Artículo - Estrategias de Purificación - Un Enfoque Simple

8/16/2019 Artículo - Estrategias de Purificación - Un Enfoque Simple

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ESTRATEGIAS DE PURIFICACIÓN - UN ENFOQUE SIMPLE

Aplicar un enfoque sistemático para el desarrollo de una estrategia de purificación. El primer paso es para describir e

escenario básico para la purificación. Consideraciones generales responden a preguntas tales como: ¿Cuál es el uso

previsto del producto? ¿Qué tipo de material de partida se encuentra disponible y cómo debe ser manejado? ¿Cuáles son

los problemas de pureza en relación con el material de origen y el uso previsto del producto final? Lo que ha de se

eliminado? Lo que debe ser eliminado por completo? ¿Cuál será la escala final de la purificación? Si hay una necesidad d

ampliación, qué consecuencias tendrá esto en las técnicas de purificación elegidos? ¿Cuáles son las restricciones

económicas y qué recursos y materiales disponibles?

La mayoría de los protocolos de purificación requieren más de un paso para lograr el nivel deseado de pureza del producto

Esto incluye los pasos necesarios cualquier acondicionado para transferir el producto de una técnica en condicione

adecuadas para llevar a cabo la siguiente técnica.

Cada paso en el proceso hará que algo de pérdida de producto. Por ejemplo, si se supone un rendimiento del 80% en cad

paso, esto se redujo a sólo el 20% de rendimiento global después de las etapas de procesamiento de 8 como se muestr

en la Figura 1. En consecuencia, para alcanzar los objetivos de rendimiento y pureza con el número mínimo de pasos y e

diseño más simple posible, no es eficiente para agregar un paso a otro hasta que se hayan cumplido los requisitos de

pureza.

En ocasiones, cuando una muestra es fácilmente pureza disponible puede lograrse simplemente añadiendo o repitiendo

los pasos. Sin embargo, la experiencia demuestra que, incluso para las aplicaciones más exigentes, de alta pureza y erendimiento se puede lograr de manera eficiente en menos de cuatro etapas de purificación bien elegida y optimizada

Las técnicas deben ser organizadas en una secuencia lógica para evitar la necesidad de etapas de acondicionamiento y la

técnicas cromatografícas seleccionadas apropiadamente para utilizar el menor número de etapas de purificación como

sea posible.

Limitar el número de pasos en un procedimiento de purificación

PREPARACIÓN

La necesidad de obtener una proteína, de manera eficiente, económica y con suficiente pureza y cantidad, se aplica a cadpurificación. Es importante establecer objetivos para la pureza, la cantidad y el mantenimiento de la actividad biológica y

para definir el marco económico y tiempo para el trabajo. Todas las propiedades de la información relativa a la proteína

diana y los contaminantes ayudarán durante el desarrollo de la purificación. Algunos experimentos sencillos para

caracterizar la muestra y la molécula diana son una excelente inversión.

Desarrollo de ensayos analíticos rápidos y fiables es esencial para seguir el progreso de la purificación y evaluar su eficacia

Preparación de la muestra y los procedimientos de extracción deben ser desarrollados antes de la primera etapa de

purificación cromatográfica.

Con información de fondo, ensayos y procedimientos de preparación de muestras en lugar de la estrategia de purificació

fase tres puede ser considerado.


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TERCERA FASE ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN

Imagínese la purificación tiene tres fases: captura, Intermedio Purificación y pulido. En la estrategia de tres fases objetivo

específicos son asignados a cada paso en el proceso:

En la fase de captura son los objetivos para aislar, concentrar y estabilizar el producto de destino.

Durante la fase de purificación intermedia el objetivo es eliminar la mayor parte de las impurezas a granel , tales como

otras proteínas y ácidos nucleicos, endotoxinas y virus. En la fase de pulido el objetivo es lograr una alta pureza mediante

la eliminación de las impurezas de traza restantes o sustancias estrechamente relacionadas. La selección y la combinació

óptima de técnicas de purificación para la captura, Intermedio Purificación y pulido es crucial para asegurar el desarrollo

de métodos rápidos, un tiempo más corto al producto puro y una buena economía.

