Artículo sobre la Conservación de Germoplasma de Especies Raras y Amenazadas (Revisión) Por J Mª Iriondo Alegría (2001)

7/23/2019 Artculo sobre la Conservacin de Germoplasma de Especies Raras y Amenazadas (Revisin) Por J M Iriondo Alegr

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Conservacin de germoplasma de especies raras y amenazadas(Revisin)

J. M. Iriondo AlegraDpto. Biologa Vegetal, E.U.I.T. Agrcola, Universidad Politcnica de Madrid.

Ciudad Universitaria s/n, 28040 [email protected]

RESUMEN

Las tcnicas de conservacinex situson componentes fundamentales de un programa de conservacin glo-bal que contemplan esencialmente las operaciones de almacenamiento y propagacin de germoplasma. El alma-cenamiento se lleva a cabo mediante el mantenimiento de colecciones de plantas en jardines botnicos y el esta-blecimiento de bancos de germoplasma. Dentro de los bancos de germoplasma, los bancos de semillas conven-cionales constituyen la opcin ms sencilla y eficaz para el almacenamiento de especies con semillas ortodoxas.

Estas semillas pueden igualmente almacenarse mediante tcnicas de crioconservacin. El almacenamiento de lassemillas recalcitrantes resulta mucho ms problemtico debido a su sensibilidad a la desecacin. Los bancos decultivoin vitroconstituyen una alternativa a los bancos de semillas en los casos en los que el almacenamiento delas semillas presenta dificultades. Los bancos de ADN, los bancos de polen y los bancos de yemas son otras po-sibilidades de almacenamiento todava poco utilizadas.

La multiplicacin por semilla constituye el mtodo ms frecuente de propagacin. Sin embargo, el estadode dormicin presente en muchas semillas de especies silvestres reduce significativamente su eficacia. Cuandono resulta posible la propagacin por semilla o interesa propagar un determinado genotipo, se recurre a las tcni-cas convencionales de propagacin vegetativa o a la micropropagacin. Las tcnicas de micropropagacin resul-tan atractivas debido a las altas tasas de multiplicacin que se consiguen y al reducido material de partida reque-rido. No obstante, presenta dificultades a la hora de reproducir la diversidad gentica almacenada y mantener suintegridad gentica.

PALABRAS CLAVE: AlmacenamientoPropagacinBancos de germoplasmaCultivoin vitroCrioconservacinSemillas ortodoxas y recalcitrantes

Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. Vol. 16 (1), 2001

Recibido: 10-11-00Aceptado para su publicacin: 19-1-01


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INTRODUCCIN

La conservacin de la biodiversidad es un tema que ha venido ganando relevancia deforma progresiva en nuestra sociedad. La conservacin de la flora silvestre constituye una

pieza clave dentro de este enmarque. No slo se trata de la obligacin tica de preservareste legado que se nos ha dado para las generaciones venideras o del puro inters cientfi-co que puede aportar. La sociedad es cada vez ms consciente de la importancia de la flo-ra silvestre como fuente de alimentos, aceites y lubricantes, gomas, resinas, ceras, colo-rantes, fibra, energa, sustancias aromticas y principios medicinales, por su valor orna-mental y por su valor ecolgico como indicador y elemento restaurador de situacionesambientales degradadas (McNeely et al.,1990; Prance, 1997).

Sin embargo, a pesar del creciente inters suscitado por la diversidad de la flora silvestre,la actividad humana est ocasionando un progresivo deterioro de la misma. Segn datos delWorld Conservation Monitoring Centre (Walter y Gillett, 1998), el 12,5 % del total aproxima-do de 250.000 especies vegetales conocidas en nuestro planeta se encuentra en peligro de ex-tincin. En consecuencia, gran cantidad de especies vegetales estn desapareciendo antes deser identificadas o de que sus propiedades sean mnimamente evaluadas. Hasta el momentoslo el 10 % de las especies vegetales han sido evaluadas por su potencial agronmico o me-dicinal, por lo que existen un gran nmero de cultivos y principios medicinales por descubrir(Prance, 1997). En Espaa, la situacin es similar a la existente en otros pases. Segn datosdel Ministerio de Medio Ambiente (1999), el 12 % de 9.799 taxones de plantas vasculares

presentes en Espaa se encuentra en peligro de extincin. Ante estos datos, se impone la ne-cesidad de tomar medidas conducentes a la conservacin de la biodiversidad vegetal.

La conservacin toma especial relevancia en nuestros das dado el acelerado procesode degradacin ambiental en el que vivimos. Sin embargo, la preocupacin por la conser-vacin de los recursos vegetales es tan antigua como la propia civilizacin humana. En el

Neoltico, con el comienzo de la agricultura y el asentamiento de las poblaciones, el creci-miento y la presin de la poblacin llev al reconocimiento de la necesidad de conservarlos recursos biolgicos con objeto de asegurar un abastecimiento sostenible de alimento

para la comunidad (Chang, 1985; Maxted et al.,1997).En cualquier caso, la percepcin de la erosin gentica como un problema a escala

planetaria no tuvo lugar hasta bien entrado el siglo XX. Las seales de alarma comenzarona tomarse en serio a mediados de los aos sesenta, al descubrirse que el alto ritmo de des-

plazamiento de variedades primitivas cultivadas por la introduccin de nuevos cultivaresestaba llevando a un rpido estrechamiento de la base gentica de las especies cultivadas(Dodds, 1991; Maxtedet al.,1997). La toma de conciencia de esta situacin determin la

puesta en marcha de medidas para la conservacin de los recursos fitogenticos.Hoy en da, la conservacin de recursos genticos es aceptada de forma generalizada

como una responsabilidad social, dentro del contexto mucho ms amplio de preservacinde la biodiversidad. En este escenario, a la prdida de recursos genticos ocurrida por lasustitucin de variedades tradicionales por cultivares modernos, hay que aadir la ocasio-nada en especies vegetales silvestres a consecuencia del deterioro de los ecosistemas na-turales por la creciente actividad humana. La preocupacin por la prdida de la biodiver-sidad vegetal y la necesidad de tomar medidas para frenarla qued especialmente patenteen la firma del Convenio sobre Diversidad Biolgica con ocasin de la Conferencia de las

Naciones Unidas sobre el Medio Ambiente y Desarrollo celebrada en Ro de Janeiro(UNCED, 1992).

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MODALIDADES DE CONSERVACIN

La conservacin de la biodiversidad puede, en teora, aplicarse a tres niveles de orga-nizacin: gnica, organsmica y ecolgica. Con los avances de la ingeniera gentica en elaislamiento, secuenciacin y transferencia de genes, se acerca el momento en el que se es-tablezcan grandes bancos de genes para su conservacin. Sin embargo, por el momento,en la mayora de los casos, los genes no se conservan individualmente, sino formando

parte de organismos, poblaciones o ecosistemas. Al igual que los genes de un organismose asocian entre ellos a travs de mltiples interacciones, los individuos de una especie ode diferentes especies interaccionan dentro de un ecosistema. Por ello, cuando se acometela conservacin con el mximo nivel de informacin el ecosistema, no slo se conser-

van cada uno de sus componentes, sino tambin todas sus relaciones recprocas. Conse-cuentemente, se considera que la forma ms lgica y el mtodo ms econmico de con-servar una entidad biolgica es dentro del ecosistema del que forma parte (Gmez-Cam-

po, 1985; Prance, 1997).Idealmente, por tanto, la conservacin de los ecosistemas, y refirindonos al nivel de

organismos, la conservacin de especies amenazadas en sus hbitats naturales, o conser-vacinin situ,constituye la manera ms apropiada de enfocar la problemtica de conser-vacin (UNCED, 1992).

