Avances en la estandarización de la PCR para la … T cruzi.pdf · • reactivos y termociclador Revisión bibliográfica de artículos publicados en Pubmed entre los años 2000

Avances en la estandarización de la PCR para la detección de la infección por

Trypanosma cruzi

Curso“Enfermedad de Chagas en el Banco de Sangre:

pasado, presente y futuro”

Trypanosma cruzi

Dra. Margarita BisioBecaria Posdoctoral – Servicio de Parasitología-Chagas –

Hospital de Niños R. Gutiérrez

14 de junio de 2012

Epidemiología de la enfermedad de Chagas

300.000

>5.000>24.000

>3.000

8 millones de infectados - 28 millones de personas en riesgo -40 mil nuevos casos/año por transmisión vectorial - 12 mil muertes/año

- Control vectorial

- Control de transfusiones

- Urbanización de las poblaciones en Latinoamérica

- Otras vías de transmisión (congénita, oral, por transplante)

DNDi, Rassi y col., 2010

>1.500

Ciclo de vida de T. cruzi y vías de transmisión

Transmisión por transfusiones o

Transmisión oral

Transmisión congénita

transfusiones o transplantes

Transmisión vectorial

Fase aguda Fase crónica

Parasitemia

Enfermedad de Chagas

Diagnóstico de laboratorio

1 técnica parasitológica positiva

2 técnicas serológicas positivas

meses años

Anticuerpos

Diagnóstico de laboratorio

• Diagnóstico

Chagas agudo: técnicas parasitológicas

MH Strout XD Hemocultivo

Parasitem

ia

Chagas indeterminado o crónico: por lo menos dos técnicas serológicas positivas

HAI IFI ELISA

• Bancos:

una técnica serológica positiva descarta la bolsa

Anticuerpos

Reacción en cadena de la Polimerasa:PCR!!

• Extracción de sangre anticoagulante: EDTA

• Extracción y purificación de ADN presente en la sangre

Extracción de ADN

presente en la sangre

• Amplificación exponencial de secuencias ADN específicas de T. cruzi

• Detección del producto de la reacción

330 pb

PCR

PCR

Amplificación exponencial de una secuencia específica

Estandarización

Preparación de Extracción de Amplificación Detección

ProductoADNMuestra

• Método• Estabilidad

ADN• Conservación

• Método de detección• Eficiencia

• Método de extracción

• Conservación

Preparación de la muestra

Extracción de ADN Amplificación Detección

Controles de calidad PCR

• Contaminaciones– áreas– reactivos y equipos– Personal y Normas

• Inhibiciones– controles externos

(positivos y negativos)• Control interno o genes

houskeeping– calibradores– calibradores

• Estándares de concentración conocida– controles de sensibilidad– curvas de calibración

PCR convencional

ADNkProducto 330 pb

Primers 121 / 122

ADN-SateliteProducto ~180 pb

Primers cruzi1 / cruzi2

Minicírculo del kinetoplasto

182 pb

ADN nuclear

ADN-k

ADN-Sat.

182 pb182 pb

Alta sensibilidad – Resultado cualitativo

PCR en tiempo real

La acumulación del producto de PCR se monitorea mientras se

lleva a cabo la amplificación

Analiza ciclo a ciclo los cambios de la señal fluorescente generada

La cantidad de ciclos necesarios

1 semana de tratamiento

Pretratamiento

La cantidad de ciclos necesarios para obtener una señal detectables

es menor cuanto mayor es la cantidad de ADN en la muestra

ADN-SatelitePrimers TCZ F / TCZ R

cruzi1 / cruzi2SatFw/SatRv

ADNkPrimers: 32F-148R

Menor riesgo de contaminaciones cruzadas

Resultado cualitativo y/o cuantitativo

Mayor precisión para evaluar la respuesta al tratamiento

PCR en tiempo real en muestras de un paciente neonato con MH positivo. Tratamiento: Benznidazol 5 mg/kg/dia

PCR en tiempo real cuantitativa

1 semana de tratamiento

Pretratamiento

Se puede estimar la carga parasitaria

PCR T. cruzi: amplificación de secuencias de ADN específicas del parásito

Ventajas• Técnica parasitológica• Alta sensibilidad analítica• Amplificación específica de ADN

Desventajas• Contaminaciones cruzadas• Uso limitado a centros de referencia• Gran variabilidad en los resultados obtenidos en distintas

regiones

Limitaciones de la PCR en el diagnóstico de Chagas

Los niveles de parasitemia son variables

• En la infección aguda y crónica• Entre población pediátrica y adulta • Entre población pediátrica y adulta • Fluctúan en un mismo paciente a lo largo de la historia natural de su

infección aún en la etapa crónica • Varían en distintas regiones geográficas

Se conoce poco sobre esta variabilidad biológica en términos cuantitativos

Un poco de historia

Utilización de PCR en publicaciones científicas:

•Detección del parásito (diagnóstico o epidemiología) (68%)•Evaluación de respuesta al tratamiento parasiticida (26%)•Estandarización del método (6%)

Gran variabilidad en los resultados publicados

Dependiendo de:

• características epidemiológicas de la población estudiada

• volumen de muestra recolectado• método de extracción y purificación

del ADN• primers utilizados

• reactivos y termociclador

Revisión bibliográfica de artículos publicados en Pubmed entre los años 2000 y 2010

Un poco de historia

38 Publicaciones utilizan PCR para detectar parásitos en sangre de pacientes con infección por T. cruzi

Población estudiada (30% Brasil, 18% Argentina, 18% Bolivia, 9% México, 7% Colombia, 18% restante: Venezuela, Chile, Paraguay, Perú, España y EEUU)

Volumen de muestra (1-15 ml)

GEB (68%) – EDTA o -20ºC (32%)GEB (68%) – EDTA o -20ºC (32%)(sin embargo entre los años 2007-2010 50 y50)

Método de extracción del ADN (86% extracción con solvente - 14% kit comercial)

ADN blanco(84% ADNk; 37% ADN satélite; 16% otros blancos ADN nuclear)

PCR cualitativa (N=38) / PCR cuantitativa (N=5)

Especificidad 84.9(74-100%) y Sensibilidad 62.8 (1,2 -100%)

Revisión bibliográfica de artículos publicados en Pubmed entre los años 2000 y 2010

Detección de T. cruzi por PCR en contextos clínicos

• Fue utilizada como herramienta de diagnóstico parasitológico indirecta y en el seguimiento de pacientes tratados

• Ha sido útil en el diagnóstico de la infección congénita y de casos agudos • Ha sido útil en el diagnóstico de la infección congénita y de casos agudos y el seguimiento de las reactivaciones postransplante

• Sin embargo los trabajos publicados informan valores muy heterogéneos de sensibilidad y especificidad

• La falta de estandarización de la técnica y de controles de calidad adecuados hacen poco fiable la comparación de resultados entre distintos laboratorios

Estudio internacional interlaboratorio

• 70 muestras analizadas a

Evaluación de diferentes procedimientos de amplificación génica para la detección de ADN de T. cruzi en muestras clínicas

• 70 muestras analizadas a ciego

• En 26 laboratorios de América y Europa

• Con diferentes protocolos de purificación del ADN y de PCR

Schijman et al 2011, PNTD

Estrategias informadas (n:48)

Blanco molecular

Nombre de los oligonucleótidos Mezcla de reacción Tipo de

termocicladorN° de ciclos

LbA Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 35

LbB Extracción con solvente IH ADNk S35 - S36 casera convencional 30

LbC/1 Extracción con solvente IH ADNk S35 - S36 casera convencional 32

LbC/2 Extracción con solvente IH ADNSat tcz1 - tcz2 casera convencional 40

LbC/3 NC NC 24s D71-D71 casera convencional 40

LbC/4 NC NC ADN CO II Tcmit 31-40 casera convencional 48

Lb/C5 NC NC ADN CO II Nested Tcmit 10-21 casera convencional 48

Lb/C6 NC NC SL Tcc- Tc1-Tc2 casera convencional 30

Lb/D1 Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 36

Lb/D2 Extracción con solvente IH ADNSat TczF-TczR QIAGEN tiempo real 50

Lb/D3 Extracción con solvente IH ADNSat TczF-TczR casera convencional 40

LbE Extracción con resina Chelex IH ADNk 121-122 casera convencional 35

LbF/1 Columna de fibra de vidrio KtR ADNSat cruzi1-2 Roche tiempo real 45

LbF/2 Columna de fibra de vidrio KtR ADNk 32f-148r Roche tiempo real 45

LbG/1 Columna de fibra de vidrio KtR ADNk 32f-148r Roche tiempo real 55



LbG/4 Columna de fibra de vidrio KtR ADNSat cruzi1-2 Roche tiempo real 45

LbH/1 Columna de fibra de vidrio KtF ADNk 121-122 Promega convencional 33

LbH/2 Columna de fibra de vidrio KtF ADNk 121-122 casera convencional 33

LbI/1 Columna de fibra de vidrio KtF ADNk 121-122 casera convencional 40

LbI/2 Columna de fibra de vidrio KtF ADNk S35 - S36 casera convencional 40

LbJ Extracción con solvente IH ADNSat Tcz1-Tcz2 casera convencional 40

LbK/1 Columna Kt ADNSat cruzi1-2 casera tiempo real 40

Tabla R4. Pruebas de PCR reportadas por los laboratorios participantes del estudio multicéntrico.

