Endosporas y formas de persistenciaLas endosporas bacterianas son formas de perdurabilidad de ciertos grupos de bacterias frente al calor, la desecacin, la radiacin y las influencias qumicas. Contienen un genoma y toda la maquinaria metablica esencial. La termorresistencia de las endsporas es una de sus principales caractersticas. Mientras que las bacterias o las formas vegetativas de las bacterias esporuladoras sometidas a 80 C durante diez minutos (pasteurizacin) mueren, las endsporas sobreviven e incluso soportan un calentamiento superior. Para eliminarlas son necesarias tcnicas de esterilizacin. Esta caracterstica permite un fcil mtodo de aislamiento de las bacterias esporuladas, calentando el material donde se supone que existen esporas a 100 C durante 10 minutos mueren todas las bacterias y, seguidamente, las esporas sobrevivientes se hacen germinar y crecer en el medio de cultivo adecuado. Son formadoras de esporas las bacterias bacilares Gram positivas, entre ellas, las pertenecientes al genero Bacillus son aerbicas y las del genero Clostridium anaerbicas. Un aspecto interesante es que el contenido de GC de este tipo de bacterias es bajo, los clostridios contienen la menor proporcin de GC de los procariotas: 22 al 27 %.

Endsporas y formas de persistenciaIntroduccinLas endsporas bacterianas son formas de perdurabilidad de ciertos grupos de bacterias frente al calor, la desecacin, la radiacin y las influencias qumicas. Contienen un genoma y toda la maquinaria metablica esencial. La termorresistencia de las endsporas es una de sus principales caractersticas. Mientras que las bacterias o las formas vegetativas de las bacterias esporuladoras sometidas a 80 C durante diez minutos (pasteurizacin) mueren, las endsporas sobreviven e incluso soportan un calentamiento superior. Para eliminarlas son necesarias tcnicas de esterilizacin. Esta caracterstica permite un fcil mtodo de aislamiento de las bacterias esporuladas, calentando el material donde se supone que existen esporas a 100 C durante 10 minutos mueren todas las bacterias y, seguidamente, las esporas sobrevivientes se hacen germinar y crecer en el medio de cultivo adecuado.

Son formadoras de esporas las bacterias bacilares Gram positivas, entre ellas, las pertenecientes al genero Bacillus son aerbicas y las del genero Clostridium anaerbicas. Un aspecto interesante es que el contenido de GC de este tipo de bacterias es bajo, los clostridios contienen la menor proporcin de GC de los procariotas: 22 al 27 %.

Caractersticas

microscpicas

Observadas con microscopa ptica muestran una gran refringencia. Esto es debido al elevado ndice de refraccin, resultante de las protenas deshidratadas y concentradas en el pequeo espacio de la espora. Prcticamente toda la materia seca de la bacteria est en la espora que posee un volumen igual a la dcima parte de la bacteria que la origino. Se colorean en caliente con carlbolfucsina y no se decoloran cuando el frotis es lavado con etanol. Las bacterias formadoras de esporas se caracterizan por la posicin de la endospora en la clula madre antes de ser liberada. La espora pude ser central, terminal o subterminal, y la clula original puede o no hincharse para acomodar la espora.

Propiedadesno presentan actividad metablica gran resistencia al efecto del calor gran resistencia al efecto de las radiaciones gran resistencia al efecto de los productos qumicos La resistencia a los efectos del calor se atribuye al bajo contenido de agua (aprox. 15%) y al contenido de cido dipicolnico. La resistencia al efecto de las radiaciones se atribuye a la presencia de puentes disulfuro, resultante de la presencia de cistena en las protenas de la cubierta externa. La resistencia al efecto de los productos qumicos debe atribuirse a la impermeabilidad que presenta en esos casos la cubierta de la espora.

InduccinEn condiciones favorables los bacilos de las especies esporuladoras se reproducen indefinidamente en su forma vegetativa, la esporulacin no es una fase obligada del ciclo de vida de la bacteria. La formacin de esporas se desencadena cuando faltan nutrientes o se acumula un exceso de productos del metabolismo celular.

