AZOSPIRILLUM

1MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS

Género: Azospirillum

I. INTRODUCCIÓN:

El suelo es una fuente rica de minerales y nutrientes que la planta necesita

para poder subsistir, desde hace miles de años los microorganismos presentes en el

suelo empezaron a generar nutrientes y enzimas que favorecían al crecimiento de las

plantas, estos microorganismos benéficos formaron simbiosis con las plantas o las

plantas se adaptaron a ellos. Además cumplen un rol fundamental en el

mantenimiento del ecosistema. Los microorganismos presentes en el suelo ejercen

una acción específica cuando se relacionan con una especie vegetal. El estudio de la

relación microorganismo-planta es muy importante ya que permite establecer una

relación entre el tipo de suelo, la variedad de planta y la micro-biota asociada. Estas

interacciones naturales dependen en gran parte del correcto mantenimiento de los

ciclos biológicos que se realicen a este nivel (sistema radicular).

El suelo es un substrato imprescindible de la vida en el medio terrestre, pues

en el se encuentran los macronutrientes como el nitrógeno, carbono, hidrogeno y

oxigeno, los cuales son los componentes principales de proteínas, coenzimas,

nucleótidos y clorofila. Estos macronutrientes y las fitohormonas reguladoras del

crecimiento desempeñan un rol importante en el desarrollo vegetativo y

rendimientos de cultivos.

Hoy en día se ve la necesidad de fertilizar los suelos por el desgaste que han

ido sufriendo durante todos los años que la agricultura mal organizada y mal

practicada ha sido empleada por las personas, en la obtención de alimentos. Frente a

esta necesidad de suelos infértiles con bajo índice de nitrógeno, se emplea

fertilizantes químicos, sin embargo estos no son muy aprovechados por la planta o

cultivos, y aproximadamente un 67% se pierde, quedando un exceso de compuestos

nitrogenados en el ecosistema que representan la mayor fuente de cintaminacion e la

atmosfera (oxido de nitrógeno) y en las aguas superficiales y profundas (nitratos)

(Collados, 2006).

Azospirillum spp. Esp. Microbiología y Parasitología.


Como una alternativa al uso de fertilizantes químicos y reguladores

sintéticos del crecimiento vegetal, se emplean microorganismos presentes en el

suelo como Azospirillum spp., que incrementa la fertilidad natural de suelo y

benefician el desarrollo vegetal a través de diferentes mecanismos como la fijación

no simbiótica de nitrógeno y protección frente al ataque de plagas y patógenos.

Se considera a Azospirillum spp. como uno de los géneros de rizobacterias

promotoras del crecimiento vegetal más estudiados en la actualidad debido a su

capacidad de mejorar significativamente el crecimiento y desarrollo, así como el

rendimiento de numerosas especies vegetales de interés agrícola (Bashan et al.

2004). Uno de los principales mecanismos propuestos en la actualidad para explicar

la promoción del crecimiento vegetal en plantas inoculadas con Azospirillum sp., se

relaciona con su capacidad de producir y metabolizar compuestos reguladores del

crecimiento vegetal o fitohormonas (Okon and Labandera Gonzáles 1994).

II. MARCO TEÓRICO:

A. Historia de Azospirillum spp.

En un principio fue llamado Spirillum lipoferum que fue descrito en 1925

por Beijerinck, esta bacteria estuvo olvidada por varias décadas. Son las

observaciones de Peña-Cabriales y Döbereiner en 1973 las que iniciarían la época

moderna de esta bacteria. Estudios taxonómicos de S. lipoferum conducen a su

reclasificación en un género nuevo, Azospirillum.

Actualmente son reconocidas seis especies en el género Azospirillum. Las

dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense, siendo éstas las

mas ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A.

amazonense, A. halopraeferans, A. irakense y A. largomobile siendo el nombre de

esta especie corregido a A. largimobile. Pocos años después del redescubrimiento

de Azospirillum y hasta alrededor de 1993, este género fue el más estudiado entre

las bacterias asociadas a plantas. La capacidad de Azospirillum para estimular el

crecimiento de las plantas y de aumentar el rendimiento de los cereales promovió



numerosos estudios sobre la ecología, fisiología y genética de esta bacteria. En la

actualidad su uso comercial comienza a extenderse en diferentes países.

B. Características Culturales

Características Generales:

El genero Azospirillum es una proteobactria, Gram negativa que utiliza

como fuente nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, aminoácidos y

nitrógeno molecular. Tiene forma bacilar pleomorfica, se puede apreciar en

algunas cepas la forma de C, con un diámetro de 0.8 a 1 um de largo y 2 a 4 um

de ancho. Tienen una cantidad de G+C equivalente al 68% a 70%. Son

microaerofilos, presentan movilidad en espiral por flagelos peritricos o polares.

Habitan comúnmente en el suelo y rizosfera, asociado a plantas, tiene la

capacidad de fijar el N₂. Almacena como reserva poli-B-hidroxibutirato,

observándose al microscopio las células jóvenes con abundantes gránulos

refringentes.

Características Diferenciales

Requiere una Tº optima de crecimiento de 30ºC a 32ºC, un pH de 7.0 – 7.3

(neutro), presenta la enzima oxidasa (oxidasa +), para su cultivo requiere de


Fig. 1 Microscopia electrónica de Azozpirillum spp.


biotina. En el medio Nfb semisólido desarrolla una película blanquecina y

densa debajo dela superficie (3 a 5mm), con viraje del indicador al azul; en

medio Nfb solido se desarrollan colonias circulares, planas blanquecinas de 2 a

3 mm, con superficies lisas o rugosas y bordes enteros, con viraje del verde al

azul.

En cultivos semigelificados y gelificados con más de 24 h de incubación se

presentan frecuentemente células refringentes con forma ovoide y de paredes

gruesas similares a quistes.


Fig. 3.-Formación de "velo" a 5 mm de la superficie en medio semi-solido selectivo para Azospirillum"

Fig. 2- Placas con medio Nfb (solido). A la izquierda de color verde claro una placa con medio Nfb sin inoculación de Azospirillum. A la derecha placa de medio Nfb con

colonias blanquecinas y con el viraje a color azul.


Una de las características fenotípicas más ampliamente usada como criterio

para el reconocimiento tentativo del género Azospirillum es el color rojo

escarlata que toman las colonias al crecer en un medio adicionado del colorante

rojo Congo.

Azospirillum presenta quimiotaxis positiva hacia ácidos orgánicos, azucares,

aminoácidos, compuestos aromáticos y hacia exudados radicales (Crozier et at

1988; López de Victoria y Lovell, 1993). Este genero migra hacia lugares del suelo

donde la concentración de oxigeno es la adecuada ubicándose en nichos ecológicos

apropiados en la rizosfera donde realiza la fijación biológica del nitrógeno y

sintetiza sustancias estimuladoras del crecimiento.

C. Clasificación:

La clasificación del Genero Azospirillum spp. Se realizo en función de las

características morfológicas y fisiológicas según el Manual de Bergey:

Reino: Bacteria


Fig.4--Colonias Rojo escarlata de Azospirillum en placa con medio rojo de congo con acido malico.

http://species.wikimedia.org/wiki/Bacteria


Phylum: Proteobacteria

Clase: Alpha Proteobacteria

Orden: Rhodospirillales

Familia: Rhodospirillaceae

Genero: Azospirillu

Especies: A. amazonense, A. halopraederans, A. lipoferum, A. brasilienses.