PCRLbX/N Método de purificación del ADN

LbK/2 Columna Kt ADNk 121-122 casera convencional 40

LbL/1 Columna de silica gel KtQ ADNSat cruzi1-2 casera convencional 40

LbL/2 Columna de silica gel KtQ ADNSat kit basado en ADNSat OligoC-T Coris convencional 40

LbM Columna de silica gel KtQ ADNk TC1-TC2 casera convencional 40

LbN/1 Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 40

LbN/2 Extracción con solvente IH ADNSat Tcz1-Tcz2 casera convencional 35

LbO Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 40

LbP/1 Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 35

LbP/2 Extracción con CTAB IH ADNk 121-122 casera convencional 35

LbQ Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 37

LbR Columna de fibra de vidrio KtR ADNk 121-122 casera convencional 40

LbS/1 Columna de silica gel KtQ 18s Tc18s F3-R4 Applied Biosystems convencional 40

LbS/2 Columna de silica gel KtQ ADNSat cruzi1-2 Invitrogen tiempo real 40

LbS/3 Columna de silica gel KtQ 18s Tc18s F1042- R1144 Invitrogen tiempo real 40

LbS/4 Columna de silica gel KtQ ADNk 121-122 Applied Biosystems convencional 40

LbT ATGEN kit KtA ADNk 121-122 Invitrogen tiempo real 40

LbU/1 Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 40

LbU/2 Extracción con solvente IH 24s D71-D72 casera convencional 32

LbV/1 Columna Kt ADNk 121-122 casera convencional 40

LbV/2 Columna Kt ADNSat Tcz1-Tcz2 casera convencional 30

LbW Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 40

LbX Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 35

LbY Extracción con solvente IH ADNk 121-122 casera convencional 35

LbZ Columna Kt ADNSat cruzi1-2 Applied Biosystems tiempo real 45

LbX/N, identificación de laboratorio/prueba, donde LbX denota el laboratorio y N cada uno de las pruebas utilizadas por ese laboratorio; IH, método casero de purificación (del inglés "in house"); KtR, KtQ, y KtF, kits de extracción de ADN comercial Roche, Qiagen y Favorgen, respectivamente;ADNk, ADN del minicírculo del kinetoplasto; ADNSat, ADN satelite; 24s, ADNr 24s�; CO II, ADN del gen de la subunidad II de la citocromooxidasa; SL, "Spliced Leader", 18s, ADNr 18s; letras verdes, métodos dirigidos a secuencias de ADNSat; letras azules, métodos dirigidios asecuencias de ADNk.

Kt, método comercial de purificación del ADN; IHmétodo casero de purificación del ADN; ADNSat, ADNsatélite; ADNk, ADN del cinetoplasto


Resultados Panel A

2

3

4

5

Nº

acie

rtos

Acierto en el panel A: un resultado de PCR positivo en las muestras de diluciones de ADN purificado o resultado de PCR negativo en los controles negativos de agua

agua

TcIV

LbF

/1

LbW

LbR

LbZ

LbG

/1

LbG

/2

LbG

/3

LbG

/4

LbP

/1

LbP

/2

LbF

/2

LbB

LbQ

LbI/1

LbS

/2

LbS

/4

LbV

/1

LbA

LbD

/1

LbD

/2

LbD

/3

LbH

/1

LbH

/2

LbN

/1

LbI/2

LbE

Lb K

/1

LbK

/2

LbV

/2

LbN

/2

LbL/

1

LbJ

LbL/

2

LbS

/1

LbS

/3

LbC

/2

LbO

LbC

/3

LbC

/4

LbC

/6

LbY

LbX

LbC

/5

LbC

/1

LbT

LbU

/1

LbU

/2

LbM

0

1aguaagua

TcVITcVI

TcITcI

TcIVTcIV


Resultados Panel B

5 p/ml

0 p/ml1

Nº

acie

rtos

Acierto en el panel B: un resultado de PCR positivo en las diluciones de GEB contaminada conparásitos o resultado de PCR negativo en el control negativo de GEB negativa

LbC

/2Lb

I/1Lb

ELb

WLb

F/1

LbO

LbG

/1Lb

G/2

LbG

/3Lb

V/1

LbV

/2Lb

RLb

D/2

LbD

/3Lb

F/2

LbN

/1Lb

N/2

LbL/

1Lb

L/2

LbB

LbQ

LbS

/2

LbG

/4

Lb K

/1

LbX

LbP

/2

LbH

/1

LbH

/2

LbK

/2

LbP

/1

LbU

/1

LbJ

LbS

/1

LbS

/3

LbY

LbA

LbM

LbC

/1

LbI/2

LbU

/2

LbS

/4

LbT

LbD

/1

LbZ

0,00005 p/ml

0,0005 p/ml

0,005 p/ml

0,05 p/ml

0,5 p/ml

5 p/ml

0

Nº

acie

rtos

LbX/N


Resultados Panel C

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% d

e ac

ierto

s

Acierto en el panel C: un resultado de PCR positivo en muestras seropositivas o un resultado de PCR negativo en las muestras seronegativas

