Axón de jibia 9 de abril de 2009 Fisiología General 2009, Clases, AxondeJibia.ppt

Axón de jibia

9 de abril de 2009

http://einstein.ciencias.uchile.clFisiología General 2009, Clases, AxondeJibia.ppt

I, mA/cm2

t, ms

Voltage clamp de un axón de jibia

NaNaNaKKKm gpNgpNI 5494

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494

-60,8mV0mV

)0()0( NaNaKKm VGVGI

dtdV

CVVGVVGI mNamNaKmKm )()(

I, mA/cm2

t, ms

-60,8mV0mV

Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494 KtVKKK gpNI ),(94

Control

TTX

I, mA/cm2

Pulso -120 a 100 mV

Vm

El curso temporal del desarrollo de la corriente de potasio no sigue un curso exponencial.

Para estudiar la relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana se mide a diferentes potenciales.

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

Vm, mV

I K, m

A c

m-2

Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.

Estrategia para buscar el potencial de inversión VK.

Sospecha: VK = -94 mV

Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué?Porque los canales están cerrados a -94 mV.

Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.

Vm, mV

IK,

mA

/cm

2

Prepulso constante

Pulso de prueba variable

Vm

1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.

VK = -73,4 mV

Los canales de K cumplen la ley de Ohm.

)( KmKK VVGI

Sorpresa: El valor encontrado, -74 mV es menos negativo que el esperado según Nernst (-94mV).

Una explicación posible: los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na.

Tarea: Calcular GK/GNa para estos canales

VK = -73,4 mV

El potencial de reposo es -60 mV, los potenciales de inversión de las corrientes de potasio y leak son -73 y -50 mV respectivamente. Calcule la razón GK/GLeak para el potencial de reposo.

Vm, mV

IK,

mA

/cm

2

VK=-73.4 mV

)( KmKK VVGI

VK=-73.4 mV

)( KmKK VVGI

Km

KK VV

IG

Vm, mV

I K,

mA

/cm

2

Vm, mV

GK/G

K,m

ax

Conductancia estandarizada en estado estacionario

Los canales de K son tetrámeros.

Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina.

Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo

Los sensores de potencial operan en forma independiente.

El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos.

Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo

La probabilidad de encontrar un canal abierto es... n4

)-V(VnNgI KmKK4 4nNgG KK

4

,

nG

G

maxK

K

Vm, mV

GK/G

K,m

ax

4nNgG KK

4

,maxK

K

GG

4

,

nG

G

maxK

K 4nNgG KK

Vm, mV

n

RT

VVzF m

e

n0

1

1

V0 = -46 mVz = 1.4

4

,

nG

G

maxK

K 4nNgG KK

Vm, mV

n

RT

VVzF m

e

n0

1

1

V0 = -47 mVz = 1.8

Errores pesados por 1/n

4nNgG KK 4

,

nG

G

maxK

K

Vm, mV

n

)-V(VnNgI KmKK4 4n

II

Kmax

K

RT

VVzF m

e

n0

1

1

V0 = -48 mVz = 1.2

Errores pesados por n

La curva n vs Vm no se ajusta bien a una función de Boltzmann.

Vm, mV

Cinética

ntennntn /)()0()()( KmKK -VVnNgI 4

KmKK -VVtnNgtI 4)()(

Kmt

KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(

Caso n(0)=0, el curso temporal de la corriente es sigmoideo

Kmt

KK -VVenNgtI n4/1)()(

Caso n(∞)=0, el curso temporal de la corriente es exponencial

Kmt

KK -VVenNgtI n/4)0()(

Vm-140mV

0 mV -100mV

Kmt


Kmt


Kmt


= 1.8 ms

Kmt


= 1.8 ms = 4.7 ms

1

5001.0

10

50

mVm

n

e

V80

60

125.0mV

n e

ms-1

n

Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.

Ngk = 35.3 mS/cm2 VK = -73,4 mV

Descripción completa de los canales de K del axón de jibia

nn

Kmt


1

5001.0

10

50

mVm

n

e

V80

60

125.0mV

n e

nnn

1

nn

nn

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV.

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV.

Calcular la probabilidad de encontrar canales con 0, 1, 2, 3, y 4 sensores activos, si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV.

Para una membrana con un solo canal, calcule el tiempo que tarda en abrirse el canal por primera vez al cambiar el potencial desde -60 mV a 0 mV.

Para una membrana con un solo canal, calcule el tiempo que tarda en abrirse el canal por primera vez al cambiar el potencial desde -160 mV a 0 mV.

Canales de sodio del axón de jibia

I, mA/cm2

t, ms

-60,8mV0mV

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494

La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.

KtVKKK gpNI ),(94NatVNaNaNa gpNI ),(54

-60 mV

0 mVVm

La corriente de Na presenta inactivación

Con el uso de TTX se puede aislar la fracción de la corriente llevada por los canales de sodio.

