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GUIA DE PRCTICA
INGENIERA TISULAR
LICENCIATURA DE MEDICINA
UNIVERSIDAD DE GRANADA
Ingrid J Garzn Bello
Departamento de Histologa
Facultad de Medicina
Universidad de Granada
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PRESENTACIN Aproximadamente hace tres dcadas nace la Ingeniera
Tisular como una alternativa
de acercamiento hacia la reparacin de rganos y tejidos. El
termino ingeniera tisular
ha sido definido por la Nacional Science Foundation como La
aplicacin de los
principios y mtodos de la ingeniera y las ciencias de la vida
hacia el entendimiento
fundamental de la relacin entre estructura y funcin de tejidos
normales y patolgicos
para el desarrollo de sustitutos biolgicos que restauren,
mantengan o mejoren la
actividad de los tejidos u rganos perdidos o daados.
La indudable capacidad de la Ingeniera Tisular para regenerar
tejidos del propio
paciente a partir de clulas extradas del mismo convierte a esta
disciplina en una de
las de mayor potencialidad dentro del campo de la medicina
regenerativa.
De esta manera, la Ingeniera Tisular se nos presenta como un
campo en rpido
crecimiento que posiblemente representa el prototipo de los
futuros desarrollos
cientficos. En primer lugar su multidisiplinariedad y su
continua expansin durante la
ltima dcada, hace de esta disciplina emergente uno de los campos
de inversin ms
importantes en lo que se refiere a investigacin bsica. De este
modo, Estados Unidos
ha aumentado sus inversiones en el desarrollo comercial de la
Ingeniera Tisular, con
una tendencia claramente progresiva en lo que se refiere al
desarrollo de la
investigacin en este campo.
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El Departamento La informacin relativa al Departamento de
Histologa puede obtenerla en la direccin
http://www.ugr.es/local/histologia/
La Profesora En primer lugar, soy profesora en el rea de
Histologa en el departamento de
Histologa de la Facultad de Medicina y Odontologa de la
Universidad de Granada. En
dicho departamento, he adquirido mi formacin histolgica, docente
e investigadora.
Dicho departamento es un departamento de referencia en Espaa y
Amrica Latina al
que acuden numerosos profesionales para su formacin, entre
ellos, jvenes becarios
y profesores de distintas universidades americanas. El
departamento mantiene as
mismo, relacin de formacin e investigacin con centros europeos
de referencia
como: (Instituto Europeo de Ingeniera Tisular, Kings College of
London, University
College of London, Institute of Pathology, Johannes Gutenberg
University).
En mi periodo de formacin predoctoral, he tenido la oportunidad
de ampliar mis
estudios predoctorales realizando estancias en centros de
reconocido prestigio
internacional como el Kings College of London y el CNIC Centro
de Investigaciones
Cardiovasculares del Instituto de salud Carlos III.
Recientemente, he tenido la
oportunidad de profundizar mis conocimientos en el rea
estadstica obteniendo el
titulo de experto universitario en Estadstica por la Universidad
Nacional de Educacin
a Distancia (UNED) 2010.
La formacin recibida ha estado dirigida a la adquisicin de
conocimientos,
capacidades y habilidades en el rea de Histologa e Ingeniera
Tisular, especialmente
en el procesamiento de tejidos humanos normales y patolgicos,
cultivos celulares,
elaboracin de tejidos artificiales, histoqumica,
inmunohistoquimica, diagnostico
histolgico y terapia gnica.
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DECLOGO DE UN GRAN
MAESTRO AL QUE ADMIRO
1. El alumno (es decir, usted) es
lo ms importante.
2. Yo slo me justifico si le soy
til
3. Yo me debo a usted como
usted se deber a sus futuros
alumnos.
4. NO soy el enemigo: estoy de su
parte
5. Nunca le har dao
deliberadamente y espero que
usted a m tampoco. Y si me
equivoco, lo reconocer
tranquilamente.
6. No tengo derecho a humillarle,
a insultarle, a ridiculizarle y no lo
har (espero que usted tampoco
lo haga con sus alumnos).
7. No veo en usted a un alumno;
veo a un profesional en
formacin (que dentro de tres
aos ser colega mo). Espero
que as se vea usted a s mismo.
8. No lo s todo pero s cosas
que los dems no saben (como
todo el mundo).
9. A la hora de calificar su
rendimiento, procurar ser justo
(dentro de lo posible) y, ante la
duda, tender a beneficiarle.
10. Siendo importante para usted
lo que yo diga, ms importante
debe ser lo que yo HAGA. Est
atento y tome buena nota.
En segundo lugar quiero hacer nfasis en mi actividad
investigadora, la cual se ha
desarrollado en el Departamento de Histologa. En dicho contexto,
los resultados de mi
labor investigadora, han sido publicados en revistas
internacionales indexadas como: Tissue
Engineering, J Tissue Eng Regen Med, J Biomater
Appl, J Cell Physiol, Int J Artif Organs, Histol
Histopathol, Ophthalmic Res, J Periodontal Res,
Ann Vasc Surg, Exp Eye Res, Journal of
Histochemistry and Cytochemistry y otras.
Igualmente, los resultados de mi actividad
investigadora vinculados con la Ingeniera Tisular
han sido presentados en 46 comunicaciones en
congresos nacionales e internacionales de las
diferentes reas de conocimiento asociadas con la
Ingeniera Tisular.
Hasta el momento he participado en cinco
proyectos de investigacin financiados por
diferentes agencias nacionales y autonmicas
(Consejera de Innovacin, Ciencia y Empresa, FIS,
SAS) relacionados con la elaboracin de tejidos
artificiales mediante Ingeniera Tisular. As mismo,
participo en el grupo multidisciplinar de
investigacin que llevar a cabo el primer ensayo
clnico de cornea humana obtenida mediante
Ingeniera Tisular y adems he desarrollado dos
patentes una de ellas actualmente licenciada a 1
empresa nacional.
Como resultado de mi actividad investigadora, he
recibido 9 premios nacionales y 2 premios
internacionales de gran trascendencia en el rea de
Ingeniera Tisular donde me gustara destacar el
premio recibido en el segundo congreso mundial de
la Sociedad de Ingeniera Tisular y Medicina
Regenerativa celebrado en Sel-Korea, donde por
primera vez aportamos como contribucin relevante
la trasdiferenciacin de clulas madre de la
gelatina de Wharthon en clulas epiteliales para su
uso en Ingeniera Tisular, tema de gran relevancia
en el mundo cientfico.
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Como contactar a la Profesora? Soy su profesora y estar siempre
dispuesta a ayudarle! Las maneras de contactarme son: -Correo
electrnico: [email protected] -Departamento de Histologa. -Telfono:
958241000 Ext. 20456 Tenga en cuenta que siempre le atender con
respeto y con la mayor amabilidad posible, de la misma manera
espero que su trato sea cordial y respetuoso hacia m. Evite
comentarios desagradables personalmente y va e mail evite
abreviaciones y mensajes poco formales, sea siempre gramaticalmente
correcto le servir para toda la vida!
Plataforma SWAD
Qu es?: Un instrumento para la gestin de la asignatura y la
comunicacin entre
profesor y alumnos.
