ASSOCIACIÓ DE FARMACOLOGIA

FIJACi óN DE LA NORADRENALINA-3H, ADMINISTRADA POR V1A INTRA VENTRICULAR, A LAS

PROTEí NAS CEREBRALES

J. MALLOL, F. MALLOL, E. RoDRÍGuEz FARRÉ, F. G. VALDECASAS

INTRODUCCIÓN.- En anteriores trabajos se ha estudiado el fenó­meno de la fijación de la Noradrenalina (NA) a las proteínas plasmá­ticas, especialmente a nivel de la albúmina, obteniéndose diversas con­clusiones acerca de la influencia que sobre es ta :fijación ejercen las variaciones de la fuerza iónica, pH , temperatura, tiempo de incubación, etcétera, y especulando diversas hipótesis acerca de la afinidad y capa­cidad del sistema, del tipo de enlace responsable de la fijación y de los grupos químicos que intervienen en ella.1

• 2

Esta fijación de la NA a las proteínas plasmáticas es de tal inten­sidad que resiste a la diálisis exhaustíva, a la precipitación ácida, a la filtración en gel de dextrano y en ultra:filtros y a la electroforesis.

En el sistema adrenérgico, tanto a nivel del simpático periférico como en las sinapsis cerebrales, las proteínas tisulares juegan un papel importante en la dinámica de la noradrenalina y, por tanto, en el fenó­meno de la neurotransmisión química. Por ello este fenómeno de la :fijación ha sido estudiado posteriormente in vivo, a nivel de las proteí­nas de diversos tejidos de rata, incluido el encéfalo, tras la administra­ción de NA por vía intraperitoneal; e in vitro a nivel de las proteínas de fracción soluble encefálica.3·7

En todos los casos mencionados, la intensidad de la :fijación fue de las mismas características antes mencionadas.

Este concepto de fijación al que venimos refiriéndonos debe dife­renciarse de la llamada «captación t isular» (cantidad de NA simple­mente atrapada por el órgano), dentro de la cual habrá una fracción fácilmente liberablt: de NA y otra fracción fuertemente fijada a las proteínas, que es a la que nos referimos nosotros.

En los estudios realizados previamente in vivo, tras la administra­ción de NA.3H por vía intraperitoneal, observábamos una escasa penetra­ción de NA en el encéfalo, en comparación con los demás órganos,

J . .v!ALLOL Y COLS. FIJACIÓN" DE LA N"ORAORENALINA 1195

debido a la barrera hematoencefálica. Por ello hemos estudiado aquí la fijación a las proteínaf. encefálicas de rata tras la administración intra­ventricular de NA.3H, a fin de obviar dicha barrera hematoencefálica .

La finalidad del presente estudio es, pues, conocer la cinética de la fijación de la NA ex6gena en las distintas fracciones subcelulares del encéfalo de rata y sentar los principios experimentales idóneos para tratar de establecer posteriormente las características de dicha fijación. Asimismo mencionaremos algunos resultados preliminares obtenidos mediante la electroforesis de incubados de fracción soluble enceHtlica en presencia de NA.3H.

MATERIAL Y MÉTODOS. -Animales y administración del producto marcado: Ratas hembras Sprague-Dawley de 200 ± 10 g. de nuestro estabularía. L-Noradrenalina.3H, 8,1 Cimmol y 1 mCí/ml (Amersham) administrada en el ventrículo cerebral lateral izquierdo del siguiente modo:

Se anestesia al animal con éter a cielo abierto, se afeita la parte superior de la cabeza y se hace una incisión anteroposterior en la piel desde la línea ínterocular hasta la nuca; se raspa el periostio del parietal izquierdo, especialmente en la zona posterior. Se coloca la cabeza de la rata en un soporte especial para inmovilizarla o mejor en un aparato de estereotaxía y con un taladro de 0'5 mm. de 0 se perfora el parietal en un punto situado a 3 mm. de la línea media y justo por delante de la implantación de las orejas, procurando no profundizar en la masa cerebral. A continuación se introduce en el orificio practicado la aguja de una jeringa micrométrica (Ha mil ton) protegida con un manguito de teflon para permitir sólo una penetración de 2'5 mm. y se inyectan 10 ¡;.l de NA.3H, sosteniendo de este modo la jeringa durante un mi­nuto a fin de evitar el reflujo del producto inyectado (fig. 1).