El proceso de purificación final debería idealmente consistir en la preparación de muestras, incluyendo la extracción y

clarificación cuando se requiera, seguido por tres grandes etapas de purificación, como se muestra en la Figura 2. E

número de pasos que se utilizan siempre dependerá de los requisitos de pureza y el uso previsto para la proteína.

Directrices para la purificación de proteínas

Las directrices para la purificación de proteínas que se muestra aquí se pueden aplicar a cualquier proceso de purificación

y son una sugerencia en cuanto a cómo un enfoque sistemático se puede aplicar a la elaboración de una estrategia depurificación eficaz. A modo de recordatorio se resaltarán estas directrices en su caso a través de los siguientes capítulos.

Definir objetivos: la pureza, la actividad y la cantidad necesaria de producto final para evitar el sobre o bajo el desarrollode un método.

Definición de las propiedades de la proteína diana y las impurezas críticos : para simplificar la selección y optimizacióntécnica.

Desarrollar ensayos analíticos: para la detección rápida de la actividad de la proteína / recuperación y contaminantescríticos.

Reducir al mínimo la manipulación de muestras en cada etapa: para evitar largos procedimientos que corren el riesgo de

perder la actividad / reducción de la recuperación.

Minimizar el uso de aditivos: pueden necesitar ser eliminado en una etapa de purificación adicional o aditivos puedeninterferir con los ensayos de actividad.

Eliminar los contaminantes dañinos principios: por ejemplo, las proteasas.

Utilice una técnica diferente en cada etapa: para tomar ventaja de características de la muestra que se pueden utilizapara la separación (tamaño, carga, hidrofobicidad, ligando especificidad).

Minimizar el número de pasos: pasos adicionales reducen el rendimiento y aumentan el tiempo, se combinan pasoslógicamente.


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PREPARACIÓN

Antes de que empieces:

La necesidad de obtener una proteína, de manera eficiente, económica y con suficiente pureza y cantidad, se aplica a

cualquier purificación, de la preparación de un extracto de proteína enriquecido para la caracterización bioquímica de la

producción a gran escala de una proteína recombinante terapéutico. Es importante establecer objetivos para la pureza y

cantidad, mantenimiento de la actividad biológica y la economía en términos de dinero y tiempo. Requisitos de pureza

deben tener en cuenta la naturaleza del material de origen, el uso previsto del producto final y cualquier problema d

seguridad especial. Por ejemplo, es importante diferenciar entre los contaminantes que deben ser eliminados y aquellosque pueden ser tolerados. Otros factores que también pueden influir en la priorización de objetivos. Los alto

rendimientos suelen ser un objetivo clave, pero pueden ser menos crucial en los casos en que una muestra es fácilment

disponibles o se requiere el producto sólo en pequeñas cantidades.

El desarrollo del método extensiva puede ser imposible sin recursos, tales como un sistema de cromatografía de diseño

ÄKTA ™. Del mismo modo, la presión del tiempo combinado con un cambio de ensayo lenta dirigirá hacia la menos extensade exploración y optimización. Todas las propiedades de la información relativa a la proteína diana y los contaminantes

ayudarán durante el desarrollo de purificación, lo que permite más rápido y más fácil la selección técnica y optimización

y evitar condiciones que puedan inactivar la proteína diana. Desarrollo de ensayos analíticos rápidos y fiables es esencia

para seguir el progreso de la purificación y evaluar la eficacia (rendimiento, actividad biológica, recuperación).

Definir los objetivos

Objetivo: Establecer los objetivos mínimos de pureza y cantidad, mantenimiento de la actividad biológica y la economíaen términos de dinero y tiempo. Definir los requisitos de pureza de acuerdo con el uso final del producto. Ejemplos ley de

pureza se muestran a continuación.