Cmo se accede? Una vez que yo le haya dado de alta (si usted
est
matriculado/a), entre en la direccin http://swad.ugr.es/ Escriba
su DNI y una
contrasea (le recomiendo que sea la misma que la del correo
electrnico para
que sea ms fcil recordarla). Una vez dentro es necesario elegir
la asignatura de
Didctica General para tener acceso a toda la informacin
disponible. Si es usted
alumno/a de la Universidad de Granada, puede usar libremente la
plataforma SWAD
en las asignaturas en las que haya sido dado de alta por sus
profesores. Si no sabe si
ha sido dado de alta en alguna asignatura, pruebe a entrar con
su nmero de DNI (sin
puntos ni letra final) sin escribir contrasea la primera vez (el
sistema le obligar a
crear una contrasea cuando entre). Si el sistema le permite
entrar, usted est dado
de alta en todas las asignaturas que aparezcan en el men "[mis
asignaturas]", situado
a la izquierda de la pantalla. Si ya est dado de alta en mi
asignatura, pero ha olvidado
su contrasea, pngase en contacto conmigo para que le asigne una
nueva.
Antes de entrar en la plataforma, tenga preparado a) una
fotografa tamao carnet
digitalizada en jpg y b) su direccin de correo electrnico.
Usted tiene que cumplimentar una ficha personal con sus datos,
direccin de correo
ugr. y fotografa. Si falta algn dato no podr ponerme en contacto
con usted.
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Informacin bsica de su nueva asignatura
LICENCIATURA DE MEDICINA
ASIGNATURA: INGENIERA TISULAR HUMANA
CURSO : Segundo
CRDITOS TOTALES: 5
CRDITOS TERICOS: 2,5
CRDITOS PRCTICOS: 2,5
REA DE CONOCIMIENTO: Histologa
DEPARTAMENTO: Histologa
Objetivos Generales
Describir las bases tericas y metodolgicas del desarrollo
celular y tisular humano y de la construccin de nuevos tejidos in
vitro e in vivo utilizando cultivos celulares y soportes
biocompatibles.
Adquirir las habilidades y destrezas en la utilizacin de tcnicas
de cultivos celulares
orgnicos aplicados a la ingeniera tisular.
Competencias
Espero que el desarrollo de la asignatura le permita adquirir
determinadas
competencias que le sern de utilidad en su futuro ejercicio
profesional. Entre ellas:
Investigar en equipo dentro de su grupo de trabajo de
investigacin basadas en el respeto.
Promover la independencia en el laboratorio para as desarrollar
investigaciones de calidad cientfica en el futuro
Disear experimentos integrando todos los conocimientos en el rea
de la Ingeniera Tisular
Aprovechar los recursos de material de investigacin para el
desarrollo de experimentos de base tanto cientfica como clnica
Resolver problemas de investigacin mediante experimentos
siguiendo el mtodo cientfico
Evaluacin
La asignatura Ingeniera Tisular Humana, se realizar a travs de
un examen terico y una evaluacin prctica. El examen terico
consistir en preguntas conceptuales y descriptivas. Para la
realizacin del mismo dispondr de 60 minutos. Para la evaluacin de
la actividad prctica, que tendr un valor el 30%, se tendr en cuenta
la asistencia a las mismas y la presentacin de un trabajo
acadmicamente dirigido referente al temario de la asignatura. Dicho
trabajo puede ser convalidado por las actividades relacionadas con
cursos reglados debidamente acreditados de temtica compatible con
la asignatura. Para superar dicho examen al menos debe alcanzar un
cinco. La calificacin final se otorga de acuerdo al R.D. 1044/2003
(B.O.E. 11 sept. 2003) con las siguientes puntuaciones. Aprobado
(5-6,9), Notable (7-8,9) y Sobresaliente (9-10). Las Matriculas de
Honor sern las mximas calificaciones dentro
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de los sobresalientes, teniendo en cuenta que se puede dar 1
matriculas de honor por cada 20 alumnos matriculados. ASIGNATURA:
INGENIERA TISULAR HUMANA
Programa terico
1. Ingeniera tisular. Medicina reparativa. Concepto.
Antecedentes.
INGENIERA TISULAR GENERAL: COMPOSICIN DE LOS TEJIDOS
ARTIFICIALES
2. La clula en ingeniera tisular. Clulas troncales o madre
humanas. Concepto.
Tipos.
Fuentes.
3. Determinacin y diferenciacin celular. Transdiferenciacin.
4. La matriz extracelular en ingeniera tisular. Concepto.
Tipos.
Biomateriales. Naturales,
sintticos e hbridos. Morfologa. Elaboracin de biomateriales.
5. Sistemas de sealizacin en ingeniera tisular. Seales solubles.
Interaccin
clula-matriz
extracelular. Contacto directo clula-clula. Estmulos
mecnicos.
6. Terapia gnica. Transferencia gnica. Mtodos. Material gentico
transferible.
Vehculo de
transferencia. Vectores. Aplicaciones.
7. Tecnologa y diseo para la construccin de tejidos. Ingeniera
tisular por
transferencia
celular. Ingeniera tisular por induccin. Ingeniera tisular por
elaboracin de
constructos.
8. Integracin de los tejidos artificiales en el cuerpo
humano.
Vascularizacin. Aceptacin
biolgica.
9. Control sanitario de los tejidos artificiales utilizados en
Medicina. Control
de
produccin. Banco de tejidos. Uso tutelado. Legislacin.
INGENIERA TISULAR ESPECIAL: APLICACIONES MDICAS
10. Ingeniera tisular del sistema cardiovascular. Injertos
vasculares.
Angiognesis. Clula
madre endotelilal. Regeneracin miocrdica.
11. Ingeniera tisular del sistema hematopoytico. Sustitutos de
clulas
sanguneas. Clula
madre hematopoytica.
12. Ingeniera tisular del sistema msculoesqueltico. Terapia
mioblstica.
Tendn.
Ligamentos. Cartlago articular. Hueso.
13. Ingeniera tisular del aparato digestivo. Estructuras
dentales. Intestino
delgado. Clula
madre intestinal. Hgado artificial. Clula madre heptica.
Pncreas. Islotes de
Langerhans.
14. Ingeniera tisular del sistema nervioso. Sistema nervioso
central.
Implantes: cerebrales y
medulares. Clulas madre del sistema nervioso. Sistema nervioso
perifrico.
Regeneracin de
la fibra nerviosa.
15. Ingeniera tisular de la piel. Clula madre epidrmica. Unidad
epidrmica
proliferativa. Piel
artificial.
LICENCIATURA DE MEDICINA
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ASIGNATURA: INGENIERA TISULAR HUMANA
Programa prctico
Prctica 1: Generalidades de metodologa sobre la investigacin
cientifica
Cultivos celulares en ingeniera tisular. Habilidades:
Conocimiento y aprendizaje de la metodologa cientifica
Prctica 2: Generalidades sobre cultivos celulares. Tipos de
cultivos celulares.
Aspectos generales
de las clelulas eucariticas en cultivo. Vocabulario. Ventajas y
desventajas de los
cultivos celulares.
Cultivos celulares en ingeniera tisular. Habilidades:
Conocimiento y aprendizaje de los materiales y equipos de un
laboratorio de cultivo celulares. Visita al
laboratorio de cultivos celulares. Norma e higiene y seguridad
en el laboratorio Aprendizaje de trabajo en condiciones estriles.
Uso y manejo de las campana de flujo laminar Preparacin de material
y reactivos (sueros, medios de cultivos, etc...)
Prctica 3: El laboratorio de cultivos celulares: Equipamiento
esencial de un
laboratorio. El
microscopio de contraste de fases: fundamentos. Requerimientos
de las clulas en
cultivo.
Condiciones de incubacin de tejidos y clulas. Soportes y
sustratos para cultivos
celulares.
Caractersticas fsico-qumicas de los medios de cultivos.
Habilidades: Aprendizaje y manejo de microscopio de contraste de
fases Descongelacin de lneas celulares de crecimiento en monocapa y
suspensin Cultivo de lneas celulares de crecimiento en monocapa y
suspensin
Prctica 4: Desarrollo de un cultivo celular (I): Obtencin de
muestras. Mtodos
de aislamiento y
separacin de clulas. Desarrollo, caracterizacin y almacenamiento
de clulas.