LbD

/2Lb

D/3

LbF/

1Lb

QLb

S/4

LbS

/2Lb

ZLb

V/2

LbV

/1Lb

P/2

LbS

/3Lb

C/1

LbC

/6Lb

K/2

LbE

LbP

/1Lb

F/2

LbU

/1Lb

YLb

N/2

LbT

LbH

/1Lb

H/2

LbL/

1Lb

G/1

LbR

LbL/

2Lb

G/4

LbJ

LbN

/1Lb

K/1

LbA

LbX

LbW

LbD

/1

LbG

/2

LbG

/3

LbI/1

LbM

LbU

/2

LbO

LbI/2

LbB

LbC

/2

0

10

LbX/N


Criterios de selección

• Especificidad del 100% en los controles negativos de los paneles A y B

• Coherencia de resultados informados en las series de diluciones de los paneles A y B

• Límite de detección � 10 fg/µL en las 3 series de diluciones del panel A y � 5 par/mL en el panel By � 5 par/mL en el panel B

Los métodos que cumplieron con los 3 criterios de selección fueron considerados métodos con buena performance (MBP)


Sensibilidad analítica

25 estrategias PCR-ADNk y PCR-ADNsat que cumplieron con los criterios de coherencia y especificidad

20/48 (41.7%) estrategias lograron BP y no estuvieran asociados al uso de una secuencia blanco en particular. Además, las pruebas que lograron BP

Sensibilidad analítica en diluciones seriadas de ADN (Panel A). Distribución de los límites de detección (LD) de las25 pruebas de PCR específicas y coherentes dirigidas a ADNk (A) ADNSat (B) para la detección de dilucionesseriadas de ADN purificado a partir de 3 poblaciones de parásitos representativos de T. cruzi DTU I (Silvio X 10), DTUIV (Can III) y DTU VI (CL Brener).

una secuencia blanco en particular. Además, las pruebas que lograron BP fueron menos sensibles para detectar ADN de la cepa representativa de TcIV

(CAN III) respecto a las de Tc I (X10) y TcVI (CL-Brener)


Consenso PCRConsensoaños MBP

1 F NA cChHD-HTx Arg-ND1 15 (93.75) positivo2 M NA cChHD-HTx Arg-Chaco1 15 (93.75) positivo3 F 54 Mega III + cChHD Br-MG 12 (75.00) positivo4 F 42 Embarazada Arg-Salta2 14 (87.50) positivo5 F 25 Embarazada Bo-ND 12 (75.00) positivo6 M 20 Donante de sangre Br-BA 10 (62.50) positivo7 F 41 cChHD Br-BA 11 (68.75) positivo8 F 31 Embarazada Bo-ND 11 (68.75) positivo9 F NA Embarazada Par-ND2 12 (75.00) positivo10 F 22 cChD Br-BA 12 (75.00) positivo11 F 41 cChD Br-BA 11 (68.75) positivo12 F 24 cChD Br-Go 10 (62.50) positivo13 F 32 Embarazada Arg-Co 8 (50.00) Ind14 F 35 cChD Br-Ceara 12 (75.00) positivo15 F 47 cChHD Br-Go 9 (56.25) positivo16 F NA Embarazada Par-ND 9 (56.25) positivo17 M 55 cChD Br-MG 10 (62.50) positivo18 M 33 cChHD Br-BA 8 (50.00) Ind19 F 66 Mega II + CBBB Br-BA 9 (56.25) positivo20 F 18 cChD Br-Go 8 (50.00) Ind21 F 18 Embarazada Arg-Sg 8 (50.00) Ind22 F 43 cChD Br-BA 6 (37.50) negativo

Pac

ient

es s

erop

ositi

vos

Tabla R6. Resultados del consenso MBP para las muestras del Panel C

Muestra G Hallazgos clínicos País-RgEdad

MBP N=16

N pos (%)

De las 32 muestras seropositivas del Panel C

-18 (56,25%) resultaron positivas para el “consenso MBP”

22 F 43 cChD Br-BA 6 (37.50) negativo23 F 57 Donante de sangre Br-Piaui 9 (56.25) positivo24 F 46 Donante de sangre Br-BA 6 (37.50) negativo25 F 25 Embarazada Par-ND2 5 (31.25) negativo26 F 32 Embarazada Par-ND2 6 (37.50) negativo27 F 36 Embarazada Arg-Chaco 5 (31.25) negativo28 F 36 Embarazada Arg-Chaco 2 (12.50) negativo29 M 59 cChHD Br-Piaui 5 (31.25) negativo30 F 29 Mega-II Br-Go 5 (31.25) negativo31 F NA Embarazada Par-ND2 1 (6.25) negativo32 F 28 Embarazada Arg-Sg 1 (6.25) negativo

