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AVANCES INVESTIGATEOS EN LA PRODUCCIÓN DE

BIOCOMBUSTIBLES

Carlos Ariel Cardona Alzate Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis Orgánica,

Ph.D en Ingeniería Química Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia,

Sede Manizales

Carlos Eduardo Orrego Alzate Ing. Químico, Especialista en Ciencias Físicas,

Especialista en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Ph.D en Química Profesor. Titular, Universidad Nacional de Colombia,

Sede Manizales

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Cardona C. A. y Orrego C.E. (Editores) Avances investigativos en la producción de biocombustibles Manizales, Caldas, Colombia,junio de 2009 ISBN: 978-958-44-5261-0 Número de páginas: 248 Palabras clave: Biocombustibles, Bioetanol, Biodiesel

Revisión: Ph.D. Johnny Alexander Tamayo Arias, Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia,

Sede Manizales

200 copias

Primera Edición, 2009

Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales Gobernación de Caldas

Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo, PNUD

Impresión: Gráficas Tizan, Manizales

Impreso en Colombia.

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PREFACIO

La inestabilidad de los precios de los combustibles fósiles, la incertidumbre del agotamiento de los pozos petroleros y la liberación que estos combustibles realizan a la atmósfera de grandes cantidades de gases contaminantes, han generado un interés mundial en la investi-gación de nuevas fuentes de energía de carácter renovable que solucionen estos problemas. Una de las alternativas más abundantes y accesibles es la energía obtenida a partir de bioma-sa, con un énfasis mayor en los biocombustibles líquidos debido a su facilidad de utilización en el sector del transporte. Dos de los más importantes biocombustibles líquidos son el alcohol etílico y el biodiesel. Este libro se enfoca al estudio de estos dos biocombustibles desde la óptica de los principales avances tecnológicos relacionados con su producción. En cuanto al concepto de materias primas, se analiza desde la posibilidad de usar aceites de microalgas para producir biodiesel hasta el uso del bioetanol para producir otro biocom-bustibie como es el hidrógeno, que se vislumbra como uno de los más promisorios gracias a su combustión limpia.

Para lograr estos propósitos se convocaron autores de universidade de España, Brasil y Co-lombia, quienes amablemente aportaron con sus capítulos los últimos avances desarrollados por sus grupos de investigación. En ese sentido, vale la pena destacar que las contribuciones de estos países al desarrollo de los biocombustibles no son solamente de tipo científico o tecnológico. España lidera en Europa la comercialización e instalación de nuevas tecnolo-gías para producción de biocombustibles, mientras que Brasil lo hace en Latinoamérica. Colombia ocupa un lugar privilegiado en la producción de biocombustibles en América La-tina, gracias a sus condiciones geográficas, climáticas, de suelo y a un marco regulatorio que ha intentado estar a la vanguardia. Además, por el interés generado en instituciones públicas y privadas para el desarrollo de los aspectos agronómicos de la producción de la biomasa, así como de su transformación agroindustrial.

La Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales, en las Plantas Piloto de Biotecno-logía y Agroindustria, con sus grupos de investigación en Procesos Químicos, Catalíticos y Biotecnológicos y Alimentos - Frutales, ha venido desarrollando diversos trabajos en el área de los biocombustibles con la realización de diversas investigaciones, tesis de doctorado y maestría, convenios e intercambios académicos con grupos de investigación en Biocombus-tibles de Colombia y el mundo. Muchos de estos grupos participan en la escritura de este libro.

La recopilación de algunas de estas investigaciones se presenta en el libro, donde la primera parte está dedicada a la producción de biodiesel, analizando su producción con el uso de

Car!' s Ariel Cardona Alza e

enzimas, su obtención a partir de microalgas y el uso de tecnologías no convencionales como son los fluidos supercríticos, la destilación y la extracción reactiva, y su efecto en la emisión de contaminantes atmosféricos. Además, un capítulo describe algunos usos del más importante subproducto: el glicerol como materia prima para otros procesos.

La segunda parte del libro está dedicada a la producción del bioetanol, realizando un análisis de los microorganismos que pueden ser usados para su elaboración, algunas tecnologías para transformar el material lignocelulósico y la estabilidad de los biorreactores utilizados. Se presenta además en esta sección el análisis de la producción de hidrógeno utilizando como materia prima bioetanol. El último capítulo presenta el uso de campos electromagné-ticos en la producción, tanto de bioetanol como de biodiesel.

Los editores y autores reconocen el esfuerzo de la Gobernación del Departamento de Cal-das - Colombia, por haber financiado íntegramente la impresión de esta obra a través del proyecto ARCANO fase III (Apropiación Rural de Competencias Agroindustriales para nuevas oportunidades en Caldas). Se destaca también el apoyo del Programa de las Na-ciones Unidas para el Desarrollo, PNUD por su apoyo incondicional al presente trabajo. También se gratifica con mucho aprecio el apoyo de la Ingeniera Diana Catalina Cubides en la compilación y organización final del presente libro. Un especial agradecimiento se brinda también en este libro al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innova-ción de Colombia, COLCIENCIAS, a la Dirección de Investigaciones de la Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales, DIMA, a la Fundación de Amparo e Investigación del Estado de Río de Janeiro, FAPERJ, la Agencia Española de Cooperación Internacio-nal, AECI, entre otras entidades, por haber financiado diferentes proyectos y misiones que permitieron establecer relaciones directas de investigación entre los editores y autores del presente libro.

Los editores y autores de esta obra consideran que los avances investigativos en la pro-ducción de biocombustibles pueden ser muy diversos, pero tal vez los más importantes siempre serán aquellos que consideren nuestro contexto geográfico, económico, ambiental y social. Cada capítulo al ser analizado demuestra como los autores tratan de acondicionar sus investigaciones y resultados a la realidad de nuestros países. No obstante la dinámica investigativa en el tema de los biocombustibles exigirá que los temas planteados aquí sean objeto de renovación constante, para lo cual se espera que los lectores de otros grupos de investigación sean los futuros gestores de iniciativas de este tipo.

Xvanccs In vestitati vos en la Producción de: Biocombustibles

AUTORES

CAPÍTULO 1. PRODUCCIÓN ENZIMÀTICA DE BIODIESEL

Carlos Eduardo Orrego Alzate, Ing. Químico, Especialista en Ciencias Físicas, Especia-lista en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Ph.D en Química. Profesor Titular, Univer-sidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

Diana Marcela Cetina Medina, Ing. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Inge-niería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

Oscar Darío Hernández Parra, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Inge-niería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

CAPÍTULO 2. LAS MICROALGAS, FUENTE DE ACEITE PARA LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

Luz Marina Flórez Pardo, Ing. Química, Ph. D en Tecnología de Alimentos. Docente, Universidad Autónoma de Occidente. Grupo de Investigación en Biocombustibles.

José Luis López Yelasco, Biólogo, Docente, Universidad Autónoma de Occidente. Gru-po de Investigación en Biocombustibles.

Jorge Enrique López Galán, Ing. Químico, especialista en Informática y Computación. Ph. D en Materias Primas Minerales y Energéticas. Docente, Universidad del Valle, Grupo de Investigación en Biocombustibles.

CAPÍTULO 3. BIOCATÁLISIS MEDIANTE CÉLULAS. APLICACIÓN A LA PRO-DUCCIÓN DE BIODIESEL

Carlos Eduardo Orrego Alzate, Ing. Químico, Especialista en Ciencias Físicas, Especia-lista en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Ph.D en Química. Profesor Titular, Univer-sidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

Óscar Darío Hernández Parra, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Inge-niería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.


Diana Marcela Cetina Medina, lng. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Inge-niería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

CAPÍTULO 4. PRODUCCIÓN DE BIODIESEL UTILIZANDO TECNOLOGÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

Diana Catalina Cubides Román, lng. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-In-geniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

Carlos Ariel Cardona Alzate. Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Co-lombia, Sede Manizales.

CAPÍTULO 5. POSIBILIDADES DE PROCESOS REACCIÓN-SEPARACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES


Annie Alexandra Cerón Sánchez, Ing. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

CAPÍTULO 6. BIOGLICEROL COMO MATERIA PRIMA PARA LA OBTENCIÓN DE PRODUCTOS DE VALOR AGREGADO

Jhon Alexánder Posada, Ing. Químico, M. Se. en Ingeniería-Ingeniería Química, Estu-diante Ph. D. en Ingeniería. Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.