Contaminacin
del cultivo celular. Habilidades: Observacin de la evolucin de
un cultivo celular de crecimiento en monocapa y suspensin
Cambio de medio de cultivo Subcultivos de clulas de crecimiento
en monocapa Preparacin de medios para congelacin de clulas en
cultivos
Prctica 5: Desarrollo de un cultivo celular (II): Subcultivo
celular. Viabilidad
celular. Mtodos
morfolgicos y bioqumicos. Principio generales de criopreservacin
celular. Habilidades: Observacin de la evolucin del cultivo celular
Tripsinizacin y subcultivo de clulas con crecimiento en monocapa
Subcultivo de clulas con crecimiento en suspensin Evaluacin de la
viabilidad celular mediante azul tripan
Prctica 6: Cultivos en Ingeniera Tisular. Cultivos de clulas
madres. Habilidades: Observacin de la evolucin del cultivo celular
Ensayos de viabilidad celular Congelacin de los cultivos celulares
establecidos
Almacenamiento de las muestras congeladas
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LLEVE SIEMPRE A CLASE ESTA GUA Y LOS DOCUMENTOS ANEXOS
NECESARIOS PARA CADA TEMA
GUIONES PARA EL TRABAJO AUTONOMO
INGENIERIA TISULAR
Facultad de Medicina
D
Mdulo Prctico: Tcnicas instrumentales en ingeniera Tisular
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1.-OBTENCIN DE MUESTRAS DE TEJIDO HUMANO
PARA CULTIVO
Las muestras de tejido humano pueden obtenerse de distintas
fuentes. En
general, los tejidos ms utilizados para la generacin de cultivos
celulares
primarios son los siguientes:
- Piel de espesor total (dermis y epidermis).
- Mucosa oral (estroma y epitelio).
- Vejiga urinaria.
- Crnea.
Para la toma de muestras, se debe utilizar una tcnica estril,
aplicando
antispticos a la zona donante previamente a la toma de
muestra.
Habitualmente, se utilizar anestesia local, pero tambin es
posible la
anestesia general.
Una vez extrados, se lavarn brevemente los tejidos en suero
fisiolgico
estril, introducindose lo antes posible en medio de transporte
estril a
4C, donde se mantendrn hasta el momento de su procesamiento.
El
medio de transporte est constituido por medio de Eagle
modificado por
Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich Ref. D5796, Saint-
Quentin-Fallavier,
Francia) suplementado con altas concentraciones de antibiticos
(500 U/ml
de penicilina G y 500 g/ml de estreptomicina) y antimicticos
(1,25 g/ml
de anfotericina B) (Sigma-Aldrich Ref. A5955) para evitar una
eventual
contaminacin de la muestra. La composicin del medio de cultivo
DMEM se
muestra a continuacin en la tabla 1.
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras se
lavarn dos
veces en una solucin estril de PBS con altas concentraciones de
penicilina,
estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 g/ml y 1,25
g/ml,
respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre,
fibrina, grasa o
materiales extraos que pudieran encontrarse adheridos a las
muestras.
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Tabla 1. Composicin de los medios de cultivo DMEM y HAM-12
utilizados en este mdulo prctico. Todos los valores estn
expresados en gramos por litro de medio de cultivo.
COMPONENTE Dulbeccos Modified Eagles
Medium (DMEM) Nutrient Mixture F12 (Ham)
SALES INORGNICAS
CaCl22H2O 0.265 0.0441
CuSO45H2O 0.0000025
Fe(NO3)39H2O 0.0001
FeSO47H2O 0.000834
KCl 0.4 0.224
MgCl6H2O 0.123
MgSO4 0.09767
Na2HPO4 0.14204
NaCl 6.4 7.599
NaH2PO4 0.109
NaHCO3 3.7 1.176
ZnSO47H2O 0.000863
AMINOACIDOS
Glycine 0.03 0.00751
L-Alanine 0.009
L-ArginineHCl 0.084 0.211
L-AsparagineH2O 0.01501
L-Aspartic Acid 0.0133
L-Cystine2HCl 0.0626 0.035
L-Glutamic Acid 0.0147
L-Glutamine 0.584 0.146
L-HistidineHClH2O 0.042 0.02096
L-Isoleucine 0.105 0.00394
L-Leucine 0.105 0.0131
L-LysineHCl 0.146 0.0365
L-Methionine 0.03 0.00448
L-Phenylalanine 0.066 0.00496
L-Proline 0.0345
L-Serine 0.042 0.0105
L-Threonine 0.095 0.0119
L-Tryptophan 0.016 0.00204
L-Tyrosine2Na2H2O 0.10379 0.00778
L-Valine 0.094 0.0117
VITAMINAS
Choline Chloride 0.004
D-Pantothenic AcidCa 0.004 0.00048
Folic Acid 0.004 0.00132
Hypoxanthine 0.00408
Linoleic Acid 0.0000084
myo-Inositol 0.0072 0.018
Niacinamide 0.004 0.000037
PyridoxineHCl 0.004 0.000062
Riboflavin 0.0004 0.000038
ThiamineHCl 0.004 0.00034
Thioctic Acid 0.00021
Thymidine 0.00073
Vitamin B-12 0.00136
OTROS
D-Glucose 4.5 1.802
Phenol RedNa 0.0159 0.0013
Pyruvic AcidNa 0.11
PutrescineHCl 0.000161
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2.- DESARROLLO DE CULTIVOS PRIMARIOS A
PARTIR DE LAS BIOPSIAS TISULARES
2.1.- TCNICAS Y MTODOS GENERALES
Para la generacin de cultivos celulares primarios a partir de
fragmentos
tisulares, se pueden utilizar dos tipos de aproximaciones:
2.1.1.- Digestin enzimtica.
Las muestras tisulares se pueden incubar en distintos tipos de
enzimas,
segn se describe a continuacin:
- DISPASA II. Para separar el tejido conjuntivo del epitelio en
muestras
de piel, vejiga, mucosa oral, etc., las biopsias se introducen
en una
solucin estril con dispasa II para digerir la membrana basal
que
ancla el epitelio al tejido conjuntivo subyacente. Si las
muestras son de
gran tamao, stas se deben fragmentar previamente con ayuda
de
unas tijeras o bistur estril. Habitualmente, esta digestin se
lleva a
cabo a 37C durante 3-4 h o a 4C durante 6-12 h, siendo
conveniente
mantener los tejidos en agitacin suave pero constante. Tras
este
periodo, es probable que el epitelio se separe espontneamente
del
conjuntivo. En caso contrario, se proceder a su separacin
mecnica
con unas pinzas estriles.
- COLAGENASA 1. Para llevar a cabo la digestin de la matriz
extracelular de los tejidos conjuntivos (dermis de la piel,
estroma de la
mucosa oral o la vejiga, limbo esclero-corneal, etc.) y
conseguir el
aislamiento de los fibroblastos estromales incluidos en dicha
matriz, las
muestras se incuban a 37C en una solucin estril de colagenasa
tipo
I de Clostridium hystoliticum (Gibco BRL Life Technologies Ref.
17100-
017, Karlsruhe, Alemania) al 2% en medio de cultivo DMEM durante
4-
6 horas en agitacin continua. Esta solucin es capaz de digerir
el
colgeno del tejido conjuntivo y liberar los fibroblastos
estromales.
Para la recogida de los fibroblastos, la solucin de digestin
que
contena las clulas estromales se centrifuga a 1.000 rpm durante
10
minutos, recogindose el pellet celular correspondiente a los
fibrobastos en frascos de cultivo de 15 cm de superficie.
