laperoxidación, pero es mayor sin las vitaminas. Seobserva una mayor protección por parte de lasvitaminas A y E, aunque ligera, en relación con lavitamina C.

Si se tiene en cuenta que, cerca del tiempo cero yaexistía, aproximadamente un 2 % de peroxidación, alcabo de 120 días llegó a un 4 %, es decir, que en eseperíodo la oxidación fue aproximadamente de un 2 %si no estaban presentes las vitaminas antioxidantes, y

de sólo 1 % ó 1 % y decimales, si contenían lasvitaminas mencionadas.

Hay que tener presente, que por la ubicación deestas vitaminas en los liposomas, no hay una protecciónde la peroxidación en la capa externa de los liposomas.Los lípidos superficiales están más expuestos a laoxidación a pesar de los procesos difusionales de lasvitaminas y el oxígeno.

A medida que aumenta la temperatura, es másrápida la peroxidación, notándose esto bien entre lastemperaturas de 37 y 60 grados. A 37 grados, laperoxidación aumenta, pero a 60 es más rápida.

0

1

2

3

4

5

6

0 3 12 21 72 120

TIEMPOS (DIAS )

% D

E PE

RO

XID

AC

ION

Vitamina E

Vitamina A

Vitamina C

Sin vitaminas

Gráfica 4. Se representa comparativamente el % de peroxidación de la fosfatidilcolina de los liposomas MLVs enpresencia y ausencia de las vitaminas.

Sustancias antioxidantes tales como vitamina E yA, son capaces de reducir el número de radicaleslibres que se forman normalmente durante un procesode oxidación, y por tanto, bajan las velocidades deoxidación, y prolongan el período conocido comoinducción.

Se observó un efecto protector de las vitaminas A,E y C, lo que se indica por la disminución de laperoxidación de la fosfatidilcolina (PC), siendo muchomás efectivas las vitaminas A y E, lo que concuerda

con la literatura revisada y los resultados previosobtenidos en nuestro laboratorio.

Es probable la conversión de buena parte del ácidoascórbico en ácido dihidroascórbico por la acción deloxígeno atmosférico y la luz, así también como elincremento de la temperatura.

Existe una profusa literatura sobre los efectos enese sentido de los agentes señalados anteriormente,todo lo cual se corrobora en nuestro trabajo.

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El alcance presente y futuro de lastecnologías liposomales

Hoy se preparan muchas aplicacionesprometedoras. En un futuro, los liposomas superarán,posiblemente, la fase de curiosidad del laboratoriopara entrar en nuestras vidas, porque es cierto queaún no han acabado de descubrirnos todos sus secretos,por tanto, cualquier esperanza es permisible.

Actualmente, se continúa realizando estudios,extendiéndose el campo de aplicación de los liposomasa diferentes áreas de investigaciones, tales como:

• Modelo de membranas para el estudio de lainfluencia en la composición lipídica y el funcionamientode estas estructuras.

• Adyuvantes para aumentar la respuesta inmuneno específica.

• Vehiculizador de sustancias para su liberacióna macrófagos.

• Reducción de toxicidad de algunas drogas.

• Protección del contenido encapsulado, por tanto,reducción de la lisis, metabolismo y eliminación de lasdrogas encapsuladas.

• Direccionalidad: administración local yespecífica de drogas.

• Transferencia de genes a células específicas.

En un breve resumen de lo que se hace en estecampo a nivel mundial, tenemos:

Surfactantes

Reconocimiento del dominio carbohidrato de laproteína A surfactante es crítica para la secreción apartir de células tipo II y calcio en liposomas.

Se investigó la creación de surfactantesartificiales para ser aplicados en pacientesportadores del Síndrome Distrófico Respiratorio(RDS). Éstos requieren de un sistema de lípidosque permitan la aplicación en forma de finas gotasen el aire, lo cual lograron mediante el empleo deliposomas.

Virus

Otros estudios con liposomas portadores del virusde la influenza, y en estudios de fusión mediados porstreptavidina, se han realizado con resultadosprometedores.

En la actualidad, aún continúan los ensayos conliposomas, tratando de encontrar una solución a lapandemia del SIDA.

Se ha reportado información sobre la utilización deliposomas catiónicos transportadores deoligonucleótidos antisense, ribozimas y genesterapéuticos en pacientes HIV-1. Se demostró, quelas células infestadas-HIV-1 son más susceptiblesque las células no infestadas a morir por la acción delos liposomas catiónicos. Todavía se desconoce lacausa molecular de estas diferencias.

Nuevos estudios sobre el efecto depresor de lapermeabilidad de las membranas, aportan Guillod etal. El intercambio de proteínas entre el virus de lainfluenza y liposomas con dicetilfosfato o ácidoesteárico. Estudios sobre HIV realizaron Pereira etal., valiéndose de liposomas.

Drogas

Los liposomas son útiles para transportar drogas alcerebro. La toxicidad y los efectos colaterales de la9-amino-1,2,3,4-tetrahidroacridina (THA), de acciónen el Sistema Nervioso Central, se redujeron al serencapsulados en DRV.

La transfección de resistencia a drogas, constituyeotro de los campos donde los liposomas están siendoaplicados en las respectivas investigaciones. Losliposomas son un vehículo importante en latransportación de drogas.

En los tipos de liposomas y consideracionesfarmacocinéticas, dos tipos de liposomas sonhabitualmente usados: vesículas multilamelares (VML;1 a 5 mm) y vesículas unilamelares (VUL; 0,05-0,2mm). Las VML están formadas por capasconcéntricas de fosfolípidos, en las que elcompartimiento acuoso está reducido, por lo que sonmuy útiles para encapsular drogas lipofílicas.