-60 mV

0 mVVm

La corriente de Na presenta inactivación

30 mV

Procedimiento para demostrar que los canales de sodio cumplen la ley de Ohm y encontrar el potencial de inversión de la corriente

VNa = 41.2 mV

Los canales de sodio cumplen la ley de Ohm

Figure 13.29. Ball-and-Chain Model for Channel Inactivation. The inactivation domain, or "ball" (red), is tethered to the channel by a flexible "chain" (green). In the closed state, the ball is located in the cytosol. Depolarization opens the channel and creates a negatively charged binding site for the positively charged ball near the mouth of the pore. Movement of the ball into this site inactivates the channel by occluding it. [After C. M. Armstrong and F. Bezanilla. J. Gen. Physiol. 70(1977):567.]

El modelo de bola y cadena para la inactivación de los canales de sodio

Topología de un canal de sodio membrana

http://nerve.bsd.uchicago.edu/Na_chan.htm

-60 mV

0 mV

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(

Tratando los axones con pronasa se puede estudiar la activación sin interferencia de la inactivación

-60 mV

0 mV

-40 mV


Procedimiento para determinar la conductancia de los canales tratados con pronasa.

INa,max = -9.38 mAcm-2 a -40 mV

GNa,max = 116 mS cm-2

VNa = 41.2 mV

Corriente inicial de cola en los axones tratados con pronasa


),( VpNa

-40 mV

0 mVVm

-60 mV

Cinética de la activación

x = 1Suma de cuadrados = 8.0

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x

Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(

La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial

elevada a la cuarta potencia.




La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial

elevada a la cuarta potencia.




La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. Lo simulamos usando una función exponencial elevada a la tercera potencia.

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa

ntemmmtm /)()0()()(

Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.


ntemmmtm /)()0()()(


m (0 mV) = 0.27 ms


ntemmmtm /)()0()()(


m (0 mV) = 0.27 ms m (-40mV) = 0.48 ms

Tau m en función del voltaje


),( VpNa

3)(tmpNa

Como ya sabemos la relación entre pNa y m podemos calular de m(∞)

m()

3 ),( VpNa


Como ya sabemos m y tau podemos calular alfa y beta

mmm

mm

mm

1

)(

m y m a diferentes voltajes

1

351.0

10

35

mV

mm

e

V

18

60

4mV

m e

Demostrar que m = 1 para el límite Vm -35 mV

La inactivación.

NamNaNa VVhmNgtI 3)(

La variable h representa probabilidad de que los canales NO estén inactivados.Para h = 1 los canales no están inactivados.(la pronasa hace h =1)Para h = 0 los canales están inactivados

La probabilidad de encontrar un canal conduciendo es m3h

-60 mV0 mV


Procedimiento para determinar h infinito en función del voltaje-

Prepulso variable

Pulso variablede pruena fijo

Medir la corriente en el mínimo.



h()

-100 mV

-60 mV -40 mV-60 mV

Determinación de tau h mediante ajuste de curvas al curso temporal de la corriente de sodio

NamNaNa VVhmNgtI 3)( ntemmmtm /)()0()()(

htehhhth /)()0()()(

-100 mV

-60 mV -40 mV-60 mV

h = 3.4 ms

NamNaNa VVhmNgtI 3)( ntemmmtm /)()0()()(

htehhhth /)()0()()(

-60 mV -60 mV

0 mV 0 mV

Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso temporal del escape de la inactivación

Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso tempooral del escape de la inactivación

h = 8.2 ms

Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso tempooral del escape de la inactivación

Tau h en función del voltaje

Como ya sabemos m y tau en función de Vm, podemos calcular alfa y beta

hhh

hh

hh

1

)(

20

60

07.0mV

h e

1

1

10

30

mVh

e

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

-150 -100 -50 0 50 100 150

)(3NamNaNaNa VVhmgNI

NNagNa = 120 mS/cm2

h

m

h, ms

m, ms

VNa = 41,1 mV

Vm, mV Vm, mV

Vm, mVVm, mV

Calcular la fracción de canales de sodio abiertos después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Calcular la fracción de canales de sodio inactivados si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 m.

Calcular la fracción de canales de sodio inactivados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Calcular la fracción de canales de sodio cerrados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Potencial de reposo y potencial de acción de

membrana

Vm

IK

INa

IL

IC

Im

CLNaKm IIIII En el potencial de reposo Im = 0 e IC = 0

LNaK III 0

Potencial de reposo

Vm

IK

INa

IL

IC

Im

LrLNarNaKrK VVGVVhmGVVnG 3max4max0

El problema tiene solución porque yo conozco n, m y h en función del potencial de la membrana.

La tarea ahora es buscar un Vr se satisfaga esta ecuación.