Identificar los contaminantes: Identificar la naturaleza de los posibles contaminantes restantes tan pronto como seaposible. La afirmación de que una proteína es pura> 95% (es decir, proteína objetivo constituye 95% de la proteína total

está lejos de una garantía de que la pureza es suficiente para una aplicación deseada. Lo mismo es cierto para la

declaración común "la proteína era homogéneo por Coomassie ™ manchado SDS-PAGE". La pureza de 95% puede seaceptable si el 5% restante consiste en impurezas inofensivas. Sin embargo, incluso las impurezas de menor importancia

que pueden ser biológicamente activos podrían causar problemas significativos tanto en aplicaciones terapéuticas y de

investigación. Por tanto, es importante diferenciar entre los contaminantes que deben ser eliminados por completo y lo

que pueden reducirse a niveles aceptables. Dado que los diferentes tipos de material de partida contendrán diferente

perfiles de contaminantes que presentarán diferentes problemas de contaminación.

Es mejor que sobre-purificar a bajo purificar por: Aunque el número de etapas de purificación debe ser minimizada, lacalidad del producto final no debe ser comprometida. Los resultados posteriores podrían ser cuestionados si pureza de la

muestra es baja y los contaminantes son desconocidos. Los contaminantes que degradan o inactivan la proteína o

interfieren con los análisis deben ser removidos tan pronto como sea posible. La necesidad de mantener la actividad

biológica debe ser considerada en todas las etapas de purificación durante el desarrollo. Es especialmente beneficioso s

las proteasas se eliminan y proteína diana transfirieron a un medio ambiente durante el primer paso.

Un proceso de producción aguas abajo debe lograr la pureza requerida y recuperación con total seguridad y fiabilidad, y

dentro de un marco económico determinado. La economía es un tema muy complejo. En la producción comercial e

tiempo de comercialización puede anular cuestiones tales como la optimización de la recuperación, la capacidad o


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velocidad. La robustez y la fiabilidad son también de gran preocupación, ya que un fracaso lote puede tener importante

consecuencias.

Los problemas de seguridad especial pueden estar implicadas en la purificación de productos biofarmacéuticos, como la

detección o eliminación de agentes infecciosos, proteínas, contaminantes inmunogénicas y peligros tumorigénicas. Pued

ser necesario el uso de técnicas de análisis dirigidos a contaminantes específicos, a fin de demostrar que se han eliminado

a niveles aceptables.

Definición de las propiedades de la proteína diana e impurezas críticas

Objetivo: Determinar una "ventana de estabilidad" para la proteína diana para facilitar la selección y optimización de lastécnicas y para evitar la inactivación de la proteína durante la purificación.

Compruebe ventana estabilidad de la proteína diana para al menos pH y la fuerza iónica. Toda la información relativa a

las propiedades de la proteína diana y los contaminantes contribuirá a orientar la elección de las técnicas de separación y

las condiciones experimentales para la purificación. Información de base de datos para el objetivo, o proteínas

relacionadas, pueden dar tamaño, punto isoeléctrico (pI) y los datos de hidrofobicidad o solubilidad. uno nativo y dos

páginas dimensiones pueden indicar la complejidad de la muestra y las propiedades de la proteína objetivo y los

principales contaminantes. Particularmente importante es el conocimiento de la ventana de estabilidad de la proteína de

modo que se evita la inactivación irreversible. Es recomendable comprobar la ventana de estabilidad de la proteína dian

para, al menos, el pH y la fuerza iónica. La Tabla 1 muestra cómo las diferentes propiedades de la proteína objetivo puede

afectar a una estrategia de purificación.