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Cuando estos liposomas son sometidos a sonicacióno extrusión a través de filtros, se forman VUL.Existen dos tipos de VUL: pequeños (menos de 0,1mm) y grandes (entre 0,1 y 0,25 mm). En general, lasVUL son mejores para transportar drogas hidrofílicas.

La utilidad médica de estos liposomasconvencionales se ve limitada por la rápida fagocitosispor las células del sistema reticuloendotelial (SRE),fundamentalmente en hígado y bazo. Aunque estacaracterística es útil cuando los liposomas se utilizanpara transportar drogas en el tratamiento de ciertosprocesos infecciosos en los que el SRE es el órganodiana, no lo es tanto cuando se utilizan para eltratamiento de tumores.

El uso de VUL pequeñas que puedan penetrar enlas células tumorales por mecanismos de endocitosisy pinocitosis, soslaya, en parte, este problema.

Por otro lado, en la actualidad se están desarrollandonuevos liposomas en los que se les incorporan pequeñascantidades de glicolípidos con carga negativa, que losvuelve más hidrófilos y reduce la opsonización yfagocitosis por el SRE. Estos liposomas permanecenen sangre cien veces más que los liposomasconvencionales, y pueden así aumentar la eficaciafarmacológica de las drogas encapsuladas.

La mayoría de agentes quimioterápicos usadospara el tratamiento del cáncer, poseen un índiceterapéutico estrecho que da lugar a efectos adversosseveros, e impiden usar la droga en la dosis necesariapara que la misma sea más eficaz.

Los liposomas pueden ser utilizados para modificarla biodistribución de la droga citotóxica, aumentandola selectividad por el tumor, y reduciendo el daño enotros tejidos. El objetivo final sería poder aumentar elíndice terapéutico de la droga, para así poder explorarel potencial de curabilidad de los agentesquimioterápicos de los que se dispone en la actualidad.

Estudios clínicos con antraciclinas atrapadas enlípidos. Las antraciclinas, y en especial la doxorrubicina,poseen un amplio espectro de actividades biológicasque incluyen tratamiento de linfomas, mieloma,sarcoma, carcinoma de ovario, cáncer de mama yotros tumores sólidos.

El principal problema asociado a su uso es lacardiotoxicidad, por lo que no se recomiendan dosisacumulativas que excedan los 500 mg/m2. El desarrollode un transportador que disminuya la liberación de ladroga en el músculo cardíaco sin disminuir su actividadantitumoral, aumentará su índice terapéutico. Losliposomas atrapan eficientemente la doxorrubicina ypueden cumplir este objetivo terapéutico.

Liposomas como transportadores deagentes modificadores de la respuestabiológica

Desde décadas pasadas, las drogas encapsuladasen liposomas, han sido objeto de estudio como unaposible alternativa a las preparaciones existentes. Elprimer estudio experimental usado con sustanciaencapsulada fue la triancinolona en 1979, donde seobservaba una mejor distribución selectiva de ladroga, así como un incremento del tiempo de vida dela droga en la piel del individuo.

Inmunología

En la Ciencia de la Inmunología, se ha hechoamplio uso de los liposomas. Por ejemplo, utilizandoantígenos para la influenza, encapsulados en liposomascon y sin adyuvantes, induce respuesta de anticuerposen ratones transformados. Estos resultados ilustran lautilidad de este modelo para el uso de estudios en lavacunación humana, y demuestran que el antígeno dela influenza, aplicado en vesículas liposomalesselectivamente, promueve sólo respuesta Th1,mientras que los antígenos libres promueven, además,respuesta Th2 in vivo.

La participación de los macrófagos en losmecanismos de defensa, tanto inmunes como noinmunes, la abordaron Buiting et al., valiéndose deliposomas.

En los estudios biotecnológicos, en ocasiones, serequieren características específicas del material deensayo. Así, se han creado liposomas unilaminaresgigantes para el análisis de la interacción entre lamembrana del retículo endoplasmático y membranascon proteínas unidas, como podrán ser anticuerpos,por ejemplo.

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En 1994 ya se tienen inmunoliposomas útiles enaplicaciones terapeútica y diagnóstica; estudiosinmunológicos relacionados con el VIH, efectoadyuvante y otros aspectos. En los últimos años, sehan realizado estudios inmunológicos haciendo uso delos liposomas.

Una interesante e ingeniosa vía de investigación secomenzó en el Departamento de Bioquímica eInmunología de la Universidad Federal de MinasGerais, Belo Horizonte, Brasil, al utilizar las técnicasliposomales para obtener anticuerpos contra fuertesvenenos mortales de escorpiones sudamericanos,como el Tityus serrulatus. Para ello, el veneno deeste arácnido se encierra en liposomas, se trata contripsina para disminuir su toxicidad, y se aplica enratas para la obtención de anticuerpos. Sin el empleode los liposomas, la aplicación de los métodosinmunológicos no era posible por la alta toxicidad deestos venenos.

En 1997, se estudió la interacción de liposomascatiónicos y las proteínas, mecanismos químico-físicosde su acción inmunoadyuvante. Liposomas cargadospositivamente funcionan como inmunoadyuvantesefectivos.

Se ha demostrado que, cuando en los liposomasexisten proteínas incorporadas en la superficie, estosliposomas son inmunogénicos. Administración de dosisreiteradas de ellos desarrollan la aparición deanticuerpos contra estos liposomas, lo cual es unproblema, ya que afecta su utlización farmacológica.

En estudios de inmuno-ensayos se empleanliposomas. Se prepararon inmunoliposomas para estudiosinmunológicos con la bacteria oral Streptococcus oralis.