D. Aislamiento de Azospirillum:

1. Zona de recolección de muestreo: Azospieillum spp. Tiene como

habitad el suelo de cultivos, específicamente en la zona denominada

rizosfera, en cultivos de Tomate (Lycopersicon sculentus) o de Maiz

(Zea mays).

2. Obtención de muestras de raíces: se recolectan las raíces del

tomate o maíz, al final del ciclo vegetativo aproximadamente un mes

antes de la cosecha. Luego se lavan las raíces con agua potable, hasta

eliminar el suelo remanente. Se cortan en secciones de

aproximadamente 5 cm, luego se desinfectan con hipoclorito de

sodio (NaClO) al 2 %, durante 5 minutos y se enjuagaron dos veces

consecutivas con agua destilada estéril. Luego se cortaron en

secciones de un tamaño aproximado de 2 cm de longitud y se

enjuagaron con agua destilada estéril.

3. Enriquecimiento: Para favorecer el crecimiento de bacterias

fijadoras de nitrógeno, se realiza el enriquecimiento de cada una de

las muestras, depositando las raíces de 10 a 15 mm por debajo de la

superficie en tubos conteniendo 6 mL de medio libre de nitrógeno

con azul de bromotimol (Nfb) semisólido. Se incuba en aerobiosis a

30 ºC por 5 días.

Resultados: Tubos con viraje del color verde asta azul, con una

película blanquecina de 3 a 5 mm.

4. Aislamiento Primario: se seleccionan los tubos donde se observa

viraje del color verde del medio hacia el azul y la presencia de una

película gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie. Se


http://species.wikimedia.org/wiki/Rhodospirillaceae

http://species.wikimedia.org/wiki/Rhodospirillales

http://species.wikimedia.org/wiki/Alpha_Proteobacteria

http://species.wikimedia.org/wiki/Proteobacteria


toma una alícuota de la película, con la que se obtiene una

suspensión en 1 mL de solución salina fisiológica estéril, y se

siembra por agotamiento y estría en placas de Petri con medio Nfb

sólido con 20 mgL-1 de extracto de levadura. Incubar a 30 ºC durante

3 a 5 días.

Resultados: desarrollaran colonias blanquecinas y pequeñas con

viraje del verde al azul de 2 a 3mm.

5. Identificación primaria de la Bacteria: seleccionamos una colonia

aislada y se realiza la tinción Gram y observar que no este

contaminada la muestra.

Resultado: bacilos Gram negativos (-).

6. Cultivo puro: de la colonia que se realiza la tinción Gram, cogemos

con el ansa en punta un poco de la colonia y la sembramos en un vial

con agar nutritivo por el método de estriado

Resultados: se obtendrá una estría uniforme con una sola

característica para todas las colonias. Para confirmar que no este

contaminada el cultivo puro se realiza una tinción Gram.

7. Identificación Bioquímica de la bacteria:

Oxidasa: oxidasa +

Medio Nfb semisólido: las placas Petri se incuban en

aerobiosis a 30 ºC por 1 semana. Luego se observara el viraje

de verde asta azul, lo que comprueba que se trata del genero

Azospirullim spp.

Medio agar rojo de Congo: las Placas de Petri se incuban a

30 °C por 48 a 72 h. Luego se observaran las colonias de

color rojo escarlata. Lo que nos confirma q se trata del genero

Azospirillum.

8. Identificacion Molecular:

Prueba de PCR: la identificación genotípica rutinaria de

las especies de Azospirillum, así como su detección, se logra

fácilmente y en forma reproducible amplificando mediante el



uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los

genes 16S rDNA [p. ej. usando las secuencias de los

oligonucléotidos 27f (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)

y 1495r (5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA)] y cortando los

productos amplificados con la enzima de restricción AluI.

Con esta estrategia se obtienen fragmentos de tamaños

específicos para cada especie de Azospirillum, distinguibles

fácilmente en geles de agarosa.

FLUJO-GRAMA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE

Azospirillum


Raíces de Tomate o Maíz

Lavar con agua potable y desinfectar con hipoclorito de sodio al 2% x 5min

Cortar las raíces en trozos de 5 cm, enjuagarlas 2 veces y volver a cortar en 2

cm

Enriquecer en medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb) semisólido

(6ml)

Incubar Por 5 dias a 30ºC

Sembrar en tubos conteniendo 6 mL de medio libre de nitrógeno con azul de

bromotimol (Nfb) semisólido

Incubar de 3 a 5 dias a 30ºC


E. Importancia de Azozpirillum:

Las especies microbianas del genero Azospirillum son muy importantes ya

que favorecen el crecimiento de la planta lo cual ha sido relacionado con el

metabolismo del nitrógeno, a través de la fijación biológica en condiciones de

vida libre o por el incremento de la actividad nitrato reductasa en condiciones

endofíficas, con relación al metabolismo del nitrógeno, Azospirillum además

de fijar el nitrógeno atmosférico en condiciones de microaerofilia que

lo asimila como amonio, presenta reducción asimilatoria del nitrato en

condiciones aeróbicas. Cuando Azospirillum crece en condiciones anaeróbicas

utiliza el nitrato como último aceptor de electrones provocando denitrificacion:

Azospirillum presenta una nitrogenasa constituida de una ferroproteína

y una molibdoferroproteína que reduce el N2 a (NH 4+). S e h a

o b s e r v a d o q u e l a p r e s e n c i a d e s a l e s d e a m o n i o

(NH4+) inhibe la actividad de la nitrogenasa


Cultivo puro primario en vial con agar nutritivo

Pruebas Bioquimicas

NO3- NO2- (NO) N2O N 2


Glutamino sintetasa (GS), glutamato deshidrogenasa (GDH-NADH) y

glutamato sintetasa (GOGAT- NADPH) las cuales incorporan el nitrógeno

fijado a la ruta de biosíntesis de a.a., péptidos y proteína.

El interés agronómico por dicho género se basa en los beneficios potenciales

que presentan algunas cepas para ser utilizadas como biofertilizante.

relacionado con la capacidad de este microorganismo para producir o

metabolizar compuestos del tipo fitohormonas, tales como ácido indol acético;

citocininas (Tien et al. 1979); giberelinas (Bottini et al. 1989) y etileno

(Strzelczyk et al. 1994), así como de otras moléculas reguladoras del

crecimiento vegetal, tales como el ácido abscísico (ABA)

F. Ambiente rizosférico:

Aparentemente, una bacteria del suelo deberá sobrevivir a las múltiples

interacciones que se presentan con la compleja comunidad microbiana que

habita el mismo microambiente, antes de que ocurra cualquier interacción con

las raíces de la planta. En el inicio de una interacción con las raíces de la planta

hospedera, el microorganismo específico deberá llegar a la superficie de las

raíces, adherirse y multiplicarse para colonizarla. Si la bacteria tiene la

capacidad de invadir los tejidos internos, se diseminará en el interior de la raíz e

incluso en otros órganos de la planta.