Diana Marcela Cetina Medina, Ing. Química, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Inge-niería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

I 6 I

Avances ín\es¡¡e;aipvos en la Producción de Biocombusabíes

Carlos Eduardo Orrego Alzate, Ing. Químico, Especialista en Ciencias Físicas, Especia-lista en Ciencia de los Alimentos, Ph.D en Química. Profesor Titular, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

CAPÍTULO 7. EFECTO DEL USO DE BIODIESEL EN LA EMISIÓN DE CONTAMINAN-TES ATMOSFÉRICOS

Franz Edwin López, Ingeniero Químico, Candidato a Ph. D Universidad de Alicante. España.

Agustín Bueno, Químico, Ph.D en Química. Profesor Titular, Departamento Química Inorgánica, Universidad de Alicante. España.

María José Illán, Química, Ph.D en Química. Profesora Titular, Departamento Química Inorgánica, Universidad de Alicante. España.

Oscar Hernán Giraldo, Químico, Ph.D en Química. Profesor Asociado, Universidad Na-cional de Colombia, Sede Manizales.

CAPÍTULO 8. ESTANDARIZACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL

Juan Carlos Higuita Vásquez, Microbiólogo, Ph. D en Microbiología y Biología Tumo-ral. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

Carlos Ariel Cardona Alzate, Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química. Profesor Asociado, Universidad Nacional de Co-lombia, Sede Manizales.

Juan Pablo Mariscal Moreno, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-Inge-niería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

Javier Mauricio Naranjo Vasco, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingeniería-In-geniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

Christian Fernando Triana Carantón, Ing. Químico, Estudiante de Maestría en Ingenie-ría-Ingeniería Química, Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.

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Carlos A riel Ca rei o na AI2 ate

CAPÍTULO 9. NUEVAS TECNOLOGÍAS EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE BIOMASA LIGNOCELULÓSICA

Julián Quintero, Ing. Químico, M. Se. en Ingeniería-Ingeniería Química, Estudiante Ph. D. en Ingeniería. Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.


CAPÍTULO 10. ESTABILIDAD DE BIORREACTORES PARA PRODUCCIÓN DE ETANOL

Isabel Cristina Paz Astudillo, Ing. Química, M. Se. en Ingeniería Química, Candidato a Ph. D. en Ingeniería. Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.


CAPÍTULO 11. PRODUCCIÓN DE HIDRÓGENO A PARTIR DE BIOETANOL

Viatcheslav Kafarov, Ing. Químico, M.Sc. en Matemática Aplicada, Ph. D. en Ciencias Técnicas. Profesor Titular, Universidad Industrial de Santander.

CAPÍTULO 12. BIORREACTORES ASISTIDOS POR CAMPOS ELECTRO-MAGNÉTICOS

Víctor Haber Pérez, Ing. Químico, M. Se. en Ingeniería Agrícola. Ph. D en Procesos Bio-tecnológicos, Profesor Universidade Estadual do Norte Fluminense. Brasil.

Oselys Rodríguez Justo, Ing. Química, M. Se en Ingeniería Química, Ph. D en Ingeniería Química. Investigador Universidad Estadual de Campiñas.- UNICAMP.

Nadia Rosa Pereira, Ing. Química, M. Se en Ingeniería Química, Ph. D en Ingeniería Quí-mica. Universidade Estadual de Campiñas - UNICAMP

Avances Investigamos en la P'oducción de Hiocombus tibies»

CONTENIDO

'REFACIO ÎII VUTORES -/..V

FIGURAS XIV TABLAS XVI

:APÍTULO 1 19 PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA DE BIODIESEL 19

1.1. Lipasas 19 1.1.1 Aspectos estructurales de las lipasas ... ..20 1.1.2. El sitio activo y la activación Ínter facial 21 1.1.3. Pre-tratamientos de lipasas para catálisis en medios no acuosos 21

1.2. Inmovilización de lipasas 23 1.2.1. Métodos de retención física 24 1.2.2. Inmovilización por enlace químico 25

1.3. Aspectos cinéticos en la producción de biodiesel 26 1.3.1. La importancia de la actividad de agua 26 1.3.2. Cinéticas monosustrato. La ecuación de Michaelis - Menten 27 1.3.3. Cinéticas bisustrato 28 1.3.4. Mecanismos y cinéticas en la producción de biodiesel 29 1.3.5. Efectos del medio de reacción en las expresiones de velocidad 32

Conclusiones 34 Referencias 35

CAPÍTULO 2 43 LAS MICROALGAS, FUENTE DE ACEITE PARA LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL 43

2.1 Contexto general sobre los biocombustibles 43 2.2. Las microalgas 44 2.3. Composición de ácidos grasos en microalgas 45 2.4. Avances en el cultivo de microalgas 46

2.4.1. Medios de cultivo (sustratos para su elaboración) 46 2.4.2. Co-culdvos 47 2.4.3. Modificaciones debidas a estrés alimenticio y a otros factores 47 2.4.4. Modificaciones de la forma de cultivo 49 2.4.5. Diseño de fotobiorreactores 50

Referencias 52

Carlos Ariel Cardona A L ate

CAPITULO 3 57 BIOCATÁLISIS MEDIANTE CÉLULAS. APLICACIÓN A LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL 57 Introducción 57

3.1. Ventajas y desventajas del uso de biocatalizadores de células completas (BCC)... 58 3.2. BCCs en medios orgánicos 59 3.3. Estabilidad de los biocatalizadores de células completas-BCC- 60 3.4. Biocatalizadores inmovilizados 61 3.5. Células inmovilizadas sobre partículas de biomasa (CPB). 62 3.6. Usos de CPBs con lipasas 62 3.7. Condiciones de inmovilización de CPBs con lipasas. 62 3.8. CPBs con lipasas para producción de biodiesel 64


CAPÍTULO 4 71 PRODUCCIÓN DE BIODIESEL UTILIZANDO TECNOLOGÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS Introducción 71

4.1. Fluidos supercrítico 72 4.2. Transesterificación de triglicéridos en FSC 73 4.3. Consideraciones de condiciones de proceso al usar FSC para producir biodiesel 74

4.3.1. Alcoholes usados 76 4.3.2. Impurezas en la materia prima 76 4.3.3. Relación molar alcohol aceite 77

4.4. Modelamiento del estado supercrítico 78 4.4.1. Cinética para la transesterificación en condiciones supercríticas 80

4.5. Análisis económico 81 4.6. Condiciones subcríticas 82 4.7. Proceso supercrítico catalizado con bases 83 4.8. Proceso supercrítico catalizado con enzimas 84


CAPÍTULO 5 89 POSIBILIDADES DE PROCESOS REACCIÓN-SEPARACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES 89

5.1. Procesos simultáneos 91 5.2. Destilación reactiva 91 5.2.1. Producción de biodiesel a partir de aceite de palma por destilación reactiva . 94

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Avances invcstitiativos en ia Producción de Biocombustibles

5.3. Extracción reactiva 98 Referencias 100

CAPITULO 6 103 BIOGLICEROL COMO MATERIA PRIMA PARA LA OBTENCIÓN DE PRODUCTOS DE VALOR AGREGADO. ... 103 Introducción 103

6.1. Propiedades fisicoquímicas 104 6.2. Mercado y aplicaciones comerciales 105 6.3. Grados comerciales del glicerol 106 6.4. Oxidación con catalizadores metálicos 107 6.5. Reducción a glicoles 110 6.6. Eterificación a poligliceroles 112 6.7. Pirólisis y gasificación 113 6.8. Esterificación e interesterificación 115

6.8.1. Esterificación de ácidos carboxílicos e interesterificación de triglicéridos. 115 6.8.2. Carboxilación de glicerol a carbonato de glicerol 117 6.8.3 Nitración de glicerol a nitrato de glicerol 119

6.9. Eterificación 120 6.9.1 Butilación de glicerol 120 6.9.2. Glicosilación de glicerol 120

6.10. Halogenación 121 Referencias 122

CAPÍTULO 7 129 EFECTO DEL USO DE BIODIESEL EN LA EMISIÓN DE CONTAMINANTES ATMOSFÉRICOS 129 Introducción 130

7.1. Composición de los gases de escape de los motores diesel y gasolina 130 7.2. Sistemas de eliminación de contaminantes en motores diesel 131 7.3. Estudio experimental del efecto del uso de biodiesel comercial en la

generación de contaminantes y en su eliminación en sistemas de post-combustión 137 7.3.1. Efecto del uso de biodiesel en la emisión de contaminantes 137 7.3.2. Efecto del uso de biodiesel en las propiedades físico-químicas de la

carbonilla generada 138 7.3.3. Efecto del uso de biodiesel en la reactividad de la carbonilla generada 141