- TRIPSINA-EDTA. La solucin de tripsina-EDTA se utilizar para
la
separacin de clulas epiteliales a partir de un epitelio
previamente
individualizado mediante dispasa II o a partir de muestras
completas
con epitelio y tejido conjuntivo no tratadas previamente. Para
ello, se
-
aade al tejido la solucin de tripsina-EDTA y se incuba a 37C
durante
20-30 minutos en agitacin continua. Transcurrido este tiempo,
se
recoge la tripsina que contiene las clulas epiteliales
individualizadas
en un tubo cnico de 50 ml con ayuda de una pipeta, procurando
no
arrastrar con ella fragmentos de epitelio. A continuacin, se
neutraliza
la tripsina aadiendo una cantidad equivalente de medio de
cultivo
(habitualmente, DMEM) suplementado con un 10% de suero
bovino
fetal y se centrifuga durante 10 minutos a 1000 rpm. El
pellet
resultante se cultiva en frascos de cultivo de 15 cm de
superficie.
2.1.2.- Explantes tisulares.
Para la tcnica de cultivo en explante, las muestras completas o
los tejidos
separados a partir de stas (epitelio o tejido conjuntivo) se
cortan en
pequeos fragmentos de alrededor de 2 x 2 mm utilizando tijeras o
bistur
estriles. Posteriormente, estos fragmentos se colocan en frascos
de cultivo
sin medio para permitir que stos se adhieran a la superficie de
los frascos.
Es importante controlar que las muestras no se resequen durante
este
tiempo. Tras ello, se aade el medio de cultivo especfico
cuidando que los
fragmentos no se despeguen del frasco.
2.2.- GENERACIN DE CULTIVOS CELULARES PRIMARIOS A PARTIR
DE TEJIDOS ESPECFICOS
2.2.1.- Piel y mucosa oral.
Para la obtencin de cultivos de queratinocitos epidrmicos u
orales, se
pueden utilizar los siguientes mtodos:
- Digestin de las muestras con tripsina-EDTA durante 20-30
minutos y
recogida de las clulas mediante centrifugacin. Este proceso se
repite 4-6
veces hasta que el nmero de queratinocitos recogido es poco
significativo.
Tras ello, se incuba el resto del tejido en colagenasa 1 para
obtener las
clulas estromales.
- Digestin previa de las muestras en dispasa II para separar el
epitelio del
estroma. Posteriormente, se puede incubar el epitelio en
tripsina-EDTA y el
estroma en colagenasa 1 bien se puede utilizar la tcnica de
explante con
ambos tejidos independientemente.
-
2.2.2.- Vejiga urinaria.
Las muestras de vejiga suelen incubarse en tripsina-EDTA, para
obtener las
clulas epiteliales (urotelio), y, posteriormente, en colagenasa
1, para
separar las clulas estromales.
2.2.3.- Limbo esclero-corneal.
Habitualmente, las muestras de limbo esclero-corneal presentan
fragmentos
de crnea adheridos a las mismas. En primer lugar, se separan
estos
fragmentos de crnea, incubndose estos restos en colagenasa 1
para
obtener cultivos de quearatocitos estromales, mientras que los
fragmentos
de limbo se pueden procesar mediante tcnica de explante o
mediante
digestin en colagenasa 1 para liberar las clulas madre del
epitelio corneal.
2.3.- MEDIOS DE CULTIVO
2.3.1.- Medio de queratinocitos.
El medio de queratinocitos se compone de 3 partes de medio DMEM
rico en
glucosa (Sigma-Aldrich Ref. D5796) y una parte de medio HAM-F12
(Sigma-
Aldrich Ref. N6658), todo ello suplementado con un 10% de suero
bovino
fetal (Sigma-Aldrich Ref. F9665), antibiticos-antimicticos (100
U/ml de
penicilina G, 100 g/ml de estreptomicina y 0,25 g/ml de
anfotericina B;
(Sigma-Aldrich Ref. A5955), 24 g/ml de adenina (Sigma-Aldrich
Ref.
A9795) y distintos factores de crecimiento:
0,4 g/ml de hidrocortisona (Sigma-Aldrich Ref. H0888),
5 g/ml de insulina (Sigma-Aldrich Ref. I2767),
10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF)
(Becton-Dickinson Ref. 354052, Lincoln Park, Nueva Jersey,
EEUU),
1,3 ng/ml de triyodotironina (Sigma-Aldrich Ref. T5516),
8 ng/ml de toxina colrica (Sigma-Aldrich Ref. C3012).
2.3.2.- Medio de clulas epiteliales corneales.
Para clulas del epitelio corneal se utiliza el mismo medio de
cultivo que se
utiliz para el cultivo de queratinocitos, pero sin factor de
crecimiento EGF.
2.3.3.- Medio de clulas estromales.
Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa
(Sigma-
Aldrich Ref. D5796) suplementado con antibiticos y antimicticos
(100
U/ml de penicilina G, 100 g/ml de estreptomicina y 0,25 g/ml
de
-
anfotericina B; Sigma-Aldrich Ref. A5955) y suero bovino fetal
(SBF)
(Sigma-Aldrich Ref. F9665) al 10%.
En todos los casos, las clulas se incuban a 37C con un 5% de
dixido de
carbono, en condiciones estndar de cultivo celular. Los medios
de cultivo
deben renovarse cada tres das.
3.- SUBCULTIVO DE LAS CLULAS MANTENIDAS EN
CULTIVO PRIMARIO
Una vez alcanzada la confluencia celular, los distintos cultivos
celulares se
lavan con PBS estril y se incuban en 1-3 ml de una solucin de
tripsina 0,5
g/l y EDTA 0,2 g/l (Sigma-Aldrich Ref. T4799) a 37C durante 10
minutos.
Una vez disociadas las clulas, se recogen en un frasco
estril,
neutralizndose la tripsina con medio de cultivo con suero bovino
fetal y
recogindose las clulas mediante centrifugacin a 1000 rpm durante
10
minutos. La presencia de abundantes protenas sricas en el suero
bovino
fetal es capaz de inactivar la accin proteoltica de la
tripsina.
Posteriormente, el pellet celular se resuspende cuidadosamente
en 5 ml de
medio MF o QC y estas clulas se cultivan en frascos de cultivo
de 15, 25 o
75 cm de superficie.
Habitualmente, los cultivos de queratinocitos se pueden expandir
hasta
aproximadamente cinco veces en nuevos frascos de cultivo. Los
cultivos de
fibroblastos se expanden hasta aproximadamente quince veces en
frascos
de cultivo antes de su uso para fabricar los sustitutos de
tejido conectivo.
En todos los casos, y para asegurar una adecuada viabilidad
celular, la
elaboracin de sustitutos de tejidos humanos artificiales se debe
llevar a
cabo utilizando clulas correspondientes a los primeros
subcultivos.
4.-CONGELACIN DE CLULAS
Una vez alcanzada la confluencia de los cultivos, se deben
congelar algunas
clulas para su conservacin a largo plazo. Para ello, las clulas
se tratan
con una solucin de tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l
(Sigma-Aldrich Ref.
T4799) a 37C durante 10 minutos para despegarlas de la
superficie del
-
frasco de cultivo. Tras neutralizar la tripsina con medio de
cultivo, se
obtienen las clulas mediante centrifugacin. Tras esto, las
clulas se
mantienen sobre hielo y se resuspenden en medio de congelacin
para
queratinocitos (10% de glicerol, 15% de SBF y 75% de DMEM) o
para
clulas estromales (10% de DMSO, 10% de SBF y 80% DMEM) en
viales
especiales para ultracongelacin. Para evitar un choque trmico
demasiado
brusco, las clulas incluidas en el medio de congelacin se
congelan a -20C
durante las primeras 12-24h, pasndose a continuacin a una
temperatura
de -60 durante 24h y, finalmente, a un tanque con nitrgeno
lquido
(inicialmente en fase vapor y despus en fase lquida), donde
se
almacenaron a largo plazo.
