Bacillus sporothermodurans anaeróbicos facultativos aislados de leches UHT elaboradas en Colombia

Ivonne Bernier P 1, Eliana Cárdena F2, Oscar A Piñeros3

1,2,3 IVONNE BERNIER LABORATORIO LTD, Calle 49 No. 70C - 31, Bogotá – Colombia. (571) 416 63 01

direcciontecnica@iblaboratorio.com Resumen

En diferentes estudios realizados, Bacillus sporothermodurans ha sido caracterizado fenotípicamente como un microorganismo aerobio estricto. Sin embargo, IBLAB, al realizar la prueba de esterilidad comercial de leches UHT producidas en Colombia, siguiendo la Norma NTC 4433, en la que se inoculan medios de cultivo en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis a diferentes temperaturas (35±2°C y 55±2°C), ha obtenido crecimientos atípicos de este microorganismo en ausencia de oxígeno, evidenciando que este bacilo no sólo puede crecer como aerobio estricto sino también como anaerobio facultativo. Para confirmar el crecimiento anaerobio, se realizaron siembras en agar infusión cerebro corazón (BHI) suplementado de vitamina B12, las cuales fueron incubados en las mismas condiciones iniciales (anaeróbicas). Se observaron las características microscópicas de las cepas aisladas en la muestra 87020 y confirmadas por tinción de Gram y pruebas bioquímicas. Para la confirmación del microorganismo se utilizó la técnica de PCR tradicional con base a la identificación del gen 16S ribosomal y posterior secuenciación. El análisis filogenético demostró un 99% de identidad con otras cepas de B.sporothermodurans. Estos análisis confirmaron la presencia de Bacillus sporothermodurans anaeróbicos facultativos en las muestras de leche UHT analizadas.

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ABSTRACT In different studies, Bacillus sporothermodurans has been characterized

phenotypically as a strict aerobic organism. However, IBLAB, while doing test of commercial sterility of UHT milk produced in Colombia, following the Standard NTC 4433, in which culture media inoculated in aerobic and anaerobic conditions at different temperatures (35 ± 2 ° C and 55 ± 2 ° C) obtained atypical growth of this organism in the absence of oxygen, showing that this bacillus can grow as not only an aerobic strictly but also anaerobic optional. To confirm the anaerobic growth, were plated on brain heart infusion agar (BHI) supplemented vitamin B12, which were incubated in the same initial conditions (anaerobic). There were microscopic features of the strains in the sample 87020 and confirmed by Gram staining and biochemical tests. For confirmation of the organism was used traditional PCR-based identification of 16S ribosomal gene and subsequent sequencing. Phylogenetic analysis showed a 99% identity with other strains of B.sporothermodurans. These analyzes confirmed the presence of facultative anaerobic Bacillus sporothermodurans in UHT milk samples analyzed.

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I- Introducción

En Colombia la actividad ganadera ha sido estimada en 25 millones de cabezas en 2010 con una producción anual de 6.600 millones de litros de leche y aproximadamente 3 millones de litros de leche corresponden a leche pasteurizada y leches UHT, equivalente al 46% de la producción total según FEDEGAN1.

Ocasionalmente se presenta

deterioro por microrganismos resistentes a las altas temperaturas, como resultado de contaminación durante operaciones de llenado. Algunos géneros presentes corresponden a Bacillus badius, Bacillus cereus, Bacillus licheniformes, Bacillus polymixa, Bacillus subtilis y Bacillus stearothermophilus, identificados como causantes de este deterioro (Petterson et al., 1996). Bacillus sporothermodurans (BS) es una bacteria Gram positiva, descrita inicialmente por Petterson et al., (1996) produce esporas altamente resistentes al calor que pueden sobrevivir en las leches UHT a temperaturas entre 135 a 142 °C por unos pocos segundos. Varios autores como (Foschino et al., 1990, Hammer et al., 1995a, 1995b, Klijn et al., 1997) han descrito a este microrganismos como una bacteria aerobia mesófila. Esta bacteria es considerada no patógena (Hammer et al., 1996) y es mejor caracterizada de forma fenotípica mediante secuenciación del gen 16S rRNA y técnicas moleculares (Pettersen et al., 1996) quien demostró la ocurrencia de 2 tipos diferentes de B sporothermodurans. Aun cuando estos dos tipos difieren fenotípicamente y genotípicamente de acuerdo con las

1

http://portal.fedegan.org.co/pls/portal/docs/PAGE/FNG_PORTAL/PG_SERVICIOS/COYUNTURA_LECHERA1/LO_QUE_USTED_NECESITA_SABER_CARTILLA.PDF

descripciones de Klijn el al 1997. Estudios de laboratorio han demostrado que la ingestión de BS (+) en leches, en animales o incluso en seres humanos no se ha observado efectos patógenos; es posible que los BS puedan llegar a enmascarar a otros bacilos que pueden ser potencialmente patógenos. Todos los métodos de caracterización fenotípica y genotípica son aplicados sobre cultivos puros y la amplificación por técnicas de PCR (Reacción de la Cadena de Polimerasa), ofrece la oportunidad de realizar la identificación específica del microrganismo (Scheldeman et al., 2012).