Puede inducirse la esporulacin colocando las clulas en agua destilada, la cual se produce a expensas de las sustancias de reserva de la clula y, probablemente como consecuencia de la ausencia de sustrato en el medio. Avalando esta hiptesis, la formacin de esporas no se produce si dentro de las cinco horas de puestas en agua destilada clulas vegetativas de Bacillus cereus, se agrega glucosa al medio. Desarrollo de la Endospora: El proceso de formacin de una endospora es complejo. El organismo modelo usado para estudiar la formacin del endospore es Bacilo subtilis. El desarrollo de una endospora requiere varias horas para terminar. Los cambios morfolgicos dominantes en el proceso se han utilizado como marcadores para definir etapas de desarrollo. Mientras que una clula comienza el proceso de formar una endospora, se divide asimtrico (etapa II). Esto da lugar a la creacin de dos compartimientos, de la clula ms grande de la madre y del foresporo ms pequeo. Estas dos clulas tienen diversos destinos de desarrollo. Los sistemas de comunicacin intercelulares coordinan la expresin clula-especfica del gene con la activacin secuencial de factores especializados de sigma en cada uno de las clulas. Despus (etapa III), el peptidoglucano en el tabique se degrada y el foresporo es engullido por la clula madre, formando una clula dentro de una clula. Las actividades de la clula y del foresporo de la clula madre conducen la sntesis de los compuestos endospora-especficos, la formacin de la corteza y la deposicin de la capa celular (etapas VI+V). Esto es seguido por la deshidratacin y la maduracin finales de la endospora (etapas VI+VII). Finalmente, la clula madre se destruye en una muerte programada, y la endospora se lanza en el ambiente. La endospora seguir siendo inactiva hasta que detecta la vuelta de condiciones ms favorables. Germinacin El proceso por el cual las esporas pasan a formar clulas vegetativas se denomina germinacin. Ocurre cuando se las coloca en el medio adecuado y se requiere en muchos casos la disponibilidad, entre otros, de glucosa, aminocidos y nuclesidos. Es posible elevar el porcentaje de esporas que germinan con un shock trmico. Entre los fenmenos de la germinacin destaquemos:perdida de la resistencia trmica aparicin de la respiracin aparicin de actividad enzimtica

excrecin de cido dipicolnico, pptidos y aminocidos ruptura de las cubiertas y aparicin del "tubo germinativo"(origen de la clula vegetativa) A este punto la pared celular de la clula emergente esta incompleta la coloracin de Gram por lo tanto no es la definitiva hay permeabilidad a molculas como el ADN (lo cual facilita fenmenos de transformacin)

11.1

CPSULA

CONCEPTOS GENERALES

La cpsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en acumulacin de material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular (o, en su caso, respecto de la capa S y de la vaina). Las cpsulas se pueden describir en funcin de:

su grado de asociacin con la superficie celular subyacente (sobre todo pared):0 Integral: ntimamente asociada con la superficie celular, a saber, con la P.C. Perifrica: asociada a la sup. celular slo en determinadas condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior. su consistencia y sus lmites externos: Rgida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la entrada de partculas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un lmite exterior definido. Flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partculas. Adems, es deformable y carente de lmites precisos. Hay una cierta confusin en la nomenclatura de las cpsulas. Nosotros usaremos los siguientes conceptos: Cpsulas en sentido estricto son aquellas de tipo rgido e integral. Capas mucilaginosas son las de tipo flexible y perifrico. Glucoclix es el conjunto de estructuras superficiales bacterianas, exteriores respecto de la pared celular, y compuestas de polisacrido. Las cpsulas son estructuras inertes, no vivas, carentes de papel activo (metablico), pero que confieren a las bacterias importantes propiedades: Adhesin a clulas hermanas, generando microcolonias y consorcios. Adhesin a sustratos inertes o vivos, lo que les permite `la colonizacin de sus nichos ecolgicos (p. ej., tejidos de organismos superiores) Proteccin contra agentes antibacterianos.

1.2

MTODOS DE OBSERVACION Y ESTUDIO

Su observacin a microscopa ptica en fresco es difcil, ya que su ndice de refraccin es similar al del medio. Al ser una estructura muy hidratada (99% de agua), su observacin con las tcnicas habituales de microscopa electrnica de transmisin (MET) y de barrido (MEB) revela una notable contraccin de su estructura. Adems, los colorantes habituales tienen poca afinidad hacia ella.