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Garios Ariel Cardona Alzate

CAPÍTULO 8 147 ESTANDARIZACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL 147 Introducción 147

8.1. Estandarización de microorganismos empleados a nivel industrial 148 8.1.1. Aislamiento de microorganismos 148 8.1.2. Identificación de microorganismos 149 8.1.3. Almacenamiento 149

8.2. Principales microorganismos empleados para la producción de bioetanol 151 8.2.1. Bioquímica de los microorganismos fermentadores 152 8.2.2. Factores que afectan el desempeño de los microorganismos en la producción de bioetanol 157

8.3. Mejoramiento de microorganismos para la producción de etanol 158 8.3.1. Técnicas de modificación genética no inducida 159 8.3.2. Técnicas de modificación genética inducida 160

8.4. Principales parámetros a considerar en la selección de microorganismos para la producción de etanol 162 8.4.1. Materias primas ricas en azúcares 163 8.4.2. Materias primas lignocelulósicas: 164

Referencias 165

CAPITULO 9 171 NUEVAS TECNOLOGÍAS EN LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE BIOMASA LIGNOCELULÓSICA 171 Introducción 171

9.1. Biomasa lignocelulósica 172 9.1.1. Celulosa 172 9.1.2. Hemicelulosa 172 9.1.3. Lignina 172 9.1.4. Etanol a partir de biomasa lignocelulósica 172

9.2. Tecnologías de pretratamiento \1¿

9.2.1. Pretratamiento mecánico \1¿

9.2.2. Pretratamiento térmico 172 9.2.3. Pretratamiento químico 17" 9.2.4. Combinaciones 17Í

9.3. Hidrólisis de celulosa 181 9.3.1. Hidrólisis enzimàtica 181 9.3.2. Hidrólisis àcida concentrada 18¿ 9.3.3. Hidrólisis àcida diluida 18

9.4. Microorganismos fermentativos 18.

I 12 I

Avances Investij»ativos en la Producción ik- ñiwfMtibuslibles

9.4.1 Bacterias 183 9.4.2. Levaduras y hongos 183

9.5. Configuraciones tecnológicas de la fermentación 184 9.5.1. Sacarificación y fermentación simultáneas 185 9.5.2. Células inmovilizadas 186

9.6. Tecnologías de deshidratación 186 9.6.1. Destilación con variación de presión 186 9.6.2. Destilación azeotrópica 187 9.6.3. Destilación extractiva 187 9.6.4. Destilación extractiva salina 188 9.6.5. Adsorción 188 9.6.6. Pervaporación 189

9.7. Discusión 190 Referencias 192

CAPÍTULO 10 199 ESTABILIDAD DE BIO RRE ACTO RE S PARA PRODUCCIÓN DE ETANOL 199 Introducción 199

10.1. Conceptos básicos 200 10.2. Análisis de estabilidad 202 10.3. Fenómenos de estabilidad presentes en sistemas continuos para la

producción de etanol 203 10.3.1. Análisis del comportamiento oscilatorio 204

10.4. Efecto de las variables de operación sobre la estabilidad de los biorreactores en la producción de etanol 205

10.5. Control de los fenómenos de estabilidad 207 Conclusiones 209 Referencias 211

CAPÍTULO 11 215 PRODUCCIÓN DE HIDRÓGENO A PARTIR DE BIOETANOL 215 Introducción 215

11.1. Combustibles limpios 216 11.2. Reformado de bioetanol 216 11.3. Influencia de la presencia de inerte en la reacción de reformado de bioetanol. 220

11.3.1. Consideraciones termodinámicas 220 11.3.2. Evaluación numérica 222

11.4. Producción de hidrógeno 223 11.5. Distribución de productos de reacción 224

Csirlos Ariel Cíttdon;i, Al/¡nc

Referencias 226

CAPÍTULO 12 229 OBTENCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES EN BIO RRE ACTO RE S ASISTIDOS POR CAMPOS ELECTROMAGNÉTICOS 229

12.1. Producción de etanol: Campos electromagnéticos de baja frecuencia 229 12.2. Fundamentos teóricos aplicados a biorreactores tipo tanque agitado

asistido por campos electromagnéticos 231 12.3. Fundamentos teóricos aplicados a biorreactores estabilizados

magnéticamente 234 12.4. Producción de etanol en biorreactores asistidos por campos

electromagnéticos 236 12.5. Produción de biodiesel en biorreactores asistidos por microondas 239 12.6. Fundamentos teóricos de las microondas 239 12.7. Mecanismos de calentamiento por microondas 241 12.8. Propiedades dieléctricas 241

Referencias 243

FIGURAS Figura 1.1. Ejemplo del mecanismo de reacción de una lipasa 20 Figura 1.2. Métodos de inmovilización de enzimas 24 Figura 1.3. Entrecruzamiento enzima-soporte y soporte-soporte con glutaraldehído ...25 Figura 1.4. Mecanismos de reacciones bisustrato: a) Mecanismo ping-pong bi-bi, b)

Mecanismo secuencial ordenado, c) Mecanismo secuencial aleatorio 29 Figura 1.5. Esquema de la transesterificación o alcohólisis de triglicéridos:

a) Reacción general, b) Pasos de la reacción 30 Figura 1.6. Mecanismo de reacción propuesto por Camacho et al 31 Figura 1.7. Esquema de reacción de interesterificación: a) Reacción general,

b) Pasos de reacción 32 Figura 4.1. Esquema de proceso para la producción de etil esteres a partir de

aceite de palma y etanol en condiciones supercríticas y sin el uso de catalizador 75

Figura 4.2. Fracción molar dióxido de carbono supercrítico en etil palmitato a 313.15, 323.15 y 333.15 85

Figura 5.1. Configuración básica de una columna de destilación reactiva 93 Figura 5.2. Esquema para la producción de biodiesel por destilación reactiva a)

con alimentación estequiométrica y b) usando metanol en exceso 97 Figura 5.3. Esquema de extracción reactiva simulado 99 Figura 6.1. Posibles productos para la oxidación de glicerol 108

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Avances InvestigatiTOS en la Producción de Biocombustibles

Figura 6.2. Estructura Monoglicéridos 115 Figura 6.3. Mecanismo de Reacción por Esterificación Directa 116 Figura 6.4. Mecanismo de Reacción por Interesterificación 117 Figura 7.1. Contaminantes emitidos por un motor diesel (Nisan 2.0), utilizando

diesel y biodiesel como combustible 138 Figura 7.2. Difractogramas de rayos X de las carbonillas 139 Figura 7.3. Espectros Raman de las carbonillas 140 Figura 7.4. Espectros DRIFTS de las carbonillas 140 Figura 7.5. Micro fotografías TEM de las carbonillas, (a) Biodiesel (b) Diesel,

(c) Printex-U y (de) Vulcan 141 Figura 7.6. Perfiles de combustión de carbonilla en NOx + 0 2 142 Figura 7.7. Perfiles de combustión de carbonilla en NOx + 0 2 catalizada

por Cu/A1203 142 Figura 7.8. Velocidad de oxidación de la carbonilla en condiciones isotermas 143 Figura 8.1: Ruta metabòlica de la producción de metanol en S. cerevisiae 154 Figura 8.2. Ruta metabòlica de Carbohidratos en Z. mobilis 155 Figura 8. 3: Técnicas de mejoramiento de microorganismos 159 Figura 10.1. Concentración versus tiempo para fermentaciones convencional y

extractiva 208 Figura 10.2. Diagrama de bifurcación para la velocidad de producción de etanol con

el área de permeación como parámetro de bifurcación 209 Figura 11.1. Almacenamiento de hidrógeno en densidad másica y volumétrica para

diferentes métodos químicos 216 Figura 11.2. Rendimiento a hidrógeno para diferentes relaciones molares agua/

etanol: a. 3, b. 6 y c. 9. Relaciones molares inerte (argón)/(agua/etanol):.... 223 Figura 11.3. Efecto de la adición de inerte en la distribución de productos de

reacción del reformado de etanol 225 Figura 12.1. Variables de importancia en el estudio de sistemas expuestos a campos

magnéticos 232 Figura 12.2. Movimiento de una particular con carga en el seno de una suspensión

expuesta al efecto de un campo electromagnético 232 Figura 12.3. Radio de curvatura de una partícula con carga en el seno de una

suspensión bajo influencia del efecto de un campo electromagnético 234 Figura 12.4. Producción de etanol asistida por campo electromagnético para el tratamiento

magnético de suspensiones microbianas de Saccharomyces cerevisiae 236 Figura 12.5. Reacción genérica de obtención de biodiesel 239 Figura 12.6. Representación esquemática de una microonda 240