Entre los años 2010 y 2011 se ha

incrementado la incidencia de leches UHT con prueba de esterilidad comercial con resultados no satisfactorios, razón por la cual se realizó la siguiente investigación identificando los grupos de microorganismos presentes en las muestras rechazadas encontrándose diferentes especies de cocos y bacilos Gram positivos como flora contaminante aerobia y anaerobia, mesófilas y termófilas. La presencia de estos bacilos en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis facultativa, procedentes de leches UHT incubadas durante 10 días a diferentes temperaturas (NTC 4433 Método para evaluar la esterilidad comercial en alimentos); indica que el producto no cumple con la prueba de esterilidad comercial “Satisfactoria” para ser comercializada como apta para consumo humano de acuerdo con la especificación del Decreto 616 de 2006 (en estudio), situación crítica ya que las leches no Satisfactorias son decomisadas y descartadas.

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II- MATERIALES Y METODOS

Muestras de leche UHT: Se analizaron 510 muestras de leche UHT de 5 marcas comerciales de venta a nivel nacional, para análisis inicial de esterilidad comercial de acuerdo con la Norma NTC 4433.

Prueba de esterilidad comercial -

NTC 4433. Para la prueba de esterilidad de las leches UHT se tomaron al azar 2 unidades del mismo lote de leche UHT. Uno de los envases se incubó a 35°C±2°C y el otro a 55°C±2°C durante 10 días. Luego se inocularon asépticamente 2 mL de leche UHT en cada uno de los 12 tubos conteniendo caldo BHI al 0,1% de almidón. Seis (6) tubos se incubaron a 35°C±2°C, de los cuales tres (3) tubos se mantuvieron en condición aeróbica y los otros tres (3) en condición anaeróbica (jarra de anaerobiosis). Los seis (6) tubos restantes se incubaron a 55°C±2°C, tres (3) tubos en condición aeróbica y los otros tres (3) en condición anaeróbica (jarra de anaerobiosis).

Todos los tubos se incubaron por

72 horas y después se realizó un frotis de cada tubo. Se observó la microscopía y se determinó la ausencia o presencia de microorganismos en cada tubo. Ninguno de los tubos incubados en condiciones de aerobiosis o anaerobiosis puede dar turbidez (crecimiento) para que la prueba sea conceptuada como Satisfactoria.

Para la presente investigación a las

leches UHT que presentaron crecimiento en cualquiera de los tubos aerobios o anaerobios se les realizó aislamiento en agar plate count y agar BHI suplementado. Este agar se preparó a partir de caldo BHI (Oxoid) adicionado de agar al 15% y suplementado de vitamina B12 (1mg/L) con posterior incubación en

las condiciones de aerobiosis o anerobiosos iniciales.

Pruebas bioquímicas. La identificación de los

microorganismos crecidos en agar plate count se realizó mediante pruebas bioquímicas comerciales (BBL Crystal) y la identificación de los microorganismos crecidos en agar BHI suplementado se realizó con pruebas bioquímicas convencionales sugeridas por Montanari et al., 2004.

Cepas bacterianas y condiciones

de crecimiento. Para la comparación de las características fenotípicas se utilizaron cepas de Bacillus sporothermodurans DSMZ 10599 versus las cepas aisladas de las leches UHT en agar BHI. Para los cultivos en anaerobiosis se utilizó la jarra de anaerobiosis, anaerogen e indicador de anaerobiosis (Oxoid). Las cajas de petri se incubaron a 35°C±2 y a 55°C°±2°C por 48 horas.

Medios de cultivo: Todos los medios

de cultivo utilizados se sometieron a pruebas ecométricas de acuerdo con la ISO 11133-2 de 2006, obteniéndose como resultados un índice de crecimiento (IG) de 16 para medios sólidos, incluido el agar BHI preparado y una turbidez alta (nivel de 2) para medios líquidos, lo que indicó que todos los medios de cultivo preparados y evaluados cumplen con los requisitos de productividad y selectividad deseados. Los medios de cultivo utilizados corresponden a la casa comercial Oxoid.