Otro campo de investigación interesante es el usode liposomas como transportadores de sustanciasinmunomoduladoras. En este caso, los liposomas sonatrapados con facilidad por monocitos y otras célulasdel SRE, ejerciendo en ella su acción. Éste es el casode los muramil-dipéptidos, que son sustanciasestructuralmente relacionadas con ciertosconstituyentes de las membranas de las paredesbacterianas, y que han demostrado tener una actividadantitumoral en estudios in vitro mediante la activacióndel sistema monocítico /15/.

Otros inmunomoduladores que se están probandoson la interleucina-2 y el interferón-g. Numerososensayos clínicos se están realizando en el momentoactual para demostrar esta hipótesis; interacción deliposomas catiónicos y las proteínas, mecanismosquímico-físicos de su acción inmuno-adyuvante.

Vacunas

En la preparación de una vacuna contra el SIDA,se estudió la inmunogenicidad de la región del lazo V3de la proteína gp 120 de HIV-1. En estos estudios, losliposomas han sido utilizados con resultados paraaumentar la respuesta inmune.

El estudio in vivo del candidato vacunal DNAHIV-1-específico (pCMV160/REV) en liposomascatiónicos, puede ser positivo. La posibilidad delempleo de los liposomas en vacunas orales, estásiendo investigada. Se han diseñado liposomas conmensajeros característicos; se prepararon liposomascon vacunas recombinantes contra Plasmodiumfalciparum

Energía

Groth y Walker (1996) lograron liposomasconteniendo las enzimas mitocondriales para la síntesisde ATP, la cual ocurrió.

En el campo de la energética, también los liposomashan sido útiles, en específico, en el cálculo de laentalpia, utilizando el método de la polarizaciónfluorescente. Se requieren unos diez moles, por lo quecomparado con los procedimientos clásicos de lacalorimetría estándar, resulta ventajosa la técnicaliposomal. El monitoreo de la temperatura mediante lamedida de la fluorescencia dada por la liberación detintes desde liposomas, inducida por láser. La granutilidad que posee este proceder es que permitepredecir el posible daño térmico en los tejidos.

Estudios de la transferencia de energía porresonancia fluorescente con el uso delisofosfatidil colina fluorescente

Estudios de las reacciones fotosintéticas indicaronmejores resultados con liposomas positivos que conneutros o negativos, liposomas que remedan a las

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mitocondrias, integrados por los lípidos de la membranainterna de las mitocondrias. Coello demostró, en elaño 1997, que la permeabilidad protónica en lasmitocondrias, necesaria para la vital síntesis de ATP,no está correlacionada con la composición defosfolípidos y sus ácidos grasos.

Sobrevivencia

Arbutin es una hidroquinina glicosilada que está enalta concentración en ciertas plantas capaces desobrevivir a una deshidratación extrema y sostenida.Dada esta característica, arbutin posee un posible rolcomo anhidrobiosis. Así, por ejemplo, podría preservara los liposomas durante la fase de deshidratación. Eneste sentido, se realizan estudios.

DNA y genes

La transferencia exitosa de genes con el uso de losliposomas, es otro de los logros biotecnológicosrecientes. A ratones parcialmente hepatotectómicosse les transfirió el gen de origen humano alfa1-antitripsina (AAT), y también a animales nohepatotectómicos parciales. El gen está localizado enel plásmido pTG7101, el cual fue incorporado apequeños liposomas de fosfatidilserina (negativos) ode lípidos cargados positivamente (DOTAP).

Por más de cinco meses, se observó, medianteELISA en el plasma del ratón, la presencia de laproteína humana. Novedoso resulta el procedimientoque permite, de forma rápida y por identificaciónvisual, especificar la secuencia del DNA por medio deliposomas tarjetados con secuencias conocidas deDNA. El procedimiento utiliza tinte rojo y marcadoradiactivamente, lográndose el resultado en menos de10 min un DNA-tagged liposomes.

Hay liposomas catiónicos capaces de transferirDNA no viral. Se han realizado considerables esfuerzosen el desarrollo de estrategias de transferencias degenes eficientes. Se han desarrollado métodos viralesy no virales, pero estos mecanismos genéticos son aúnpobremente entendidos.

Estudios relacionados con estos mecanismos serealizan con la utilización de los liposomas.Optimización de los parámetros de liposomas

catiónicos en la transferencia de genes en células invitro. Ácido nucleico atrapado en liposomas resultóeficiente. Uso de los lioposomas en la transferenciade DNA.

Investigadores indican la posibilidad de la terapiagénica renal en ciertas enfermedades de este órgano,mediada por liposomas. La utilidad de los liposomascatiónicos en la transferencia de material genético.Un nuevo sistema de transmitir genes evita la utilizaciónde vectores virales o el uso de métodos invasivos. Congenes contenidos en liposomas se logra vencer labarrera cerebral.

La utilización de liposomas en terapia génicapuede evitar la necesidad del uso de vectores viralesy métodos invasivos para la administración de losgenes manipulados mediante la Ingeniería Genética.

Un equipo de la Universidad de California, en LosÁngeles, Estados Unidos, desarrolló un sistema noinvasivo para la administración de genes terapéuticosen el interior del cerebro y, de esta forma, evitar elobstáculo que supone la barrera hematoencefálica,una pared capilar que protege al cerebro de laintroducción de la mayoría de los compuestos presentesen la corriente sanguínea.

Los investigadores que publican hoy sus resultadosen Proceedings of the National Academy ofSciences, señalan que esta aproximación en terapiagénica podría ser posible en humanos con el empleode anticuerpos que seleccionarán los receptores dianaen el cerebro humano, como el receptor de insulina.