LA5J


TABLAS

Tabla 1.1. Parámetros cinéticos del modelo ping pong para esterificaciones en medio no acuoso catalizadas por lipasas 34

Tabla 3.1. Ventajas y desventajas del uso de BCCs 58 Tabla 3.2. Productos comerciales obtenidos mediante BCCs 59 Tabla 3.3. Condiciones de cultivo y tipo de soporte utilizados en la producción

de algunos CPPS con microorganismos productores de lipasas 63 Tabla 3.3 (Continuación). Condiciones de cultivo y tipo de soporte utilizados

en la producción de algunos CPPS con microorganismos productores de lipasas 63

Tabla 3.4. Algunas condiciones de reacción y sustratos utilizados en la producción d ésteres metílicos de ácidos grasos (EM) mediante catálisis con células inmovi lizadas en partículas de biomasa (CPB) o biocatalizadores de células completa (BCC) 64

Tabla 4.1. Algunas aplicaciones de los Fluidos Supercríticos 73 Tabla 5.2. Composición del aceite de palma usado en la simulación (% peso) 95 Tabla 5.3. Propiedades calculadas 95 Tabla 5.4. Constantes para el cálculo de Cp 96 Tabla 5.5. Constantes para el cálculo de la presión de vapor por Antoine 96 Tabla 5.6. Paramétras de interacción de grupos para sistemas que contienen

triglicéridos 91 Tabla 5.7. Principales datos obtenidos en la simulación del proceso 10C Tabla 6.1. Principales propiedades físicas del glicerol 105 Tabla 6.2. Hidrogenólisis de Glicerol 112 Tabla 7.1. Análisis elemental de las carbonillas 135 Tabla 7.2. Análisis inmediato de las carbonillas 13Ç Tabla 8.1: Principales microorganismos empleados en la producción de etanol y

vía fermentativa 152 Tabla 8.2: Levaduras empleadas en la producción de etanol utilizando diferentes

materias primas 15: Tabla 8.3: Bacterias empleadas en la producción de etanol utilizando diferentes

materias primas 156 Tabla 8.4: Ejemplos de mejora de microorganismos, técnicas usadas y

característica mejorada 162 Tabla 8.5: Composición química de algunas materiales lignocelulósicos (% en

base seca) 16í Tabla 10.1. Clasificación de estados estacionarios para un sistema bidimensional 201 Tabla 10.2. Efecto de variables en la estabilidad de sistemas productores de etanol 20(

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Avance-- InvcsHi'aiivi n en la Producción de Biocombustibles

Tabla 10.3. Datos de rendimiento y productividad para fermentación convencional y extractiva 208

Tabla 11.1.a. Resumen de catalizadores para reformado de bioetanol 217 Tabla 11.1 .b. Resumen de catalizadores para reformado de bioetanol 218 Tabla 11.1.c. Resumen de catalizadores para reformado de bioetanol 219 Tabla 11.2. Condiciones de operación utilizadas para los cálculos termodinámicos 223 Tabla 12.1. Estudios de los efectos biológicos de campos electromagnéticos sobre

Saccharomyces cerevisiae 236 Tabla 12.2. Parámetros cinéticos de la fermentación en lote de mieles de caña de azúcar

por Saccharomyces cerevisiae a 30°C y 300 rpm en el biorreactor tipo tanque agitado asistido por campo electromagnético, usando una combinación de dos diferentes tipos de sistemas de generación de campo electromagnético 238

Tabla 12.3. Datos comparativos de la fermentación de etanol usando S. cerevisiae inmovi-lizada en diferentes biorreactores. 238

Tabla 12.4. Particularidades de sistemas de microondas empleados en varios procesos 243

. Q 7 J «

•Vanees Investiga ih o» en la Producción de Biocombustibles

CAPÍTULO 1

PRODUCCIÓN ENZIMÀTICA DE BIODIESEL

Carlos Eduardo Orrego Alzate*, Diana Marcela Cetina Medina, Óscar Darío Hernández Parra

En este capítulo se presentan los aspectos básicos de la producción de biodiesel catali-zada por lipasas. Inicialmente se analizan las previsiones necesarias que se deben tener para que estas enzimas ejerzan su función catalítica en sistemas no acuosos para lo cual se han publicado diferentes tipos de tratamientos, incluida la inmovilización. En una se-gunda parte se estudian los fundamentos de la cinética de reacciones mono y bi-sustrato para la mejor comprensión de los modelos que se han propuesto por parte de diversos autores para las reacciones de transesterificación e interesterifícación que usualmente se utilizan en la producción de biodiesel vía catálisis con lipasas.

1.1. LIPASAS

Las lipasas (triacilglicerol hidrolasas, E.C. 3.1.1.3) son enzimas capaces de hidrolizar o sinte-tizar glicéridos de ácidos grasos de cadena larga [1], cuya función natural más conocida es la contribución que hacen a la digestión de los triglicéridos aprovechando la energía de sus en-laces ésteres. Aparte de sus sustratos naturales, tales como triglicéridos y ésteres insolubles en agua, las lipasas pueden catalizar hidrólisis enantio y regioselectivas y síntesis de un gran espectro de ésteres naturales y sintéticos [2-4], Las aplicaciones industriales de lipasas han sido revisadas a fondo por Vulfson [5], Actualmente, las lipasas encuentran aplicaciones en el procesamiento químico orgánico, formulaciones de detergentes, síntesis de biosurfactan-tes, la industria oleoquímica, la industria lechera, la industria agroquímica, la manufactura de papel, nutrición, cosmética, en la síntesis de químicos finos y el procesamiento farmacéutico [6]. Las lipasas son las enzimas que más frecuentemente se utilizan en medios orgánicos ya que tienen una afinidad inherente por los ambientes hidrofóbicos [7]. Además tienen la habilidad de catalizar no sólo reacciones hidrolíticas sino también reacciones de síntesis en medios orgánicos, cuando el contenido de agua está muy limitado. Más aún, estas enzimas pueden presentar una amplia especificidad en relación con el sustrato y también ser muy selectivas con respecto a la reacción catalizada, incluyendo una alta enantio selectividad [8],

' Universidad Nacional de Colombia-Sede Maníjales, Plantas Piloto de biotecnologia y Agroindustria, Campus Ltì Nubla, Manióles, AA 127, Colombia. Telefax: +57-68879400 Ext. 55880.E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]

Producción Enzimática de Biodicsel

Hay publicados numerosos trabajos que resaltan el gran potencial de lipasas en química orgánica [9-12],

1.1.1 ASPECTOS ESTRUCTURALES DE LAS LIPASAS Las lipasas usadas con mayor frecuencia provienen de microorganismos (bacterias y hon-gos), pero están también presentes en animales y plantas. Sus moléculas han sido recono-cidas y estudiadas y muestran que el número de aminoácidos en sus cadenas normalmente se encuentra entre 270 y 641 [13]. Las lipasas están contenidas, estructuralmente hablando, en la familia de las <x/[3 hidrolasas, proteínas cuya estructura consiste en un arreglo central hidrofóbico de ocho [3-hojas empacadas entre dos capas de a-hélices amfifílicas. Las lipa-sas se denominan serina hidrolasas, ya que su sitio activo contiene una tríada catalítica formada por los aminoácidos Ser - His - Asp/Glu que permite el ambiente adecuado para catalizar tanto la hidrólisis como la síntesis. El mecanismo, que es esencialmente el mismo para la creación o ruptura de enlaces tipo éster de los acilglicéridos se puede dividir en varios pasos:

1. Unión del sustrato a la serina de la tríada catalítica, dando como resultado un intermedio tetraedral estabilizado por enlaces de hidrógeno entre los residuos His y Asp del sitio activo.

2. El alcohol es liberado creando un complejo acil-enzima. 3. Luego se realiza un ataque de un nucleófilo (agua en la hidrólisis, alcoholes en las tran-

sesterificaciones u otros ésteres en las interesterificaciones) formando de nuevo un in-termediario tetraedral.

4. Luego, la resolución del ataque hace que se liberen los dos productos (un ácido o éster) y libera la enzima en su forma original.