Imagen a microscopa ptica de la cpsula del neumococo (Streptococcus pneumoniae)

A microscopa ptica: Se recurre a tincin negativa por medio de nigrosina o tinta china

(resaltan como un halo transparente sobre el fondo oscuro del porta). A microscopa electrnica: Hay que recurrir a la estabilizacin previa de la estructura capsular (para evitar su contraccin ulterior) por medio de anticuerpos anticapsulares o de lectinas. Tras esta operacin, se procede a la tincin por una ferritina catinica (p. ej., el rojo de rutenio), con afinidad hacia polianiones. Para investigar ms sobre la estructura de la cpsula se recurre igualmente a difraccin de rayos X del polisacrido capsular. Aislamiento del material capsular: El material de las capas mucosas (es decir, de las cpsulas flexibles y perifricas) es muy fcil de aislar, ya que tiende a dispersarse continuamente en el medio de cultivo. Por lo tanto, se puede aislar directamente de los sobrenadantes resultantes de la centrifugacin del cultivo correspondiente. El material de las cspulas rgidas e integrales puede aislarse tratando al cultivo con agua caliente o con cidos o lcalis dbiles.

1.3

COMPOSICIN QUMICA Y ESTRUCTURA

En general, el material capsular se compone de macromolculas asimtricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades repetitivas: polisacridos o polipptidos. 1) cpsulas polisacardicas a) Heteropolisacridos aninicos, cuyas unidades repetitivas constan de azcares (osas), aminoazcares, cidos urnicos, polioles (en muchos casos con radicales fosfato, formiato, succinato, etc.). b) Homopolisacridos neutros, como i) ii) levanos (polmeros de unidades de fructosa unidas por (2 6) dextranos

iii) celulosa c) alginatos (p. ej., en Azotobacter, Pseudomonas), consistentes en una alternancia de distintos tipos de cidos urnicos. 2) cpsulas polipeptdicas (slo encontradas en el gnero Bacillus). Estn formadas por glutamil-polipptidos. As p. ej., en B. anthracis el pptido es slo de D-glutmico. Las cpsulas y capas mucilaginosas bacterianas constituyen el llamado antgeno K (capsular). Una misma especie puede constar de distintas razas, cada una de ellas con un Ag K distintivo, distinguible del de las dems por su composicin qumica y su

inmunorreactividad. Por ejemplo, en Escherichia coli se encuentran unos 70 tipos diferentes de especificidades de Ag K. Las cpsulas polisacardicas estn unidas a la superficie subyacente, sobre todo a la pared celular. La estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una ordenacin regular radial, o a veces, en lminas concntricas.

1.4

FUNCIONES En laboratorio, muchas bacterias suelen perder la capacidad de formar cpsulas al cabo de varios subcultivos. As pues, la posesin o no de cpsula es algo que no afecta a la viabilidad de las bacterias. Pero en medios naturales, las cpsulas confieren a las bacterias una serie de propiedades, que dependen del nicho ecolgico particular donde viva cada bacteria. Estudiaremos una serie de propiedades o papeles generales, comunes a todas las cpsulas, para concluir con algunos ejemplos de papeles especficos.1.4.1 PROPIEDADES O PAPELES GENERALES

1) Mejora en las propiedades de difusin de nutrientes hacia la clula. Los polisacridos extracelulares aninicos funcionan como una resina de intercambio. 2) Proteccin contra la desecacin 3) Proteccin contra la predacin por parte de protozoos. 4) Proteccin contra agentes antibacterianos: a) contra metales pesados b) contra bacterifagos c) contra clulas fagocticas (p. ej., la cpsula del neumococo) d) contra detergentes e) contra anticuerpos 5) Adhesin a sustratos: a) sobre sustratos inertes: propiedad importante, sobre todo en medios acuticos. La mayora de las bacterias acuticas no son planctnicas, sino que viven en interfases (superficies, sedimentos), donde los nutrientes difunden mejor. Veamos cmo se produce el proceso: i) la bacteria se adhiere por la cpsula al sustrato;

ii)

la cpsula supone un aumento de superficie bacteriana, lo que se traduce en una mejora en la capacidad de absorber nutrientes;

iii) la bacteria se multiplica, formndose una microcolonia donde los individuos estn ms protegidos frente a los agentes antibacterianos; iv) se forman consorcios con otros microorganismos. Ello permite una alianza o colaboracin metablica entre distintas especies, por la que se produce la degradacin concertada de sustratos insolubles. Esta propiedad tiene una serie de importantes secuelas econmicas: corrosin y obstruccin de caeras; formacin de placa dental y caries; formacin de biopelculas en catteres y prtesis quirrgicas