Para resolver este obstáculo, los expertos hanrecubierto los genes con liposomas o células grasascon miles de filamentos cerúleos, que desempeñandos funciones: aumentar la estabilidad y la duraciónde los liposomas en sangre, y ligar las célulasgrasas a los anticuerpos diana del cerebro. Cuandose inyectaron intravenosamente en ratas, se vioque dos genes diferentes han sido capaces decruzar la barrera hematoencefálica y lasmembranas neuronales, explican. En el año de1994 investigadores reportaron la creación deliposomas catiónicos útiles en la transfección degenes.

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Permeabilidad

Existen péptidos capaces de incrementar lapermeabilidad de los vasos sanguíneos hacia tejidosespecíficos, permitiendo la salida de los liposomashacia esos tejidos. Los péptidos P (SP) en ratas,facilitan, así, la salida de los liposomas desde loscapilares hacia los tejidos específicos, donde seencuentran receptores dianas, como son tráqueas,esófagos, vejiga urinaria. Tales liposomas puedenportar una variedad de agentes farmacológicos quepueden ser liberados localmente en los tejidos dianasseleccionados para los propósitos terapéuticos.

La aplicación de vanadato en músculo medianteliposomas, y su relación con el incremento deltransporte de glucosa, ha sido objeto de investigaciónpor Kristiansen et al. La alfa 1-ácido glicoproteínainfluye en la permeabilidad de las membranas celularesmediante la utilización de liposomas que indagansobre el mecanismo de este efecto.

Varios científicos realizaron estudios sobre elcomportamiento difusional de los liposomas y, engeneral, sobre las vesículas. Se realizaron estudiossobre la permeabilidad de la barrera sanguínea cerebrala analgésicos como la encefalina y la bifalina. Ladifusión del zinc en las bicapas lipídicas fue analizada.

La permeabilidad de dichas bicapasy los estudiosde bioluminiscencia también se han apoyado en losliposomas. Se analizó la difusión del zinc en lasbicapas lipídicas. La permeabilidad de lasbiomembranas es fundamental para la vida, por ello,en 1997, se realizaron estudios de permeabilidad conliposomas.

Etanol

La metodología avanzada en la optimización delproceso de producción de etanol en cultivos con altadensidad de células, procura incrementar la utilizacióndel sustrato y tratar de eliminar la fase de crecimientocelular y de productos secundarios, así como elaumento de la productividad volumétrica, con lo cualse reducen los costos.

Para lograr esto, las investigaciones están dirigidasa obtener células genéticamente adaptadas aconcentraciones de etanol superiores a 11 %, para

obtener diseños experimentales que impliquen elreciclaje de las células en el proceso productivo, yfinalmente, otra vertiente de trabajo es la de logrartecnologías con células inmovilizadas.

Otro aspecto al que se le presta atención es lograrsistemas continuos, que permitan mejorar el controldel proceso, aunque resulta costoso al tener que evitarla contaminación.

El incremento de la extracción del etanol tambiénes importante. En la actualidad, se ensaya a escalaindustrial con la bacteria Zymomonas mobnilis, en unproceso anaeróbico, continuo e inmovilizado, utilizandoel sustrato glucosa, y también con la levaduraSaccharomices cerevisiae. A diferencia de estosensayos, nuestra industria de alcohol utiliza diversascepas de levaduras y bacterias, y a la melaza denuestra industria azucarera como sustrato, dondeexiste una mezcla de azúcares, siendo el principal lasacarosa, y se acompañan de otros metabolitosdiversos.

El procedimiento para la producción de etanol apartir de la caña de azúcar, procura la fermentaciónde la melaza con una fuente energética externa; lafermentación de la melaza en una destilería en laplanta de la caña, utilizando la bagaza como fuel; lasdestilerías autónomas, utilizando la bagaza como fuel,así como otras formas más.

Vesículas

Un nuevo método para obtener vesículasunilaminares gigantes de 10 a 60 micras de diámetrosfue reportado.

En ocasiones, en Biotecnología se requierenmétodos que cumplan con determinados requisitos.La tecnología de atrapamiento por encapsulaciónliposomal a veces se precisa ajustarla a determinadastemperaturas, pH, momentos de clivajes de losliposomas para que liberen su contenido, etcétera.

Uno de los campos más prometedores de latecnología liposomal es su empleo en la IngenieríaGenética. Con tales propósitos, se han empleadoliposomas catiónicos. Los resultados obtenidossugieren que los liposomas son potentes en latransducción retroviral.

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Un importante paso en la biodireccionabilidad delos liposomas se está por obtener sobre la creación delos liposomas bioadhesivos, mediante la modificacióndel ácido hialurónico.

Otra utilidad de los liposomas, y que se utiliza enla actualidad, es sobre las investigaciones de la relaciónentre la estructura y las propiedades funcionales delipoproteínas. Las lysozymas modificadasquímicamente son capaces de provocar agregación,fusión y destrucción de liposomas.

Cáncer

Los liposomas se han utilizado en las investigacionessobre el cáncer, tanto como vehículos para eltransporte de drogas, hasta las células cancerosascon independencia, donde se encuentre la creación denuevas estrategias para combatir esta enfermedad.

Se ha reportado, que liposomas preparados conhexadecilfosfocolina y polietilenglicol, y suscombinaciones, resultan una preparación prometedorapara el tratamiento del cáncer mamario, según ensayosrealizados in vitro y en ratas. La posibilidad real deluso de los liposomas en la terapia anticáncer, quedaclaramente expuesta con el reporte. La tolerancia adoxorubicin en el tratamiento del cáncer, aumenta aladministrarse en liposomas como se ha demostrado.

Se encontró, que en cánceres de pecho y ovario,para los cuales es urgente el desarrollo de nuevosregímenes quimioterápicos más activos, la utilizaciónde doxorubicin encapsulado en liposomas (PLD)resultó ser más efectivo con una alta velocidad derespuesta (26 %). Con el uso de polietilenglicol, selogró un liposoma portador de doxorubicin másduradero en sangre y que ejerce el efecto de la drogasobre el tumor sólido. Se preparó un liposoma radiactivoque permite localizar el cáncer e incrementar suimagen. Fue reportado el efecto inhibitorio sobre elcrecimiento de tumores (HL-60) por liposomashíbridos.