Las coordenadas expresadas varían según el peso del animal, por lo que deben ser determinadas personalmente para cada caso particular, inyectando un colorante y congelando posteriormente el cráneo del ani­mal y haciendo cortes sagitales seriados. Con este sistema hay un pequeño error estadístico del 5 %.

Se ha utilizado, para cada tiempo, una rata sin tratar que sirve de blanco tejido .

Obtenciones de las fracciones subcelulares: Se ha llevado a cabo por centrifugación diferencial a 600 X g., 20.000 X g. y 105.000 X g. Tanto un alícuota del homogeneizado, como los sedimentos obtenidos y resuspendidos, así como la fracción soluble, se sometieron a los si­guíen tes análisis :

1) 0'1 ml. para determinación de proteínas. 2) 1 ml. para digestión directa con mezcla digeridora y contaje

inmediato en Instagel (todo el digerido) o en tolueno-etanol-PPO-

1196 ANNALS DE MEDICINA

aguja y man9uito

ventriculo toteral

X puntos de inyección

FJC. l.

POPOP; el sedimento representa la NA fijada y debe digerirse antes de contar la radioactividad (fig. 2).

Determinación de proteínas: Se llevó a cabo por el método de Schactetie y Pollack.8

REACTIVOS EMPLEADOS.

Buffer Tris-succinato: Para el homogeneizado,

Tris hidroximetilaminometano Ac. Succínico . NaOH . Agua bidestilada c. s. p.

0,05 M. 0,05 M. 0,05 M.

pH 5,9 e 1 = 0,15.

6,05 g. 5,90 g. 1,80 g. 1 litro

Mezcla digeridora: Ac. perclórico al 70 % y agua oxigenada con­centrada v /v. Debe utilizarse, por lo menos, doble volumen de mezcla digeridora respecto al volumen a digerir; se deja actuar un mínimo de cuatro horas, o mejor media noche, y luego se mantiene a estufa du­rante 2-3 horas a 70 °C; se deja enfriar a oscuras y se pone a contar.

J. MALLOL Y COLS. FIJACIÓN DE LA NORAORENALINA ll97

r 1 DIAL/SI S PRECIPITACION 1 \ ACID\ . 1

~xttmor interior pr~cipitado SQbr~nad.

\ge3ti/ ácida ¡

centelleo liquido

FIG. 2.

HOMOGENIZAOO (tampÓn Trls-$U(I;inato)

1 pH ~9 r..q75

600xg

1 \ sobr~rd.

20.{)()()xg

1 \ pel/et 3obrl.

Precipitación ácida: En tricloroacético frío al 10 %. Un mínimo de dos volúmenes respecto al volumen a precipitar. Se deja actuar media hora y se centrifuga para separar el precipitado.

Líquido de ce~ttelleo: - Tolueno (1 litro). - Etanol (500 mi. ). - PPO (4 g.). - dimetil-POPOP (lOO mg. ).

Instagel: Acepta hasta 1,1 ml. de todo tipo de muestra acuosa.

ELECTROFORESIS.-La fracción soluble de dos o tl·es encéfalos de rata se sometió a concentración con membranas ATOM bajo vacío mode­rado, hasta conseguir una concentración proteica alrededor de 4,5 g/ 100 ml. Se pusieron a incubar 350 ¡.l.l. de fracción soluble concentrada con 10 ¡.l.Ci de NA-3H, durante 6-8 horas a 37 °C. La electroforesis se llevó a cabo en tiras de acetato de celulosa PoLIPHOR o CELLOGEL, aplicando 15 ¡_l.l por tira. Se utilizó tampón veronal pH 8,6 y un tiempo de migración de 45 ruin. a 240 V.