La adaptación de Azospirillum al futuro ambiente rizosférico probablemente

se inicia con la germinación de la semilla, la cual exuda infinidad de compuestos

orgánicos que forman parte fundamental de la espermosfera. Posteriormente, la

exudación de compuestos será a través de las raíces durante el desarrollo de la

planta. Aun cuando las especies de Azospirillum difieren en su capacidad para

utilizar diferentes compuestos como fuentes de carbono y nitrógeno, estas

bacterias usan para su crecimiento unos pocos mono y disacáridos así como

alcoholes polihidroxilados, y principalmente diversos ácidos orgánicos tales

como málico y succínico y algunos aminoácidos. Para el uso de diferentes

fuentes de carbono, tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen todas las



enzimas de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas y de la vía de Entner-Doudoroff,

así como todas las enzimas del ciclo de los ácidos Tricarboxílicos. Tanto A.

lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad de crecer autotróficamente con

H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa

La riqueza en compuestos orgánicos en la espermosfera/rizosfera conduce a

intensas actividades e interacciones microbianas. Algunos estudios indican que

la quimiotaxis a los exudados de raíz es uno de los factores que influyen en la

llegada de los microorganismos a la rizosfera. Tanto en A. lipoferum como en A.

brasilense se demostró una fuerte actividad quimiotáctica hacia diversos

azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos, así como hacia compuestos

aromáticos y exudados radicales. La respuesta quimiotáctica a diferentes fuentes

de carbono es variable dependiendo de la especie de Azospirillum e incluso es

cepa-específica. También una respuesta hacia el oxígeno (aerotaxis) fue

observada en A. brasilense. Zonas de baja concentración en oxígeno fueron las

preferidas por las células bacterianas para su crecimiento y multiplicación,

siendo repelidas por altas concentraciones de oxígeno y condiciones

anaeróbicas. La aerotaxia parece ser especialmente importante bajo condiciones

de fijación de nitrógeno, permitiéndole a las células de Azospirillum alcanzar

concentraciones de oxígeno lo suficientemente bajas para que se exprese la

actividad nitrogenasa. Se sugiere que tanto la respuesta quimio y aerotáctica son

características que contribuyen en el proceso de colonización de las raíces de las

plantas, ya que el consumo de oxígeno durante el crecimiento activo de las

raíces enriquece el ambiente con sustratos orgánicos y genera gradientes de

oxígeno al consumirse éste durante la respiración. No obstante, la colonización

de la rizosfera y la superficie o el interior de las raíces será el resultado del

enriquecimiento selectivo de los microorganismos mejor adaptados a estos

ambientes. Por ejemplo, la capacidad para producir bacteriocinas por algunas

cepas de A. brasilense y A. lipoferum podría representar ventajas competitivas

sobre las cepas de estas especies o íntimamente relacionadas que sean sensibles

a estas biomoléculas. Además, la capacidad de producir sideróforos (agentes

quelantes del hierro) por algunas cepas de A. brasilense pudiera ser de gran



importancia durante la colonización del ambiente rizosférico y de la superficie

de las raíces al ejercer efectos antagónicos contra otros miembros de la

comunidad microbiana, incluyendo a microorganismos deletéreos o patógenos

de las plantas.

Esta actividad antagonista correlaciona con la alta sensibilidad de A.

brasilense a los antibióticos estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol

producidos por actinomicetos del suelo, en comparación a la elevada resistencia

a los antibióticos del tipo β-lactámicos producidos por hongos. La expresión

constitutiva de la actividad β-lactamasa fue observada entre numerosas cepas

de A. brasilense. Estos resultados sugieren que el antagonismo causado por

hongos contra Azospirillum es limitado. También es concebible que se presenten

efectos sinérgicos entre Azospirillum y otros miembros de la comunidad

rizosférica. Por ejemplo, el filtrado de un cultivo de Phialophora radicicola,

hongo usado como agente de biocontrol, promueve el crecimiento de A.

lipoferum y A. brasilense. De manera similar, la interacción entre A.


Fiq. 5. Inhibicion del crecimiento y la esporulacion de un hongo fitopatogeno causada por A. brasilense.


brasilense y Azotobacter chrococcum o Streptomyces mutabilis conduce a

incrementos de sus respectivas poblaciones en la rizosfera de trigo.

Diversas condiciones tales como el envejecimiento celular y la presencia de

metales pesados provocan que las células vibroides de Azospirillum cambien su

morfología y tomen la forma de "quistes" (conocidos como formas C),

conduciendo a la agregación celular y formando grumos visibles de gran

tamaño. Aparentemente, residuos de arabinosa presentes en el exopolisacárido y

en el polisacárido capsular están involucrados en la agregación de A. brasilense.

La agregación y la formación de quistes mejoran la sobrevivencia

de Azospirillum, situación en la que la acumulación de poli-β-hidroxibutirato

(PHB) parece desempeñar una función importante al servir como almacén de

carbono y energía. Además, diversas funciones fisiológicas son atribuidas al

PHB, destacándose la mayor resistencia a la desecación, a la luz ultravioleta y al

choque osmótico. Se ha sugerido que la formación de quistes pudiera

desempeñar una función importante en la sobrevivencia de Azospirillum en el

ambiente rizosférico, cuando los nutrientes son limitados, previo a la asociación

con las raíces de la planta. Recientemente, ha sido publicada una amplia revisión

sobre las características de A. brasilense en relación con la agregación celular.

G.Interacción con la planta:

Probablemente, una vez que las células de Azospirillum se han adaptado a las

condiciones del ambiente rizosférico y han logrado llegar a la superficie de las

raíces, debido a sus características quimio y aerotácticas, se iniciará el

establecimiento de la asociación. Diferentes estudios han mostrado que A.

brasilense tiene la capacidad para adherirse a las raíces de plantas gramíneas

como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens, trigo, maíz, así

como a las raíces de plantas de otras familias que incluyen al algodón y tomate,

e incluso a superficies inertes como poliestireno y arena. La capacidad

de Azospirillum para adherirse a las raíces, al menos a las de mijo, es

significativamente mayor que la mostrada por otras bacterias de la comunidad



rizosfera como Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas, e incluso

que E. coli. La asociación de Azospirillum con las raíces de las plantas se

desarrolla en dos etapas completamente independientes. La primera consiste en

una adsorción rápida, débil y reversible, la cual es dependiente de proteínas de la

superficie bacteriana del tipo de las adhesinas en conjunto con la participación

del flagelo polar. La segunda fase consiste de un anclaje lento pero firme e

irreversible que alcanza su máximo nivel 16 h después de la inoculación, el cual

parece ser dependiente de un polisacárido extracelular de Azospirillum. Los

resultados de un estudio reciente sugieren la posibilidad de que una proteína de

la membrana externa de Azospirillum participe en el proceso de adherencia a las

raíces de las plantas. El proceso de adherencia de Azospirillum a las raíces de las

plantas ha sido revisado recientemente. En diversos casos se ha reportado la

aparición de material fibrilar que contribuye al anclaje de Azospirillum a las

raíces de diversas plantas, describiéndose como esencial para el anclaje a las

partículas de arena. Aún en la actualidad, la naturaleza del material fibrilar no ha

sido elucidada, aunque parece ser de origen bacteriano. Recientemente se ha

publicado una revisión sobre la capacidad de Azospirillum para adherirse a

superficies abióticas del suelo.

La inoculación de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los

principales sitios de colonización son las áreas de elongación celular y las bases

de los pelos radicales. Sólo algunas células de Azospirillum llegan a adherirse a

la cofia o a los pelos radicales. Sin embargo, fue observada la presencia

de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia. La inoculación

de raíces de trigo con una cepa de Azospirillum que expresa constitutivamente el

gen reportero gusA mostró que en los primeros días de la asociación las células

bacterianas colonizan específicamente los sitios de emergencia de las raíces

laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto de la raíz primaria como de

las raíces secundarias y posteriormente la superficie de la raíz. En plantas de

trigo fue observado que la inoculación de Azospirillum induce cambios en la

morfología de los pelos radicales, siendo éstos cambios significativamente

mayores que los causados por Rhizobium leguminosarum o Azotobacter



chrococcum, los cuales son mínimos. Además, fue observado que la inoculación

con 105 a 106 células de Azospirillum causa tanto la elongación como el

aumento de la superficie total de la raíz, en tanto que la inoculación de 108 a

109 células causa la inhibición del desarrollo de ésta. Aparentemente, el

incremento del tamaño del sistema radical se debe, al menos parcialmente, al

aumento de la división celular y al intenso crecimiento de la zona de elongación

de las raíces.