Conservacin in situ

La conservacin in situ de especies amenazadas implica una adecuada proteccin ygestin de sus ecosistemas. Existe un gran nmero de figuras de proteccin de espaciosnaturales en donde la actividad humana queda condicionada o restringida en mayor o me-nor medida. No obstante, frecuentemente la simple restriccin de la actividad humana enel entorno no resulta suficiente para asegurar la supervivencia de las especies a conservar.La gestin activa de un ecosistema para conservar una determinada especie puede reque-rir medidas de intervencin, como la preservacin del medio fsico en el que se desarrollala especie amenazada, la potenciacin de interacciones con otros organismos que llevenimplcito un beneficio para la especie amenazada, y el establecimiento de programas dereforzamiento de poblaciones existentes, reintroduccin en localidades donde la pobla-cin ya se haya extinguido o, incluso, la introduccin de nuevas poblaciones (Falk, 1989).

Para poder acometer de forma apropiada este tipo de acciones resulta necesario reca-bar previamente una gran cantidad de informacin sobre la especie a proteger y su ecosis-tema. Por ello, el proceso de conservacin in situse inicia con el estudio y seguimiento enel tiempo de las poblaciones, recabando datos demogrficos, genticos y autoecolgicos(Schemske et al.,1994; Gillman, 1997). La utilizacin de tcnicas de anlisis de viabili-dad de poblaciones constituye otra herramienta de gran valor por su capacidad diagnsti-ca y su poder de evaluacin al considerar diferentes alternativas de gestin (Menges,1986; Iriondo, 1996).

A menudo, las actividades de conservacin in situse encuentran con problemas deaplicacin derivados de la necesidad de establecer marcos legales de proteccin de lasreas y hbitats pertinentes, de conflictos de inters con otras actividades humanas, y defalta de una asignacin continuada y a largo plazo de recursos econmicos a las institu-ciones encargadas de las tareas de conservacin. A esto cabe aadir, en numerosas ocasio-


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nes, la falta de una informacin bsica sobre la biologa de las especies a conservar. Estetipo de limitaciones conlleva la necesidad de desarrollar mtodos de conservacin ex situ,o conservacin fuera del hbitat natural, que sirvan para complementar las acciones toma-das en los hbitats naturales (Reid y Miller, 1989).

Conservacin ex situ

Mientras est universalmente aceptado que el mecanismo ms efectivo y eficientepara la conservacin es la proteccin de los hbitats, tambin est reconocido que las tc-nicas de conservacinex situconstituyen componentes crticos en un programa de conser-

vacin global (Conway, 1988; Ashton, 1987).Los programas de conservacin ex situcomplementan la conservacinin situalmace-nando a largo plazo germoplasma representativo de las poblaciones, permitiendo un me-

jor conocimiento de las caractersticas anatmicas, fisiolgicas y bioqumicas del materialalmacenado, y proporcionando propgulos para su utilizacin en programas educativos,

programas de mejora gentica de especies cultivadas y en planes de reforzamiento, rein-troduccin o introduccin (McNeely et al.,1990).

Los mtodos de conservacinex situimplican la recoleccin de muestras representa-tivas de la variabilidad gentica de una especie y su mantenimiento fuera de las condicio-nes naturales en las que la especie ha evolucionado. Las ventajas que proporcionan estosmtodos son control directo sobre el material, fcil accesibilidad y disponibilidad (Reid yMiller, 1989).

Una vez realizada la recoleccin del material a conservar, la conservacin ex situdeespecies amenazadas consta de dos elementos esenciales: el almacenamiento o preserva-

cin del germoplasma y el desarrollo de mtodos que posibiliten su propagacin. No obs-tante, tambin deben tenerse presentes otros elementos relevantes tales como la documen-tacin y la caracterizacin del germoplasma almacenado (Hummer, 1999). Conviene te-ner presente que la reducida disponibilidad del material vegetal disponible es un factorque siempre acompaa a las actividades de conservacin de especies raras o amenazadas,de manera que la capacidad de ensayar protocolos y llevar a cabo experimentos con repli-cacin se encuentra a menudo muy limitada (Pence, 1999). Para solventar este problema,a veces se trabaja simultneamente con especies emparentadas no amenazadas donde ladisponibilidad de material no est limitada (McComb, 1985).

ALMACENAMIENTO DE GERMOPLASMA

El almacenamiento de germoplasma de especies amenazadas tiene lugar en forma decolecciones de plantas y en los bancos de germoplasma (Lalibert, 1997).

Colecciones de plantas

Las colecciones de plantas constituyen el mtodo tradicional de conservacin ex situde recursos fitogenticos. Bajo esta denominacin se pueden considerar tanto los jardines



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botnicos como las colecciones de plantas en campo. No obstante, el almacenamiento degermoplasma de especies amenazadas en forma de colecciones de plantas tan slo tienelugar bajo el cuidado de los jardines botnicos.

Los jardines botnicos pueden considerarse las primeras instituciones implicadas enla conservacin ex situde recursos vegetales. El establecimiento de colecciones de dife-rentes tipos de plantas se remonta a la antigedad, estando en muchos casos vinculado a

prcticas religiosas. Sin embargo, el gran desarrollo de los jardines botnicos tal como losconocemos en la actualidad lleg de la mano de las grandes potencias coloniales, que es-tablecieron numerosos jardines en sus posesiones de ultramar y en sus propios pasescomo mtodo de introduccin de plantas y cultivos exticos (Smith, 1986).

En la actualidad hay cerca de 1.500 jardines botnicos por todo el mundo, de los cua-

les ms de 500 desarrollan actividades de conservacin. Los jardines botnicos cultivanalrededor de 80.000 especies, de las cuales un 10 % se encuentra en peligro de extincin(Milleret al.,1995). Ello pone de manifiesto la importante contribucin de la red de jardi-nes botnicos a la conservacin de especies amenazadas.

La conservacin en jardines botnicos presenta una serie de problemas derivados desu irregular distribucin por el mundo y del escaso soporte financiero que reciben para sumantenimiento. As, por ejemplo, existen 532 jardines botnicos en Europa y solamente82 en frica y 66 en Amrica del Sur. En los pases tropicales, donde reside el mayor n-mero de especies, es donde menos jardines botnicos hay. Por ello, en el conjunto de los

jardines botnicos, la flora de los pases tropicales y subtropicales se encuentra peor re-presentada que la de los pases de climas templados (Maxted et al.,1997). A ello hay queunir el hecho de que la variabilidad intraespecfica mantenida suele ser baja, frecuente-mente cada accesin est slo representada por uno o unos pocos ejemplares. Por ello, sereconoce la necesidad de maximizar, en la medida de lo posible, la diversidad gentica de

las accesiones de los jardines botnicos (Heywood, 1990; Maxted et al.,1997).