Extracción de ADN: se realizaron

extracciones de DNA a partir de a) cultivos puros de presuntas colonias aisladas en agar BHI provenientes de la prueba de esterilidad no satisfactoria b) a partir de las leches incubadas por 20 horas y subcultivadas en caldo BHI y c) a partir de agar BHI de cultivos puros

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obtenidos por esporulación a 80 °C por 10 minutos. Las colonias provenientes de cultivos puros se inocularon en 200 µL de buffer de lisis, seguida de agitación por vórtex y posterior calentamiento a 92°C por 20 minutos y centrifugación por 5 minutos a 10000 rpm. Para las muestras subcultivadas en caldo BHI se tomó 1 mL de la muestra y se procedió de igual forma.

Primeros y condiciones PCR: los

siguientes primeros fueron utilizados BSPO-F2 (5′ ACGGCTCAACCGTGGAG 3′), localizado en la posición 589–605 y BSPO-R2 (5′ GTAACCTCGCGGTCTA 3′), localizado en la posición 1252–1237, amplifican el gen 16S rRNA específico de B.sporothermodurans, con un tamaño de 648 pares de bases (pb) (Scheldeman et al., 2002), 2 µL del ADN extraído de B.sporothermodurans se le añadió a 23 µL de una mezcla de 20 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM KCl, 3mM MgCl2, 0.2 mM de cada deoxynucleotide trifosfato, 1-2 U Taq DNA polymerasa y 20 pmoles de cada primer. Las condiciones del ciclo fueron descritas por Scheldeman et al 2002. Para la amplificación del gen 16S rRNA fue utilizado 27F AGAGTTTGATCMTGGCT CAG, 1492R TACGGYTACCTTGTTACG ACTT,518 FCAGCAGCCGCGGTAATAC G and 800R TACCAGGGTATCTAATCC, que amplifica el fragmento de 1465 bp (descrito por Macrogen, Korea). Cuatro (4) μL del producto de la PCR fue

analizado en 1,5% gel de agarosa (Bioline USA) y teñido con bromuro de etidio. Las muestras fueron corridas a 100 volts por 35 minutos y visualizadas en un transiluminador UVP (Upland, CA USA).

Secuenciación: los productos de

PCR se purificaron y se secuenciaron utilizando un secuenciador de DNA 3730XL (Applied Biosystems, California, USA). Dos (2) cepas recuperadas en este estudio y referenciadas como 87017 y 87020 (aeróbica y anaeróbica facultativa respectivamente), les fue secuenciado el gen completo 16S rRNA. Las secuencias se compararon con la base de datos del BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) y la base de datos del proyecto ribosomal (RDP).

Secuencia de nucleótidos y

análisis filogenético: múltiples secuencias de alineaciones y las matrices de análisis se calcularon utilizando el software DNAMAN. Los árboles filigenéticos fueron diseñados utilizando la versión 4.1 del software MEGA. Las distancias genéticas se calcularon utilizando el modelo de sustitución de nucleótidos de Tamura-Nei y los árboles se construyeron por el método de neighbor-joining con 10 000 repeticiones de bootstrap.

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II- RESULTADOS Microorganismos aislados de las

pruebas de esterilidad no satisfactorias

De las 510 muestras de leche

analizadas para la prueba de esterilidad

comercial, 144 muestras de leche UHT de diferentes presentaciones y marcas comerciales dieron resultados de prueba de esterilidad No satisfactoria, presentando crecimiento de diferentes grupos de bacterias termorresistentes. Tabla No. 1

Tabla No 1. Presencia en (%) de especies de bacterias termoresistentes en

leches UHT

Microorganismos Presencia

(%)

Lactococcus lactis 43,75

Gemella morbillorum 6,25

Staphylococcus simulans 6,25

Bacillus subtilis 12,5

Bacillus brevis 12,5

Bacillus spp 18,75

Setenta y cinco (75) muestras de

leche UHT, es decir el 52 % de las muestras analizadas presentaron crecimiento positivo en agar BHI y se confirmó la presencia de B sporothemodurans tanto por pruebas bioquímicas como por PCR

De las 75 muestras, treinta y tres (33) muestras desarrollaron el microorganismo en condiciones anaerobias facultativas (44%) y sólo en 9 muestras el crecimiento se presentó en condiciones aerobias estrictas (12%) Tabla No. 2.