Es de interés señalar que los sitios que coloniza Azospirillum lipoferum son

diferentes, dependiendo de la variedad de la planta, al menos en el caso del

arroz. La capacidad de Azospirillum para colonizar las raíces de las plantas es

variable dependiendo de la cepa. Con el uso de microscopia con focal de rayos

láser y sondas de oligonucleótidos fluorescentes y con el uso de anticuerpos

monoclonales cepa-específicos ha sido mostrado que algunas cepas de A.

brasilense, incluyendo a la cepa tipo Sp7, se encuentran restringidas al ambiente

rizosférico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raíz

de plántulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente

en altas densidades en los espacios intercelulares de la raíz, así como en el

interior de los pelos radicales. Resultados similares, usando otras metodologías,

habían sido reportados con algunas de las mismas cepas

de Azospirillum inoculadas en trigo creciendo en condiciones de campo.

Azospirillum spp. Esp. Microbiología y Parasitología. Fig. 5. Estimulación del crecimiento de las raíces de maíz inocuilado con A. brasilensis




H. Mecanismos de estimulación del crecimiento de las

plantas:

Auxinas

Tiene la capacidad de inducir la elongación de las células del tallo en la

región subapical y que logran reproducir el efecto fisiológico del ácido indol 3-

acético (AIA). Estos compuestos han sido vinculados a procesos de

orientación del crecimiento de tallos y raíces en respuesta a la luz y gravedad,

diferenciación de tejidos vasculares, dominancia apical, iniciación de las raíces

laterales y adventicias, estimulación de la división celular y elongación de tallos

y raíces (Ross et al. 2000). La producción y metabolismo bacteriano de auxinas

ha captado la atención de los investigadores desde dos puntos de vista: a nivel

metabólico, por la capacidad del microorganismo para producir estos compuestos

y regular su producción en diferentes condiciones ambientales (Costacurta and

Vanderleyden 1995) y a nivel morfofisiológico por el efecto que ocasiona su

producción en asociación con distintas especies vegetales (Falik et al. 1989). En

cultivos puros de Azospirillum sp., además de la forma principal, el ácido indol-

3-acético (AIA), se han identificado otros compuestos indólicos de interés, tales

como el ácido indol-butírico (IBA) (Costacurta et al. 1994), indol láctico (Crozier

et al. 1988), indol acetamida (Hartmann et al. 1983), indol acetaldehído

(Costacurta et al. 1994), indol etanol e indol metanol (Crozier et al. 1988),

triptamina, antranilato y otros compuestos indólicos no caracterizados aún

(Hartmann et al. 1983).

Biosíntesis bacteriana de auxinas

En microorganismos se han propuesto, al menos tres vías metabólicas para la

biosíntesis del ácido indol acético (AIA) a partir de triptofano (Trp),

denominadas vía del indol 3-piruvico (AIP), ácido 3-acetamida (AIM) y la vía de

la triptamina (Tam) (Cheryl and Glick 1996). Adicionalmente se ha descripto una

vía que no requiere de este precursor para la biosíntesis del AIA y que se

denominada vía independiente del Trp. A pesar de esta diversidad, en el

metabolismo procariótico la biosíntesis parece seguir dos rutas predominates: la



ruta de la indol 3-acetamida (IAM) y la del ácido indol 3- pirúvico (IPA) por

encima de la vía de la triptamina (Tam) y de la vía independiente de triptofano.

Lambrecht et al. (2000) han encontrado un patrón de biosíntesis de AIA

característico de la interacción planta-microorganismo que depende

específicamente de rol ecofisiológico de la especie bacteriana que interactúa,

siendo estas fitopatogénicas o promotoras del crecimiento. Tal es el caso de

Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonas

savastanoi y Erwinia herbicola, todas especies fitopatogénicas que sintetizan el

AIA de manera inducible por la vía de la indol 3- acetamida (IAM) y de manera

constitutiva por la vía del indol 3-piruvico (IPA). La expresión del gen clave de

la vía de la indol acetamida (iaaM), es predominante cuando la bacteria se

encuentra en el apoplasto vegetal en forma invasiva, mientras que la expresión

del gen clave de la vía del indol 3- piruvico (ipdC) es predominante cuando la

bacteria se encuentra en la superficie de la hoja de manera saprofítica. En

contrapartida, la mayor parte de las bacterias promotoras del crecimiento, tales

como Azospirillum sp. o Bacillus sp. Sintetizan AIA de manera inducible a través

de la vía del IPA (Patten and Glick 1996). Abdel-Salam and Klingmüller (1987)

lograron aislar once mutantes (Tn-5) de Azospirillum lipoferum capaces de

producir entre el 45-90% menos de AIA, comparados con sus cepas isogénicas

salvajes. La capacidad residual de estos mutantes, sugirió en ese momento dos

explicaciones posibles: la existencia de varias rutas de síntesis de AIA ó la

presencia de múltiples copias de genes codificantes de transferasas de

aminoácidos aromáticos con baja especificidad por el sustrato. En la actualidad

sabemos que al menos cuatro vías de síntesis diferentes han sido descriptas para

el género Azospirillum (Prinsen et al. 1993), tres dependientes del Trp: Indol 3-

pirutato (AIP), Indol 3-acetamida (AIM) y Triptamina (Tam) y una que no

utilizaría a este aminoácido como precursor (Costacurta and Vanderleyden

1995). La magnitud de expresión de cada vía depende fundamentalmente de las

condiciones de crecimiento bacteriano y en general se considera que la síntesis

mayoritaria depende de la disponibilidad del Trp en el sustrato. En este sentido,

la evidencia establece que si el aminoácido se encuentra disponible, la vía



predominante es la del acido indol-3-piruvico (IPA) y de manera secundaria la

vía de la de la indol 3-acetamida (IAM). La vía del ácido indol 3-pirúvico (AIP)

parece tener gran homología a la descripta en plantas superiores (Nonhebel 1993)

y su secuencia comienza con la conversión del Trp a AIP por una transferasa de

aminoácidos aromáticos, seguida por decarboxilación del producto a indol 3-

acetaldehído, a cargo de una indol piruvato decarboxilasa y posterior oxidación a

AIA por una indolacetaldehído dehidrogenasa (Costacurta et al. 1994). La vía del

IPA fue confirmada inicialmente en A. brasilense Sp245 cuando se clonó por

primera vez el gen ipdC que codifica para una IPyA decarboxilasa (Costacurta et

al. 1994). La posterior caracterización molecular descripta por Van de Broek et

al. (1999), determinó que la expresión de este gen era regulada corriente arriba

por el mismo IAA, lo cual representó la primera descripción de un gen bacteriano

especificamente regulado por auxinas.