Bancos de germoplasma

La conservacin ex situde germoplasma de especies raras y amenazadas est basadaesencialmente en la utilizacin de los bancos de germoplasma. Los bancos de germoplas-ma son centros orientados al almacenamiento mediante propgulos de una parte represen-tativa de la variabilidad gentica correspondiente a una determinada especie. Dentro deesta categora podemos distinguir los bancos de semillas, los bancos de cultivo in vitro,los bancos de polen y los bancos de genes o bancos de ADN.

Bancos de semillas

El almacenamiento de semillas ha interesado a la humanidad desde el inicio de laAgricultura hace 10.000 aos. Los antiguos agricultores almacenaban semillas para su uti-lizacin en la siembra del siguiente ao o como reserva de alimento. Sin embargo, no eshasta mediados del presente siglo cuando se inicia de forma sistemtica el almacenamien-to de semillas con fines cientficos o de conservacin. El almacenamiento del material aconservar en forma de semillas constituye uno de los procedimientos de conservacin ex

situms vlidos y extendidos en la actualidad. Se ha podido comprobar que el almacena-




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miento de semillas a largo plazo constituye una operacin relativamente simple y econ-mica en trminos de tecnologa, infraestructuras, personal y gastos de mantenimiento(Maxtedet al.,1997). De esta manera, resulta posible mantener un gran nmero de semi-llas de diferentes especies vegetales durante largos perodos de tiempo y con un mnimoriesgo de daos genticos. Las semillas presentan una serie de caractersticas que hacenque su almacenamiento sea el mtodo ms eficaz y econmico para la conservacin ex

situde especies vegetales. Por un lado, las semillas son unidades adaptadas a la dispersinen el tiempo y, por tanto, capaces en la mayora de los casos de permanecer viables, deforma natural, durante largos perodos de tiempo (Chin, 1994). En segundo lugar, el pe-queo tamao de las semillas, unido a la posibilidad de que cada una de ellas posea unaconstitucin gentica diferente, asegura la conservacin de una gran diversidad genticaen un espacio reducido (Iriondo y Prez, 1999).

La conservacin de semillas posee mayores requerimientos tcnicos que las coleccio-nes de plantas. Sin embargo, estas ltimas resultan caras en trminos de mano de obra yespacio, y slo permiten el mantenimiento de un nmero reducido de individuos por espe-cie. Adems, las colecciones de plantas resultan vulnerables frente a desastres naturalescomo incendios, tornados, plagas y enfermedades (Damania, 1996).

La conservacin de semillas ofrece como mnimo un servicio de seguridad y apoyo aotras tcnicas de conservacin, mientras que, en el otro extremo, puede constituir la nicaopcin disponible cuando los ltimos ejemplares de una especie estn a punto de desapa-recer (Reid y Miller, 1989). Por ello, entre todos los mtodos de conservacin, los bancosde semillas son los ms utilizados al ser simultneamente prcticos y econmicos.

En general, se utiliza el trmino coleccin base para las colecciones almacenadas alargo plazo, mientras que el trmino coleccin activa es aplicado a colecciones almace-nadas a medio plazo y se utiliza el trmino colecciones de trabajo para referirse a colec-

ciones de mejoradores almacenadas con objetivos a corto plazo. Por motivos de seguri-dad, a menudo se guardan duplicados de las colecciones base en otros bancos de semillas.Aunque el almacenamiento en bancos de germoplasma est universalmente aceptado

como parte integral de los programas de conservacin de plantas silvestres, las muestrasde semillas de plantas silvestres almacenadas en bancos de germoplasma suponen menosdel 2 % del total de germoplasma almacenado, destinado esencialmente a plantas cultiva-das (Astley, 1991).

Semillas ortodoxas y semillas recalcitrantes

Las semillas se clasifican como ortodoxas o tolerantes a la desecacin cuando son ca-paces de mantener su viabilidad tras ser desecadas a menos de 5-10 % de contenido en

humedad. Por el contrario, las semillas recalcitrantes o sensibles a la desecacin pierdenviabilidad cuando se desecan por debajo de un lmite crtico, habitualmente entre 12-30 %de contenido en humedad (Chin y Roberts, 1980). Existe una tercera categora en la quelas semillas tienen caractersticas de almacenamiento intermedias entre las ortodoxas y lasrecalcitrantes. Las semillas intermedias pueden ser desecadas a contenidos de humedadsimilares a los de las semillas ortodoxas. Sin embargo, las semillas, una vez desecadas, sedaan al someterlas a bajas temperaturas y su viabilidad desciende rpidamente durante elalmacenamiento (Ellis et al., 1990a). Por ello, la determinacin del comportamiento delas semillas de una especie constituye un tema trascendental de cara a su conservacin a



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largo plazo. Las semillas de especies con semillas ortodoxas pueden ser conservadas enbancos de semillas convencionales bajo condiciones de baja temperatura y humedad. Porel contrario, las especies con semillas intermedias o recalcitrantes no pueden mantenersede esta manera (Marzalina y Krishnapillay, 1999).

Afortunadamente, la mayora de las especies silvestres de las zonas templadas delplaneta forman semillas ortodoxas. Las semillas recalcitrantes se encuentran en especiesacuticas, especies con semillas de gran tamao, especies procedentes de zonas tropicalesy algunas especies arbreas de clima templado como Quercus, Acer y Aesculus (Chin yRoberts, 1980).

Principios de conservacin de semillas

El principio bsico para la conservacin de semillas es la limitacin de los cambiosqumicos que son originados por el metabolismo o los procesos de envejecimiento. Sesabe desde hace tiempo que unas condiciones de baja temperatura y bajo contenido en hu-medad prolongan la longevidad de las semillas. De acuerdo a las reglas de Harrington(Justice y Bass, 1978), existe una relacin exponencial entre la longevidad de las semillas,la temperatura y el contenido de humedad de almacenamiento, de manera que la longevi-dad de una semilla se duplica por cada reduccin de 5 C en la temperatura y por cada re-duccin de un 1 % en el contenido de humedad. De acuerdo con este modelo, las semillasconservadas a muy bajas temperaturas y con muy bajos contenidos de humedad deberanmantenerse viables durante milenios. Sin embargo, Vertucci y Roos (1990) y Elliset al.(1990b) han mostrado que existen lmites a los efectos beneficiosos de la desecacin so-

bre la longevidad y que estos lmites dependen de la composicin qumica de la semilla.

Tambin se ha comprobado que, en contra de lo establecido por las reglas de Harrington,los efectos de la temperatura y el contenido de humedad no son independientes (Vertucciy Roos, 1993). De todas formas, el uso apropiado de estos dos factores proporciona unava aceptable para la conservacin a largo plazo de muestras de semillas en bancos de ger-moplasma.

