LGN0232 – Genética molecular

Maria Carolina QuecineDepartamento de Genética

mquecine@usp.br

Aula Prática

MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA

MÉTODOS DE INTRODUÇÃO DE DNA NA CÉLULA

Suspensão de células competentes

+Moléculas de DNA

recombinante

= Incubar 30 min no gelo

Choque térmico (42°C/90 s)

CHOQUE TERMICO

I. Transformação bacteriana (Escherichia coli) por choque térmico e seleção de clones

transformantes

1. Descongelar no gelo o microtubo com as células competentes de E. coli DH5α;

2. Ligar banho-maria e deixar meio LB aquecendo a 42ºC;

3. No gelo, adicionar aos 40 μL das células competentes 1 a 2 μL de DNA do plasmídeo.

Homogeneizar a mistura e incubar por 90 segundos à 42 oC;

4. Transferir o microtubo para o gelo por 3 - 5 minutos

5. Remover o microtubo e adicionar 300 μL de meio LB. Rapidamente, mas com cuidado,

ressupenda as células com pipeta.

6. Transferir as células para um microtubo e incubar a 37 ºC por 1 hora sob agitação (180 rpm)

7. Plaquear 100 μL da suspensão de células em meio LB contendo kanamicina (usar

10 µL de uma concentração 100 mg/mL). Incubar por toda a noite (overnight) a 37oC, com

placas invertidas.

II. Aula prática – Transformação bacteriana (Escherichia coli) por eletroporação e

seleção de clones transformantes

1. Descongelar no gelo o microtubo com as células competentes de E. coli DH5. Para

cada amostra, colocar uma cubeta no gelo;

2. Ligar banho-maria e deixar meio LB aquecendo a 37ºC;

3. No gelo, adicionar aos 40 L das células competentes 1 a 2 L de DNA do plasmídio.

Homogeneizar a mistura e incubar no gelo por cerca de 1 minuto;

4. Transferir a mistura de células e DNA para a cubeta resfriada e fazer a suspensão

alcançar o fundo da cubeta. Colocar a cubeta na câmara de eletroporação. Empurrar

a cubeta até encaixar entre os eletrodos. Pulsar apenas uma vez.

5. Remover a cubeta da câmara de eletroporação e adicionar mL de meio LB pré-

amornado a 37 ºC. Rapidamente, mas com cuidado, ressupenda as células com pipeta.

6. Transferir as células para um microtubo e incubar a 37 ºC por 1 hora sob agitação

(180 rpm).

II. Transformação bacteriana (Escherichia coli) por eletroporação e seleção de

clones transformantes

ELETROPORAÇÃO

Suspensão de células

Eletrodo Eletrodo

Cuveta

Pulso elétrico

Eletroporador

Gene lacZ = codifica a enzima β-galactosidase

SELEÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES

Produção da enzima β-galactosidase

X-gal é clivado = colônia azul

Não há produção da enzima β-galactosidase

X-gal não é clivado = colônia brancaÁgar + ampicilina + X-gal

Sítio múltiplo de clonagem

pUC8Vieira & Messing,

1982

Gene de resistência à ampicilina

Agrobacterium

• Bactéria do solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA para dentro da célula da planta;

• No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as células de plantas, ou inoculada no tecido da planta, transferindo parte do seu DNA para as células da planta;

Bombardeamento

• Partículas de ouro ou tungstênio são cobertas com DNA e aceleradas em direção ao tecido da planta (hélio comprimido);

• As partículas perfuram a parede celular e penetram dentro da célula;

• Utilizado quando não é possível por incompatibilidade biológica o uso de Agrobacterium - em monocotiledôneas.