Desarrollar ensayos analíticos

Objetivo: Para seguir el progreso de una purificación, para evaluar la eficacia (rendimiento, actividad biológicarecuperación) y para ayudar durante la optimización. Seleccionar ensayos que son rápidos y fiables. Para avanzar de

manera eficiente durante el desarrollo del método de la eficacia de cada paso debe ser evaluada. El laboratorio debe tene

acceso a los siguientes ensayos:

• Una rápida, ensayo fiable para la proteína diana


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• Determinación de la pureza

• Determinación de proteínas totales

• Los ensayos para las impurezas que deben ser eliminadas

La importancia de un ensayo fiable para la proteína diana no debe subestimarse. Al probar fracciones cromatográficas

asegurar que los tampones usados para la separación no interfieren con el ensayo. La pureza de la proteína diana es má

a menudo estimado por SDS-PAGE, electroforesis capilar, cromatografía de fase invertida o espectrometría de masas

Ensayos de Lowry o Bradford se utilizan con mayor frecuencia para determinar la proteína total. El ensayo de Bradford e

adecuado particularmente para muestras en las que hay un alto contenido de lípidos que puede interferir con el ensayo

de Lowry.

Para la purificación de proteínas a gran escala a menudo es esencial la necesidad de ensayar proteínas diana e impureza

críticos. En la práctica, cuando una proteína se purifica con fines de investigación, es lento para identificar y establece

ensayos específicos para los contaminantes dañinos demasiado tiempo. Un enfoque práctico es purificar la proteína a un

cierto nivel, y a continuación, realizar SDS-PAGE después de un período de almacenamiento para verificar la escisión de l

proteasa. Experimentos de control adecuados, incluidos en los ensayos para la bioactividad, ayudarán a indicar si las

impurezas están interfiriendo con los resultados.

TERCERA FASE ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN

PRINCIPIOS

Con información de fondo, ensayos y preparación de muestras y procedimientos de extracción en lugar de las tre

estrategias de purificación de fase puede ser aplicado (Figura 3). Esta estrategia se utiliza como una ayuda para e

desarrollo de procesos de purificación de proteínas terapéuticas en la industria farmacéutica y es igualmente eficiente

como una ayuda en el desarrollo de los esquemas de purificación en el laboratorio de investigación.

Asignar un objetivo específico para cada paso en el proceso de purificación.

En la Estrategia trifásico de un objetivo específico se asigna a cada paso. El problema de purificación asociado con un pasoen particular dependerá en gran medida de las propiedades del material de partida. Por lo tanto, el objetivo de una etap

de purificación variará de acuerdo con su posición en el proceso, es decir, al principio para el aislamiento del producto de

la muestra bruta, en el medio para la purificación adicional de la muestra parcialmente purificada, o en el extremo para

una limpieza final de un producto casi puro.

La estrategia de tres fases garantiza el desarrollo de métodos más rápidos, un tiempo más corto al producto puro y una

buena economía.

En la fase de captura son los objetivos para aislar, concentrar y estabilizar el producto de destino. El producto debe se

concentró y se transfiere a un entorno que conservar potencia / actividad. En el mejor, también se puede lograr una

importante eliminación de otros contaminantes críticos.


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Durante la fase de purificación intermedia los objetivos son para eliminar la mayoría de las impurezas a granel, tales como

otras proteínas y ácidos nucleicos, endotoxinas y virus.

En la fase de pulido mayoría de las impurezas ya se han retirado a excepción de cantidades traza o sustancia

estrechamente relacionadas. El objetivo es lograr la pureza final.

Cabe señalar que esta estrategia de tres fases no significa que todas las estrategias deben tener tres etapas de purificación

Por ejemplo, la captura y purificación intermedia pueden ser alcanzable en un solo paso, como la purificación intermedia

puede y pulido. Del mismo modo, las demandas de pureza pueden ser tan bajas que una etapa de captura rápida e

suficiente para lograr el resultado deseado, o la pureza del material de partida puede ser tan alta que sólo se necesita unetapa de pulido. Para la purificación de proteínas terapéuticas cuarta o quinta etapa de purificación puede ser necesario

para cumplir con las más altas exigencias de pureza y de seguridad. La selección óptima y la combinación de técnicas de

purificación para la captura, Intermedio Purificación y pulido es crucial para un proceso de purificación eficaz.