b) sobre sustratos vivos (tejidos de organismos superiores): i) En sistemas normales (efectos benficos): La flora (= microbiota) autctona que coloniza los epitelios de los animales superiores est englobada en glucoclix, estando las bacterias adheridas a la superficie tisular. Es decir, las cpsulas pueden actuar como adhesinas (molculas para la adhesin). Otro ejemplo de ello lo da la microflora autctona de la simbiosis del rumen En sistemas patolgicos: La cpsula es uno de los factores de virulencia, de los que depende el inicio de muchas infecciones por parte de bacterias patgenas. Si, adems, la flora autctona del individuo afectado est alterada o disminuida, esto supone un nicho ecolgico vaco o perturbado, que puede ser colonizado por bacterias patgenas, en parte gracias a su glucoclix, que adems las protege frente a surfactantes, clulas fagocticas, anticuerpos, etc. Muchas cpsulas polisacardicas no son reconocidas como material extrao por el sistema inmune, debido a que su estructura mimetiza estructuras del propio hospedador. Otras cpsulas sobrapasan la capacidad de respuesta del sistema inmune, o bien no activan eficientemente al sistema complemento.

ii)

PARED CELULAR BACTERIANA A diferencia de las clulas eucariotas, la sofisticacin de una bacteria est en sus envolturas. La pared celular se encuentra por fuera de la membrana citoplasmtica. Es una pared celular rgida, que est presente en todas las bacterias, con excepcin de los micoplasmas. La estructura y funcin de la pared celular es tan especial que constituye una caracterstica distintiva de las procariotas, que no posee ningn otro ser vivo. La pared celular desarrolla funciones vitales para la bacteria. La presencia de pared protege a la bacteria de la diferencia de presin osmtica entre el medio interno de la bacteria y el medio externo. De no existir la pared, la bacteria estallara. Funciona adems como una barrera para sustancias txicas qumicas y biolgicas presentes en el medio externo. La rigidez de la pared celular es la que proporciona la forma a la bacteria. Existen dos tipos de pared bacteriana, que pueden diferenciarse por sus caractersticas tintoriales. A principios del siglo XX el dans Hans Christian Gram utiliz por primera vez un mtodo de tincin que permiti dividir a las bacterias en dos grupo:

aquellas capaces de retener el colorante cristal violeta luego de la decoloracin con alcohol-acetona: Gram positivas aquellas que pierden el colorante por decoloracin: Gram negativas

Todas las bacterias pueden asignarse a un grupo o a otro de acuerdo a cmo aparezcan despus de la tincin, con excepciones: 1-las micobacterias, que tienen una estructura que responde a las de los Gram (+), pero que no se tie porque su pared tiene finos 3-los que un caen debajo alto del que lmite contenido de carecen resolucin de del de microscopio pared lpidos ptico celular 2-los treponemas, que tienen una estructura de pared de Gram (-), pero que no pueden ser observados porque son tan micoplasmas,

La pared celular est compuesta por un polmero mixto denominado peptidoglicano, glucopptido o murena. Esta polmero esta formado por una cadena lineal de dos aminoazcares alternados, N-acetilglucosamina y cido Nacetilmurmico. A cada residuo de cido murmico se halla ligado un tetrapptido compuesto de D y L-aminocidos alternados. Aproximadamente un tercio de los tetrapptidos presentes intervienen en la unin lateral entre cadenas adyacentes de murena. Algunas de estas cadenas tetrapeptdicas se unen entre s por medio de otros pptidos cortos que forman puentes cruzados entre las cadenas de aminocidos. Las cadenas de murena unidas por esos puentes peptdicos resulta en una supermolcula gigante nica que envuelve a la bacteria y forma la slida y rgida pared.