Conservacin de semillas ortodoxas en bancos de semillas convencionales

Los mtodos para la manipulacin de las semillas, el envasado, los ensayos de germi-nacin y el envo de muestras de semillas han sido evaluados en profundidad y se encuen-tran estandarizados para el caso de especies cultivadas (Ellis et al., 1985, FAO e IPGRI,1994) y, en principio, son igualmente aplicables a las especies silvestres.

Una vez que las semillas llegan al banco, stas se desecan hasta un contenido de hu-medad de 3-7 % (FAO e IPGRI, 1994). A continuacin se limpian, se cuentan y se ensayasu viabilidad antes de colocarlas en recipientes. Los recipientes utilizados para el almace-namiento suelen ser tarros de vidrio, tubos de ensayo, latas metlicas hermticas y bolsasde aluminio laminado (Chin, 1994; Iriondo y Prez, 1999).

Los mtodos de conservacin convencionales normalmente incluyen el almacena-miento a temperaturas comprendidas entre 5C y 20 C. En la conservacin a largo pla-zo las semillas se almacenan normalmente a 18 C, mientras que en la conservacin amedio plazo se utiliza una temperatura de 0 a 10 C (Ellis et al., 1985).




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Independientemente de las condiciones de almacenamiento utilizadas, la viabilidad delas muestras debe ser controlada peridicamente. Si el porcentaje de germinacin es infe-rior al 85 % del valor inicial en muestras almacenadas en colecciones a largo plazo y al65 % del valor inicial en colecciones activas, se recomienda su regeneracin ya sea me-diante nuevas recolecciones o por multiplicacin a partir de las semillas viables (FAO eIPGRI, 1994). La regeneracin mediante recoleccin en muchos casos no es posible al ha-

ber desaparecido las poblaciones naturales y la multiplicacin inevitablemente conllevaalteraciones en la composicin gentica de las muestras, originando, frecuentemente, unadisminucin de la variabilidad gentica y, en cualquier caso, prdida de genotipos. Porello, resulta prioritario garantizar unas condiciones adecuadas de almacenamiento para re-trasar en lo posible la regeneracin.

A cada muestra de semillas le corresponde informacin sobre el lugar de recoleccin,viabilidad inicial y mtodos para la ruptura de la dormicin. Igualmente importante resul-ta el nmero de identificacin del banco, el nombre de la especie y su localizacin en lascmaras de almacenamiento. De forma adicional, la muestra de semillas puede ser carac-terizada y evaluada bajo criterios genticos, fenotpicos y agronmicos. Toda esta infor-macin sobre las colecciones, de gran importancia para el futuro uso de las muestras al-macenadas, se organiza e incluye en una base de datos.

Conviene hacer una distincin entre el diseo y los procedimientos utilizados en unbanco de semillas de especies cultivadas y los llevados a cabo en un banco de semillas deespecies silvestres. Los bancos de semillas de especies cultivadas manejan miles de acce-siones de especies cuyas semillas son habitualmente de considerable tamao. En conse-cuencia, estos bancos de semillas necesitan mucho ms espacio y cierto nmero de facili-dades adicionales para cumplir sus objetivos. Por el contrario, los bancos de semillas deespecies silvestres normalmente poseen menos accesiones y las semillas almacenadas son

ms pequeas. El desecado puede realizarse mediante desecantes qumicos, un mtodopoco prctico para bancos de semillas de especies cultivadas. El gel de slice se vende conun indicador de cobalto que posee un color azul. Cuando absorbe humedad se torna rosa y

permite detectar la presencia de cualquier agujero o grieta en el envase. Las ampollas devidrio cerradas a la llama utilizadas en muchos bancos de semillas de especies silvestresson probablemente los envases ms adecuados para el almacenamiento de semillas, peroson demasiado caros y requieren demasiada mano de obra para los bancos de semillas deespecies cultivadas (Gmez-Campo, 1987).

La conservacin de semillas de especies silvestres ha experimentado un gran desarro-llo en Espaa a lo largo de las ltimas dcadas. El Banco de Germoplasma del Departa-mento de Biologa Vegetal de la Universidad Politcnica de Madrid ha sido pionero enestas actividades y en la actualidad cuenta con cerca de 9.500 accesiones de semillas.Otras instituciones que cuentan con bancos de semillas de especies silvestres son el JardnBotnico de Crdoba, el Jardn Botnico de Madrid, el Jardn Canario, el Jardn Botnico

de Valencia, el Jardn Botnico de Sller (Mallorca) y el Jardn Botnico Marimurtrade Blanes (Girona) (Ministerio de Medio Ambiente, 1999). El resto de los pases de la re-gin mediterrnea posee una cobertura de bancos de semillas de especies silvestres mu-cho ms escasa. Desde la Organizacin para la Investigacin Fitotaxonmica del reaMediterrnea (OPTIMA) se estn llevando a cabo diversas iniciativas encaminadas a tras-ladar el ejemplo de Espaa al resto de pases del Mediterrneo (Iriondo y De Hond,1996).



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Crioconservacin de semillas ortodoxas

A la conservacin de material vivo a muy bajas temperaturas se le conoce con elnombre de crioconservacin (Pritchard, 1995). En la crioconservacin se persiguen tem-

peraturas inferiores a 130 C para alcanzar unas condiciones de ausencia de agua en es-tado lquido, baja energa cintica molecular y una difusin extremadamente lenta, y aslograr que las reacciones qumicas se encuentren prcticamente paralizadas (Pritchard,1995). Bajo estas condiciones, se postulan longevidades extremadamente largas y slo li-mitadas por la acumulacin de lesiones genticas producto de la radiacin de fondo. Lastcnicas de crioconservacin utilizan normalmente nitrgeno lquido (196 C) debido asu coste relativamente bajo (Benson, 1999).

Los protocolos para el almacenamiento en nitrgeno lquido de semillas ortodoxasfueron establecidos por Stanwood y Baas (1981). Se ha podido comprobar que las semi-llas ortodoxas de un gran nmero de especies son capaces de sobrevivir a la crioconserva-cin en nitrgeno lquido (i.e. Iriondo et. al,1992). En algunas especies se han observadoroturas de las semillas y agrietamiento de las cubiertas seminales (Stanwood, 1985). Sinembargo, un control cuidadoso de la velocidad de enfriamiento, el contenido de humedadde la semilla y la velocidad de descongelacin pueden ser cruciales para obviar estos da-os. Las semillas pequeas son las que se adaptan mejor a esta tcnica, mientras que lasespecies con semillas grandes y con alto contenido en lpidos son las ms problemticas.

Las semillas se almacenan normalmente en recipientes especficamente diseadospara tal efecto en la fase de vapor del interior de tanques que contienen nitrgeno lquido,aproximadamente a 160C. El nivel de nitrgeno lquido se vigila peridicamente paramantener las semillas almacenadas a la temperatura de 160C (Iriondo y Prez, 1999).