Peroxidación

Investigadores demostraron la posibilidad de quela peroxidación de los lípidos de la sangre se iniciemediante hipoclorito generado por la activación deneutrofilos y monocitos/macrófagos. Llegaron a este

resultado en experimentos de incubación de liposomasPC con hipoclorito y con tricloruro de hierro,respectivamente. Estudios de peroxidación por tiposde radiaciones y los radicales formados, se estudiaroncon los liposomas, las interacciones de los efectos delhierro, el zinc y la peroxidación de los lípidos de lasmembranas.

En estudios de la inhibición de la peroxidación delípidos de la yema de huevo (lecitina), empleandoliposomas y como inhibidores el beta-caroteno y elalfa-tocoferol, se encontró que el beta caroteno fuemás efectivo. Esta acción demostró el efecto facilitadordel aluminio sobre la peroxidación fosfolipídica mediadapor hierro en las membranas del sistema nervioso.

Fases

Los liposomas y células interaccionan en cuatroformas. A diferentes temperaturas, las membranasde lecitinas pueden existir en diferentes fases, y latransición de una fase a otra puede ser detectada pormétodos físicos como el incremento de temperatura.A altas temperaturas, se observa en la fase detransición, que la membrana pasa de una forma o fasegel/sólido a líquido cristal, donde la libertad demovimiento de una molécula individual es mayor. Enel caso de la PC, la temperatura de transición es de−15 a −7 oC; comparada con lecitinas de fuentesmamarias que están en el rango de 0 − 40 oC. Esto esimportante para la manufactura y explotación delliposoma, ya que esta propiedad influye sobre aspectoscomo la permeabilidad, fusión, agregación y enlacecon proteínas.

Interacción celular

Los liposomas y células interaccionan en cuatroformas. Un liposoma puede primero absorber a lacélula de la membrana, donde éste puede liberar sucontenido dentro del fluido extracelular; alguno de loscontenidos pueden pasar a través de la membranadentro de la célula. Otros liposomas son ingeridos porel proceso de endocitosis, y son degradados enorgánulos llamados lisosomas, los cuales liberan elcontenido del liposoma dentro del citoplasma.

El contenido del liposoma puede entrardirectamente al citoplasma si el liposoma se fusiona

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con la membrana de la célula. Un liposoma puedetambién intercambiar sus lípidos con los lípidos de lamembrana.

Los liposomas son utilizados en los estudios deBiomembranología para dilucidar los mecanismos yfactores que intervienen en las interaccionesmembrana-membrana; así por ejemplo, se preparóliposomas catiónicos mediante el empleo dedipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol (Chol) yestearilamina (SA). Estas vesículas fosfolipídicasfueron expuestas a un biofilm de bacteriasStaphylococcus epidermidis, frente al cual estosliposomas mostraron una gran afinidad de adsorción,demostrando que la fuerza de adsorción depende dela fuerza iónica del medio, concluyendo que la adsorciónestá mediada por efectos electrostáticos.

Estudios con poblaciones de células de diferentehidrofobicidad mostraron que el carácter hidrofóbicode las células bacterianas tiene efecto sobre laadsorción de los liposomas. Las estrategias de diseñosliposomales, en ocasiones, precisan evitar el fenómenode la fusión, mientras que en otros es necesaria.

Se mostraron, que la exposición a la luz ultravioletade dos series de liposomas unilaminares (LUV)compuestos de relaciones molares 3:1 dedioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) y 1,2-bis[10-(2'-hexadienoyloxy)decanoyl]-sn-glycero-3-phosphatidyl-choline (bis-SorbPC), facilita la fusiónde los liposomas. La extensión y velocidad de la fusiónde los liposomas depende de la extensión de lafotopolimerización, la temperatura y el pH.

En la Biotecnología actual se realizan importantesestudios en este campo. Un grupo de investigadoreschinos tratan de solucionar uno de los problemas quetiene la tecnología liposomal, la agregación. Otro usode los liposomas es en el tratamiento de la queratinociteshumana. La transferencia de proteínas a los liposomaspermiten la posibilidad real del uso de estosproteoliposomas como modelos para el estudio a nivelmolecular de la interacción de estas proteínas con susligandos (Dalencon et al., 1996).

La presencia de péptidos embebidos en lamembrana liposomal parece causar disturbios en ella,lo que facilita los eventos de fusión; así se demostró

mediante el empleo de péptidos anfifílicos en liposomasSUVs. Las interacciones con las membranas, lasuniones con éstas, son partes importantes del uso dela tecnología de encapsulación de sustratos enliposomas para ser aplicados in vivo.

Uno de los órganos más delicados en los seresvivos es el cerebro. Se ha investigado sobre la posibilidadde utilizar los liposomas para transportar drogas alcerebro. Se trata de liposomas termosensibles y dehipertermia. Las ventajas de este tipo de orgánulos esque permiten incrementar la concentración de lasdrogas en los tumores y, además, posibilitan matar alas células cancerosas por hipertermia local.

La interacción entre los liposomas y las células ylos macrófagos, es el objeto de estudio del equipoformado. La compartimentación de las reaccionesbioquímicas fue uno de los grandes logros evolutivosde las células. Mediante los liposomas, se puedelograr estas separaciones entre las reacciones. Unejemplo elocuente es la obtención de la reacción encadena de la polimerasa (PCR) dentro de un liposomatermorresistente, constituido por 1-palmitoíl-2-oleíl-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC).