El promotor del gen ipdC contiene un elemento de respuesta a auxinas

(AuxRE), el cual es similar al AuxRE encontrado en los promotores de los genes

inducibles por auxinas de plantas superiores (Lambretch et al. 1999). Por su

parte, la vía de la indol 3-acetamida (IAM) ha sido una de las más estudiadas en

bacterias fundamentalmente fitopatogénicas e involucra la acción consecutiva de

dos grupos de enzimas: Trp-monooxigenasas responsables de la oxidación del

Trp a indol 3-acetamida y AIM-hidrolasas responsables de la subsecuente

hidrolisis del precursor a AIA, y para las que sendos genes ya han sido clonados

en Pseudomonas syringae (Yamada et al. 1985) y Agrobacterium tumefaciens

(Klee et al. 1984). La existencia de esta vía en A. brasilense fue sugerida en los

trabajos de Prinsen et al. (1993) y en los ensayos de Bar and Okon (1993).

Posteriormente, en ensayos realizados con varias cepas de A. brasilense y

mutantes con reducida capacidad de sintetizar AIA, en medio de cultivo

químicamente definido, Prisen et al. (1993), determinaron la existencia de Indol

3-acetamida en la fracción sobrenadante del medio de crecimiento, con lo que se

presentaba evidencia directa de la capacidad bacteriana de síntetizar este

precursor. Una tercera vía de menor importancia ha sido descripta para este

género, la vía de la Triptamina, en la que los eventos bioquímicos involucran la



conversión inicial del Trp a triptamina, catalizada por enzimas tipo

Trpdecarboxilasas dependientes del piroxidal fosfato, seguida de la conversión a

indolacetaldehído por aminaoxidasas. Aunque esta vía esta presente en plantas

(Conney and Nonhebel 1991) y hongos (Frankenberger and Arshad 1995) se ha

puesto muy poca atención en bacterias y solo fue sugerida para dos especies en

particular. Bacillus cereus (Perley and Stowe 1996) y Azospirillum brasilense

(Hartman et al. 1983), quienes comprobaron la capacidad bacteriana de producir

AIA a partir de triptamina en medio de cultivo químicamente definido.

Posteriormente, Ruckdäschel and Klingmüller (1992) detectaron compuestos

intermediarios y confirmaron esta vía de síntesis en sobrenadantes de cultivos de

Azospirillum lipoferum. Desde el punto de vista molecular, ni las enzimas, ni los

genes de la vía han sido caracterizados para este género. Finalmente se ha

descripto una vía independiente del Trp en la que trabajando con precursores

metabólicos marcados, Prinsen et al. (1993) sugirieron que la conversión de AIA

(en ausencia de Trp) en diferentes cepas de Azospirillum brasilense seguía una

distribución del 0,1; 10; y 90% para las vías de la IAM, AIP y la Independiente

del Trp respectivamente; sin embargo, esta vía habría sido desestimada

recientemente para este microorganismo y solo se considerarían aquellas

dependientes del Trp (Yaacov Okon)

Giberelinas

Las giberelinas (GAs) constituyen un amplio grupo de compuestos naturales

(ácidos diterpenos tetracíclicos) que regulan diversos procesos en el crecimiento

y desarrollo de las plantas, tales como la germinación, el alargamiento caulinar,

la floración y la fructificación (Davies 1995). Desde el punto de vista estructural,

las giberelinas libres se dividen en dos grandes grupos: aquellas que poseen un

complemento completo de átomos de carbono,

(GAs-C20) y aquellas en las que el C20 se pierde (GAs-C19). Todas las GAs

están carboxiladas en el C7, con la excepción de GA12-aldehído y pueden tener

presentes una (GA4), dos (GA1), tres (GA8) ó cuatro (GA32) funciones

hidroxilo. La posición en la molécula que presenta hidroxilación (OH),

representa unos de los puntos más importantes en la determinación de la



actividad biológica. Así, la hidroxilación de los C3 y C13 en sus posiciones ß y α

respectivamente, produce la activación de la molécula, mientras que la

hidroxilación del C2 en su posición ß tiene efecto fuertemente negativo sobre su

actividad biológica (Pearce et al. 1994). Además de las formas libres, se han

identificado formas conjugadas endógenas que incluyen: éter glucosídicos (GA-

G), donde la glucosa se une a la estructura de la GA por un grupo hidroxílo, y los

ésteres glucosídicos (GA-GE), donde la glucosa se une a la molécula de la

hormona por medio de un grupo carboxílo del C7 (Sembder et al. 1968).

Biosíntesis y Metabolismo

Las GAs pueden definirse como productos de la vía de los diterpenos y su

síntesis, en plantas superiores se inicia con la ciclización de un precursor común

de 20 moléculas de carbono, el geranil geranil pirofosfato (GGPP). Este

intermediario es sintetizado en plástidos a partir de ácido mevalónico (AM),

isopentenil difosfato proveniente de gliceraldehído 3-fosfato ó bien como se

comprobó recientemente por piruvato proveniente de la vía de las deoxixulosas

5-fosfato (Litchtenthaler, 1999). En tejidos de crecimiento vegetativo, ocurre la

primera fase de síntesis, con la ciclización del GGPP en protoplástidos y resulta

en la formación definitiva del ent-kaureno, en dos pasos sucesivos que requieren

de la actividad de dos enzimas claves: la copalil difosfato sintasa (CPS), la cual

produce el intermediario copalil difosfato y la ent-kaureno sintasa, que sintetiza

el producto final ent-kaureno. En una segunda fase de síntesis, el ent-kaureno es

convertido en Gas biológicamente activas por una serie de reacciones de

oxidación, catalizadas por dos tipos de enzimas. Las primeras reacciones ocurren

en membranas extraplastídicas y resultan en una contracción del anillo B de C6 a

C5, tomando así la molécula la forma giberelica característica. Estas reacciones

son catalizadas por las Citocromo P-450 dependientes monooxigenasas y

culminan con la formación de GA12, la que se considera la primera GA, como

tal, de la vía. Posteriormente y en una tercera fase de síntesis, este intermediario

o bien GA53 (producto de la 13á-hidroxilación de GA12) es metabolizado por

enzimas solubles, llamadas dioxigenasas 2-oxoglutarato dependientes, las que

utilizan el 2-oxoglutarato como co-sustrato. Dos tipos de dioxigenasas son



requeridas para convertir GA12 ó GA53 por vías paralelas en GAs activas. Las C

20-oxidasas y las 3ß-hidroxilasas. Un tercer grupo de dioxigenasas 2-

oxoglutarato dependientes, las 2ß-hidroxilasas, producen la hidroxilación de la

posición 2ß de la molécula, produciendo con ello la pérdida de actividad

biológica (Mac Millan

1997).

Biosíntesis y metabolismo de GAs por Azospirillum sp. en

medio de cultivo

Bottini et al. (1989) determinaron la capacidad de Azospirillum lipoferum

Op33 de producir compuestos tipo GA1, GA3 e iso-GA3 en medio de cultivo

químicamente definido. La identificación de estas formas endógenas de GAs se

realizó por Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de Masa con

Monitoreo Selectivo de Iones (GC-MS-SIM), mientras que la cuantificación se

realizó por medio de test biológicos en arroz (Murakami et al. 1972) y determinó

una concentración equivalente a GA3 de 20 y 40 pg.ml-1 de GA1 y GA3

respectivamente. La identificación y cuantificación de GA1, GA3 e iso-GA3 se

realizó por GC-MS, a partir de cultivos puros y determinó que el patrón de

producción era de GA3>iso-GA3>GA1. Piccoli and Bottini (1996) pusieron de

manifiesto la capacidad de Azospirillum lipoferum para producir los precursores

inmediatos GA9 y GA19 lo cual permitió especular sobre la existencia de por lo

menos dos vías de síntesis en la bacteria. La primera mediada por reacciones de

13α-hidroxilación temprana y que involucraría el metabolismo de GA19 a un

precursor inmediato GA20 y la segunda mediada por reacciones de 3ß y 13á-

hidroxilación tardía y que involucraría la conversión de GA9 a formas activas

sobre el crecimiento vegetal. Piccoli et al (1996) y Piccoli et al. (1998)