Tabla No. 2 Tipos de crecimiento observados en aerobiosis y anaerobiosis

Crecimiento en tubos de esterilidad Comercial

Número

muestras

Bacilos Gram Positivos en filamentos

Bacilos Gram Positivos

individuales

Tubos aerobios a 35°C 9 9

Tubos aerobios y anaerobios a 35°C 30 30 30

Tubos aerobios a 35°C y tubos aerobios a 55°C 3 3 3

Morfología microscópica Sobre los aislamientos en agar BHI

bajo condiciones de aerobiosis y anerobiosis se observó que había 2 tipos de morfología de crecimiento diferentes: (1) de tipo aerobio, que corresponde a colonias mayores a 2 mm de diámetro,

de superficie brillante de color beige y rugosa con bordes difusos reducidos; y (2) el tipo anaeróbico correspondiente a colonias mayores a 3 mm de diámetro, de bordes liso de color beige, suaves, opaca. En la tinción de Gram las colonias aerobias se presentan como bacilos Gram positivos en cadenas

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largas o como filamentos largos (figura 1A), morfología similar a la del B. sporothermodurans DSMZ 10599 (figura 1B). En contraste las colonias

anaerobias se presentan como bacilos Gram positivos en cadenas más cortas o en células individuales (figura 1 C y D)

FIGURA 1

Fig 1. Bacillus sporothemodurans traits from aerobic and anaerobic culture, A) in UHT

milk (aerobic), B) pure culture from supplemented BHI agar (aerobic), C) UHT milk (anaerobic), D) pure culture from supplemented BHI agar (anaerobic).

Caracterización fisiológica Fisiológicamente las cepas aisladas

que crecieron en condición de aerobiosis fueron similares a la respuesta bioquímica de B sporothermodurans DSMZ 10599. Las características bioquímicas de las cepas aisladas bajo condiciones de anaerobiosis mostraron un crecimiento en 2 diferentes rangos de temperatura 35°±2°C y a 55°C°±2°C. Además ambas cepas aerobias y anaerobias mostraron el mismo comportamiento frente a la fermentación

de los azúcares (producción de ácido) y a no hidrolizar la úrea, la gelatina o almidón; todas las cepas analizadas fueron catalasa y oxidasa positiva. Sin embargo, las diferencias estaban presentes en el crecimiento a 55 °C y concentración de NaCl (7%), con cepas anaeróbicas que muestran un crecimiento variable a 53 °C y crecimiento variable a una concentración de cloruro de sodio al (7%) respectivamente. Tabla No. 3

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Tabla N°3. Características de B. sporothermodurans aislados en aerobiosis y anaerobiosis

Phenotypic profile

Results

B. sporothermodurans DSMZ 10599

Aerobic wild strains Anaerobic wild

strains

Cytology

Formation of filaments V V V

Individual bacilli V V +

Acid of

Cellobiose - - -

Fructose - - -

Galactose - - -

Glucose - - -

Mannitol - - -

Mannose - - -

Hydrolysis of:

Urea - - -

Gelatin - - -

Starch - - -

Growing conditions:

Strict aerobic + + -

Facultative anaerobic - - +

Growth at 53 ± 2 ° C - V V

Growth at 35 ± 2 ° C + + +

Growth at pH 5.8 + + +

Growth at pH 6.8 + + +

Others

Catalase + + +

Oxidase + + +

Citrate - - -

Growth in NaCl

0% + + +

2% + + +

5% + + +

7% - + V

Growth at

15°C + + +

20°C + + +

45°C + + +

53°C + - V

V= variability

Análisis molecular Los métodos moleculares

permitieron la confirmación de B.sporothermodurans en leches UHT. Los resultados de la PCR tradicional para el B sporothemodurans DSMZ 10599 cepa utilizada como control mostraron que las cepas aerobias y anaerobias

aisladas en el laboratorio presentan gran similitud con el gen 16S rRNA BSPO-F2 y BSPO-R2 primeros BSPO seleccionados para el estudio de genes específicos amplificados 16S rRNA para BS, la generación de una banda de 648 pares de bases (pb), que está al mismo nivel (tamaño) de la cepa referencia DSMZ 10599 utilizada en este estudio, confirmando así que las cepas aerobias y

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anaerobias facultativas corresponden a BS como inicialmente se identificaron por el método tradicional

El análisis comparativo de las secuencias de nucleótidos del gen 16S rRNA de 87017 y 87020 y las cepas diferentes de BS revelaron algunas diferencias en el gen VR principalmente en la regiones hipervariables VR1 y VR2. La cepa 87017 mostró una sustitución en el VR1, en la posición 84 (C→T). Tres sustituciones fueron detectadas en

ambas cepas en la región VR2 en las posiciones 448 (G → A), 471 (C → G), que han sido reconocidos como la región hipervariable entre los rRNAs de las diferentes cepas bacterianas (Fig. 2). En VR6 hubo una sustitución en la posición 1001 (A→C) en ambas cepas, y ninguna sustitución se observó en la región VR8 de ambas cepas estudiadas. Otras sustituciones se observaron en las cepas 87017 y 87020 en diferentes posiciones del gen (Fig. 2).