Sangre

Una de las limitaciones de las tecnologíasliposomales radica en la rapidez de aclaramiento ensangre. Ensayos tendientes a prolongar esto, se hanrealizado. La protrombina es uno de los factoresrelacionados con la coagulación sanguínea, y se hanrealizado trabajos con este factor y los liposomas. Serealizó también el estudio de material lipídico entre lasplaquetas sanguíneas y membranas lipídicas, aquíliposomas PC; la hemoglobina fue encapsulada enliposomas.

Los péptidos angiotensinógenos, angiotensina I yangiotensina II, están vinculados con la presiónsanguínea. Varios investigadores descubrieron(empleando la técnica liposomal), ques estos péptidosalteran la fluidez de las membranas fosfolipídicas, porlo que podría estar esto relacionado con la presión. Eléter lípido 1-O-octadecyl-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina tiene una acción anticáncer probada, peroposee efectos colaterales como es una fuerte actividadhemolítica. Se ensaya la posibilidad de aplicarlomediante liposomas.

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Piel

La preparación de ungüentos y su aplicación en lasuperficie de la piel, ha sido parte de la rutina por siglos.La medicina contemporánea ha continuado la prácticacon la incorporación de drogas y otros ingredientesdentro de lociones, pastas y cremas. En general, esaspreparaciones sirven como llevadores de drogas, ytambién como agentes transportadores de humedad,que incrementan la adsorción de la droga.

En algunos casos, la sustancia por transportar puedepasar al sistema circulatorio a través de la piel, y serdiseminada al cuerpo. Independientemente de lasaplicaciones médicas, un sector mucho más al alcancedel público es la utilización de los liposomas aplicados atratamientos locales, la que ha conquistado el mercadode la cosmetología.

Debido a la posibilidad de los liposomas paraliberar su contenido dentro de capas superficiales yprofundas de la piel, aun sin un ingrediente activo, losliposomas pueden liberar humedad y suplir moléculasde lípidos hacia las capas callosas. Moléculas de aguapueden liberarse de las capas profundas unas u otraspor lípidos hidratados. En adición a mezclas deliposomas, pueden llevar otras sustancias, tales comovitaminas, proteínas, antibióticos, etcétera. Algunasmanufacturas son aún nacientes para encapsularperfumes, lo cual incrementa la duración de lafragancia.

Las sociedades Loreal L. Lancome y ChristianDior, fueron las primeras en poner a punto ycomercializar algunas preparaciones liposómicas desustancias regenerantes para la piel, tales como:cremas hidratantes, extracto de timo y otro colágeno.Todas estas sustancias se presentan encapsuladas enliposomas mantenidos en suspensión en un medioacuoso, lo que evita el uso de otras sustancias comoglicerol, alcohol, aceites menos favorables para la piel,etcétera, además de que los liposomas permanecíanen las inmediaciones del lugar de acción, fusionándosecon las membranas de las células de la piel, yaumentando así su contenido lipídico e hidratante. Sinembargo, este último fenómeno ha sido pocodemostrado en ensayos de laboratorio.

Se analizó la administración tópica de los

medicamentos encapsulados en los liposomas paranumerosas enfermedades de la piel. Los resultadosobtenidos permitieron pronosticar una utilización delos sistemas liposómicos en dermatología, por lasnumerosas ventajas que ofrecen los sistemas deadministración avanzados, como son: incremento delefecto local con la siguiente disminución de la toxicidadsistémica, versatilidad para lograr un sistema dérmicoo transdérmico, en dependencia de la formulación,mayor aceptabilidad cosmética entre otros.

Estudios sobre la toma de liposomas por célulasepiteliales pigmentadas de la retina humana en cultivode tejido. Vesículas liposomales desarrolladas,portadoras de insulina, son capaces de penetrar la pielintacta en un por ciento alto, con una bioeficienciahasta de 50 %.

La anfotericina B es una droga antifúngica de usoindispensable en los infantes con cáncer. Sin embargo,su administración por vía intravenosa suele provocarestados cianóticos y de poca tolerancia: es el fenómenocianótico Raynaud. La tromboxana A2 podría ser lacausa de este peligroso efecto. Agentes terapeúticospara tejidos endotelial mediante el uso de liposomas.Los primeros investigadores en explotar lasposibilidades de la acción cutánea de los liposomas f.

En este primer estudio, se seleccionó el acetónidode triamcinolona (0,1 %) como fármaco modelo parala encapsulación en liposomas. Se obtuvieron vesículasde tipo MLV (Multillamellar Vesicles), las cuales seformularon posteriormente como loción, gel y crema,cuya efectividad biológica se evaluó en conejos. Losresultados indicaron que la preparación liposómicaliberó entre 4-5 veces más agente activo en laepidermis, comparado con el grupo control. Además,se comprobó que los niveles de triamcinolona en laregión talámica fueron entre 2-3 veces menores parala forma liposómica. El tratamiento de diferentesinfecciones fúngicas de la piel ha sido formulado enforma liposómica; se encuentran: miconazol,ketoconazol, rilopilox y econazol, entre otros.

Detergentes

Los sistemas de enzimas inmovilizadas no hanpodido penetrar todavía al mercado doméstico. Sinembargo, la inmovilización puede probar su utilidad en

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esta área, por ejemplo, en la estabilización dedetergentes. Igualmente, algunas lipasas pueden serinmovilizadas para lograr un poder más efectivo ypara la obtención de grasas. Por último, algunasenzimas para la obtención de cremas o para eltratamiento de alimentos pueden dejar a un lado suvida arrinconada y realzarse a través de lainmovilización. Se preparó liposomas con losdetergentes n-octyl beta D-glucósido y Triton X-100.