1198 ANNALS DE ¡\<IEDICINA

Los procedimientos de tinción, decoloración, etc., fueron los habi­tuales utilizados para las proteínas séricas. En nuestro caso hemos utili­zado el colorante ROJO PoNCEAU-S.

Una vez reveladas las bandas, se cortaron y se pusieron a disolver en ácido acético al 80 % para cuantificar las proteínas a 520 nm. y medir a continuación la radiactividad presente en cada banda.

RESULTADOS. - No se apreciaron alteraciones neurológicas tras el traumatismo craneal motivado por la inyección intraventricular, así como tampoco hay que señalar ninguna muerte por dicha manipulación.

La figura 3 muestra la disminución con el tiempo de ]as cantidades de radioactividad captada y fijada a nivel del homogeneizado de cerebro. La figura 4 muestra los mismos resultados expresados en relación al contenido proteico de homogeneizado.

DPM xlo-•

30

20

10

~r ...... _~ __ · __ ·------~------~------r-----~~ - ·-:-:-2 ~3 : 4 horas

FtG. 3.- Homogeneizado de cerebro. l-Noradrenalina-3H. Dosis administrada 10 uCi, intra­vencdcular. Ratns hembra $prague-Dawley 150 g.

Captación (DPM/g. óq¡ano); Fijación (DPM/g. órgano).

En la figura 5 se observan Jos porcentajes de fijación en fracción soluble y sedimento de 600 X g respecto al total fijado por el órgano, apreciándose cómo a medida que el primero disminuye aumenta el segundo.

J . MALLOL Y COLS. FIJACIÓN DE U NORAPRENALINA 1199

* 300

*

200

10

::r --_.-&..· ---:.-*-

'----~====-----.--2 ----------~-----------~--T"~ hcr-Clll-

Pie. 4. - Homogeneizado de cerebro. I-Noradrenalina-3H. Dosis administrada 10 uCi, intra­ventricular. Ratas hembra Sprague-Dawley 150 g.

Captación (DPM/g. de proteína); Fijación (DPM/g. de proteína).

En la figura 6 se expresan los mismos porcentajes de fijación, pero respecto al captado por cada fracción correspondiente, se aprecia tam­bién en aumento progresivo a nivel del sedimento de 600 X g.

En la figura 7 los mismos porcentajes, pero expresados ahora en función de la radioactividad total captada por el órgano. Aquí se obser­va que el aumento de fijación a medida que transcurre el tiempo se debe exclusivamente al aumento de la fijación en el sedimento de X 600 X g.

En la figura 8 se representa un esquema de los resultados obtenidos en las experiencias electroforéticas . Se aprecia cómo las bandas de migración más lenta son las que fijan la radioactividad.

D ISCUSIÓN. - Un primer ptmto importante a tocar sería el deter· minar el volumen acePtable de NA.3H a administrar en el ventriculo lateral. Por ejemplo, si administramos 30 p.l de NA en el ventriculo lateral de una rata (NoBLE y cols., 1967), se dilata y deforma consi­derablemente dicha estructura, con la ventaja, sin embargo, de que a las dos horas la radioactividad se iguala a ambos lados del encéfalo.

1200 ANNALS DE MEDICINA

60

60

t 40

* 20

4 lloros

FIG. 5.- Fracciones cerebrales. l-NornJrenalina·3H. Dosis administrada 10 uCi, imraven­tricular. Ratas hembra Sprague-Dawley 150 g. Porcentaje de fijación en: Sedimento

de 600 x g., y Fracción soluble, respecto al total fijado por el órgano.

* 16

12

8 •

{

'

4 1\orQS

FIG. 6.- Fracciones cerebrales. I-Noradrenalina.3H. Dosis administrada 10 uCi, intraven· tricular. Ratas hembra Sprague-Dawley 150 g. Porcentajes de fijación: en Sedimento

de 600 X g., y Fracción soluble, respecto al total captado por cada fracción.