Análisis filogenético El análisis filogenético de la secuencia

del gen 16S rRNA de B.sporothermodurans (1465pb) a partir de 87017 y 87020 (cepas aerobias y anaerobia respectivamente) aisladas a partir de la prueba de esterilidad comercial, permitió agrupar a la cepa anaerobia con la cepa No.19, encontrándose una similitud del 99% a nivel nucleotídico (Fig 3). Las cepas de

BS (aerobia y anaerobia) fue más similar a la cepa SC-H.

Las cepas estudiadas de Bacillus sporothermodurans y de otras cepas cercanas genéticamente se agruparon en el mismo clado, y mostraron una similitud mayor al 94% en su gen 16S rRNA. El grado más alto de disimilitud que existe entre especies del género Bacillus es del 7% (Fig.3).

Fig. 2 Alineamiento de las regions variables (VR) of B. sporothermodurans strains of 16S rRNA gene.

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Fig.3 B.sporothermodurans árbol filogenético utilizando el método Neighbor-

joining y el modelo de sustitución Tamura-Nei. Las cepas analizadas en el estudio corresponden a la 87017 y 87020.

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DISCUSIÓN El sector lácteo se enfrenta aun

grave problema debido a la presencia de B sporothermodurans en la leche UHT, ya que su presencia cataloga al producto como NO SATISFACTORIO (Norma NTC 4433) y conduce a su decomiso. Esto se traduce en pérdidas económicas para los productores de leche que son los más afectados. Las pérdidas en el sector lácteo por el decomiso y descarte de las leches consideradas No Satisfactorias tienen un impacto económico en los productores de leche, que son conscientes que la presencia de este bacilo puede reducir la vida útil del producto, aunque el microrganismo es considerado como no patógeno para los seres humanos, puede reducir la calidad de la leche debido a la supervivencia de las esporas al proceso de esterilización comercial (Scheldeman et al., 2005, Pettersson et al. 1996; Herman et al. 1998, Vaerewijck et al., 2001). La presencia de diferentes grupos de bacterias termorresistentes en la leche UHT, indica que existe más de una fuente de contaminación que debe estudiarse, con el fin de determinar dosis apropiadas de choque de desinfectantes para eliminar este microorganismo (Scheldeman et al., 2005).

La prueba de esterilidad comercial

realizada con la NTC 4433 que aunque no es específica para realizar la prueba de esterilidad comercial en leche UHT, permite claramente identificar si los bacilos presentes crecen de forma aerobia o de forma anaerobia, la desventaja de esta técnica es que dura 10 días la incubación, 3 días la siembra en caldo BHI, 48 horas la siembra en agar BHI y 72 horas a 7 días las pruebas bioquímicas para su identificación, para un total de 18 a 23 días.

Por otro lado los métodos moleculares utilizando el gen 16S ARNr, reducen el tiempo de respuesta de 23 días a 48 horas. Gray y col. 1984 destacó que la región variable VR2 donde se concentra el mayor número de diferencias de nucleótidos entre 440-496 pb y forma una estructura de lazo y horquilla, y con VR1 del gen 16S que concentra un mayor número de nucleótidos.

En las cepas 87017 y 87020 se

encontraron ciertas sustituciones en dichas regiones (VR1, VR2 y VR6) y en otras partes del gen se encontraron que pueden ser los responsables del control del fenotipo del microrganismo.

Para concluir, la detección temprana

de BS, mediante la incubación de la leche durante 40 horas es una alternativa viable de la detección, pero para que sea concluyente falta realizar más ensayos de laboratorio para que la prueba sea aprobada como oficial para la detección de este microorganismo; igualmente se deben realizar estudios de la presencia de este microorganismo en las leches crudas en las diferentes regiones del país. Igualmente se hace necesario estudios que identifiquen el gen que confiere la resistencia al calor.

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AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a la junta

directiva y al equipo de microbiología de IBLAB, por el patrocinio y colaboración en la realización del presente estudio.

Igualmente a Corpogen, y en especial

al Dr, Walter Ocampo por los aportes en la revisión del documento

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