Generalmente, las clulas se congelan a una densidad 1/3-5. Esto
significa
que con un frasco de cultivo celular de 75 cm se preparan 3-5
crioviales
para congelar. Cada uno de estos crioviales servir ms adelante
para
sembrar un frasco de cultivo de 75 cm.
-
5.- CONSTRUCCIN DE SUSTITUTOS DE TEJIDOS
HUMANOS MEDIANTE INGENIERA TISULAR
La construccin de sustitutos tisulares de espesor completo se
lleva a cabo
de modo secuencial. Para ello, en primer lugar se elabora un
sustituto del
tejido conjuntivo o estroma de la estructura que se quiere
reproducir y, en
segundo tiempo, se fabrica un equivalente epitelial en la
superficie del
mismo, tal como se describe a continuacin.
5.1.- ELABORACIN DE UN SUSTITUTO DEL ESTROMA O TEJIDO
CONJUNTIVO
Para la creacin de sustitutos del tejido conjuntivo de un rgano
o
estructura concreta, se deben utilizar clulas correspondientes a
ese tejido
conjuntivo y biomateriales que permitan la generacin de una
estructura
tridimensional. A continuacin, se describe el uso de cuatro
tipos diferentes
de biomateriales: geles de agarosa al 2%, geles de fibrina,
geles de agarosa
ms fibrina y geles de colgeno tipo I, tal como se detalla a
continuacin.
5.1.1.- Fabricacin de geles de agarosa al 2%.
Para la generacin de sustitutos estromales de agarosa, se emplea
agarosa
tipo VII especial para cultivos celulares (Sigma-Aldrich Ref.
A9045) disuelta
en PBS. En primer lugar, se disuelve la agarosa slida al 2%
(p/v) en PBS,
calentando la mezcla hasta ebullicin para favorecer la disolucin
de la
agarosa. Esta solucin de agarosa al 2% en PBS se esteriliza a
120C y 2
atmsferas de presin mediante autoclavado. Para la fabricacin
de
sustitutos estromales, se utilizan unos 2 ml de esta disolucin
de agarosa
lquida calentada hasta alcanzar el punto de fusin, aadindose
50.000-
200.000 clulas estromales obtenidas mediante tripsinizacin del
cultivo
primario de clulas estromales. Para llevar a cabo esta accin, se
debe
tener especial cuidado en utilizar la disolucin de agarosa a
temperaturas
muy bajas, cercanas al punto de gelificacin (40-50C), evitando
as el dao
trmico a las clulas de la mezcla. Una vez mezcladas las clulas y
la
disolucin de agarosa, la mezcla an lquida se debe alicuotar lo
ms
rpidamente posible en recipientes estriles de cultivo celular,
dejndose
solidificar a temperatura ambiente durante 5 minutos (figura
1).
-
Figura 1. Gel de agarosa al 2% sobre una placa de Petri estril
para
cultivo celular. En la imagen de la izquierda se aprecia el gel
en estado
lquido, mientras que a la derecha se aprecia el mismo gel despus
de
solidificar.
5.1.2.- Fabricacin de geles de fibrina humana.
Para la generacin de geles de fibrina humana, se utiliza plasma
sanguneo
humano congelado procedente de donantes sanos siguiendo las
normas y
recomendaciones de la Asociacin Espaola de Bancos de Tejidos
(AEBT).
La fabricacin de sustitutos estromales de fibrina con clulas se
lleva a cabo
utilizando una modificacin de la tcnica previamente descrita por
Meana y
colaboradores (Llames et al., 2004; Meana et al., 1998). Para
ello, se
utilizan 50.000-200.000 clulas estromales procedentes de los
cultivos
primarios, resuspendidos en 2 ml de medio de cultivo DMEM, a los
cuales se
aaden unos 5 ml de plasma sanguneo humano (equivalente a 10-12
mg
de fibringeno) y 14 ml de suero salino al 0,9%. Para evitar la
fibrinolisis
espontnea de los geles de fibrina, se aaden 200 l de cido
tranexmico
(Amchafibrn, Fides Ecofarma, Valencia, Espaa). Finalmente, la
reaccin
de coagulacin de la fibrina se precipita mediante la adicin de 1
ml de
Cl2Ca 0,025 mM a la mezcla, alicuotndose sta inmediatamente
en
pocillos, placas de Petri o frascos de cultivo (figura 2). Los
geles alicuotados
se dejan en el incubador a 37C con un 5% de CO2, durante 2 horas
para
que coagulen.
-
Figura 2. Preparacin de sustitutos estromales de fibrina
humana.
La mezcla que contiene el plasma, las clulas, el agente
antifibrinoltico y el
cloruro clcico se alicuota en las superficies de cultivo
(insertos porosos)
antes de que comience la reaccin de coagulacin del plasma.
-
5.1.3.- Fabricacin del geles de agarosa ms fibrina.
Para la elaboracin de geles de agarosa y fibrina, se prepara una
mezcla de
fibrina, DMEM, cido tranexmico y clulas estromales tal como se
describi
en el apartado anterior. Sin embargo, justo despus de precipitar
la
reaccin de coagulacin con cloruro clcico, se aade una pequea
cantidad
de agarosa tipo VII especial para cultivos celulares
(Sigma-Aldrich Ref.
A9045) disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de
fusin. La
concentracin final de agarosa en el gel debe oscilar entre el
0,05% y el
0,3% (p/v). Una vez mezclados todos los componentes, y evitando
un
trauma fsico excesivo, estos geles se alicuotan cuidadosamente
en
diferentes superficies de cultivo.
5.1.4.- Fabricacin de geles de colgeno.
Los geles de colgeno se preparan utilizando colgeno tipo I de
cola de rata
disponible comercialmente (Roche Diagnostics Ref. 11179179001,
Basilea,
Suiza) y siguiendo la metodologa previamente establecida por la
propia
casa comercial. En primer lugar, el colgeno liofilizado se
disuelve en 3 ml
de una solucin estril de cido actico al 0,2% durante 12 h sin
agitacin.
Posteriormente, para la generacin de sustitutos estromales, se
aaden
50.000-200.000 clulas estromales tripsinizadas del cultivo
primario y
resuspendidas en 200 l de medio de cultivo (figura 3). Para
inducir la
gelificacin de la solucin de colgeno tipo I con clulas
estromales, se
aade a la mezcla 300 l de una solucin de bicarbonato sdico
estril (25
mg/ml) o una cantidad variable de NaOH, alicuotndose la mezcla
rpida
pero cuidadosamente en los pocillos destinados a la generacin de
los
constructos tisulares. De este modo, mediante aumento del pH,
las fibras
de colgeno disueltas en cido comienzan a formar un gel semislido
que se
deja secar durante 2 h en incubador a 37C.
Figura 3. Preparacin de geles de colgeno.
-
5.2.- ELABORACIN DE UN SUSTITUTO EPITELIAL
Tras generar el sustituto estromal, se procede a subcultivar las
clulas
epiteliales sobre la superficie del mismo, utilizando
tripsina-EDTA. Adems,
para garantizar una correcta diferenciacin y estratificacin del
epitelio
construido, se utiliza la tcnica de cultivo denominada interfase
aire-lquido
(Reichl y Mller-Goymann, 2003). Para ello, los constructos
tisulares se
elaboran en sistemas de cultivo Transwell con membranas porosas
de 0.4
m (Costar, Corning Inc., Corning, Nueva York, EEUU). Estos
sistemas de
cultivo estn compuestos por una placa estril de 6 pocillos en el
interior de
los cuales se aloja una pieza de plstico mvil cuya base est
formada por
una membrana porosa y permeable de nylon o policarbonato (figura
4). El
tamao de estos poros permite a los nutrientes pasar a travs de
la
membrana de la placa pero impide la migracin de las clulas de
un
compartimento a otro.