SELECCIÓN Y COMBINACIÓN DE TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN

Reducir al mínimo la manipulación de muestras

Minimizar el número de pasos

Utilizar diferentes técnicas en cada paso

Objetivo: Ruta más rápida a un producto de la pureza requerida.

Para cualquier separación cromatográfica cada técnica diferente, ofrecer un rendimiento diferente con respecto a la

recuperación, resolución, velocidad y capacidad. Una técnica puede ser optimizada para centrarse en uno de estos

parámetros, por ejemplo, la resolución, o para lograr el mejor equilibrio entre dos parámetros, tales como la velocidad ycapacidad. Una separación optimizada para uno de estos parámetros producirá resultados muy diferentes en apariencia

de los producidos utilizando la misma técnica, pero se centró en un parámetro alternativo. Ver, por ejemplo, los resultado

mostrados en la página 49, donde se utiliza intercambio iónico para una captura y de una etapa de pulido.

Seleccionar una técnica para cumplir los objetivos para la etapa de purificación.

Capacidad, en el modelo simple que se muestra, se refiere a la cantidad de proteína diana cargado durante la purificaciónEn algunos casos la cantidad de muestra que puede ser cargado puede estar limitado por volumen (como en la filtración

en gel) o por las grandes cantidades de contaminantes en lugar de la cantidad de la proteína diana.

Velocidad, es de la mayor importancia en el comienzo de una purificación donde los contaminantes tales como la

proteínas deben ser eliminados lo más rápidamente posible.Recuperación, se vuelve cada vez más importante que los beneficios de purificación debido a una apreciación del valodel producto purificado. Recuperación está influenciada por procesos destructivos en la muestra y las condiciones

desfavorables en la columna.

Resolución, se consigue mediante la selectividad de la técnica y la eficiencia de la matriz cromatográfica para producipicos estrechos. En general, la resolución es más difícil de lograr en las etapas finales de purificación cuando las impureza

y proteína diana es probable que tengan propiedades muy similares.

Cada técnica ofrece un equilibrio entre la resolución, la velocidad, la capacidad y la recuperación y deben ser seleccionado

para satisfacer los objetivos de cada etapa de purificación. En general, la optimización de uno cualquiera de estos cuatro


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parámetros sólo puede lograrse a expensas de las otras y una etapa de purificación será un compromiso. La importancia

de cada parámetro variará dependiendo de si una etapa de purificación se utiliza para la captura, purificación intermedi

o de pulido. Esto dirigir la optimización de los parámetros críticos, así como la selección de los medios de comunicación

más adecuados para la etapa.

Las proteínas se purifican usando técnicas de purificación cromatográficas que separan según las diferencias en

propiedades específicas, como se muestra en la Tabla 3.

Elija combinaciones lógicas de las técnicas de purificación a partir de los principales beneficios de la técnica y la condición

de la muestra al principio o al final de cada paso.

Reducir al mínimo la manipulación de muestras entre etapas de purificación mediante la combinación de técnicas para

evitar la necesidad de acondicionamiento de la muestra.

Evitar medidas adicionales de acondicionamiento de muestra.

El producto debe ser eluyó de la primera columna en condiciones adecuadas para las condiciones de inicio de la siguiente

columna.

Para cualquier etapa de captura, seleccionar la técnica que muestra la fuerte unión a la proteína diana mientras que la

unión como algunos de los contaminantes como sea posible, es decir, la técnica con la más alta selectividad y / o capacidad

de la proteína de interés.

Considere el uso tanto de aniones y cromatografía de intercambio catiónico para dar diferentes selectividades dentro de

la misma estrategia de purificación.

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