Este mecanismo se ilustra en la figura 1.1. mediante un ejemplo para una hidrólisis [14]:

R

- .. V

o- N

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Figura 1.1. Ejemplo del mecanismo de reacción de una lipasa

Kvances Investiga tivus en la Producción de Biocumbustibles

1.1.2. EL SITIO ACTIVO Y LA ACTIVACIÓN INTERFACI AL La evidencia de un cambio súbito en la actividad de lipasas después de una concentración determinada de sustratos en medios acuosos llevó a un estudio más a fondo de la estruc-tura de estas proteínas que explicara este fenómeno. Mediante la cristalografía de rayos X y otras técnicas aplicadas en las lipasas nativas y en complejos con inhibidores (p. ej. lipasa de Candida rugosa [15, 16], Pseudomonas cepacia [17]) se revelaron cambios confor-macionales con respecto a la enzima nativa que llevaron a proponer que existe una "tapa" cubriendo el sitio activo de las lipasas. De esta manera, estas enzimas tienen dos estructuras estables, una cerrada (inactiva) en agua en la cual esta tapa cubre el espacio donde se enlazan los sustratos y, por tanto, también al sitio activo, y una abierta (activa) que se forma en una interface agua - lípido/ solventes orgánicos que efectúa un cambio en la conformación, desplaza esta tapa y expone el sitio activo.

Las lipasas tienen un amplio espectro de aplicaciones industriales, y una de las más actuales es su aplicación como un catalizador en la producción de biodiesel. Existe ya una gran can-tidad de estudios alrededor de su desempeño [18-26],

1.1.3. PRE-TRATAMIENTOS DE LIPASAS PARA CATÁLISIS EN MEDIOS NO ACUOSOS Hasta hace muy poco tiempo, el uso de enzimas en medios no acuosos parecía no ser viable, pues al comparar con las reacciones llevadas a cabo en solución acuosa, las velocidades de reacción en solventes orgánicos anhidros son típicamente de dos a cuatro órdenes de mag-nitud más lentas [27]. Como posibles causas de este comportamiento está el hecho de que las enzimas son insolubles en tales medios formando aglomerados. Sufren además la deshi-dratación de regiones críticas de la enzima y en tales disolventes no se despliega fácilmente como sí sucede en un medio acuoso- la estructura alterada de la enzima por su liofilización (proceso usual para su conservación). Para soslayar estos problemas, se ha descrito una serie de estrategias con el objetivo de acelerar la tasa de reacción en reacciones enzimáticas en medios no acuosos que incluyen, entre otros, la modificación química, el tratamiento con tensoactivos, el uso de sales para su co-liofilización, la activación mediante éteres corona y la inmovilización en soportes poliméricos [28-30], técnicas que se describen en forma sucinta a continuación.

Tensoactivos: para ilustrar esta alternativa de activación se resalta el trabajo que realizaron Yasuda et al [31] para mejorar la actividad de transesterificación de una lipasa liofilizada. Las enzimas que fueron liofilizadas en compañía de metil ésteres de ácidos grasos (los de los ácidos esteárico, mirístico y láurico mostraron los mejores resultados) o de ciertos tipos de surfactantes (Tritón: X-45, X-57, X-100 y X-165) exhibieron mayores actividades de transesterificación que las que se prepararon sin estos aditivos. Otros resultados que usaron metodología similar fueron los reportados por Persson et al [32] que utilizaron lipasas de

| 21 | •

l'roduccton ! _ Biodlc c]

Humicola lanuginosa, Candida rugosa, Rhizomucor miehei y Pseudomonas cepa-cia adsorbidas en el surfactante monoestearato de sorbitan. Las lipasas adsorbidas en e] surfactante fueron "activadas" entre 1.9 a 150 veces comparada con la lipasa cruda. En otre reporte la lipasa de Candida rugosa, recubierta con un surfactante (di-dodecil éster ribitol amida del ácido glutámico) exhibió una considerable actividad en la esterificación de lauri] alcohol y ácido láurico en isooctano. En contraste, el polvo de lipasa nativa no mostró casi actividad cuando se dispersó en el solvente [33].

Co-liofiüâción con sales: se ha demostrado que al co-liofilizar la enzima con algunas sales le permite un mejor desempeño catalítico en disolventes orgánicos. Como explicaciones se ha sugerido el incremento de la polaridad del sitio activo detectado por medio de espec-troscopia de resonancia de giro de electrones (ESR por sus siglas en inglés), por el efectc estabilizador de las sales cosmotrópicas y al fenómeno de hidratación preferencial [34], LÍ activación por sales es un fenómeno general [28], Respecto a las lipasas, la adición de cloru-ro de potasio antes de la liohlización de la lipasa de Humicola lanuginosa incrementó si actividad hasta 46 veces comparada con la lipasa cruda [4],

Eteres corona: los éteres corona son poliéteres cíclicos compuestos de unidades de oxi-eti leño, que se han usado para la activación enzimàtica también con un procedimiento de co-liofilización de una disolución acuosa lipasa-éter. Los estudios hechos por van Unen 5 colaboradores [35, 36] han señalado que esta técnica puede resultar en una alta actividac biocatalítica en medios orgánicos. En particular reportaron que la adición de éter corona an-tes de la liofiüzación de oc-quimotripsina mejora la actividad en tolueno. De manera similai Koops et al\bl\ y Persson efa¿[32] elevaron la actividad de algunas lipasas. Los éteres coroni incrementan la frecuencia de conversión de la enzima (TOF por sus siglas en idioma inglés y/o el porcentaje de enzima catalíticamente activa. Ambos efectos pueden ser explicado; por la estabilización conformacional inducida por los éteres corona en medios orgánicos Parte de esta estabilización se atribuye a los complejos no covalentes de los éteres coron; con los grupos amino en los residuos de lisina en las proteínas [36], Una segunda hipótesi; ha sido desarrollada por Santos et al\ò*S\ quienes propusieron que los éteres corona actúar como impresores moleculares, los cuales preservan la estructura local del sitio activo enzi mático durante la catálisis en ambientes deshidratados.

Ciclodextrinas: las ciclodextrinas comprenden una serie de oligosacáridos cíclicos de D-glu copiranosa enlazados con un enlace oc(l-4), producidos a partir de almidón [39]. Las ciclo dextrinas son capaces de estabilizar proteínas en solución acuosa y en solventes hidrofílicos Griebenow et al [40] observaron que si la subtilisina Carlsberg se liofiüza en presencia d< metil-¡3-ciclodextrina, la tasa de transesterificación de m-fenetil alcohol con vinil butirato er tetrahidro furano se incrementa en 164 veces. Un efecto similar se observó para las lipasa; de Pseudomonas cepacia (PCL) cuando fueron co-liofilizadas con nueve ciclodextrina; [41], Como con los éteres corona, el incremento de la actividad se explica por la retenciór de la estructura secundaria de la enzima nativa en un solvente polar orgánico [28].

'¡i;in< Lnresií'M,L\us cri] l.i Produccir-n ve .rtmcumbiisnlíks

Impresores moleculares: la impresión molecular bloquea la enzima en una conformación favo-rable para la catálisis durante la liofilización a través de la adición de una molécula-plantilla a la solución de la enzima antes de su congelamiento, seguida por su remoción después de la liofilización. Se ha mostrado que las lipasas co-liofilizadas con materiales anfifílicos tipo-géminis, solubles en agua, tienen una alta actividad enzimàtica en medios no acuosos [42],

Modificación química: otra estrategia para incrementar la solubilidad, actividad y estabilidad de lipasas en solventes orgánicos es la modificación química de su superficie. Koops et al. [43] reportaron el uso de dos derivados activados de polietilenglicol y «-octanol como mo-dificadores; el éter monometílico triesilactivado de polietilenglicol 2000 fue el modificador más efectivo, al activar lipasas que mostraron un incremento de su actividad en disolventes orgánicos en 27 veces.