Las semillas ortodoxas no suelen requerir un enfriamiento gradual. Sin embargo,

cuando el contenido de humedad de las semillas es alto puede resultar necesario una dese-cacin previa de las mismas, ya que el contenido de humedad de las semillas es uno delos factores ms importantes para controlar la respuesta de la semilla a la exposicin a ni-trgeno lquido (Vertucci, 1989; Vertucci y Roos, 1993). Nuestros estudios han mostradoque las semillas de numerosas especies silvestres y cultivadas que tras la recoleccin pre-sentan contenidos de humedad entre 4 y 12 % pueden ser almacenadas directamente ennitrgeno lquido, sin necesidad de desecacin previa ni de un enfriamiento gradual(Iriondo et al., 1992). La descongelacin de las semillas crioconservadas se lleva a cabocolocndolas directamente a temperatura ambiente al sacarlas de los tanques de criocon-servacin.

En estas circunstancias se evita la necesidad de llevar a cabo controles de viabilidad,responsables de una disminucin significativa del nmero de semillas almacenadas, y sesoslayan los riesgos de cambio gentico asociados a los procesos de multiplicacin. Otrasventajas de las tcnicas de crioconservacin son la ausencia de controles de temperatura yhumedad durante el almacenamiento, la inexistencia de daos por parsitos y patgenosy, en teora, una viabilidad indefinida. Por ello, los bancos de crioconservacin de semi-llas ortodoxas constituyen una alternativa interesante a los bancos de semillas convencio-nales, principalmente para muestras de las que no se dispone gran cantidad de semilla yde las que no es factible realizar nuevas recolecciones (Stanwood, 1985).

Estas tcnicas han sido utilizadas con xito en varias especies raras o amenazadas deEspaa, como Coronopus navasii(Cav.) DC., Vella pseudocytisus L., Cistus osbeckiifo-lius Webb ex Christ. y Helianthemum polygonoides, Peinado et al. (Gonzlez-Benito et




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al., 1998). De igual manera, diversas especies amenazadas estn siendo conservadas me-diante crioconservacin de semillas por parte de instituciones de Estados Unidos y Aus-tralia (Falk, 1987; Touchell y Dixon, 1994).

Adems de semillas ortodoxas, las esporas de pteridofitos y briofitos tambin puedenser crioconservadas. As, por ejemplo, se han logrado conservar con xito esporas del he-lecho arborescente amenazado Cyathea spinulosa (Agrawal et al., 1993) y del helecho

Asplenium billotii (Iriondo, no publicado).Las tcnicas de crioconservacin pueden igualmente resultar especialmente tiles en

el almacenamiento de semillas recalcitrantes y la conservacin de otros propgulos comopices de tallos, yemas o meristemos para los que no existen en la actualidad otras alter-nativas para la conservacin a largo plazo (Benson, 1999; Marzalina y Krishnapillay,

1999).

Conservacin de semillas recalcitrantes

Las semillas recalcitrantes tienen longevidades cortas que oscilan entre unas pocassemanas y varios meses (Chin y Roberts, 1980). Los tres factores que contribuyen a lacorta longevidad de las semillas almacenadas son: sensibilidad a la desecacin, daos porfro y problemas de contaminacin microbiana y germinacin durante el almacenamientoasociados a su alto contenido en humedad.

Se sabe que la velocidad de desecacin, el estado de desarrollo, la temperatura y laconcentracin de O2son factores que afectan al contenido crtico de humedad de las semi-llas recalcitrantes (Berjaket al., 1993). Esto indica que la expresin de la sensibilidad a ladesecacin es un carcter multifactorial en el que las condiciones ambientales y el meta-

bolismo juegan un papel fundamental. Las semillas recalcitrantes se caracterizan a menu-do por su incapacidad para limitar su metabolismo o por disponer de un sistema de elimi-nacin de radicales libres incompleto y, en consecuencia, por quedar expuestas durantelargos perodos a los radicales libres.

Para mantener la viabilidad, las semillas recalcitrantes se conservan a una temperatu-ra tan baja como sea posible bajo condiciones que mantengan un contenido de humedadde las semillas ligeramente superior al lmite crtico y aseguren un aporte de oxgeno parala respiracin (Marzalina y Krishnapillay, 1999). Dado que la longevidad de las semillas

bajo estas condiciones es tan slo del orden de semanas o meses, estas especies se conser-van habitualmente en colecciones de campo.

En la actualidad se estn desarrollando mtodos para que los tejidos puedan ser ex-puestos a temperaturas inferiores a 0C sin que se forme hielo letal. Estos mtodos re-quieren optimizar el contenido de humedad de la semilla y enfriar los tejidos hasta unatemperatura apropiada y a una velocidad adecuada de manera que tanto los daos por de-secacin como por congelacin sean evitados (Chin, 1988).

Uno de estos mtodos est orientado a semillas recalcitrantes que son extremadamen-te sensibles a la desecacin y no pueden sobrevivir a contenidos de humedad inferiores al60 % (por ejemplo, ctricos). Estas semillas se almacenan en un estado de vitrificacin enel que no se forman cristales de hielo a pesar de encontrarse a temperaturas inferiores a0C (Fahy et al.,1984). Estos cristales de hielo se evitan mediante el tratamiento de lassemillas con sustancias crioprotectoras y la utilizacin de velocidades de enfriamiento ex-tremadamente rpidas (hasta 2.000C/min). Las sustancias crioprotectoras previenen la



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desnaturalizacin de los constituyentes de la clula durante la fase de desecacin y estabi-lizan el estado de vitrificacin (Benson, 1999). Se ha observado que muchos sistemas ve-getales recopilan este tipo de sustancias durante determinados estados de desarrollo. As,durante la maduracin de la semilla, las semillas ortodoxas acumulan cantidades masivasde azcares y protenas que se consideran protectoras frente a varios tipos de estrs (Ver-tucci y Roos, 1990). Las sustancias protectoras de sntesis habitualmente utilizadas son eldimetil sulfxido (DMSO) y el etilenglicol. Una vez que se optimiza el contenido de hu-medad en la semilla, los tejidos se enfran rpidamente con nitrgeno lquido. La descon-gelacin de las muestras crioconservadas tambin es crtica y normalmente se lleva a cabode forma rpida para evitar la formacin de hielo.

Una segunda aproximacin a la conservacin de semillas recalcitrantes consiste en

separar los ejes embrionarios de los cotiledones, desecarlos y almacenarlos en nitrgenolquido. La recuperacin de la planta tras el almacenamiento es mediante tcnicas de cul-tivoin vitro.As, por ejemplo, se han realizado ensayos en este sentido con Quercus fagi-neay Corylus avellana,habindose obteniendo tasas de recuperacin del 60 y 80 %, res-

pectivamente (Gonzlez-Benito y Prez 1992, 1994b).