MÉTODOS PARA A INTRODUÇÃO DO TRANSGENE NA PLANTA

Transformação Genética de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana Pequeno porte

Ciclo de vida curto

Elevado número de sementes

Genoma pequeno e sequenciado

Diversidade de mutantes (estudo de

genômica funcional)

Fonte: http://www-ijpb.versailles.inra.fr/ en/arabido/arabido.htm

Planta Modelo

Tipos de transformação

Explantes de raízes (Valvekens et al., 1988)

Infiltração a vácuo (Bechtold et al. 1993)

Floral-dip (Clough & Bent, 1998)

Vantagens do Floral-dip

Método simples e rápido

Sem variação somaclonal

Dispensa uso de condições estéreis

Transformação genética de Arabidopsis thaliana pelo método Floral-dip

Clough & Bent (1998), The Plant Journal 16:735-743

1. Crescer Agrobacterium tumefaciens em meio líquido contendo antibiótico de

seleção até a fase estacionária de crescimento (OD600 = 0,8-1,0)

2. Centrifugar cultura de A. tumefaciens por 5 min a 4000 rpm

3. Descartar sobrenadante e ressuspender pellet em solução contendo 5%

sacarose e 0,02% Silwet L-77 (surfactante)

4. Mergulhar flores em estágio inicial de desenvolvimento na suspensão de A.

tumefaciens

5. Manter plantas no escuro em câmara úmida por 24 h e repetir todo

procedimento após 7 dias

Crescer material vegetal

Preparar suspensão de Agrobacterium

Agrobacterium em

LB sólido Agrobacterium em

LB líquido

Centrifugar

Agrobacterium

Ressuspender

péllet

5% sacarose

0,02% Silwet L-77

Fonte: https://blog.addgene.org/tips-for-arabidopsis-transformation

Mergulhar flores em

suspensão de AgrobacteriumRemover síliquas

Método de Transformação Floral-dip

Câmara úmida e

escuro por 24h

Cronograma de

transformação e

seleção de

transgênicos

Columbia em MS + higromicina

homozigota _/_ heterozigota R/_

homozigota _/_

heterozigota R/_

homozigota R/Rhomozigota R/R

Germinação de sementes T3 em meio de cultura seletivo

Confirmação de transformação genética pelo sistema GUS

GUS report system in rice. a : Control callus. b and c : Transgenic calli. d , e , and f Transgenic plantlets. g , h , and i : Transgenic plant, leaves, and roots

Kaikavoosi et al., 2015. Applied Biochemistry and Biotechnology, 177, DOI 10.1007/s12010-015-1827-4.

Solanum lycopersicum

Justificativas do uso na pesquisa

Pequeno porte

Ciclo de vida curto

Elevado número de sementes

Genoma conhecido

Diversidade de mutantes (estudo

de genômica funcional)

Protocolo de transformação

genética já estabelecido

Transformação genética de tomateiro

MT

Transformação genética de tomateiro

Cultura bacteriana crescida overnight a 28ºC

Centrifugação

Ressuspendida em meio MS Suspensão bacteriana

OD600 = 0,2-0,3

+Acetoseringona Explantes cotiledonares

Co-cultivo2 dias25ºC

Meio MS com antibióticos para seleção

Formação de gemas

adventícias

Formação de raízes

Plantas aclimatizadas

Selecionadas com aplicação de kanamicina Plantas resistentes a seleção serão

analisadas por testes moleculares de confirmação de introgressão transgênica

e inoculadas com o patógeno

Transformação genética de tomateiro

Pino-Nunes et al. (2009)

MT

RESULTADOS PRELIMINARES Transformação genética de tomateiro

D E

A B C

Controle MT MT MT-Rg1

MT MT-Rg1

Meio de regeneração

Meio de enraizamento

RESULTADOS PRELIMINARES Transformação genética de tomateiro

MT MT-Rg1

Casa-de-vegetação

Auto-fecundadas e produzirão sementes T1

Sementes T1 serão germinadas e as plântulas serão selecionadas com aplicação de kanamicina, para

posterior inoculação com o patógeno

MT-Rg1 MT-Rg1 Bax

Transformação genética de tomateiro

MT MT-Bax #1 MT-Bax #2 MT-Bax #3