Industria

El uso analítico de sistemas de enzimasinmovilizadas es muy amplio e importante. Debido ala gran especificidad de las enzimas, estos sistemas sehan empleado en la determinación de una gran variedadde compuestos en el diagnóstico clínico, a través desondas enzimáticas, como por ejemplo una sondaoxígeno-glucosa oxidasa para la determinación deglucosa en un rango de hasta 10-3 mol/L, y otra deamonioureasa para la determinación de urea.

Existen numerosos ejemplos de las aplicacionesque, en varias industrias, han encontrado los sistemasde enzimas o células inmovilizadas. Algunos de losmás importantes son: producción de etanol porlevaduras inmovilizadas, producción de leche libre delactosa, mediante un proceso continuo que hace usode la lactasa de la levadura inmovilizada en geles depoliacrilamida, producción de varios aminoácidos (ácidoaspártico, triptófano, L-tirosina), producción deantibióticos (penicilina), producción de nucleótidos,producción de jugos y vinos, clasificación de cervezas,hidrólisis de polisacáridos, isomerización de glucosa,etcétera.

La tendencia actual en la tecnología farmacéutica,se basa sobre el desarrollo de sistemas de liberacióncontrolada de medicamentos cada vez másperfeccionados, en los cuales, el vehículo favorece lapenetración, la liberación e incluso, el destino farmaco-cinético del principio activo.

Los liposomas constituyen en la actualidad uno delos sistemas de administración de medicamentos y deproductos biológicos, en general, más atractivos porsu funcionalidad, versatilidad de empleo y susperspectivas futuras. Es por esas razones, que la víade administración tópica recibió una mayor atención

a partir de 1980, y se introduce el término"localizadores" para definir la acción de los liposomascomo transportadores de medicamentos en los sitiosde mayor accesibilidad como la piel y las membranasmucosas ocular, nasal y pulmonar.

Medicina

Desde que en 1965 Bangham describiera, porprimera vez, los liposomas, se conocen cada vez másaplicaciones en el uso de estas vesículas comotransportadoras de drogas.

Los liposomas son vesículas compuestas porsimples o múltiples membranas de fosfolípidos querodean un compartimento acuoso. Tienen un tamañovariable entre 0,025 y 20 µm, y debido a sus propiedadeshidrofílicas e hidrofóbicas, pueden ser usados paraincorporar compuestos acuosos y lipofílicos. Tambiénpueden atrapar anticuerpos específicos entre suscadenas de ácidos grasos, pudiendo así liberar ladroga en aquellas células que posean el receptor oantígeno específico a ese anticuerpo /2/.

En la actualidad, se están desarrollando numerososensayos clínicos que utilizan liposomas comotransportadores de agentes quimioterápicos,principalmente derivados de las antraciclinas y elcisplatino, así como de sustancias moduladoras de larespuestas biológica. Su uso como transportadores deácidos nucleicos, incluyendo ADN y oligonucleótidosantisentido, como terapia génica de algunos tumores,es otro campo de intensa investigación.

En la lucha en contra de la tuberculosis, también sehan utilizado las técnicas liposomales. Se realizóestudios para conocer cómo es la interacción de losantibióticos con las membranas de las bacterias.Utilización de compuestos fosforilados en liposomasen contra de la artritis.

Insulina en liposomas es aplicada por vía oral en eltratamiento de diabéticos como una vía deadministración efectiva. Calcitonina fue encapsuladaen liposomas por Arien y Dupuy. Liposomasintegrados por fosfatidilcolina parecen descender elnivel de colesterol en sangre, e incluso removerlo delos depósitos en arterias. Estos ensayos se realizaronen conejos con resultados positivos.

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Un estudio realizado en humanos con triamcinolonaliposómica en forma de ungüento, fue publicado porKrowczynski y Stozek. Ellos encontraron, que laformulación liposómica presentaba mayor absorciónen la piel (cerca de 3 veces mayor) que el ungüentoempleado como control. Estos resultados lespermitieron sugerir, que las formulaciones liposómicasde este fármaco pueden convertirse en un sistema deliberación perfeccionado para la terapia transdérmica.

Resultados similares fueron reportados porWohlrab y Lasch en un estudio de penetración dehidrocortisona en liposomas. En el caso del econazol,se prepararon varias formulaciones con el productoen forma de base y de nitrato, las cuales se evaluaronmediante estudios de biodisposición in vivo,comparadas con los productos comerciales existentesen forma de crema, gel y loción, y en fórmulasliposómicas con el fármaco libre. Los resultadosindicaron, que la mayoría de los productos liposómicosprodujeron mayores concentraciones de econazol enlas diferentes capas de la piel, y menoresconcentraciones en los órganos internos, si se comparancon las formas comerciales, según este estudio.

Los retinoides han demostrado ser eficaces en eltratamiento de diversos tipos de acné y otrasdermatosis. Cuando se administran por vía sistémica,producen teratogenicidad, por lo cual no deben serempleados por pacientes del sexo femenino. Estosresultados difieren de los reportados por Foldvari etal., quienes investigaron el tratamiento de lasinfecciones genitales producidas por papilomaviruscon interferón alfa encapsulado en liposomas,comprobándose la desaparición de las lesionescutáneas en una población femenina al término de 12semanas de tratamiento.

En la mayoría de los casos, la encapsulación enliposomas rinde mayores concentraciones del agenteactivo en los diferentes estratos de la piel,principalmente en la epidermis que en la circulaciónsistémica y órganos como cerebro, riñón e hígado,etcétera, comparada con las formas farmacéuticasconvencionales, minimizando la toxicidad sistémica.Los péptidos sintetizados se utilizan para direccionarliposomas conteniendo citostáticos a célulasproliferantes.