Bancos de cultivoin vitro

Si bien la conservacinex situen bancos de semillas constituye la alternativa ms uti-lizada, en ciertas especies surgen problemas de propagacin o conservacin que impideno dificultan el uso de dicha solucin. Este sera el caso de: a) especies con semillas recal-citrantes (Roberts y King, 1982); b) especies que no producen semilla, con baja o nulafertilidad o con produccin reducida de semillas o de polen (Pence, 1999); c) clones conelevado grado de heterocigosis que han sido seleccionados por sus caractersticas en una

poblacin natural y que deben ser mantenidos mediante propagacin vegetativa. La con-servacin por semilla permite el almacenamiento de los genes del clon, pero puede resul-tar dificil recuperar la combinacin heterocigtica para la que fueron seleccionados losclones (Withers, 1985); d) especies perennes con ciclos de vida muy largos que no produ-cen semilla hasta cierta edad. Estas especies se suelen propagar vegetativamente paraacortar la entrada en produccin, aunque posean semillas viables y con capacidad de serconservadas en un banco de germoplasma; e) especies con una poblacin natural extrema-damente reducida donde la mera recoleccin de semillas pueda afectar a la supervivenciade la poblacin (Clemente, 1999). En estos casos, las tcnicas de almacenamiento o con-servacinin vitroconstituyen una alternativa vlida a la conservacin de semillas de es-

pecies raras o amenazadas.Los protocolos de conservacinin vitrose atienen, en todos los casos, a las siguientes

etapas: a) obtencin del explanto; b) establecimiento del cultivo; c) almacenamiento;d) recuperacin de un cultivo viable; e) regeneracin de plantas (Dodds, 1991).

En este protocolo el almacenamiento es normalmente la etapa que implica ms cos-tes, tanto en equipamiento como en personal. En el caso de que el cultivo se mantenga encondiciones normales (crecimiento continuo), los repicados debern hacerse en intervalosque oscilarn de varios das a varios meses, dependiendo del tipo de cultivo y de las espe-cies. Adems, en estas circunstancias, los subcultivos estn expuestos a un continuo ries-go de prdidas por accidente o contaminacin, a lo que hay aadir el riesgo de alteracio-nes genticas (variacin somaclonal) (Phillips et al., 1994; Lynch, 1999; Pence, 1999).




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El perodo comprendido entre repicados puede extenderse induciendo un crecimientolimitado del cultivo mediante reduccin de la temperatura y/o iluminacin, estrs osmti -co, reduccin de la presin parcial de oxgeno, desecacin del material vegetal, o altera-cin de los medios de cultivo, eliminando componentes nutritivos o incorporando retar-dantes de crecimiento. Entre estas alternativas, la utilizacin de bajas temperaturas y lamanipulacin de los componentes del medio de cultivo son las ms aconsejables desde un

punto de vista prctico, por su eficacia y simplicidad (Lynch, 1999).Si bien las tcnicas de almacenamiento in vitrose han aplicado de forma extensiva en

la conservacin de recursos fitogenticos de plantas cultivadas (Dodds, 1991), existenmuy pocos precedentes de aplicacin en especies amenazadas (Arora y Bhojwani, 1989).En Espaa se han utilizado las tcnicas de almacenamientoin vitromediante crecimiento

limitado con Centaurium rigualii, Coronopus navasii, Lavatera oblongifolia, Limoniumcalaminare, Limonium catalaunicum, Limonium dufourii, Limonium esteveiy Limoniumgibertii (Iriondo y Prez, 1991; Martn, 1993). Las mejores condiciones de almacena-miento se consiguieron a 5C en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) slo o suplemen-tado con 4,44 M benciladenina (BAP) + 0,54 M cido naftalenactico (NAA).

La conservacinin vitroa largo plazo pasa por el almacenamiento del material cultiva-do bajo condiciones de crioconservacin. Al igual que con la crioconservacin de las semi-llas, a estas bajas temperaturas el metabolismo queda totalmente paralizado, con lo que segarantiza la conservacin del material durante un perodo indefinido de tiempo. La criocon-servacin del material cultivado in vitroplantea mayores dificultades que la crioconserva-cin de semillas, debido al mayor contenido en humedad presente en los tejidos. Para supe-rar este problema se llevan a cabo tratamientos previos con sustancias crioprotectoras y sedesarrollan protocolos especficos de congelacin y descongelacin (Pence, 1999).

La aplicacin de estas tcnicas al almacenamiento de especies amenazadas ha sido

hasta el momento muy escasa. En Espaa se ha experimentado con las tcnicas de crio-conservacin de vitrificacin y encapsulacin-deshidratacin en Centaurium rigualiiy enAntirrhinum microphyllum (Gonzlez-Benito y Prez, 1994a; Gonzlez Benito et al.,1997; Gonzlez-Benito et al.,1998).

Bancos de ADN

Con el avance de las tcnicas de ingeniera gentica que posibilitan la transferenciade genes entre especies totalmente distintas, una nueva alternativa que comienza ahora a

perfilarse es la instalacin de bancos de ADN. Entre sus ventajas estn la pequea canti-dad de material vegetal necesaria para su almacenamiento y la posibilidad de transferirgenes a genotipos o especies relacionadas. Esta tcnica puede ser utilizada con especies

amenazadas o incluso extintas tomando muestras del material en vivo o a partir de espec-menes de herbario (Wanget al., 1993). En los bancos de ADN, el ADN extrado de indi-viduos de una determinada poblacin se almacena a bajas temperaturas (congeladores a

80C o tanques de nitrgeno lquido). En la actualidad, esta alternativa slo presentautilidad en el caso de especies o gneros cuyo genoma ha sido profundamente estudiado ydonde se conocen las secuencias de numerosos o importantes genes. Sin embargo, es po-sible que en un futuro este tipo de bancos vaya extendindose a medida que se vayan im-

plantando las tcnicas de ingeniera gentica en los procesos de mejora y obtencin denuevos cultivares.



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Otros bancos de germoplasma

Los bancos de polen y los bancos de yemas vegetativas son otras dos opciones deconservacin que en principio podran ser aplicables a la conservacin de especies raras oamenazadas. En ambos casos, el almacenamiento se realiza a bajas temperaturas, siendoaplicables las tcnicas de crioconservacin. Los bancos de polen tienen la ventaja de querequieren un mnimo espacio y resultan aplicables tanto a especies con semillas ortodoxascomo a especies con semillas recalcitrantes. Sin embargo, slo conservan la mitad del ge-noma, el polen tricelular resulta muy difcil de almacenar, necesita de una coleccin decampo que proporcione flores femeninas para llevar a cabo una propagacin convencionaly los propgulos no estn directamente disponibles (Wang et al., 1993). Los bancos de

yemas vegetativas se utilizan en la actualidad en la conservacin de clones de especiesfrutales y requieren la puesta a punto de la tcnica de injerto sobre planta patrn. Esta tc-nica podra ser aplicable a determinados casos de especies arbustivas o arbreas en peli-gro de extincin.

PROPAGACIN

Una componente fundamental de la conservacinex situde especies raras o amenaza-das consiste en el desarrollo de mtodos de propagacin y cultivo que posibiliten la utili-zacin del material almacenado en operaciones de conservacin in situ como reforza-mientos, reintroducciones o introducciones, en estudios cientficos para un mejor conoci-

miento de la especie o en mbitos de divulgacin cultural y educativa como jardinesbotnicos o centros de interpretacin de espacios naturales.