Una vez solidificados los sustitutos estromales (idealmente, 24
horas ms
tarde), se procede a tripsinizar los cultivos primarios de
clulas epiteliales,
subcultivndose stas sobre la superficie de los sustitutos
estromales (unas
500.000 clulas en cada caso). Finalmente, 10-15 das despus
de
establecer el cultivo epitelial sobre el sustituto estromal, se
utiliza la tcnica
aire-lquido para favorecer la estratificacin y la maduracin
epitelial. Para
ello, se aade medio de cultivo de clulas epiteliales al depsito
inferior del
sistema, pero no al superior, que se expone directamente al
aire. Esta
tcnica aire-lquido se mantiene durante 10-15 das ms.
-
Figura 4. Sistemas de cultivo Transwell con membranas
porosas.
Todo el proceso descrito se muestra de forma esquemtica en la
figura 5
para el caso de la piel.
Figura 5. Elaboracin de sustitutos de piel humana utilizando
una
tcnica secuencial sobre sistemas de cultivo Transwell.
5.3.- NANOESTRUCTURACIN DE TEJIDOS ARTIFICIALES
La nanoestructuracin es un procedimiento que permite
modificar
significativamente las propiedades fsicas de los biomateriales y
los tejidos
artificiales, hacindolos ms resistentes y elsticos. El
procedimiento que se
utilizar en esta prctica es el que se denomina compresin plstica
y que
se describe a continuacin:
1. Separar cuidadosamente los tejidos artificiales de la
superficie de cultivo
(placas de Petri, por ejemplo). Para ello, utilizar esptulas
redondas o de
punta fina estriles evitando daar o romper los tejidos
artificiales.
2. Sobre una superficie plana colocar 2-3 papeles absorbentes
estriles
(papeles de filtro). Sobre stos, colocar un filtro o membrana de
nylon o
policarbonato estril que impedir que los tejidos se adhieran al
papel de
filtro.
Soporte poroso Sustituto estromal
con fibroblastos en su interior
Subcultivo de
queratinocitos sobre el sustituto estromal
Tcnica de
cultivo aire-lquido
Sustituto de piel
-
3. Colocar cuidadosamente el tejido artificial sobre el filtro o
membrana,
evitando la formacin de pliegues o burbujas.
4. Utilizar otro filtro o membrana estril sobre el tejido. Para
tejidos con
epitelio en su superficie, esta membrana debe tener un tamao de
poro
suficientemente grande para evitar daar en exceso el
epitelio.
5. Colocar 2-3 papeles absorbentes estriles sobre este filtro o
membrana.
6. Depositar una superficie plana sobre todo el material (por
ejemplo, un
fragmento de vidrio rectangular de tamao similar al del papel de
filtro).
7. Colocar cualquier objeto en la superficie con un peso de
80-100 g
(dependiendo del tipo de biomaterial).
8. Esperar 3-10 minutos (dependiendo del tipo de biomaterial) y
retirar el
biomaterial ya estructurado. Para evitar su deshidratacin
excesiva, aadir
lo antes posible PBS o medio de cultivo al tejido
nanoestructurado.
-
6. EVALUACIN HISTOLGICA DE LOS SUSTITUTOS
TISULARES
6.1 MICROSCOPA PTICA
Para el anlisis de los tejidos mediante microscopa ptica, las
muestras de
tejido artificial se fijan en formaldehdo al 4% tamponado y se
deshidratan
en concentraciones crecientes de etanol (70, 80, 96 y 100%).
A
continuacin, el etanol se sustituye por xileno y las muestras se
incluyen en
bloques de parafina. Una vez enfriados los bloques, se obtienen
secciones
transversales de 4 m de espesor que se tien con hematoxilina y
eosina
para su examen histolgico mediante el microscopio ptico.
6.2 MICROSCOPA ELECTRNICA DE BARRIDO
Para el estudio de los tejidos mediante microscopa electrnica de
barrido,
las muestras se fijan en glutaraldehdo al 3% en tampn fosfato
0,1 M (pH
7.2) a 4C durante 4-6 horas, lavndose a continuacin dos veces
en
tampn fosfato 0,1 M (pH 7.2) a 4C. Tras la fijacin, las muestras
se
deshidratan en concentraciones crecientes de acetona (30, 50,
70, 95 y
100%), desecndose por completo mediante el mtodo del punto
crtico.
Este mtodo consiste en la sustitucin de la acetona tisular,
junto con
cualquier resto de agua que pudiese quedar en las muestras, por
CO2
lquido en fro. A continuacin, el CO2 es evaporado a baja
presin,
aumentndose progresivamente la temperatura, hasta que la
muestra
queda desecada por completo. Una vez desecados, los tejidos se
recubren
de tomos de oro y paladio y se analizan en un microscopio
electrnico de
barrido FEI Quanta 200 utilizando el modo de alto vaco.
-
7. MICROANLISIS POR ENERGA DISPERSIVA DE
RAYOS X
Para estudiar la viabilidad celular de los cultivos celulares
establecidos a
partir de biopsias tisulares, se utilizar el microanlisis por
energa
dispersiva de rayos X (EPXMA). Para ello, las clulas se
cultivarn sobre
rejillas de oro de 3 mm de dimetro especiales para microscopa
electrnica
(Fedelco ref. G100 G3) (Figura 6) recubiertas con Pioloformo
(SPI-CHEM
ref. 2466), tal como se describe a continuacin.
Figura 6. Rejillas de oro sobre las que se deposit una fina capa
de
Pioloformo para permitir la adhesin celular.
Figura 7. Estructura qumica del polivinil-butiral
(Pioloformo).
-
7.1 PREPARACIN DE LAS REJILLAS CUBIERTAS CON PIELOFORMO
En primer lugar, es necesario lavar bien las rejillas de oro
especiales para
microscopa electrnica (Fedelco ref. G100 G3) para eliminar todos
los
restos de materia orgnica que pudiesen haberse depositado sobre
stas.
Para ello, utilizar cloroformo puro (2 lavados de 5 min cada
uno).
Posteriormente, aclarar las rejillas con etanol absoluto y lavar
en cido
actico al 2%, dejndolas secar al aire. Para permitir el
crecimiento de las
clulas sobre las rejillas de oro, se aplica una fina capa de
Pioloformo sobre
estas rejillas. El Pioloformo o polivinil-butiral es un
compuesto orgnico
soluble en cloroformo que es capaz de formar pelculas muy
delgadas de un
material similar al plstico que permite la adhesin y el
crecimiento celular
en su superficie. Para generar finas lminas de pioloformo, se
utilizan
portaobjetos de vidrio, los cuales se sumergen en una solucin
de
pioloformo en cloroformo, dejndose secar al aire. Tras ello, se
despegan
las lminas de pioloformo slido adheridas a los portaobjetos
utilizando un
bao de agua templada, puesto que estas lminas flotarn sobre el
agua.
Tras ello, colocar sobre cada lmina de pioloformo slido de 1 a 3
rejillas de
oro previamente lavadas. Finalmente, depositar un cubreobjetos
de vidrio
de 11 mm de dimetro (Fedelco ref. 06-K-F 0513) sobre las
rejillas
colocadas sobre el pioloformo y transportar todo ello a una
placa de 4
pocillos, esterilizndose mediante irradiacin ultravioleta
durante 12 horas.