Pared

celular

en

las

bacterias

Gram

positivas

La pared celular de las Gram (+) es ms gruesa que la de los Gram (-). La pared clulas de los Gram (+) contiene dos componentes fundamentales, el peptidoglucano, descripto anteriormente y cidos teicoicos. Los cidos teicoicos estn formados por polmeros de glicerol fosfato o ribitol fosfato con sustituyentes laterales (azcares simples, aminoazcares y aminocidos). Cerca del 50% de la pared bacteriana est compuesta por cidos teicoicos y stos pueden unirse a los residuos del cido acetilmurmico del peptidoglucano. Una importante cantidad de cidos teicoicos se hallan unidos a glicolpidos de la membrana citoplasmtica, por lo que se los llama cidos lipoteicoicos. Estos cidos parecen participar en el anclaje de la pared celular a la membrana citoplasmtica. Los cidos teicoicos se encuentran slo en las bacterias Gram (+) y constituyen los mayores determinantes antignicos que definen la individualidad inmunolgica de esas bacterias. Existe una variedad de otras molculas que pueden formar parte de la pared celular de los Gram (+), aunque se encuentran en pequea cantidad. Algunas son polisacridos, como los polisacridos de Streptococcus, que definen la especificidad de grupo. Otras son protenas, como la protena M del Streptococcus del grupo A o la protena A del Staphylococcus aureus.

Pared

celular

en

las

bacterias

Gram

negativas

El espesor de la pared celular de una bacteria Gram (-) es considerablemente menor que el de una Gram (+) y estructuralmente dichas paredes tiene poca similitud entre s. La cantidad de murena es mucho menor en los Gram (-), pero igualmente forma una fina pero muy resistente monocapa que protege a la bacteria de la baja osmolaridad exterior y le da su forma, como ocurre con los Gram (+). La pared celular de los Gram (-) carece de cidos teicoicos. Slo unas pocas cadenas de murena estn unidas a otras cadenas paralelas por medio de los tetrapptidos y son suficientes como para formar una nica malla de murena. El resto de las cadenas permanecen sueltas y sumergidas en un fluido que contiene agua y molculas libres, para formar un gel periplsmico, que aparece a ambos lados, exterior e interior de la fina pared celular. El descubrimiento y la textura de este gel periplsmico ha modificado el concepto que se tena de la estructura de las envolturas de un Gram (-) y de la presencia del antes llamado espacio periplsmico. Este no es un espacio lleno de fluido, sino que es un verdadero gel que define al llamado periplasma. As, el periplasma contiene a la molcula nica de peptidoglucano y contiene protenas en solucin. Estas protenas son enzimas con distintas funciones, como fosfatasa alcalina, enzimas inactivadoras de antibiticos y otras protenas relacionadas al transporte activo de solutos hacia el interior de la bacteria. El tratamiento de una bacteria Gram (-) con lisozima o con ciertos antibiticos de la familia de las penicilinas, en un medio isotnico con el citosol bacteriano, genera unas formas esferoidales que han perdido parte pero no todas sus envolturas. Estas estructuras se denominan esferoplastos y pueden llegar a replicarse in Vitro. Cuando lo hacen, bajo condiciones especiales, se obtiene lo que se denomina formas L de una bacteria. Las formas L cuando son transferidas a un medio adecuado, pueden regenerar la bacteria Gram (-) de la que provinieron. Membrana externa: por fuera del periplasma se encuentra una estructura exclusiva de las bacterias Gram (-) denominada membrana externa. Parece una bicapa lipdica similar a cualquier membrana biolgica, pero su estructura es asimtrica y su composicin es diferente a la de las membranas de otros organismos vivos. La semicapa interior est compuesta por fosfolpidos, pero la exterior est compuesta por lipopolisacrido (LPS). Este LPS tiene actividad de endotoxina El 1-el lpido A, y es un altamente LPS fosfolpidos que txico para est contiene el ser humano formado glucosamina en vez de y otros mamferos. por: glicerol

2-un polisacrido no especfico, que posee una estructura conservada entre especies relacionadas de bacterias G (-) 3-las cadenas laterales del polisacrido, que definen al antgeno somtico O. este es el antgeno mas abundante sobre la superficie de toda bacteria G(-). En gran medida la asimetra de la membrana externa radica en que el LPS slo se halla en el lado exterior de la bicapa. La membrana externa no contiene la diversidad de protenas que contiene la membrana citoplasmtica, pero las pocas que estn presentes lo estn en gran cantidad. Adems de las porinas, que son protenas que forman poros en la membrana externa, a travs de los cuales las bacterias G(-) incorporan pequeas molculas hidroflicas por difusin; existe una protena llamada lipoprotena de Braun, o simplemente lipoprotena, que es la protena ms abundante en las bacterias G(-)