Propagacin por semilla

Tanto en angiospermas como en gimnospermas el mtodo ms habitual de propaga-cin es a partir de semillas. El perodo que comprende desde la germinacin de la semillahasta el establecimiento de las plntulas es el ms vulnerable de todo el ciclo vital, ya quela semilla en germinacin est expuesta a drsticas variaciones en contenido de humedady temperatura y las plntulas son muy susceptibles a daos por plagas y enfermedades y ala competencia con otras plantas (Iriondo y Prez, 1999).

El perodo de germinacin se caracteriza a travs de dos parmetros: el porcentaje desemillas que germinan y la velocidad de germinacin. Cuando estos parmetros se estu-dian bajo condiciones ambientales ptimas controladas resulta posible estimar la germina-

bilidad intrnseca y el vigor de una muestra de semillas. Estos factores dependen esencial-mente de la existencia de dormicin, la presencia de infecciones microbianas, el tamaode la semilla, su edad y las condiciones de almacenamiento (Forbes y Watson, 1992).Mientras en las semillas de plantas cultivadas la germinabilidad de las semillas ha sidotan mejorada que no se tiene casi en consideracin, la baja germinacin de una muestra desemillas de especies silvestres puede constituir una grave limitacin para una propagacinefectiva (Iriondo y Prez, 1999).




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La dormicin o incapacidad del embrin para germinar debido a causas inherentes ala propia semilla suele ser a menudo uno de los factores que limita en mayor medida lagerminacin de semillas de especies silvestres (Bewley y Black, 1994).

Existen dos categoras bsicas de dormicin en funcin de la localizacin de los me-canismos que bloquean la germinacin. A menudo, la semilla presenta dormicin porquelos tejidos que envuelven al embrin (cubiertas seminales, endospermo, pericarpo) impi-den la germinacin. Los mecanismos que impiden la germinacin en la dormicin im-

puesta por las cubiertas pueden ser interferencia con la absorcin de agua o con el inter-cambio de gases, restricciones mecnicas, retencin de inhibidores procedentes del em-

brin y suministro de inhibidores al embrin. Este tipo de dormicin no se rompe en lanaturaleza hasta que la cubierta resulta daada por la actividad microbiana, por procesos

de congelacin o por el fuego (Bewley y Black, 1994). Por tanto, la manera de eliminareste tipo de dormicin, al objeto de incrementar el porcentaje de germinacin de las semi-llas, consiste en llevar a cabo una escarificacin de las cubiertas. Dependiendo de la espe-cie, la escarificacin puede llevarse a cabo por mtodos mecnicos (papel de lija), qumi-cos (cido sulfrico) o sometiendo a las semillas a elevadas temperaturas, en agua calien-te (calor hmedo) o en una estufa (calor seco) (Iriondo y Prez, 1999).

Por el contrario, se dan casos en los que la naturaleza de la dormicin reside en elpropio embrin y en donde la eliminacin de las cubiertas no permite la germinacin delembrin. En algunas orqudeas los embriones no se encuentran totalmente formados en elmomento de la dispersin de las semillas y necesitan tiempo para madurar. Ms frecuen-temente, la dormicin del embrin es consecuencia de la presencia de inhibidores en elmismo. El balance entre reguladores de crecimiento endgenos, inhibidores y promotoresde la germinacin resulta afectado por las condiciones ambientales externas que puedenllegar a romper la dormicin (Bewley y Black, 1994). Algunas semillas requieren ser im-

bibidas en agua a cierta temperatura durante algn tiempo. Esto se puede conseguir alma-cenando las semillas entre capas de arena u otro sustrato humedecido, procedimiento de-nominado estratificacin. Otros factores que pueden romper este tipo de dormicin son laalternancia de temperaturas, el lavado de inhibidores solubles al agua o la imbibicin ensoluciones de cido giberlico (Iriondo y Prez, 1999).

Existe una amplia literatura referida a estudios sobre la germinacin de semillas deespecies raras y amenazadas en la regin mediterrnea. Iriondo et al.(1994) proporcionanuna recopilacin de estudios llevados a cabo en este rea.

Propagacin vegetativa

Las tcnicas de propagacin vegetativa son muy importantes para la conservacin dela integridad gentica del material vegetal. Estas tcnicas se han desarrollado a lo largo devarios siglos y la investigacin en este campo es todava muy activa (Matthews, 1999).

Su utilizacin en el campo de especies vegetales amenazadas reside fundamentalmen-te en los jardines botnicos, a la hora de multiplicar material vegetal para su exposicin ocon fines de estudio o intercambio. No obstante, estas tcnicas tambin pueden ser utiliza-das de cara a la obtencin de material vegetal para actuaciones de reforzamiento, intro-duccin o reintroduccin cuando la reproduccin por va sexual no resulta factible o efi-caz. En estos casos se debe tener la precaucin de mantener controlada la identidad gen-tica del material propagado y de tener en cuenta, no slo la produccin de un determinado



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nmero de individuos, sino tambin la produccin de un mnimo nmero de genotiposdistintos.

Existe un amplio abanico de tcnicas de propagacin vegetativa y la eleccin de lams adecuada pasa por tener previamente un profundo conocimiento de la morfologa dela especie y de la existencia de algn medio de propagacin vegetativa natural en la mis-ma (Hartmannet al., 1997). Si bien la propagacin por esquejes o estaquillas de tallo es latcnica ms utilizada, no deben olvidarse otras posibilidades, como divisin de mata, divi-sin de rizomas, tubrculos y estolones, propagacin por bulbos, seudobulbos o bulbillos,

propagacin mediante esquejes de hoja, propagacin a partir de races y propagacin porinjerto (Hartmann et al., 1997).

Micropropagacin

Las tcnicas de cultivo in vitrohan sido utilizadas de forma extensiva en la propaga-cin y conservacin de recursos fitogenticos en agricultura (George y Sherrington, 1984;Dodds, 1991). De igual manera estas tcnicas han sido adaptadas para su utilizacin en unamplio rango de especies silvestres con problemas de propagacin por mtodos conven-cionales y/o con poblaciones extremadamente reducidas (Fay, 1992).

En la mayora de los casos, la micropropagacin se lleva a cabo utilizando yemas omeristemos caulinares como material de partida (Lynch, 1999). Los meristemos tienen laventaja de ser un material muy estable desde un punto de vista gentico y de encontrarsenormalmente libre de virus. No obstante, a menudo resulta difcil su utilizacin debido aque su manipulacin es ms compleja a consecuencia de su reducido tamao(0,2-1,0 mm) y al largo perodo de tiempo requerido para el desarrollo de los tallos. Debi-

do a ello es ms frecuente la utilizacin de explantos caulinares constituidos por el meris-temo apical y uno o ms nudos, debido a que son ms fciles de manipular, se establecenrpidamente y a menudo proliferan bien. En esencia, el proceso conlleva cinco etapas(Clemente, 1999): 1) preparacin de las plantas madre donadoras de los explantos, al ob-

jeto de que se encuentren en condiciones fisiolgicas y sanitarias ptimas; 2) estableci-miento del cultivo, introduciendo los explantos iniciales, previamente sometidos a asep-sia, en el medio de cultivo; 3) multiplicacin, a partir de las yemas axilares de los tallosen desarrollo o mediante la induccin de yemas adventicias; 4) elongacin de los tallos yenraizamiento, y 5) aclimatacin a condiciones ex vitro,mediante la exposicin progresi-va de las plantas a las condiciones de temperatura, luz y humedad existentes en el inver-nadero.