2-max

2-max

-2

mScm 0,3 -50.1mV

mScm 120 mV 41.1

mScm 36 -73.3mV

LL

NaNa

maxKK

GV

G V

GV

)(4KKKK VVngNI

)(3NaNaNaNa VVhmgNI

)( LLL VVGI

NKgK=36 mS/cm2 VK=-73,3 mV

NNagNa=120 mS/cm2 VNa = 41,1 mV

NLgL=0,3 mS/cm2 VL = -50,1 mV

Ecuaciones de Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol.117:500-544.

En : F. Bezanilla “El Impulso Nervioso” En: Biofísica y Fisiología Celular, Latorre et al ed. Universidad de Sevilla, Sevilla 1996.

Ecuaciones empíricas basadas en Hodgking y Huxley 1952. Las constantes y están en ms-1 y V en mV.

Vm ,(mV)

h

m

n

Celda Objetivo

Celda a ajustar para que la celda objetivo sea cero Solver:

Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.

Solver:

Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.

Este es el Potencial de Reposo.

Axón de jibia

VNa 41.1 mV GNa 6Scm-2

VK -73.3 mV GK 320Scm-2

VL-50.1 mV GL 330Scm-2

Vm

CM 1Fcm-2

Tarea: Calcular el potencial de reposo dadas estas conductancias y potenciales de inversión de las corrientes.

Potencial de acción de membrana.

-60,8 mV

En el potencial de reposo se cumple que Ii = 0

Vm, mV

Im, (

Acm

-2)

dt

dVCIII m

LNaK 0

0,5 ms @-80 mV

Al cambiar el potencial de la membrana inyectando corriente, Ii ya no es 0, es la corriente que necesito para ir a -80 mV.

¿Cuál será la trayectoria del potencial desconecto la corriente, es decir hago Im = 0.

Vm, mV

Im, (

Acm

-2)

0,5 ms @-80 mV

LNaKm

m IIIdt

dVC La trayectoria apunta a -60 mV

Vm, mV

Im, (

Acm

-2)

¿Cuál será la trayectoria del potencial desconecto la corriente, es decir hago Im = 0.

0,5 ms @-50 mV

¿Trayectoria esperada?

Vm, mV

Im, (

Acm

-2)

LNaKm

m IIIdt

dVC

1,0 ms @-50 mV

Vm, mV

Im, (

Acm

-2)


LNaKm

m IIIdt

dVC

0,5 ms @-40 mV


Vm, mV

Im, (

Acm

-2)

LNaKm

m IIIdt

dVC

Computación de la trayectoria

m

LNaKm

C

III

dt

dV

tdt

dVVtV m

mm )(

Vm, n, m y h son los valores iniciales de la trayectoria. Con estas corrientes se calcula la derivada dVm/dt

Ahora calculo el nuevo Vm

)(4KmKKK VVngNI


)( LmLL VVGI

Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm a Vm(t) por t unidades de tiempo.

Computación de lo nuevos valores de n,m y h.

n, m y h infinito Tau de n, m y h (ms)

ntttt ennnn /)()( )(

n(t+t) es el nuevo valor de nn es el valor esperado para el nuevo Vm.(se lee del gráfico A)n(t) es el valor anterior de n.n es el valor de la constante de tiempo para el nuevo Vm. (se lee del gráfico B)

Vm Vm

A Bh

m

n

h

n

m



mtttt emmmm /)()( )(

m(t+t) es el nuevo valor de mm es el valor esperado para el nuevo Vm.(se lee del gráfico A)m(t) es el valor anterior de m.m es el valor de la constante de tiempo para el nuevo Vm. (se lee del gráfico B)

Vm Vm

A Bh

m

n

h

n

m



htttt ehhhh /)()( )(

h(t+t) es el nuevo valor de hh es el valor esperado para el nuevo Vm.(se lee del gráfico A)h(t) es el valor anterior de h.h es el valor de la constante de tiempo para el nuevo Vm. (se lee del gráfico B)

Vm Vm

A Bh

m

n

h

n

m


m

LNaKm

C

III

dt

dV

tdt

dVtVtV m

mm )()2(

Vm, n, m y h son los valores actualizados.Con estas corrientes se calcula la derivada dVm/dt


)(4KmKKK VVngNI


)( LmLL VVGI

Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm(t) a Vm(2t) por t unidades de tiempo.


m

LNaKm

C

III

dt

dV

tdt

dVtVtV m

mm )2()3(

Vm, n, m y h son los valores actualizados.Con estas corrientes se calcula la derivada dVm/dt


)(4KmKKK VVngNI


)( LmLL VVGI

Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm(2t) a Vm(3t) por t unidades de tiempo.

Así se continúa por toda la trayectoria...

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Tiempo, (ms)

Vm

, (m

V)

I m, (

mA

cm-2)

VK

VNa

Tiempo, milisegundos


Tiempo, (ms)

Vm

, (m

V)

I Na,

(m

Acm

-2)

VK

VNa

INa


Tiempo, (ms)

Vm

, (m

V)

I K, (

mA

cm-2)

VK

VNa

INa

IK

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