Atm PRESENTACION

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  1. 1. UNIVERSIDAD DE GRANADA FACULTAD DE MEDICINA EVALUACIN DE LA VIABILIDAD DE LOS CONDROCITOS DE LA ARTICULACIN TEMPOROMANDIBULAR PARA SU UTILIZACIN EN INGENIERA TISULAR MAXILOFACIAL TESIS DOCTORAL Ana Beln Marn Fernndez Departamento de Histologa Servicio de Ciruga Oral y Maxilofacial 2012
  2. 2. Editor: Editorial de la Universidad de Granada Autor: Ana Beln Marn Fernndez D.L.: GR 44-2013 ISBN: 978-84-9028-259-5
  3. 3. EVALUACIN DE LA VIABILIDAD DE LOS CONDROCITOS DE LA ARTICULACIN TEMPOROMANDIBULAR PARA SU UTILIZACIN EN INGENIERA TISULAR Memoria que presenta la Licenciada en Medicina y Ciruga Ana Beln Marn Fernndez para optar al grado de Doctor en Medicina Fdo.: Ana Beln Marn Fernndez VB El Director de la Tesis VB El Director de la Tesis Dra. D. Ingrid J. Garzn Bello Dr. D. Miguel Alaminos Mingorance VB El Director de la Tesis Dr. D. Vctor Sebastin Carriel Araya DEPARTAMENTO DE HISTOLOGA FACULTAD DE MEDICINA SERVICIO DE CIRUGA ORAL Y MAXILOFACIAL HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DE LAS NIEVES UNIVERSIDAD DE GRANADA 2012
  4. 4. UNIVERSIDAD DE GRANADA FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Histologa Grupo de Investigacin de Ingeniera Tisular CTS - 115 Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en los laboratorios del Grupo de Ingeniera Tisular del Departamento de Histologa de la Universidad de Granada y financiada por el Proyecto de Investigacin FIS PI11/02668 financiado por el Fondo de Investigacin Sanitaria del Instituto de Salud Carlos III.
  5. 5. A toda mi familia.
  6. 6. AGRADECIMIENTOS Mis primeras palabras de agradecimiento van dirigidas a mis padres y a mi marido Carlos, ya que sin su cario, apoyo y sabios consejos, habra sido difcil alcanzar lo que hoy soy. Tambin quiero expresar mi gratitud a todo el Departamento de Histologa de la Facultad de Medicina de Granada por la oportunidad de iniciarme en el mundo de la investigacin y por desarrollar, gracias a su gran ayuda, la siguiente Tesis Doctoral. Gracias al Dr. D. Miguel Alaminos, por la atencin y tiempo dedicado, y a los Dres. D. Ingrid Garzn y D. Sebastin Carriel, por todas sus enseanzas. Al Servicio de Ciruga Oral y Maxilofacial, donde he iniciado mi carrera profesional y, en especial, a mi amigo el Dr. D. Daro Snchez, por el tiempo dedicado y la ilusin que transmite por estos proyectos.
  7. 7. TESIS DOCTORAL Ana Beln Marn Fernndez
  8. 8. ndice NDICE INTRODUCCIN 1 1. Articulacin Temporomandibular.. 5 1.1. Estructura anatmica de la articulacin temporomandibular del adulto humano 5 1.2. Estructura histolgica de la articulacin temporomandibular del adulto humano. Disco articular 12 1.3. Histofisiologa articular . 22 1.4. Biomecnica articular 24 1.5. Fisiopatologa articular .. 30 1.5.1. Sndrome de Disfuncin Temporomandibular ...... 30 1.5.1.1. Epidemiologa ... 31 1.5.1.2. Etiopatogenia 31 1.5.1.3. Clnica 32 1.5.1.4. Fisiopatologa discal 32 1.5.1.5. Diagnstico 35 1.5.1.6. Estadiaje 35 1.5.1.7. Teraputica 36 1.6. Procedimientos reconstructivos de la articulacin temporomandibular. Controversias actuales.. 40 1.6.1. Conceptos generales 40 1.6.2. Discopexia .. 40 1.6.3. Discectoma 41 1.6.4. Condilotoma. Sustitucin articular . 42 1.6.5. Controversias en el empleo de materiales autlogos . 43 2. Ingeniera Tisular . 47 2.1. Conceptos generales . 47 2.2. Ingeniera Tisular de la Articulacin Temporomandibular ... 49 2.3. Viabilidad celular . 55 2.3.1. Evaluacin de la integridad de la membrana celular ... 57 2.3.2. Ensayos funcionales . 58 2.3.3. Ensayos con pruebas de fluorescencia . 59 2.3.4. Ensayos morfolgicos .. 59 2.3.5. Microscopa electrnica analtica 59 2.3.6. Determinacin del perfil de expresin gnica mediante microarray .. 63 OBJETIVOS . 64 MATERIALES Y MTODOS . 66 1. Aislamiento de condrocitos 67 2. Obtencin de subcultivos celulares .. 68 3. Determinacin de la viabilidad celular mediante tcnicas mixtas metablicas y de exclusin de colorantes vitales (Live/Dead ) .. 69 4. Determinacin de la viabilidad celular mediante tcnicas de exclusin 69
  9. 9. ndice de colorantes vitales (azul tripn) 5. Determinacin de la viabilidad celular mediante el anlisis del perfil inico cuantitativo mediante microscopa electrnica analtica por energa dispersiva de rayos X .. 72 6. Determinacin de la viabilidad celular mediante el anlisis del perfil de expresin gnica global utilizando microarray de ARN 78 7. Determinacin de la Viabilidad Media . 79 8. Anlisis estadstico . 79 RESULTADOS 81 1. Generacin de cultivos primarios de condrocitos de disco articular de la articulacin temporomandibular del adulto humano . 82 2. Viabilidad celular determinada mediante tcnicas mixtas metablicas y de exclusin de colorantes vitales (Live/Dead ) 83 3. Viabilidad celular determinada mediante tcnicas de exclusin de colorantes vitales (azul tripn) .. 88 4. Viabilidad celular determinada mediante el anlisis del perfil inico cuantitativo mediante microscopa electrnica analtica por energa dispersiva de rayos X . 91 5. Viabilidad Media .. 111 6. Viabilidad celular determinada mediante el anlisis del perfil de expresin gnica global utilizando microarray de ARN 113 DISCUSIN . 123 CONCLUSIONES ... 138 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 141