33 M 38 Análisis de rutina Br-Go (NE) 1 (6.25) negativo34 M 51 Análisis de rutina Br-ND 1 (6.25) negativo35 NA NA Donante de sangre Arg-BAs (NE) 1 (6.25) negativo36 F 39 Análisis de rutina Br-Go 1 (6.25) negativo37 F 37 Análisis de rutina Br-Go (NE) 2 (12.50) negativo38 NA NA Donante de sangre Arg-BAs (NE) 3 (18.75) negativo39 F 36 Análisis de rutina Br-Bh 3 (18.75) negativo40 F 40 Análisis de rutina Br-Go 5 (31.25) negativo41 F 40 Análisis de rutina Br-Go 5 (31.25) negativo42 F 58 Análisis de rutina Br-Go 6 (37.50) negativo

G, Género; País-Rg, País y región endémica de procedencia; MBP, métodos con buena performance en los panelesA y B; N pos, cantidad de MBP que informaron resultados positivos; F, femenino; M, masculino; ND, dato nodisponible; cChD, enfermedad de Chagas crónica, cChHD, enfermedad de Chagas crónica con manifestacióncardíaca; Mega, Megacolon, CBBB, Bloqueo completo de rama derecha, HTx, transplante cardíaco; Arg, Argentina;Bo, Bolivia; Br, Brazil; Par, Paraguay; BAs, Buenos Aires; Bh, Bahia; Go, Goias; MG, Minas Gerais; Sg, Santiago delEstero; NE, no endemico; Ind, indeterminado. 1 T. cruzi DTU I, 2 T. cruzi DTU II/V/VI,

Indi

vidu

os s

eron

egat

ivos

-10 (31,25%) resultaron consideradas negativas

- 4 (12,5%) resultaron indeterminadas


Muestras clínicas

Criterio de selección:

Especificidad: 100%

Sensibilidad: >60%

LbA C 33.3 60.0 47.4 -0.1 31.3 70.0 40.5 0.0LbB C 72.2 35.0 52.6 0.1 65.6 30.0 57.1 0.0

LbC/1 C 0.0 100.0 52.6 0.0 0.0 100.0 23.8 0.0LbC/2 C 66.7 15.0 39.5 -0.2 68.8 10.0 54.8 -0.2Lb/D1 C 94.4 45.0 68.4 0.4 81.3 40.0 71.4 0.2Lb/D2 TR 94.4 85.0 89.5 0.8 68.8 100.0 76.2 0.5Lb/D3 C 94.4 85.0 89.5 0.8 62.5 100.0 71.4 0.4LbE C 94.4 65.0 78.9 0.6 81.3 80.0 81.0 0.5

LbF/1 TR 83.3 95.0 89.5 0.8 62.5 100.0 71.4 0.4LbF/2 TR 72.2 90.0 81.6 0.6 53.1 90.0 61.9 0.3LbG/1 TR 100.0 60.0 78.9 0.6 84.4 60.0 78.6 0.5LbG/2 TR 100.0 65.0 81.6 0.6 78.1 40.0 69.0 0.4LbG/3 TR 100.0 65.0 81.6 0.6 78.1 40.0 69.0 0.4LbG/4 TR 94.4 90.0 92.1 0.8 62.5 60.0 61.9 0.4LbH/1 C 27.8 80.0 55.3 0.1 21.9 80.0 35.7 0.0LbH/2 C 22.2 80.0 52.6 0.0 15.6 80.0 31.0 0.0LbI/1 C 83.3 40.0 60.5 0.2 78.1 50.0 71.4 0.3LbI/2 C 38.9 40.0 39.5 -0.2 53.1 40.0 50.0 -0.1LbJ C 55.6 60.0 57.9 0.2 59.4 70.0 61.9 0.2

LbK/1 TR 61.1 70.0 65.8 0.3 43.8 60.0 47.6 0.3LbK/2 C 0.0 100.0 52.6 0.0 0.0 100.0 23.8 0.0

kappa N=(38)

LbX/N

PCR performance vs consenso MBP

Acc (N=42)

Tabla R7. Rendimiento de los métodos de PCR en comparación con el serodiagnóstico y el consenso MBP de resultados de PCR.