confirmaron la capacidad de Azospirillum lipoferum Op 33 de producir GA9,

GA20 y GA5 en medio de cultivo químicamente definido, lo cual aporta nuevos

elementos para el complejo esquema de síntesis bacteriana. En otros ensayos,

Piccoli and Botiini (1994) demostraron la capacidad de A. lipoferum Op33 de

metabolizar GA20 a GA1, una molécula biológicamente activa sobre el

crecimiento vegetal en medio de cultivo químicamente definido. En este trabajo,



no se caracterizó otro metabolito y esto permitió especular sobre la capacidad

bacteriana de 3ß-hidroxilar este precursor inmediato solo a esta forma activa por

medio de una vía de 13α-hidroxilación temprana que finalizaría con la

producción de GA1. Adicionalmente, Piccoli et al (1996) confirmaron la

capacidad de la misma cepa bacteriana para metabolizar GA9 a GA3 (otra

molécula con actividad biológica). Estos resultados permitirían suponer que la

promoción del crecimiento de plantas inoculadas, se debería al menos en parte, a

la capacidad bacteriana de metabolizar precursores inmediatos de GAs, a formas

biológicamente activas para el crecimiento de la planta. En otros ensayos, Piccoli

et al. (1998), Evaluaron exitosamente la capacidad bacteriana de hidrolizar

glucosíl conjugados de GAs, en medio de cultivo químicamente definido,

modificado por la adición de un glucosíl ester de GA20 ó de 13-O-glucósido de

GA20, lo que confirmó la capacidad del microorganismo de aumentar en la

planta el pool endógeno de formas activas de giberelinas por la hidrólisis de

glucosa a partir de conjugados sin actividad biológica.

Citocininas

Son un grupo de compuestos naturales que regulan la división y

diferenciación celular en tejidos no meristemáticos de plantas superiores.

Químicamente son purinas, en su mayoría derivadas de la adenina, que incluyen

sus respectivos ribótidos, ribósidos y glucósidos. Estas fitohormonas se han

asociado a un gran número de procesos fisiológicos y celulares entre los que se

detallan el retardo de la senescencia por acumulación de la clorofila, la formación

de órganos en una gran variedad de cultivos de tejidos, el desarrollo de la raíz, la

formación de pelos radicales, la elongación de la raíz, la iniciación del tallo, la

expansión de las hojas. Por definición, son compuestos que en presencia de

concentraciones óptimas de auxinas, inducen la división celular en cultivos o

tejidos vegetales. El primer regulador con actividad específica del tipo citocinina,

fue descubierto por Miller et al. (1955) y se denominó cinetina (K) la cual fue

considerada como una forma no natural de la hormona. En 1963, Letham,

identificó una forma natural que denominó zeatina (Z) y desde entonces más de

40 moléculas y sus metabolitos han sido clasificados. La bioactividad no es



uniforme en las formas identificadas y en la mayoría de los casos depende del

tipo de anillo aminopurina presente en la molécula; de la sustitución del N6 con

una cadena simple derivada de una unidad isopurina; de la sustitución de las

posiciones 2 y 9 del anillo, por grupos H, CH3-S ó ribosil y de la presencia de

una cadena insaturada lateral con un óptimo de 5 carbonos. Las formas con

mayor actividad biológica descripta sobre tejidos o cultivos vegetales son la

Zeatina (Z), isopentenil-adenina (iP), cinetina (K) y benziladenina (BAP) y todas

poseen un doble puente alkilico en la posición N6.

Producción microbiana de citocininas

Muchos microorganismos de la risósfera, entre los que se detallan bacterias

y hongos, son capaces de sintetizar citocininas en cultivos químicamente

definidos. Barea et al. (1976) encontraron que al menos el 90 % de las bacterias

aisladas de la rizósfera de cultivos de interés agronómico, fueron capaces de

producir compuestos tipo-citocinas. Como resultado de la íntima relación entre

estos organismos y la superficie de la raíz, la producción exógena de esta

hormona, puede tener un profundo efecto sobre el crecimiento de la planta. Al

igual que lo reportado para las auxinas, la producción microbiana de esta

hormona, podría el suplementar el contenido endógeno de la planta y en ciertos

casos promover el crecimiento vegetal o resultar fitotóxica. En la actualidad

sabemos que las plantas, responden a la adición exógena de citocininas, lo cual

representa un punto de gran interés, debido a que no se conoce la significancia

ecológica de la síntesis microbiana en los tejidos vegetales. A pesar de que la

producción microbiana de citocininas en plantas superiores comenzó con

modelos de microorganismos fitopatógenos, en la actualidad los investigadores

se han volcado a la comprensión de este proceso en grupos de bacterias

promotoras del crecimiento. El modelo mas estudiado en este sentido ha sido el

de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, donde se ha investigado tanto la

producción de la hormona en el microsimbionte como en la planta. Desde el

punto de vista fisiológico, existe poca información que pueda relacionar en forma

directa el efecto de la inoculación con Azospirillum sp., la promoción del

crecimiento vegetal y la producción de citocininas. En este sentido Tien et al.



(1979) mostraron que la inoculación con A. brasilense provocaba cambios

significativos a nivel de la morfología de raíz de plántulas de pearl millet,

observando incremento en el número de raíces laterales y en la densidad de los

pelos radicales de cada raíz. La aplicación exógena de auxinas, citocininas y

giberelinas produjo cambios en la morfología de la raíz comparables a los

obtenidos por la inoculación con la inoculación. En otros ensayos, Cacciari et al.

(1989) determinaron que el cultivo mixto de A. brasilense y Arthrobacter

giacomelloi mostraba una gran producción de giberelinas y citocininas,

comparado con sus respectivos monocultivos, lo cual tendría gran importancia

fisiológica, debido a que la presencia de distintas especies microbianas en la

rizósfera, induciría la producción de citocininas y otras fitohormonas en bacterias

PGPR.

Etileno

Junto con auxinas, giberelinas y citosininas, el etileno es una hormona muy

importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas (Burg 1962). Debido a su

composición gaseosa en condiciones fisiológicas, por mucho tiempo, no se quiso

aceptar como una fitohormona; sin embargo diferentes trabajos, demostraron que

su síntesis y acción sobre la planta, era crítica para determinados procesos

fisiológicos.

El etileno es una molécula muy simple y simétrica, compuesta por 2 átomos

de C (Unidos en doble ligadura) y 4 átomos de H, soluble en agua en

aproximadamente 140 ppm, 25 C y 760 mm Hg (15 veces mas que el oxígeno).

Es muy activo y puede ejercer sus efectos fisiológicos a concentraciones muy

bajas en el tejido vegetal (0.1 ppm). En plantas superiores, todos los tejidos

tienen capacidad de sintetizar esta hormona, pero en general la magnitud de la

expresión, se asocia al estado de crecimiento y desarrollo de los mismos, siendo

mas activa en aquellos tejidos en activa división celular, que se encuentran bajo

condiciones de estrés ó en estado de senescencia (Burg and Burg 1968). Desde

que Gane (1934) reportó por primera vez la capacidad de las plantas de sintetizar

etileno, una gran variedad de compuestos, que incluyen metionina, ácido

linolénico, propanol, ß-alanina, etionina, etanol, glicerol, ácidos orgánicos y



hasta glucosa y sacarosa (Yang 1974), han sido propuestos como posibles

precursores de la hormona; sin embargo, en un trabajo in vitro de modelaje no-

enzimático, Abeles and Rubistein (1964), revelaron que la metionina era el

precursor natural por exelencia. En el caso de la síntesis microbiana, los

precursores propuestos fueron muy variados (Fukuda and Ogawa 1991) pero la

L-metionina ha sido el sustrato mayormente descripto en los cultivos bacterianos.