1.2. INMOVILIZACIÓN DE LIPASAS

La inmovilización de enzimas consiste en la restricción deliberada de la movilidad de la enzima [44], Después de su inmovilización las enzimas quedan localizadas en una región de-finida del espacio, limitada por barreras materiales o electrostáticas, que separan físicamente la enzima del seno del medio de reacción, pero que son permeables a las moléculas de reac-tivos v de productos. La inmovilización puede servir para dos objetivos: mejorar la estabili-dad de la enzima y reducir su consumo ya que la enzima puede ser retirada y reutilizada en varios ciclos de reacciones. El grado de mejora de esta estabilidad operacional depende de la estructura de la enzima, el método de inmovilización y el tipo de soporte [45],

Los procesos de inmovilización pueden ser llevados a cabo mediante manipulación del microambiente de la enzima variando el tipo de enlace con el soporte (p.ej. enlace covalente, adsorción hidrofóbica e intercambio iónico y entrecruzamiento), por atrapamiento en una barrera material (p.ej. microencapsulación en vesículas lipídicas, atrapamiento en micelas invertidas o en matrices poliméricas, y confinamiento membranas de ultrafiltración). Tam-bién se puede lograr la inmovilización de la enzima alterando su macroambiente (mediante modificación del medio de reacción, lo que puede ocasionar por, ejemplo, su precipitación en el disolvente orgánico) [46].

La inmovilización de lipasas tiene dos aspectos importantes: en primera medida, y dado que la mayoría de lipasas parecen requerir alguna forma de activación interfacial, la inmoviliza-ción debería promover este proceso al máximo posible y prevenir que la enzima activada se revierta a su forma cerrada. Existen estudios que muestran que matrices que provean simultáneamente características no-polares/hidrofóbicas y polares/hidrofílicas son adecua-das para alcanzar una activación y estabilización óptima de la lipasa. Como segundo aspecto, y dado que las lipasas comerciales son frecuentemente mezclas crudas con contenidos tan

lJr.-diKXi-n I: il zi malica ele Biodiese!

bajos como 0.1 - 5% p/p, el protocolo de inmovilización debería permitir el enlace selec-tivo de una enzima de interés a partir de una mezcla compleja de enzimas [47]. Las estruc-turas 3D de lipasas indican que son proteínas simultáneamente hidrofílicas e hidrofóbicas, siendo su principal área hidrofóbica la región alrededor del sitio catalítico. De acuerdo con esta hipótesis, la afinidad entre soportes y enzima es muy importante para la inmovilización eficiente de la enzima [48],

Los métodos de inmovilización de lipasas-enzimas pueden ser diferenciados en dos catego-rías generales: retención física y enlazamiento químico [49], Un esquema que ilustra algunos de los tipos de inmovilización, según esta categorización, se muestra en la figura 1.2.

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T i r Figura 1.2. Métodos de inmovilización de encimas

1.2.1. MÉTODOS DE RETENCIÓN FÍSICA 1.2.1.1. Adsorción Es el método más simple e involucra interacciones superficiales reversibles entre la enzima y el material de soporte. Se ha observado que la inmovilización por adsorción no-covalente es muy útil en sistemas no acuosos, en los cuales la desorción puede ser despreciada debido a la baja solubilidad de enzimas en estos solventes, por lo que son ampliamente usadas en estos medios de reacción [44, 50-56].

1.2.1.2. Atrapamiento o inclusión En el atrapamiento en matrices, la solución de enzima se mezcla con un fluido polimèrico que luego se solidifica. Ejemplos característicos de este tipo de inmovilización son el atra-pamiento en geles de polisacáridos como alginatos, x-carragenanos, agar, quitosano y ácido poligalcturónico u otras matrices poliméricas como gelatina, colágeno y polivinilalcohol [57-60]. Esta técnica tiene diferentes opciones como la del atrapamiento de lipasas en mem-

| 24 | «

Avances jnvesriííauvos en ja Producción de Biocombustibíes

branas delgadas semipermeables [61-64] o la encapsulación en microcápsulas que varían entre 1 0 - 1 0 0 pim de diámetro usando vesículas lipídicas [65], materiales inorgánicos [66] y microcápsulas de hidrogel [67-69].

1.2.2. INMOVILIZACIÓN POR ENLACE QUÍMICO 1.2.2.1. Enlazamiento iónico Está basado en las interacciones electrostáticas de grupos iónicos con diferentes cargas en-tre la matriz del soporte de las enzimas. Los soportes de intercambio iónico (p. ej. Duolite A358, celulosa DEAE, Sephadex DEAE y carboximetil celulosa) se han usado con frecuen-cia y buen desempeño [70-73].

1.2.2.2. Enlace covalente La inmovilización de lipasas por enlace covalente con matrices insolubles es una técnica ampliamente investigada. Se pueden formar enlaces covalentes entre los materiales de so-porte y algunos grupos funcionales de los residuos de aminoácido presentes en la superficie de la enzima (usualmente - N H , de la lisina o la arginina, -COOH de los ácido aspártico o glutámico, -OH de la serina o la treonina y - S H de la cisteína). En un caso típico del uso de esta técnica el soporte se activa inicialmente por un reactivo específico para hacer que sus grupos funcionales se tornen fuertemente electrofíücos, para que luego reaccionen con algunos grupos nucleofílicos fuertes en la enzima. La reacción involucrada puede involucrar la formación de isoúrea, enlaces diazo, enlaces peptídicos o una reacción de alquilación. El procedimiento debe ser llevado a cabo bajo condiciones de reacción suaves para evitar la desactivación de la enzima [74-80]. En la figura 1.3. se ilustra el tipo de enlace imina que se forma cuando se usa glutaraldehído como agente entrecruzante para soportes con grupos amino superficiales disponibles o como brazo espaciador en la inmovilización covalente con residuos de lisina.

'}— NH2 C H 0 C H J C H 2 C H 2 C H O N H ? _ L

1 N=CH—CH2-CH2-CH2-CH=N~L

- Entrecruzamiento

i NCH—CMCH2 * CH¡2 CHfíH

Figura 1.3. Entrecruzamiento encima-soporte y soporte-soporte con glutaraldehído

Producción Enzimàtica de Biodiesel

1.3. ASPECTOS CINÉTICOS EN LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

Luego de conocer los procedimientos mediante los cuales las lipasas son protegidas, activa-das o inmovilizadas para su uso en medios orgánicos, deben comprenderse otros aspectos que afectan su comportamiento en estos ambientes. El primero de ellos es el que debe garantizarse una disponibilidad de agua mínima para que estas enzimas logren hacer su función catalítica. El parámetro fundamental que se utiliza para la medida de esta condición es la actividad de agua del medio de reacción o del microambiente en el que la lipasa se encuentra inmovilizada.

1.3.1. LA IMPORTANCIA DE LA ACTIVIDAD DE AGUA El agua es crítica para las enzimas y afecta su desempeño en diferentes formas: influen-ciando la estructura de la enzima mediante enlaces no-covalentes como los puentes de hidrógeno, facilitando la difusión de reactivos y alterando el equilibrio de la reacción. Un contenido muy bajo de agua generalmente reduce la actividad enzimàtica. Varios estudios han demostrado que la cantidad de agua adsorbida en una enzima en disolventes orgánicos es un parámetro más determinante de la actividad enzimàtica que el contenido de agua del solvente mismo. Pencreac'h y Baratti [81] encontraron que la actividad hidrolítica de lipasas en medios orgánicos no puede ser estimada de la actividad en medios acuosos. Entonces, para cuantificar la cantidad de agua presente en la mezcla de reacción, la actividad termodi-námica de agua ( a j es una medida muy usada [34, 82] y es considerada el parámetro clave que gobierna la actividad de lipasas y enzimas en general en medios orgánicos [83],

Usualmente, las lipasas adsorbidas no son muy útiles en trabajo en sistemas con alta ac-tividad de agua por su posible desorción, sin embargo, las enzimas pueden permanecer adsorbidas en las superficies de membranas en medios orgánicos debido a la insolubilidad práctica en disolventes orgánicos. A su vez, la inmovilización puede permitir altas activida-des de esterificación sin una hidrólisis asociada [84], Los biocatalizadores de lipasas inmovi-lizadas usan frecuentemente matrices que, por sí mismas, pueden actuar como adsorbentes de agua [85],

La actividad de agua ( a j de un medio es un factor importante en reacciones catalizadas por lipasas porque las reacciones lipolíticas ocurren en interfases aceite-agua. Una alta aw

favorece la lipólisis mientras las reacciones de esterificación se conducen de mejor manera con bajos valores de a . En una esterificación de ácido láurico con octan-l-ol en isooctano catalizado por lipasas inmovilizada en un sol-gel, los datos indicaron que el a^ del medio correlacionó con la cantidad de éster (octil laurato) producido con un rendimiento máximo de éster a un a de 0.6. La alcohólisis catalizada por lipasas y la acilación [86] se conducen mejor a a <0 .5 mientras que la lipasa de Candida rugosa expresó su más alta relación de transesterificación a hidrólisis a a = 0.11 y la más alta actividad total a a = 0.53 [87], W J w L J

' U 6 J "

Avances mvesuiranvos en la Producción de Biocombusübíes

Finalmente, la actividad de agua inicial de un disolvente orgánico es modificada por el agua liberada en la reacción y su exceso puede llevar a la generación de sistemas bifásicos, lo que puede ser beneficioso para ésteres de síntesis [88].