Los campos de aplicación son el tratamiento devitreoretinopatías en oftalmología y la inhibición delcrecimiento de células tumorales e inhibición dediseminación de metástasis en el tratamiento delcáncer.

Se ha ensayado con éxito, en el suministro de laanfotericina B atrapada en liposomas. Las dosisliposomales fueron bien toleradas por los niños. Elequipo de investigadores del Department ofBiochemistry, Universiteit Gent, Belgium. integrado,viene realizando investigaciones importantes sobre laglicoproteína prion (PrPC), de función desconocida,pero que se encuentra presente en la superficie deneuronas y de las células glial. Como tal, estaglicoproteína, está implicada en enfermedades comola encefalopatía espongiforme bovina (mal de lasvacas locas), la enfermedad humana de Creutzfeldt-Jakob (sospechosa de ser la forma humana de laanterior bovina). También la glicoproteína PrPC estávinculada con el desarrollo del mal de Alzheimer(locura senil en humano). Entre las técnicas utilizadaspor este grupo están las técnicas liposomales.

Anestésicos

Los autores concluyeron, que la lecitina liposómicapenetra rápidamente dentro de la piel humana, por loque plantean la relevancia de estos sistemas comopromotores de la penetración. A partir de esta fechacomienzan a surgir con más frecuencia en la literaturareportes acerca de la administración de corticoidespor vía tópica. Los principales estudios incluyen variosésteres de hidrocortisona y 5-alfatestosterona, entreotros.

Los anestésicos locales constituyen una familia deagentes activos que se caracterizan por tener un cortotiempo de vida media en el organismo; la mayoríaposeen escasa penetración en la piel, y en general, seconsideran poco efectivos por vía tópica.

Se han preparado en forma liposómica, lossiguientes agentes: tetracaína, dibucaína, lidocaína,entre otros. Los anestésicos locales constituyen unafamilia de agentes activos que se caracterizan portener un corto tiempo de vida media en el organismo;la mayoría poseen escasa penetración en la piel y, engeneral, se consideran poco efectivos por vía tópica.

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Se han preparado, en forma liposómica, lossiguientes agentes: tetracaína, dibucaína, lidocaína,entre otros. Se realizaron también investigaciones conlidocaína liposómica para uso tópico.

Toxinas

También, utilizaron liposomas en el estudio detoxinas desde Bacillus thuringiensisvar. israelensis.Uso de los liposomas en estudios de desnaturalizacióntérmica de venenos de serpientes a 48-50 gradoscentígrados en Bungarus fasciatus.

Imágenes

Otra aplicación novedosa de los liposomas es suutilización, como agente de contraste, en el empleo delultrasonido en la obtención de imágenes con finesmédicos en los estudios de posibles patologías. Eneste sentido, se prepararon liposomas (liposomasecogénicos), en específico, con fosfatidilcolina (PC),fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG) ycolesterol (CH), utilizando el método de dehidratación/rehidratación.

Entre los agentes de contraste ultrasónicosdesarrollados en la actualidad, ocurre que en ocasionesno son útiles para tejidos específicos o no poseensuficiente reflectividad acústica. Los estudiosrealizados con liposomas in vitro e in vivo dejaronresultados positivos. En la actualidad, se desarrollanfamilias de liposomas ecogénicos apropiados paratejidos específicos

Bomba de sodio-potasio

Estudios sobre la bomba de sodio se llevan a cabocon las técnicas liposomales. Cómo funcionan lasdefensinas humanas y los procesos de formación deporos también es objeto de estudio mediante estatecnología.

Estabilidad

Estudios realizados con pequeñas vesículasunilaminares constituidas por cuatro lípidos catiónicos,y variando el contenido de colesterol, señalan laimportancia de esta molécula en la estabilidad y lascaracterísticas de estas membranas. Como técnicasde medidas, se emplearon la polarización fluorescentey la resonancia magnética nuclear. Se comprobó, que

la adición de colesterol provoca el empaquetamientode los lípidos catiónicos.

Físico-química

La creación de membranas artificiales liposomalesy membranas liposomales semejantes a las membranasbacterianas, está permitiendo indagar sobre laspropiedades fisicoquímicas reales en las de estosmicroorganismos, las cuales son fundamentales en eltratamiento medicamentoso de las enfermedades.

Por su parte, se ha estudiado el efecto de loscationes monovalentes sobre la curvatura de losliposomas. En otro aspecto, una nueva posibilidad delas técnicas liposomales es la creación de vesículascon múltiples compartimentaciones. Los autores deeste ensayo atraparon vitamina B 12, Beta-caroteno,drogas, etcétera, en una misma vesícula de formacompartimentada. Derivados de D-mio-inositolafectan la fluidez de las membranas en liposomas, ypodrían ejercer efectos en las membranas celularesnaturales.

BiosensoresTambién han sido elaborados biosensores para la

determinación de algunos iones como H+, (pH),etcétera. Una posibilidad distinta sería la aplicación deenzimas inmovilizadas para la detección de pesticidasy otros trazos de materiales tóxicos. Actualmente, alacoplar la especificidad de una enzima con algunossistemas fluorométricos, se han podido llevar a caboanálisis muy sensibles de niveles de concentracionestan bajos como es de 10-12 M.

Cosméticos

La vitamina A y la isotretioína tienen elinconveniente adicional de que son irritantes, y quedurante las primeras semanas provocan laexacerbación de los síntomas de acné, por lo cual,muchos pacientes se muestran insatisfechos con eltratamiento. Estas limitaciones motivaron a variosinvestigadores para llevar a cabo la encapsulación deestos agentes en liposomas, y los resultadospreliminares han demostrado las ventajas de estasformulaciones, como por ejemplo, menor tiempo detratamiento, la no recurrencia de los síntomas alterminar el período de tratamiento, y la mayoraceptabilidad cosmética.

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