La regulación de la producción de etileno en plantas superiores depende

mayoritariamente de las enzimas consideradas «clave» de la biosíntesis de esta

hormona: S-adenosil-L-metionina (SAM) sintetasa, 1-aminociclopropano-1-

ácido carboxílico (ACC) intetasa y ACC oxidasa. Tanto los genes que codifican

para estas enzimas como sus elementos reguladores han sido caracterizados,

modificados y re-introducidos en plantas de interés agrícola con fines

agronómicos (Fluhr and Mattoo 1996). La SAM sintetasa cataliza la primera

reacción de la biosíntesis a partir de metionina, aumentando el contenido de S-

adenosil-L-metionina (SAM) para diversas rutas metabólicas, dentro de las que

se detallan la biosíntesis de Etileno (Fluhr and Mattoo 1996) y poliaminas (Even-

Chen et al. 1982). La segunda reacción es catalizada por la ACC sintasa y

determina la hidrólisis de la SAM para formar ACC y 5´-metiltioadenosina

(MTA) (Kende, 1989).

Finalmente la ACC oxidasa comanda la conversión de ACC a Etileno, CO2

y cianuro (John, 1991).

Dentro de los factores que Inducen la producción de Etileno, el estadío de un

órgano influye en la tasa de síntesis de esta hormona, siendo mayor en etapas

donde las células están en división, maduración ó senescencia (Burg y Burg

1968).

Producción de etileno por Azospirillum

Existe muy poca información disponible, relacionada a la producción de

etileno por Azospirillum y su efecto sobre el crecimiento vegetal. Trabajos de

Primrose and Dilworth (1976) determinaron la capacidad de bacterias promotoras

del crecimiento vegetal de vida libre, Azotobacter y Bacillus de producir etileno

en medio de cultivo químicamente definido y esto fue un catalizador para que



Strzelczyk et al. (1994) testearan la capacidad de Azospirillum de producir este

compuesto in vitro sobre diferentes fuentes carbonadas. Sus resultados

determinaron que la bacteria podía sintetizar etileno y que la producción

dependía de la presencia de metionina en el medio de cultivo. Recientemente,

Krumpholz et al. (2006) evaluaron la respuesta de crecimiento de plántulas de

tomate inoculadas con Azospirillum brasilense FT326 (súper productora de

IAA), correlacionando el aumento significativo en el número y longitud de

raíces, con la producción vegetal de etileno de hasta 10 veces superiores a los

controles.

Los cambios morfológicos fueron acompañados de un aumento de actividad

de la ACC-sintasa, una de las enzimas clave de la ruta de síntesis de esta

hormona. Según Peck and Kende (1995), el paso limitante para la biosíntesis de

etileno es la conversión de la S-adenosilmetionina (SAM) a 1-

aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC), catalizada por la ACC sintasa. La

expresión y la actividad de esta enzima, así como la producción de etileno,

incrementan por la adición de AIA exógeno.

Algunos investigadores proponen un modelo en el que la capacidad de

algunas bacterias para promover el crecimiento vegetal sería indirecta y estaría

en relación directa a la expresión bacteriana de la enzima 1-aminociclopropano-

1-carboxilato deaminasa (ACC deaminasa). Esta enzima clave en metabolismo

del etileno, hidroliza el 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) que es

intermediario de la hormona activa (Glick, 1995). Bacterias que poseen esta

enzima pueden clivar el ACC a amonio y alfa-cetobutirato y prevenir la

acumulación de etileno y sus efectos tóxicos (Glick et al. 1998). A pesar de que

Azospirillum estimula el crecimiento de plantas, los miembros de este género no

producen ACC deaminasa, por lo que no pueden regular los niveles de etileno en

tejido vegetales. En este sentido Holguín and Glick (2001) comprobaron que la

transferencia del gen de la ACC deaminasa de Enterobacter cloacae en

Azospirillum brasilense resultó en una mejora considerable del crecimiento de la

planta inoculada.



Acido Abscísico

Es una hormona vegetal, involucrada diferentes procesos fisiológicos del

crecimiento y desarrollo de la planta, como la dormición de yemas y semillas, la

maduración de frutos y en situaciones de estrés ambiental desfavorables como

déficit hídricos o estrés salinos. El ácido abscísico (ABA) se forma en plastidios,

tanto de hoja como de raíz y su biosíntesis comienza a partir del ácido

mevalónico, vía farnesil farnesil pirofosfato (FFPP), dentro de lo que se conoce

globalmente como síntesis de los terpenos. La alternativa más aceptada de

continuación de la ruta metabólica es la síntesis de carotenoides y su posterior

clivaje para dar xantoxina y ABA. Este secuenciamiento opera en plantas

superiores, especialmente bajo condiciones de estrés hídrico y salino. El ABA

está relacionado con la capacidad de plantas superiores para adaptarse a

condiciones de estrés, a través de distintos procesos fisiológicos y moleculares

que incluyen: alteraciones en la expresión de genes relacionados con estrés

hídrico y cierre de estomas. Desde el punto de vista fisiológico, el ABA favorece

la economía del agua dentro de la planta, por su efecto regulador sobre la

apertura y cierre de estomas a nivel de las hojas (Davies, 1995); además participa

en la dormición de yemas y semillas; en la acumulación de proteínas de reserva

en semillas (soja); en la inhibición del crecimiento y germinación inducido por

auxinas y GAs; en la inhibición del crecimiento foliar en situaciones de estrés y

en la regulación de la síntesis proteica en respuestas de aclimatación a diferentes

tipo de estrés; sin embargo, todas estas funciones están relacionadas a un objetivo

común, la defensa del sistema vegetal en condiciones ambientales desfavorables.

Su valor fisiológico más importante ha sido relacionado con la sobrevivencia de

la planta y el control de la economía del agua, más que con incrementos de la

producción agrícola en sí (Davies and Jones, 1991). La respuesta central de la

planta a un déficit hídrico, tiene como resultado un incremento en la síntesis de

ABA endógeno, que provoca los efectos fisiológicos y bioquímicos antes

mencionados, que son indefectiblemente acompañados de cambios en la



expresión de genes, muchos de los cuales son regulados por esta hormona (Bray,

1993).

Bajo estas condiciones, las plantas requieren menos agua para su

funcionamiento y así sufren menor daño. Un aspecto de sumo interés en la

fisiología de esta hormona es que la apertura y cierre estomático en plantas

superiores, puede ser regulada a distancia por medio de señales químicas

provenientes de la raíz y el tallo, constituyendo la evidencia en tiempo real de la

disponibilidad hídrica del suelo

Producción de Ácido Abscísico por Azospirillum

Es muy escasa la información documentada sobre la identificación de ABA

en cultivos químicamente definidos de Azospirillum y su correlación al

crecimiento de la planta. La mayor parte de los ensayos fueron realizados en

sistemas de cultivos e inoculaciones de hongos y bacterias fitopatogénicas ó en

asociaciones simbióticas por bacterias nodulantes. Solo un trabajo reportó la

producción de ABA por A. brasilense Ft326 en medio de cultivo definido (Kolb

and Martin, 1985), sin embargo la identificación se realizó por RIA técnica poco

sensible, comparada con la de espectrometría de masas, que se utiliza en la

actualidad.