I.3.2. CINÉTICAS MONOSUSTRATO. LA ECUACIÓN DE MICHAELIS - MIEN-TEN La ecuación más fundamental para el estudio de cinéticas de reacción enzimáticas es la que se basa en la suposición simple de que una enzima (E) se enlaza reversiblemente con un sustrato ( i ) para formar un complejo enzima-sustrato (ES) que posteriormente reacciona irreversiblemente para arrojar un producto (P) y devolver la enzima en su forma original (E). Este mecanismo se puede desglosar como sigue:

enzima E y un único sustrato, en donde ES simboliza el complejo enzima sustrato y P el producto:

E + S+zz ES - + E + P

(l.l)

La velocidad de esta reacción es proporcional a la concentración que existe del complejo enzima-sustrato, de tal manera que:

v=kca,[ES]

(1.2)

Suponiendo que la velocidad a la que se forma el complejo enzima - sustrato es contrarres-tada por la velocidad en la que se libera producto y en la que se liberan enzima y sustrato, se puede obtener un parámetro denominado la constante de Michaelis K :

[ E ] [ S ] k _ l + k 2

[ £ S ] A,

(1.3) Es preferible que la expresión de la velocidad de reacción se normalice sobre la concen-tración total de enzima en el sistema, ya que ésta se encuentra repartida entre el complejo enzima - sustrato y la enzima libre, de tal manera que:

I I . . . I' M ' M l ' l 1 ^ tu

(1.4)

Producción Enzimàtica de BiodieseJ

Con lo que la velocidad de reacción se puede obtener como:

y = Ir [/ Eli

(1.5)

E introduciendo al parámetro y — k. ¡ q u e representa la máxima velocidad de reacción posible:

= vmax [S] K +[S]

(1.6)

Este resultado se ha denominado la ecuación de Michaelis — Menten.

1.3.3. CINÉTICAS BISUSTRATO Históricamente, las cinéticas de reacción enzimàtica están ligadas a los parámetros desarro-llados para reacciones con un único sustrato (monosustrato). Sin embargo, en el caso de la producción de biodiesel, las posibles rutas (transesterificación directa e hidrólisis — esterifi-cación) incluyen reacciones con dos sustratos (bisustrato). Las materias primas concernien-tes al proceso (aceites y grasas refinadas, crudas o usadas, etc.) contienen un gran número de sustancias, aunque desde el punto de vista químico, los triglicéridos son las principales materias primas del proceso y generalmente a éstos van dirigidos muchos estudios cinéti-

Los modelos desarrollados para reacciones bisustrato se pueden dividir de acuerdo a la forma en que los sustratos son enlazados por la enzima en dos tipos: secuenciales y ping - pong [89, 90].

En los mecanismos secuenciales, la enzima debe enlazar los dos sustratos para formar un complejo ternario de enzima — sustratos antes de liberar los productos. En este caso se uti-liza una sub clasificación de acuerdo al orden en que los sustratos deben enlazarse. Si existe un orden preciso para enlazarse se habla de mecanismos secuenciales ordenados, si, por el contrario, el orden no interesa, el mecanismo se denomina secuencial aleatorio.

En los mecanismos ping — pong el enlace de la enzima con cualquier sustrato produce un complejo que libera un producto y luego el siguiente sustrato se enlaza para liberar un siguiente producto y regresar a la enzima a su estado original.

Avances IrH'gsURativos en la Ptniluccii!»» <.ie Biocombuscibies

La expresión de velocidad resultante para estos casos se puede expresar respectivamente :omo:

v — ! M ^ J (Secuencia! ordenado, primero se enlaza A) (1.7) [A]+[A][B]

(Secuencial aleatorio) (1.8) ksKab+Kah[Á\+Kha[B]+[A\B}

v = KUt [A] + Ky ¡ [5]+ [A ][5] PonS Bi Bi) c -9) 5n la figura 1.4. se muestran los esquemas de las cinéticas mencionadas suponiendo que la reacción general entre los dos sustratos es irreversible.

A i' R Q

1- EAÊ'P 1)

EA EAB — El'Q 1»

FQ

A B P Q

B Á Q P e)

I'igtra 1.4. Mecanismos de reacciones btsustrato: a) Mecanismo ping-pong bi-hi, b) Mecanismo secuencial ordenado, c) Mecanismo secuencial aleatorio

Los mecanismos relacionados representan las situaciones más simples para la comprensión de las reacciones bisustrato. Sin embargo, de acuerdo a las características de reactantes utili-zados, lo más riguroso es postular mecanismos paso a paso que describen el funcionamien-

I 'roduccion i nzimatica ele Diodiesu

to de las lipasas, la formación de complejos intermedios enzima - sustrato y enzima - pro-ducto, para obtener las expresiones correspondientes a las que se ajustan estadísticamente los datos experimentales que se puedan tomar. Un caso de esta aproximación lo presentan Paiva et al ¡91] que derivan para hidrólisis reversibles simultáneas de ésteres, la tasa de un éster particular con una mitad acilo m y una mitad alcohólica n, a partir de un número I de mitades acilo y J mitades alcohólicas presentes en la solución.

1.3.4. MECANISMOS Y CINÉTICAS EN LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL Como ya se ha mencionado, el proceso de producción de biodiesel tiene básicamente dos rutas, la transesterificación y un proceso en dos pasos, hidrólisis - esterificación. Debido a la complejidad de los tri-acil-glicéridos usados como materias primas, para los estudios cinéticos usualmente se deben realizar simplificaciones como restringir el seguimiento de la reacción a grasas idealizadas compuestas de un solo tipo de ácidos grasos y la transforma-ción global del triglicérido a los metil o etil ésteres sin considerar los pasos intermedios de formación de mono y di acil glicéridos.

1.3.4.1. Cinéticas de transesterificación La figura 1.5. (a) muestra la reacción global de transesterificación. En la figura 1.5. (b) se ilustra un mecanismo más real en el que se producen los alquil ésteres a partir de mono, di y triglicéridos.

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Figura 1.5. Esquema de la transesterificación o alcohólisis de triglicéridos: a) Reacción general, b) Pasos de la reacción

nces Invesrigaovos en la Producciun de Biocombusiibles

Al-Zuhair et al [92] estudiaron la cinética de la metanólisis de aceite de palma mediante lipasa libre de Mucor miehei en n-hexano como solvente mediante la reacción de la Figura 1.4.a y propusieron un mecanismo Ping Pong Bi Bi con inhibición por ambos sustratos. Dossat etal [93], usando esta misma reacción, estudiaron la cinética de alcohólisis con butanol de aceite de girasol con un alto contenido oleico usando lipasa inmovilizada á&¥Jji%pmncor mie-hei en n-hexano y medio libre de solvente proponiendo un mecanismo Ping Pong Bi Bi. Los datos se ajustaron al modelo con inhibición competitiva por parte del alcohol.

Una propuesta más completa del mecanismo de la alcohólisis fue propuesta por Cama-cho et al [94]. Ésta consiste en tomar los pasos según la reacción de la figura 1.5.b, aunque aumentando el número de triglicéridos tomados en cuenta de acuerdo a la posición de la cadena de ácido graso e incluyendo como paso del mecanismo la migración de las cadenas de ácido graso en diferentes posiciones (migración (l,2)/(2,3)- a (l,3)-diacilglicéridos y (2)-a (l)/(3)-monoacilglicéridos) (ver figura 1.5.). La reacción fue estudiada usando tnoleína y etanol como sustratos, así como un aceite con alto contenido de ácido oleico y etanol, mediante lipasas inmovilizadas de Mucor miehei y Rhizopus oryzae en metil /er-butil éter como solvente. Se realizó la derivación de las ecuaciones para describir la variación de la concentración de los tri-, di- y monoglicéridos (sumando todas las combinaciones para cada acilglicérido) respecto al tiempo, usando la suposición de estado estable para los complejos enzima - sustrato.