J. ,\iALLOL Y COLS. FIJACIÓN DE LA :-<ORADRENALINA 1201

•¡,

* 7,5

*

~ ~/ ----------~------

* 5

* ...

2,5

4 horus

Frc. 7. - Fracciones cerebrales I-Noradrenalina-3 H. Dosis administrada 10 uCi, intraven­tricular, ratas hembra Sprague-Dawley 150 g. Porcentajes de fijación en: homogenizado

toral; Sedimento de 600 X g., y fracción soluble, respecto al total captado par el órgano.

80

6 0

1 '

40

20

6 frocclonos

FtG. 8. - Electroforesis de fracción solubre cerebral. Incubación a 37° C. Tampón T ris-suc­cinato pH 5,9, 1 = O, 15. I-Noradrenalina-3H 96,87 ng/ml. Concentración proteica 24,86 mg/ml. Porcentajes de radioactividad fijada y contenido proteico en cada fracción proteica,

respecto al total.

1202 ANNALS DE MED[CINA

Por el contrario, la inyección de 10 ¡.¡.l en el ventrículo lateral del gato de la misma sustancia, veremos gue Ja radioactividad queda práctica­mente confinada al ventrículo ipsilateral y al tercer ventrículo (CARR y MooRE, 1969). Nosotros, en función de la literatura consultada, he­mos creído oportuno utilizar el volumen antes referido de 10 ¡.¡.l.

Dentro de los tiempos expuestos en los resultados (de cero a cuatro horas) el método presenta suficiente sensibilidad en cuan to al número de CPM obtenidos. A tiempo más largos, la sensibilidad disminuye considerablemente y se deben utilizar tres animales. Por ejemplo, para determinar la radioactividad fijada en las 24 horas después de la admi­nistración, así como modificar los volúmenes habituales mencionados en el apartado de material y métodos; a pesar de ello, no podemos aducir pruebas concluyentes de los resultados observados a estos tiem­pos prolongados.

Dentro de lo expuesto, vemos que la cinética de captación global es superponible a lo observado por !VERSEN y GLOVINSKI en 1966,11

es decir, una caída de tipo exponencial en dos fases: una rápida que llega hasta las 12 horas y otra más lenta que se prolonga hasta las 48 horas.

Dentro de los tiempos observados no hemos podido constatar una estabilización o equilibrio del fenómeno de la fijación. Por de pronto parece que la fracción fijada es dinámica, susceptible de liberarse; esto podría indicar o bien que se trata de una fijación débil o bien que, aunque esté fuertemente fi jada, pueda, in vivo, liberarse el complejo, al contrario de lo que sucede in vitro, o bien tener relación con la vida media y resíntesis de las proteínas. La variación en los porcentajes de fijación a nivel de fracción soluble y sedimento de 600 X g. podría indi­car no sólo un destino inespecífico e independiente de la NA, sino también un posible intercambio entre dichas fracciones.

Los resultados in vitro obtenidos en experiencias previas que de­muestren una estabilización del complejo NA-proteína formado y las experiencias preliminares a tiempos más largos (hasta 24 horas), donde hay un aumento considerable de la fijación global respecto a la capta­ción, pueden indicar una capacidad importante en el almacenamiento de la NA cerebral y estar en relación con el pool de reserva de turnover lento (alrededor de las 18 horas) propugnado por ciertos autores.12

Los resultados obtenidos en las experienci~s electroforéticas permi­ten apuntar una especificidad en la fijación de la NA a las distintas proteínas de la fracción soluble encefálica, especialmente para aquellas de migración más lenta, mientras que resultados obtenidos a nivel de fracción soluble de miocardio demuestran que la mayor fijación tiene lugar en proteínas de migración intermedia.

J. MALLOL Y COLS. FIJACIÓN DE LA NORADRENALJNA 1203

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