Cuando se trata de conservar la mayor diversidad gentica posible de una poblacin,las semillas constituyen normalmente el material de propagacin preferido. Si la germina-cin de las semillas es baja cuando se utilizan mtodos convencionales, las tcnicas decultivo in vitro pueden contribuir a mejorar los porcentajes de germinacin (Fay et al.,1999). Adems, cuando la disponibilidad de semillas es escasa, situacin comn en mu-chas especies amenazadas, a la germinacin in vitrole sucede una etapa de proliferacinal objeto de producir un mayor nmero de plantas. De esta manera, se ha llevado a cabocon xito la germinacin in vitrode varias especies de orqudeas tropicales amenazadas,como Dendrobium spectatissimum, Cymbidium rectum, Clowesia rosea y Epidendrumilenseutilizando diversos medios de cultivo, a menudo con la adicin de sustancias inde-finidas o complejas, como pulpa de banana y extracto de patata (Fay et al., 1999). En el




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caso de algunas orqudeas terrestres de climas templados (i.e. Orchis laxifloray Liparisloeselii) la germinacin in vitrose ha conseguido gracias al desarrollo de protocolos decultivo simbitico con micorrizas (Fay et al., 1999).

En la regin mediterrnea se han desarrollado mtodos de micropropagacin para unimportante nmero de especies amenazadas. Iriondo et al.(1994) aportan informacin so-

bre la aplicacin de tcnicas de micropropagacin en 63 especies mediterrneas. Ms re-cientemente, Gonzlez Benitoet al.(1999) recogen referencias publicadas correspondien-tes a 36 especies espaolas amenazadas.

Los beneficios potenciales del uso de sistemas de cultivoin vitropueden ser enormes,entre los que se encuentran: (1) las altas tasas de multiplicacin que se consiguen, (2) lade ser un cultivo asptico que puede mantenerse libre de hongos, bacterias, virus e insec-

tos parsitos, (3) el espacio reducido que ocupan, (4) la economa frente a colecciones decampo y (5) las mltiples aplicaciones en programas de mejora gentica (Dodds, 1991).Sin embargo, las tcnicas de micropropagacin no estn exentas de problemas. En

muchos casos, la micropropagacin de una especie presenta enormes dificultades debidasa la contaminacin del material de partida, la falta de respuesta del explanto inicial, la hi-

perhidratacin de los tallos y la ausencia de enraizamiento (Lynch, 1999). Un problemaadicional es la posible ocurrencia de variacin somaclonal, entendindose sta como laaparicin de variacin gentica en el material vegetal a consecuencia del cultivo in vitro(Scowcroft, 1985). Este problema, existente en las diversas aplicaciones de las tcnicas demicropropagacin, cobra especial importancia en la conservacin de especies amenaza-das, en donde lo que se pretende es conservar la diversidad gentica original procedentede una poblacin natural (Fayet al., 1999; Pence, 1999; Touchell y Dixon, 1999). El pro-

blema puede ser minimizado mediante una cuidadosa seleccin del material vegetal departida y de los medios de cultivo, y la evaluacin gentica del material micropropagado

(Iriondo y Prez, 1996; Lynch, 1999).La dificultad para propagar material genticamente diverso y el riesgo de variacinsomaclonal hacen que las tcnicas de cultivo in vitrosolamente se deban utilizar en con-servacin en casos crticos en los que la propagacin por semilla resulta inviable o muy

poco efectiva.

CONSIDERACIONES FINALES

En la actualidad se considera que las tcnicas de conservacin in situyex situconstitu-yen aproximaciones complementarias para alcanzar un objetivo comn (Falk, 1989;UNCED, 1992; Ramanatha Rao y Riley, 1994). De igual manera, los diversos mtodos dealmacenamiento y propagacin disponibles no deben identificarse como alternativas exclu-yentes (Withers, 1993). Los planes de recuperacin de especies amenazadas tienden haciaun enfoque integrado en la utilizacin de los mtodos de conservacin. Cada tcnica deconservacin posee ventajas e inconvenientes y por ello resulta interesante complementarunos y compensar otros mediante la integracin de varios mtodos (Maxted et al., 1997).

Un elemento clave inherente a cualquier tcnica de conservacin es el adecuado ma-nejo de la informacin. Para una adecuada gestin in situse requiere obtencin, organiza-cin y procesado de informacin relativa a la biologa de la especie a conservar, la ubica-cin de las poblaciones y las caractersticas del medio fsico y bitico (Schemske et al.,



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1994). Paralelamente, en conservacinex situlos bancos de germoplasma y jardines bot-nicos requieren igualmente una adecuada recopilacin y manejo de la informacin relati-va a las colecciones, su identidad taxonmica y gentica, su estado fisiolgico y sanitario,su ubicacin en el centro y los datos de origen del material vegetal. Por todo ello, el xitoy los beneficios de los programas de conservacin dependen en gran medida de este fac-tor, que, en ocasiones, no es suficientemente considerado.

SUMMARY

Germplasm conservation of rare and threatened plant species

Ex situ conservation techniques are basic elements in a global conservation program. They essentially con-sist of germplasm storage and propagation operations. Storage is performed through the maintenance of plantcollections in botanical gardens and the establishment of germplasm banks. Among the different types of germ-plasm banks, seed banks are the simplest and most efficient alternative for the storage of species with orthodoxseeds. These seeds can also be stored using cryopreservation techniques. The storage of recalcitrant seeds ismore troublesome due to their sensitivity to desiccation and in vitrobanks can be an alternative to seed bankswhen seed storage is not feasible. DNA stocks, pollen banks and bud banks are other possibilities for storagescarcely used yet.

Seed multiplication is the most frequent method of propagation. However, the dormancy displayed bymany seeds of wild plant species often reduces the efficiency of this method significantly. When seed propaga-tion is not feasible or there is an interest in the propagation of a particular genotype, conventional techniques ofvegetative multiplication or micropropagation techniques can be used. Micropropagation techniques are attracti-ve due to its high multiplication rates and the reduced amount of starting material that is required. Nevertheless,significant problems can arise to reproduce the stored genetic diversity of one species and maintain its geneticintegrity.

KEY WORDS: Storage

PropagationGermplasm bankIn vitrocultureCryopreservationOrthodox and recalcitrant seeds

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Artículo sobre la Conservación de Germoplasma de Especies Raras y Amenazadas (Revisión) Por J Mª Iriondo Alegría (2001)