E*0S5Í=^=ÍEA-OOS g o l = = i Q S S E - O S i = ¿ = ± E A + S S S ' <_

* * *

b) c)

i )

+BA E A - O T Í = = = E + o s o

d) e)

Figura 1.6. Mecanismo de reacción propuesto por Camacbo et al [94 j:

a) Desacilación del triglicérido a través del complejo acil - enverna para producir los diglicéridos,

b) Lomen-ración del 2-monoglicérido a 1 (3)-monoglicérido, c) Formación de glicerol del 1(3)-

monoglicéndo por parte de la lipasa, d) Formación del 1,2-diglicérido del 1 (3)-monoglicérido

por esterificación del grupo acilo liberado del triglicérido, e) Esterificaríón del grupo aalo liberado

del triglicérido a través del complejo acil- encima con el alcohol

Otra propuesta interesante es la hecha por Cheirslip et al [95], En ésta se involucra al agua como un sustrato adicional además de aceite de palma y etanol, de tal manera que se to-

m | 31

Producción hnznrninoi de fíiodiesel

marón en cuenta tanto reacciones de transesterificación como hidrólisis de los glicéridos y esterificación de los ácidos grasos libres. En este trabajo se utilizó lipasa de Pseudomonas sp inmovilizada en polvo de polipropileno micro poroso. Se propusieron tres mecanismos para el proceso en donde de nuevo se hace la suposición de estado estable para los comple-jos enzima — sustrato en los cuales se incluyó la inhibición por alcohol. Los datos experi-mentales se ajustaron mejor al tercer mecanismo.

1.3.4.2. Cinéticas de interesterifícación La interesterificación se refiere al uso de sustrato un éster, generalmente más pequeño, que modifica el sustrato de triglicérido. El esquema de la reacción se muestra en la figura 1.6. En este caso no se desintegra el triglicérido sino que se reemplazan las cadenas de ácido graso con los radicales acilo del segundo éster. La interesterificación presenta como ventaja frente a la alcohólisis la capacidad de reutilización de la lipasa, ya que no tiene una inhibición apreciable [96], aunque Xu é>/<?/[97] demostraron mediante un estudio cinético de la interes-terificación de aceite de soya y acetato de metilo mediante lipasa inmovilizada de Candida antarctica libre de solvente que los datos cinéticos se ajustan a un modelo Ping Pong Bi Bi con inhibición por parte del acetato.

1.3.5. EFECTOS DEL MEDIO DE REACCIÓN EN LAS EXPRESIONES DE VELOCIDAD Hasta la fecha no hay un modelo general para predecir los efectos del medio en la cinética, en la estabilidad de la enzima, en la enantioselectividad y en la estabilidad del reactor [28, 83. 98-100]. Se han hecho intentos para establecer correlaciones entre la actividad de la enzima y las diferentes propiedades fisicoquímicas de los disolventes, tal como la acomodación de carga (constante dieléctrica) [83] y la hidrofobicidad (coeficiente de partición octanol/agua logP) [101, 102],

>4-

b)

Figura 1.6. Esquema de reacríón de interesterificación: a) Reacción general, b) Pasos de reacríón

Avances ínvestiâtivos en ¡a Producción de fíiocombusríbles

tín una teoría que ha sido desarrollada por van Tol et al. [103] de acuerdo a la teoría del es-tado de transición, el complejo del estado de transición se asume en equilibrio con el estado base del sustrato y la enzima. La correspondiente constante de equilibrio termodinàmico se puede así expresar en parámetros cinéticos basados en la actividad, que son los mismos en todos los solventes, como también la constante de especificidad (igual a / [Encima], K . en la ecuación de Michaelis) basada en la actividad termodinámica resulta independiente del solvente. Por ello, en este modelo, las constantes cinéticas basadas en la actividad son llamados "parámetros intrínsecos" debido a que el solvente no las afecta. Sandoval et al. [99] mejoró y verificó este modelo usando la esterificación de ácido oleico con etanol catalizado por una lipasa inmovilizada para predecir la cinética en varios solventes orgánicos y en sis-temas libres de solvente.

Hazarika et al. [102] estudiaron el efecto del solvente en la esterificación de ácido oleico con etanol en un sistema disperso de lipasa pancreática de porcino. Los solventes fueron seleccionados con base en sus valores de hidrofobicidad (log P). El valor de log P ha sido propuesto como una medida cuantitativa de la polaridad del solvente y de la actividad de la enzima para reacciones catalizadas por lipasas, y en general, las velocidades de reacción se incrementan con la hidrofobicidad del solvente. La relación de la velocidad de reacción inicial con los valores de log P de disolvente muestra que la actividad de la enzima se incre-menta casi linealmente con el incremento de log P. Resultados similares fueron reportados con lipasa de Candida rugosa recubierta con un tensoactivo como catalizador en disol-ventes orgánicos.

Sin importar el tipo de reacción catalizada (bien sea hidrólisis, esterificación o intereste-rificación), la descripción más general y aceptada de la acción catalítica de lipasas es un mecanismo Ping Pong Bi Bi [4], Muchos investigadores han propuesto también modelos cinéticos para reacciones en medios orgánicos basados en este mecanismo [68, 73]. Algunos valores para síntesis de ásteres en medios no acuosos catalizada por lipasas obtenidos de diferentes referencias bibliográficas se muestran en la 0.

Existen dos tipos generales de mecanismos cinéticos reconocidos para una reacción Bi Bi, Ping Pong (no secuencial) o mecanismos de complejo ternario (secuencial). Al Zuhair et al [92] propusieron un mecanismo de alcohólisis de aceites basados en el mecanismo de hidró-lisis enzimàtica. Los grupos funcionales ácidos o básicos encontrados en lugares específicos en los sitios activos de la enzima catalizan la reacción donando o aceptando protones du-rante el curso de la reacción. Tal mecanismo de transferencia de protones empieza el paso catalítico en muchas reacciones catalizadas por enzimas [104],

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Producción Enzimàtica de Biodiesci

CONCLUSIONES

Las lipasas pueden catalizarla producción de biodiesel mediante reacciones de esterificación transesterificación e interesterificación. Para hacerlo eficientemente requieren de acondicio namientos que garanticen la apertura del centro activo a los sustratos, la estabilidad de esta: enzimas en medios tan agresivos como disolventes orgánicos y la disponibilidad de agu: suficiente para que desempeñen la función catalítica. La inmovilización, realizada correcta mente, puede ofrecer el microambiente necesario para que se cumplan estos requisitos. Sin importar el tipo de reacción catalizada (bien sea hidrólisis, esterificación o interesterifi cación), la descripción más general y aceptada de la acción catalítica de lipasas es un meca nismo Ping Pong Bi Bi.

Tabla 1.1. Parámetros cinéticos del modelo ping pong para esterificaciones en medio no acuoso catalizadas por lipasas.

Sustratos/ Solvente/ Linasa

V ' max

(mmol mi r f ' g 1 ) Ka

(mol L ') Kb

(mol L"ll K,A

(mol L ') K,k

(mol L"1) Ref.

wo-butírico. Alcohol amílico/iso-octano/LCR libre

0,167 0,60 0,750 - 0,020 [105]

Acido laúrico. sulcatol/tolueno/LCR 0,400 0,439 2,522 - 0,795 [106]

Acido palmítico. mentol / ;¿ooctano/LCR 0,640 1,00 0,011 - 0,013 [107]

Acido oleico. Metanol/hexano/LCA 4,9 0,013 0,016 0,003 [108]

Acido oleico. etanol/hexano/LPP libre

4,0 0,066 0,103 0,020 [109]

Ácido oleico. Etanol/hexano/LMM

23,0 0,45 0,6 - 0,06 [110]

Acido oleico. Etanol/COj S C/MML

14,0 0,16 1,60 - 0,065 [110]

Ácido oleico, n-butanol/hexano/LCR 3,2 0,380 0,190 0,23 0,780 [111]

Ácido oleico, n-butanol/wo-octano/LC'R

18,2 0.599 0,149 - 1,933 [112] Ácido oleico, n-butanol/wo-octano/LC'R 19.0 0,640 0,128 - - ri i2 i

Upasa de Mucor miehetlMM; lipasa de päncreas de porcino: LPP; lipasa de KMiehei: LRM; lipasa de Candida antarctia. LC4; lipasa de Candida rugosa: LCR

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Av anees Investiga ti vos en la Producción de ßiocomb ustible

REFERENCIAS

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AVANCES INVESTIGATEOS EN LA PRODUCCIÓN DE … · Ing. Químico, M.Sc. en Ingeniería Química de la Síntesis Orgánica, Ph.D en Ingeniería Química ... l com o materi prima a par