Termociclador Se (N=18)

E (N=20)

Acc (N=38)

kappa (N=38)

Se (N=32)

E (N=10)

PCR performance vs serología

Métodos seleccionados:– IHF - ADNk convencional– IHF - ADNSat convencional– IHF – ADNSat tiempo real (SG)– KtR – ADNSat tiempo real (Tq)

LbK/2 C 0.0 100.0 52.6 0.0 0.0 100.0 23.8 0.0LbL/1 C 88.9 45.0 65.8 0.3 84.4 60.0 78.6 0.4LbL/2 C 83.3 60.0 71.1 0.4 71.9 60.0 69.0 0.3LbM C 66.7 50.0 57.9 0.2 59.4 50.0 57.1 0.1

LbN/1 C 66.7 80.0 73.7 0.5 46.9 60.0 50.0 0.0LbN/2 C 72.2 80.0 76.3 0.5 46.9 70.0 52.4 0.1LbO C 66.7 55.0 60.5 0.2 46.9 30.0 42.9 -0.2

LbP/1 C 88.9 85.0 86.8 0.7 53.1 80.0 59.5 0.2LbP/2 C 11.1 100.0 57.9 0.1 6.3 100.0 28.6 0.0LbQ C 83.3 90.0 86.8 0.7 62.5 100.0 71.4 0.4LbR C 88.9 55.0 71.1 0.4 81.3 70.0 78.6 0.5

LbS/2 TR 50.0 90.0 71.1 0.4 37.5 100.0 52.4 0.2LbS/4 C 55.6 90.0 73.7 0.5 46.9 100.0 59.5 0.3LbT TR 50.0 75.0 63.2 0.3 40.6 80.0 50.0 0.1

LbU/1 C 16.7 95.0 57.9 0.1 9.4 90.0 28.6 0.0LbV/1 C 27.8 100.0 65.8 0.3 15.6 100.0 35.7 0.1LbV/2 C 44.4 100.0 73.7 0.5 28.1 100.0 45.2 0.2LbW C 100.0 35.0 65.8 0.3 90.6 40.0 78.6 0.3LbX C 100.0 50.0 73.7 0.5 87.5 60.0 81.0 0.5LbY C 77.8 50.0 63.2 0.3 75.0 80.0 76.2 0.5LbZ TR 50.0 90.0 71.1 0.4 37.5 100.0 52.4 0.2

72 77.5 68.4 0.4 59.4 70.0 59.5 0.2(50-88.9) (55-90) (57.9-78.1) (0.2-0.6) (37.5-75) (60-100) (47.6-71.4) (0-0.4)

Mediana(25-75p)

LbX/N, denominación del laborartoio/método de PCR; letras azules, métodos dirigidos hacia ADNk; letras verdes, métodos dirigidoshacia ADNSat; barras celestes y verdes, metodos con buena performance en los paneles A y B; barras grises, métodos con mejorrendimiento; consenso MBP, consenso realizado con los resultados de PCR de los MBP; C, convencional; TR, tiempo real; E,especificidad; Se, Sensibilidad; Acc, accuracy; kappa, índice kappa; 25-75p, percentilos 25-75.


Reproducibilidad

Los resultados obtenidos fueron similares a los obtenidos en los laboratorios del estudio internacional interlaboratorio y la concordancia entre los

diferentes métods fue alta

Los 4 métodos se reprodujeron por 4 operadores en un laboratorio de referencia


• Gran variabilidad de la performance obtenida (Sensibilidad y Especificidad)

• Los 4 métodos con mejor performance informaron Especificidad del 100%

• Estos 4 métodos eran distintos en cuanto a la secuencia blanco y tipo de termociclador utilizado y se evaluaron en un laboratorio de referencia

Conclusiones

• Al evaluar la técnica en un solo laboratorio por varios operadores se obtuvo alta reproducibilidad y robustez

• Fue alta la concordancia entre la técnicas que utilizan ADN satélite y ADN del kinetoplasto.

• La sensibilidad analítica de la PCR es alta pero aún con las técnicas más sensibles no se logra detectar parásitos en muestras de algunos pacientes con infección por T. cruzi.

Control interno de amplificación (IAC)

Flujo de trabajo en la evaluación de dos métodos de extracción utilizandocontrol interno de amplificación (IAC)*un operador perdió la M3 durante el procedimiento de extracción.

Resultados de PCR obtenidos para cada serie de muestras de ADN

Workshop internacional 2008: Estandarización de la PCR para detección de infección por T. cruzi

Extracción: Fenol - Clorof Precipitación: Isopropanol

ADNk y ADN Satélite ADN Satélite

Columna

+ Control Interno (Duffy y col, 2009)

Real Time PCRPrimers utilizados


Representación mediante Boxplot de los resultados de PCRq-IACSG

Control interno de amplificación (IAC)

Valores de Cts obtenidos mediante PCRq-IACSG delas muestras analizadas desde los series restantesluego de eliminar los series atípicos (KtQ N=101muestras; IH N=84 muestras)

Mediana de los Cts obtenidos para las 6 muestras de ADN de cada serie (combinación operador/procedimiento de purificación (KtQ o IHF)