7.2 ADHESIN DE LAS CLULAS AL SOPORTE
Levantar las clulas obtenidas a partir de las biopsias tisulares
utilizando
tripsina, EDTA o un componente no enzimtico, segn el tipo
celular a
tratar. Subcultivarlas sobre las rejillas de oro cubiertas con
pioloformo a una
densidad que permita alcanzar subconfluencia en 24 h (alrededor
de 1000
clulas por rejilla). Incubar en su medio habitual durante 24-48
h para
permitir la adhesin de las clulas a esta superficie.
7.3 ELIMINACIN DEL MEDIO DE CULTIVO
-
Con el fin de eliminar la contribucin del medio de cultivo al
espectro de
rayos X en los anlisis celulares, es necesario realizar un
lavado de las
rejillas conteniendo las clulas. En nuestro caso, de acuerdo con
los criterios
establecidos previamente por diferentes autores (Wroblewski et
al., 1983;
Wroblewski y Roomans, 1984; Abraham et al., 1985; Lechene,
1988;
Zierold y Schfer, 1988; von Euler et al., 1992; Borgmann et al.,
1994;
Warley, 1994), se utilizar como solucin lavadora el agua
destilada. De
este modo, todas las muestras se lavarn mediante inmersin en
agua
destilada a una temperatura de 4C, durante 5 segundos para
evitar el
choque osmtico. La solucin lavadora se ha de mantener en
constante
movimiento por agitacin magntica (Figura 8).
Figura 8. Preparacin de las clulas de gelatina de Wharton
mantenidos en cultivo para anlisis mediante microanlisis por
energa dispersiva de rayos X. 1. Se muestran los
micropocillos
donde se cultivan las clulas sobre las rejillas de oro cubiertas
con
Pioloformo. 2. Las rejillas con las clulas cultivadas, se lavan
en
agua destilada y se secan en papel absorbente para eliminar
el
exceso de agua. 3. Criofijacin por inmersin en nitrgeno
lquido.
7.4 CRIOFIJACIN Y CRIODESECACIN DE LAS MUESTRAS
Tras lavar las rejillas que contienen las clulas a analizar, se
eliminar
rpidamente el exceso de agua con un papel filtro, realizndose
la
criofijacin celular mediante inmersin rpida de todas las
muestras en
nitrgeno lquido (Figura 8). Las rejillas con las clulas
criofijadas se
colocarn en un portamuestras de aluminio preenfriado a -196C
mediante
inmersin en nitrgeno lquido.
1 2 3
-
Las clulas criofijadas y depositadas en el interior del
portamuestras se
transfieren de forma inmediata a un sistema de criodesecacin de
alto vaco
Emitech K775 (Emitech, Watford, Reino Unido) con el objetivo de
extraer el
agua de las clulas por sublimacin o liofilizacin (Figura 9). Las
muestras
se criodesecarn durante un total de 12 horas a una presin de
vaco de 10-
5 mbar siguiendo el perfil de temperaturas mostrado en la Tabla
2, de
acuerdo con los criterios establecidos por Warley y Skepper
(Warley y
Skepper, 2000).
Figura 9. Criodesecador utilizado para la liofilizacin celular
para
microanlisis por energa dispersiva de rayos X.
Tabla 2. Perfil de temperaturas e intervalos de tiempo para
la
criodesecacin de las clulas cultivadas sobre rejillas en un
sistema de alto
vaco.
Segmento Temperatura
inicial
Temperatura
final Tiempo
1 100C 100C 1 hora
2 100C 70C 1 hora
3 70C 70C 1 hora
4 70C 50C 1 hora
-
5 50C 50C 1 hora
6 50C +25C 12 horas
7.5 RECUBRIMIENTO DE LAS MUESTRAS
Despus de la criodesecacin, las clulas se deben recubrir con
una
superficie conductora de electricidad para facilitar el barrido
del haz de
electrones durante su observacin microscpica y deteccin
analtica. En
concreto, las rejillas criodesecadas y montadas sobre el
portamuestras de
aluminio se recubrirn con una fina capa de carbn utilizando
un
evaporador Emitech (Watford, Reino Unido) dotado de un hilo de
grafito
(Electron Microscopy Sciences, Madrid) en condiciones de alto
vaco.
7.6 OBSERVACIN Y ANLISIS DE LAS MUESTRAS MEDIANTE
MICROSCOPA ELECTRNICA ANALTICA
La cuantificacin del contenido inico de las clulas cultivadas,
se lleva a
cabo mediante microscopa electrnica analtica, utilizando un
microscopio
electrnico de barrido Phillips XL 30 (Phillips, Eindhoven,
Holanda) acoplado
a un detector de energa dispersiva de rayos X EDAX DX4i con una
ventana
CDU ultrafina (EDAX, Eindhoven, Holanda) y un sistema de
deteccin de
electrones retrodispersados de estado slido (K.E.
Development,
Cambridge, Reino Unido). La configuracin geomtrica de este
equipamiento posibilita la deteccin simultnea de electrones
secundarios y
rayos X.
Tras su recubrimiento, colocar las rejillas conteniendo las
clulas sobre el
soporte microanaltico del microscopio electrnico de barrido.
Para cada
clula se obtendr un espectro microanaltico en el que destacarn
los picos
correspondientes al contenido inico de sodio, potasio, fsforo,
magnesio,
azufre, cloro y calcio.
-
Para la visualizacin de las muestras en el microscopio
electrnico de
barrido mediante electrones secundarios, se fijarn los
siguientes
parmetros:
Voltaje del microscopio 10 kV
Angulacin de superficie 0
Distancia de trabajo 10 mm
Para la deteccin microanaltica, las condiciones instrumentales
deben ser
las siguientes:
Voltaje del microscopio 10 kV
Aumentos 10000
Angulacion de superficie (tilt) 0
Cuentas por segundo (CPS) 500
Tiempo de adquisicin 200 s
Tamao del haz de electrones spot size 6
Distancia de trabajo 10 mm
rea de anlisis puntiforme y esttica
Para determinar cuantitativamente el contenido elemental de las
clulas, se
utilizar el mtodo de la razn pico-fondo o mtodo P/B con
referencia a
patrones de calibracin de matriz orgnica previamente
conocidos
(Boekestein et al., 1980; Roomans, 1988; Statham, 1998). La
concentracin de cada elemento se determinar de acuerdo con la
siguiente
frmula:
____
(P/B)spc Z2/Aspc
Cspc = Cstd ______________________
___
(P/B)std Z2/Astd
-
Donde:
- Cspc es la concentracin del elemento a cuantificar,
- P corresponde a las cuentas netas de la seal caracterstica del
elemento,
- B es la radiacin continua medida debajo del pico, es decir,
tomada entre los mismos niveles de energa de la seal
caracterstica,
- Z2/A es el valor medio del nmero atmico al cuadrado por el
peso atmico, correspondiente un valor especfico para el dextrano
y
las clulas (Warley, 1997).
La preparacin de los patrones de calibracin se realizar de
acuerdo con
las pautas previamente establecidas en nuestro laboratorio
(Crespo et al.,
1993; Lpez-Escmez y Campos, 1994) utilizando diferentes sales
(NaHPO4,
MgCl2, CaCl2H2O y K2SO4) disueltas en una matriz orgnica. Para
ello, se
preparan soluciones de cada sal a diferentes concentraciones en
dextrano al
20% (300 kD). Los patrones se montan sobre membranas
microporosas de
las unidades Millicell y se criofijan mediante inmersin en
nitrgeno lquido.
En esta fase del proceso, as como en la posterior criodesecacin,
montaje y
recubrimiento, se debe seguir el mismo procedimiento que se
expuso para
la preparacin de clulas humanas para microanlisis. Los patrones
se
analizan en el microscopio electrnico de barrido y se
microanalizan
inmediatamente despus de su preparacin para evitar su
contaminacin o
modificacin qumica, adquirindose entre 15 y 20 espectros para
cada
concentracin de patrn, utilizando las mismas condiciones de
anlisis que
se utilizaron para las clulas cultivadas sobre rejillas de
oro.