Interacción de fitohormonas producidas por

Azospirillum sp. y su efecto sobre el crecimiento del

sistema vegetal

El estudio de las interacciones entre las diferentes hormonas en los sistemas

vegetales ha emergido en la actualidad y en este caso, las fitohormonas

producidas por microorganismos endofíticos no quedan exceptuadas del análisis.

Fulchieri et al. (1993) encontraron que plántulas de maíz (Zea mays L.)

inoculadas con las 3 cepas de Azospirillum lipoferum mejoraron

significativamente el crecimiento de la raíz y de la parte aérea. En estos ensayos

GA3 fue identificada en la fracción ácida libre del extracto vegetal y estos

resultados permitieron especular sobre la capacidad bacteriana de incrementar in



vivo el pool de giberelinas con actividad biológica sobre el crecimiento vegetal

en las raices de plantas inoculadas.

Ross and O´Neill (2001) sugieren que las auxinas podrían promover, al menos en

parte, la elongación del tallo por incrementar los niveles de endógenos de

giberelinas 3ß-hidroxiladas, lo cual podría tener relación directa con los

resultados obtenidos por Fulchieri et al. (1993) ya que ni el contenido endógeno

de IAA ni la expresión de los genes que codifican para 3ß-hidroxilasas fueron

cuantificados en las fracciones correspondientes. Otro factor a considerar sería

que por lo menos dos de las cepas utilizadas para la inoculación (A. lipoferum Op

33, A. lipoferum iaa 320) eran productoras de AIA lo que permitiría especular,

que al menos en parte, el aumento en el contenido endógeno de GA3 en la raíz

podría deberse al cross-talk del AIA sobre el pool de GAs de la raíz y que parte

de la respuesta del crecimiento observado en parte aérea y subterránea se debería

al efecto de las GAs producidas por las diferentes cepas de Azospirillum

lipoferum ó por las GAs producidas por las plántulas inducidas por el AIA

bacteriano, como describen Yaxley et al (2001); Como mencionamos

anteriormente, Krumpholz et al. (2006) han evaluado la respuesta de crecimiento

de plántulas de tomate inoculadas con Azospirillum brasilense FT326

(súperproductora de IAA), correlacionando el fenotipo vegetal con la producción

vegetal de etileno. El aumento en la producción de etileno fue significativamente

superior a los controles y los cambios morfológicos fueron acompañados de un

aumento de actividad de la ACC-sintetasa tisular. De acuerdo con Peck and

Kende (1995), el paso limitante para la biosíntesis de etileno es la conversión de

la Sadenosilmetionina (SAM) a 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico

(ACC), catalizada por la ACC sintetasa y la expresión como la actividad de esta

enzima, así como la producción de etileno, incrementa por la adición de AIA

exógeno. Estos antecedentes indicarían que el aumento de etileno, al menos en

parte de debería a un cross-talk entre el AIA producido por la bacteria en la vía

de sintesis del etileno como sugieren Rahman et al. (2002).



I. Aplicación:

Algunas compañías en diferentes países han registrado inoculantes

de Azospirillum para maíz y otros cultivos. Burdman y col. refieren que

en Sudáfrica se lleva a cabo la producción de inoculantes a base



de Azospirillum para 150,000 hectáreas de maíz y 12,000 de trigo.

Algunas características de la producción de inoculantes a base

de Azospirillum han sido discutidas.

Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del

crecimiento de las plantas no se ha generalizado mundialmente, en

México la aplicación de ésta bacteria en diferentes cultivos ha rebasado

con mucho lo hecho en otros países. En el ciclo agrícola primavera-

verano (PV) del año 1999 la Secretaría de Agricultura, a través de su

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias

(INIFAP) y de la Fundación Mexicana para la Investigación

Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboración con el Centro de

Investigación sobre Fijación de Nitrógeno-UNAM, llevó a cabo la

inoculación de alrededor de 450,000 hectáreas de maíz y 150,000

hectáreas de sorgo, cebada y trigo, empleando cepas

de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para promover el

crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los cultivos.

La evaluación del rendimiento de grano en alrededor de 675

hectáreas de los diversos cultivos, que comprendieron cerca de 170

sitios de México con características edáficas en regiones climáticas

diferentes mostró el éxito de la inoculación en el rango de 62 a 95% de

los casos analizados, con incrementos que fluctuaron en el rango de 6 a

98%. El incremento promedio en la producción de los cultivos de maíz,

trigo, cebada y sorgo bajo las diferentes condiciones evaluadas fue del

26%. Los resultados fueron dependientes de la variedad y cultivo, tipo

de suelo, uso y nivel de fertilizantes. La mejor respuesta a la

inoculación se presentó en suelos de tipo ligero (arenosos), con niveles

intermedios de fertilización en el rango de 45-90 Kg N/ha, y con las



variedades "criollas" de maíz. Considerando la cantidad de variedades,

cultivos, suelos y condiciones climáticas evaluadas, los resultados de la

inoculación con Azospirillum reflejan claramente la capacidad de la

bacteria para promover el desarrollo de las plantas y el impacto

positivo sobre el rendimiento de los cultivos de grano.

El temor o las precauciones expresadas en algunas revisiones sobre

el tema, por cierto muy escasas, para extender el uso de Azospirillum a

niveles comerciales debido a la "inconsistencia de la inoculación"

tienen poco valor ante los resultados de producción obtenidos en

decenas de experimentos, así como los obtenidos en miles de hectáreas

con diferentes cultivos, variedades y condiciones edáficas y climáticas.

Aún en la actualidad hacen falta muchos estudios de investigación

básica, tanto sobre la bacteria como en su interacción con la planta,

para un mejor entendimiento de la asociación Azospirillum-planta. No

obstante, en mi opinión, la aplicación de Azospirillum como

bioestimulante que incrementa la producción de los cultivos deberia

extenderse a todos aquéllos lugares donde la aplicación de fertilizantes

es nula o escasa, como lamentablemente ocurre en no pocos países que

tienen una agricultura subdesarrollada. En las regiones donde se

practica una agricultura moderna, la inoculación

con Azospirillum permitiría reducir las elevadas cantidades de

fertilizantes que generalmente se aplican y con ello disminuir tanto el

costo de producción como los problemas derivados de su uso,

principalmente la contaminación, sin detrimento de la producción.



III. Conclusiones:

El genero Azospirillum: es una proteobactria, Gram negativa que utiliza

como fuente nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, aminoácidos

y nitrógeno molecular.

Azospirillum es capas de sintetizar fitohormonas: como auxinas,

citosinas, ABA. Las cuales ayudan al crecimiento y mejoramiento de la

calidad de la planta.

Esta bacteria puede crecer en la rizosfera o en el interior de las raíces.

En la rizosfera actúa como in regulador de fitopatogenos pues, inhibe el

crecimiento de hongos fitopatogenos y bacterias.

Mejora el crecimiento de las plantas, pues un cultivo inoculado con

Azospirillum spp tiene mejores resultados que otro fertilizado

químicamente.

El genero Azospirillum esta conformado por: A. lipoferum, A.

brasilienses, A. amazonense, A. halopraederans. Estos son utilizados

como importantes biofertilizantes de suelos desgastados y con baja

concentración de nitrógeno.

IV. Bibliografía:

Br. Baiocchi Torres Alberto Alejandro. Br. Saavedra Barreto Ángel Pedro.

Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp. Y su efecto como

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