PCRq-IACSG, PCRq dirigida a IAC; Ct, ciclo umbral; KtQ, purificación con kit comercial del ADN (QIAGEN); IHF, purificación con solvente del ADN

La utilización del IAC permitió descartar largadas y posibles falsos negativos, además nos permitió identificar los métodos con mejor rendimiento


Detección de T. cruzi

• Especificidad • Sensibilidad

F-K F-S F-SRTAnálisis 0 72.2 80.6 79.2Análisis 2 78.6 85.7 87.5

Extracción con solventeF-K F-S F-SRT

Análisis 0 69.4 83.3 83.3Análisis 2 70.1 88.7 92.6

Extracción con solvente

Análisis 0: datos crudos 18 operators Análisis 2: corrección por exclusión de datos outliers (IAC)

C-K C-S C-SRTAnálisis 0 55.6 55.6 52.8Análisis 2 58.1 59.5 51.8

Extracción con columnaC-K C-S C-SRT

Análisis 0 94.4 91.7 83.3Análisis 2 96.9 93.8 100.0

Extracción con columna

��

• Necesidad de optimizar la extracción utilizando kit para aumentar la sensibilidad• IAC nos ayudo a detectar datos atípicos y mejorando la performance de los resultados


Conclusiones

• Es necesario utilizar IAC para evaluar la posible inhibición o pérdida de ADN durante el proceso de extracción

• Los métodos de extracción con columnas aumentan la Especificidad aunque deben ser optimizados para su utilización con muestras conservadas en buffer guanidina.

• Los métodos de PCR en tiempo real evitan las contaminaciones por carryover y utilizando detección mediante sondas TaqMan se puede lograr sensibilidades similares a las de las PCR convencionales

• Los blancos moleculares más utilizados, ADN satélite y ADNk, fueron los más sensibles para la detección de T. cruzi.

Diciembre 2011Taller OPS

Protocolos Operativos Estándares (POEs)

Extracción de AN con el kit KtR partiendo de 300µL de GEB y eluyendo en 100 µL de buffer de elución

Amplificación por PCRq taqman multiplex dirigida a ADNSat e IAC utilizando mezclas de reacción comercial

Sensibilidad analítica: LoD: 0,2 par/mL (CL Brener)

Reproducibilidad intra/inter-ensayo: CV%: 4,55%

Reproducibilidad interlaboratorio: 92,3%

Evaluación de la respuesta terapéutica: QPCR

Fin del tratamiento

1 6a Pos NQ ND2 7m Pos 127,8 ND3 1a Pos 5,7 ND4 1a Pos NQ ND5 7m Pos 799,6 ND6 3a Pos NQ ND7 10m Pos 16,8 ND

Tabla R14. Carga parasitaria evaluada mediante PCRq-MTq

EdadCasoQPCR (par/mL)

Pretratamiento

7 10m Pos 16,8 ND8 1a Pos 27,1 ND

11 10m Pos 39,6 ND12 8a Pos NQ ND13 10m Pos 43,8 ND14 11m Pos 1,3 ND

a, años; m, meses; Pos, positivo; NQ, no cuantificable; ND, no detectable.

Los POEs utilizados fueron útiles para evaluar la eficacia de drogas parasiticidas en pacientes en edad pediátrica

Conclusiones

Debido a la gran dispersión de resultados observados en el estudio internacional y ladetección de falsos positivos y falsos negativos por problemas durante el procesamiento delas muestras, redactamos POEs teniendo en cuenta los siguientes resultados

- la incorporación de un control interno de amplificación es útil para descartar falsosnegativos

- la extracción de AN mediante procedimientos comerciales y la utilización de PCRtaqman multiplex dirigida a ADNSat y a un control interno de amplificación permite obtenertaqman multiplex dirigida a ADNSat y a un control interno de amplificación permite obtenerresultados específicos y sensibles

La diferente sensibilidad analítica detectada en diluciones seriadas de ADN de cepasrepresentativas de las distintas UDTs de T. cruzi, determina la necesidad de realizar lascurvas estándares con cepas representativas de la región a la que pertenecen los pacientesestudiados en los ensayos de QPCR

La alta sensibilidad analítica de la estrategia de PCRq-Mtq y los bajos niveles devariación intra, inter-ensayo e interlaboratorio, promueven a este método como unaherramienta de laboratorio clave para el seguimiento de pacientes bajo tratamiento etiológicoen ensayos clínicos de nuevas drogas y esquemas terapéuticos

Fase aguda Fase crónica

Enfermedad de Chagas

��Parasitemia

benznidazol o nifurtimox¿nuevas drogas y esquemas terapéuticos?