El anlisis de los patrones de dextrano al 20% conteniendo
concentraciones
conocidas de sales de sodio, cloro, magnesio, fsforo, azufre,
potasio y
calcio, permite realizar la calibracin de las concentraciones de
los citados
elementos frente a la seal P/B. La concentracin de cada elemento
en el
estndar es directamente proporcional a la razn P/B de acuerdo
con la
siguiente frmula:
Donde:
- Cts es la concentracin del elemento en el patrn, la cual es
conocida,
- (Pstd/Bstd) es la razn P/B, donde el fondo se ha medido entre
el mismo rango de energa de la seal caracterstica obtenida del
anlisis de los estndar,
Cts = K (Pstd/Bstd)
-
- K es la constante de calibracin caracterstica para cada
elemento
y configuracin instrumental utilizada.
La relacin entre Pstd/Bstd frente a la concentracin de cada
elemento se
estudia mediante regresin lineal simple.
Puesto que la constante de calibracin K depende de la diferencia
en el Z2/A
(factor G) entre el estndar y la clula, para el anlisis se
emplea la
siguiente ecuacin para valorar la influencia de dicho factor en
el ajuste de
la curva:
Y = Pstd/Bstd (Z2/A)std
Donde Z2/A es el promedio del valor de Z2/A para todos los
elementos
presentes en el volumen analizado de estndar:
Z2/A = (fiZi2/Ai)
Donde:
- Zi es el nmero atmico del elemento i,
- Ai es el peso atmico de dicho elemento, - fi es la fraccin de
masa del elemento i expresada como masa
elemental/masa total (Hall y Gupta, 1984).
En la Tabla 3 se muestran las ecuaciones de regresin obtenidas
para todos
los elementos cuando Y= Pstd/Bstd Z2/A se calibr frente a Cstdt
para los
elementos Na, Mg, P, S, Cl, K y Ca analizados a 10 kV.
-
Tabla 3. Ecuaciones regresin obtenidas cuando Y = Pstd/Bstd Z2/A
se
calibr frente a Cstd analizados a 10 kV.
Elemento
Sodio (Na) Y = 3,75 + 0,032x (r = 0,99 P <
0,001)
Magnesio (Mg) Y = 1,07 + 0,052x (r = 0,98 P <
0,001)
Fsforo (P) Y = 0,64 + 0,042x (r = 0,99 P <
0,001)
Azufre (S) Y = 1,38 + 0,052x (r = 0,97 P <
0,001)
Cloro (Cl) Y = 1,42 + 0,036x (r = 0,99 P <
0,001)
Potasio (K) Y = 3,32 + 0,054x (r = 0,99 P <
0,001)
Calcio (Ca) Y = 0,60 + 0,063x (r = 0,99 P <
0,001)
-
ACTIVIDADES
Actividad: Cada alumno deber revisar la documentacin entregada y
contestar a las
preguntas planteadas, las cuales constituirn la base para la
evaluacin de este curso.
La documentacin que se entrega consiste en 3 documentos cuya
naturaleza es la
siguiente:
- Documentos de lectura:
1. Documento titulado Metodologa de investigacin cientfica. Este
documento
constituye el texto base de lectura y consulta que el alumno
deber leer para
poder responder a las preguntas que se indican en el resto de
documentos.
2. Trabajo n 1. Se trata de un trabajo de investigacin original
publicado en una
revista cientfica y relacionado con la ingeniera tisular del
cartlago.
3. Trabajo n 2. Este documento representa un trabajo de
investigacin original
publicado en una revista cientfica y se centra en la elaboracin
de un modelo de
crnea artificial mediante ingeniera tisular.
- Documentos que el alumno deber rellenar y enviar al profesor
para proceder a la
evaluacin del mismo:
1. Preguntas sobre el Trabajo n 1.
2. Preguntas sobre el Trabajo n 2.
-
Preguntas sobre el Trabajo n 1.
INGENIERA TISULAR
CURSO: METODOLOGA DE INVESTIGACIN CIENTFICA
TRABAJO NO PRESENCIAL
NOMBRE:
Despus de leer el Trabajo n 1 titulado Evaluacin de la
viabilidad de los cultivos de
condrocitos mediante microanlisis por energa dispersiva de rayos
X, entregado junto
con la documentacin anexa responda a las siguientes preguntas
referidas al trabajo
de investigacin mencionado:
1.- EL PROBLEMA DE INVESTIGACIN
Identifique y describa el problema de investigacin planteado por
los autores del
trabajo y formule la pregunta o preguntas de investigacin que se
presentan de forma
implcita o explcita en ste.
Problema de investigacin
Preguntas de investigacin
2.- FORMULACIN DE LAS HIPTESIS
Identifique y describa las hiptesis nula y alternativa que se
presentan de forma
implcita o explcita en el trabajo.
Hiptesis nula H0
Hiptesis alternativa H1
-
3.- VALIDACIN DE LAS HIPTESIS
Describa las variables dependientes e independientes planteadas
de forma implcita o
explcita en el trabajo e indique a qu tipo de escala pertenecen
(por ejemplo,
nominal).
Variable Dependiente VD
Variable Independiente VI
Indique cul de las hiptesis (H0 o H1) se confirma al final del
estudio.
Verificacin de la hiptesis nula
H0
Verificacin de la hiptesis alternativa
H1
Si procede, indique el estudio estadstico que se ha realizado en
el estudio y justifique
si este tipo de estudio es el apropiado para este caso.
Mtodo estadstico
Justificacin
-
Cules son las conclusiones del trabajo?
Conclusiones
4.- VALIDEZ DE LA INVESTIGACIN
Indique si el trabajo presenta validez interna y/o externa y por
qu.
Validez Interna
Validez Externa
-
Trabajo n 2
INGENIERA TISULAR
CURSO: METODOLOGA DE INVESTIGACIN CIENTFICA
TRABAJO NO PRESENCIAL
NOMBRE:
Despus de leer el Trabajo n 2 titulado Construction of a
Complete Rabbit Cornea
Substitute Using a Fibrin-Agarose Scaffold, responda a las
siguientes preguntas
referidas al trabajo de investigacin mencionado:
1.- EL PROBLEMA DE INVESTIGACIN
Identifique y describa el problema de investigacin planteado por
los autores del
trabajo y formule la pregunta o preguntas de investigacin que se
presentan de forma
implcita o explcita en ste.
Problema de investigacin
Preguntas de investigacin
2.- FORMULACIN DE LAS HIPTESIS
Identifique y describa las hiptesis nula y alternativa que se
presentan de forma
implcita o explcita en el trabajo.
Hiptesis nula H0
-
Hiptesis alternativa H1
3.- VALIDACIN DE LAS HIPTESIS
Describa las variables dependientes e independientes planteadas
de forma implcita o
explcita en el trabajo e indique a qu tipo de escala pertenecen
(por ejemplo,
nominal).
Variable Dependiente VD
Variable Independiente VI
Indique cul de las hiptesis (H0 o H1) se confirma al final del
estudio.
Verificacin de la hiptesis nula
H0
Verificacin de la hiptesis alternativa
H1
Si procede, indique el estudio estadstico que se ha realizado en
el estudio y justifique
si este tipo de estudio es el apropiado para este caso.
Mtodo estadstico
Justificacin
-
Cules son las conclusiones del trabajo?
Conclusiones
4.- VALIDEZ DE LA INVESTIGACIN
Indique si el trabajo presenta validez interna y/o externa y por
qu.
Validez Interna
Validez Externa