  10. 10. 1 INTRODUCCIN OBJETIVOS MATERIALES Y MTODOS RESULTADOS DISCUSIN CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
  11. 11. Introduccin 2 La articulacin temporomandibular (ATM) o complejo articular temporomandibular es una articulacin ginglimoartrodial que articula bilateralmente la mandbula con el crneo. Forma parte del Sistema Masticatorio, unidad funcional y estructural encargada de la masticacin, el habla y la deglucin, aunque tambin desempea un papel significativo en la respiracin y en la percepcin gustativa. Este sistema est a su vez constituido por la articulacin alveolodentaria, los ligamentos, los msculos masticadores y un importante mecanismo de control neurolgico. Ambas articulaciones, sinovial y dentaria, han de actuar con precisin y armona; la primera tiene como principal funcin guiar los movimientos mandibulares y la segunda, al poseer receptores propioceptores (a nivel periodontal), protege todo el sistema de posibles traumas oclusales. Dentro de la ATM, el hueso temporal se relaciona con los huesos del crneo y con la mandbula a travs de dos dispositivos articulares. Por una parte, se relaciona con los huesos del crneo mediante una articulacin esttica (sinartrosis) y, por otra parte, con el cndilo mandibular, constituyendo anatmicamente una enartrosis que funcionalmente acta a modo de bisagra en los movimientos de apertura y cierre mandibular, comportndose como una diartrosis. Desde el punto de vista funcional, se clasifica como una diartrosis bicondlea, ya que articula dos huesos cuyas superficies convexas se encuentran articuladas a una cavidad y que contiene un disco menisco articular que adapta ambas estructuras seas, siendo todo ello lubricado por el lquido sinovial. A su vez, cada ATM est constituida por dos estructuras, una superior temporodiscal y una inferior discocondilar. La ATM es una articulacin de caractersticas funcionales exclusivas, ya que los movimientos de una no son independientes de la otra, sino que al realizar un movimiento los msculos del lado derecho e izquierdo deben actuar simultneamente de forma sinrgica y antagonista. Este movimiento recproco es nico en el organismo (Gmez de Ferraris y Campos; 2009). La ATM se encuentra ntimamente relacionada con la oclusin dentaria y el sistema neuromuscular, ya que sus movimientos no estn guiados nicamente por la forma anatmica del hueso y del sistema msculo-ligamentoso, sino tambin por la oclusin dental. Por su compleja dinmica articular, cualquier trastorno funcional o patolgico que asiente en alguno de sus componentes afectar el normal fun- cionamiento de todo el sistema (Gmez de Ferraris y Campos; 2009).
  12. 12. Introduccin 3 Para comprender esta compleja unidad articular y la patologa que asienta en ella, hay que tener slidos conocimientos sobre la anatoma, la histologa, la fisiologa y la biomecnica articular, aspectos que proporcionan las bases biolgicas para el logro de un buen diagnstico, una adecuada teraputica y una acertada prevencin de las disfunciones articulares. Dentro de las patologas que afectan a la ATM podemos destacar el Sndrome de Disfuncin Temporomandibular (SDTM), tambin denominado como Sndrome de desarreglos internos, por la incidencia elevada que existe en la poblacin. Dicha alteracin fue definida por Dolwick en 1983 como: Una relacin anormal del disco articular respecto al cndilo, fosa y eminencia de la articulacin temporomandibular. Se trata de una patologa multifactorial caracterizada por una anormal relacin del disco articular respecto al cndilo, fosa y eminencia de la articulacin temporomandibular. Junto a otras alteraciones estructurales y funcionales que se producen en la articulacin tenemos la degeneracin progresiva del disco articular, generalmente por un desplazamiento anterior del mismo, alterando la cintica articular y provocando la aparicin de una serie de sntomas (dolor, chasquidos, bloqueos, limitacin en la apertura oral, etc.), que caracterizan a dicha enfermedad. En los primeros estadios de la enfermedad el abordaje es multidisciplinar, mientras que en estadios avanzados de la patologa donde se asocia una degeneracin progresiva del disco, nos encontramos con la necesidad de realizar una extirpacin quirrgica del mismo, quedando una alteracin estructural y funcional articular importante que puede desembocar en la aparicin de grandes secuelas. Los nuevos estudios de investigacin buscan entender la biologa, composicin, metabolismo, organizacin ultraestructural y molecular, y las propiedades biomecnicas del disco articular con la esperanza de desarrollar un procedimiento de reparacin biolgica como una alternativa a los tratamientos existentes para el SDTM, con el objetivo de hallar un sustituto biolgico viable con las propiedades bioqumicas y biomecnica