Criterio de curanegativización de la parasitemia

negativización de la serología buscar otro color

meses años

Anticuerpos

El valor de PCR es esencialmente como marcador de falla terapéutica (resultado positivo)

Usos clínicos

Diagnostico de Chagas congénito

Mayores de 8

Serodiagnosis

Menores de 6 meses

Microhematocrite

Non infected

InfectedInfected

+ --

Benznidazol 5-8 mg/kg/día en 2 dosis diarias - 60 días

+

bl45

A C

bl0

bl45br bl0

bl45

br

D

bl0

B

��

1 2 3 1 2 3 4 5

br

120 125 130 135 140 145

��

IIb IId

Diagnóstico temprano de reactivación por transplante cardíaco

Paciente con transplante cardíaco

La PCR fue marcador temprano de reactivación

1 2 3 4 5 6 8 10 12 13 14 16 18 20 23 36 46 54 66 80 111

PCR-ADNkPCR-SL � � � I I I �

Semanas pos-TCEstudio TC

54 days33 days

StroutPiel I

RA & TMT RA T T

6 (50%) pacientes que sufrieron reactivación postransplannte mostraron un aumento de la parasitemia, detectada por PCR

Diez y col 2007 Am J Transplant

Diagrama de seguimiento, tratamiento parasiticida y recolección de muestras

de sangre en niños y neonatos

Servicio de Parasitología HNRG (estudio financiado por la OMS)

Cohorte estudiada��

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GA: niños � 2 años

GB: niños > a 2 años

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Evaluación del tratamiento parasiticida mediante PCR-ADNk

Grupo A n:28 Grupo B n:72



5060708090

100

% p

ositi

vos

50

60

70

80

90

100

% p

ositi

vos

T0 T60dT12m T36m

PCR

MH/SC01020304050

Toma de muestra

PCR MH/SC

T0T60d

T12mT36m

PCR

SC0

10

20

30

40

Toma de muestra

PCR SC

PCR, PCR-ADNk; MH, microhematocrito; SC, serología convencional; T0, inicio del tratamiento con Benznidazol; T60d,fin del tratamiento; T12m y T36m, 6 y 36 meses luego de finalizado el tratamiento

Caso DN: seguimiento mediante serología convencional y PCR

tto 1, inicio de la terapia con Bz; Tto 2, se reinició tratamiento con benznidazol debido a que la madre relato en laconsulta falta de adherencia la tratamiento. MH, Microhematocrito; Pos, positivo; Neg, negativo; NR, no realizado; ND,no detectable T0, inicio del tratamiento; T7d, 1 semana de tratamiento; T30d, 1 mes de tratamiento 1; T6m, T9m, T12m,6, 9 y 12 meses luego de del primer tratamiento, respectivamente; T36m�, 36 meses luego de terminado el segundotratamiento

Caso CL: seguimiento mediante serología convencional y PCR

Tto Bz, tratamiento durante 60 días con benznidazol;Tto Nf, tratamiento durante 60 días con Nifurtimox.MH, Microhematocrito; Pos, positivo; Neg, negativo;ND, no detectable T0, inicio del tratamiento; T7d, 1semana de tratamiento; T30d, 1 mes de tratamientocon Bz; T60d, fin del tratamiento Bz; T6m, T9m, T12m,T24m, T36m y T54m, 6, 9,12, 24, 36 y 54 mesesluego de finalizado el tratamiento, respectivamente;T30d� y T60d�, 30 y 60 días de tratamiento conNifurtimox.Las flechas indican el inicio del tratamiento.

Evaluación del tratamiento parasiticida mediante PCR-ADNk

Grupo A n:28 Grupo B n:72



5060708090

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T0 T60dT12m T36m

PCR

MH/SC01020304050

Toma de muestra

PCR MH/SC

T0T60d

T12mT36m

PCR

SC0

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20

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40

Toma de muestra

PCR SC

PCR, PCR-ADNk; MH, microhematocrito; SC, serología convencional; T0, inicio del tratamiento con Benznidazol; T60d,fin del tratamiento; T12m y T36m, 6 y 36 meses luego de finalizado el tratamiento

La negativización de PCR fue indicadora de buen pronóstico y resultados persistentementes positivos indicadores tempranos de

falla terapéutica

Gracias!

E1224, prodroga del rabuconazol

Optimización del procedimiento de toma de muestras para PCR en la evaluación de la respuesta parasitológica en pacientes con

enfermedad de Chagas en fase crónica tratados con benznidazol enAiquile, Bolivia

Formulación Pediátrica del benznidazol

Fondo de Innovación Tecnológica Sectorial de SaludDesarrollo de Técnicas de Diagnóstico para Chagas

FONARSEC 2011

Desarrollo de un kit de diagnóstico molecular de

infección por Trypanosoma cruzi:

validación para detección neonatal de Chagas congénito

Documents

Avances en la estandarización de la PCR para la … T cruzi.pdf · • reactivos y termociclador Revisión bibliográfica de artículos publicados en Pubmed entre los años 2000