Upload
others
View
3
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
OPTIMALISATIE EN VALIDATIE VAN
MEERDERE REAL-TIME PCRS VOOR
DE DETECTIE EN DISCRIMINATIE
VAN BARTONELLA HENSELAE EN
BARTONELLA QUINTANA
Aantal woorden: 27.941
Lisa Van Reeth Stamnummer: 01270050
Promotor: Prof. dr. A. Van Landschoot
Copromotoren: Dr. M. Reynders
Dr. sc. P. Descheemaeker
Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de richting Master of Science
in de industriële wetenschappen: biochemie
Academiejaar: 2016 - 2017
OPTIMALISATIE EN VALIDATIE VAN
MEERDERE REAL-TIME PCRS VOOR
DE DETECTIE EN DISCRIMINATIE
VAN BARTONELLA HENSELAE EN
BARTONELLA QUINTANA
Aantal woorden: 27.941
Lisa Van Reeth Stamnummer: 01270050
Promotor: Prof. dr. A. Van Landschoot
Copromotoren: Dr. M. Reynders
Dr. sc. P. Descheemaeker
Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de richting Master of Science
in de industriële wetenschappen: biochemie
Academiejaar: 2016 - 2017
“De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
“The author and the promoters give the permission to use this thesis for consultation and to
copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more
specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis.”
9 juni 2017
Auteur
Lisa Van Reeth
Copromotor
Dr. sc. P. Descheemaeker
Promotor
Prof. dr. A. Van Landschoot
Copromotor
Dr. M. Reynders
Voorwoord
Vanaf het begin, toen de aard van dit onderzoek werd geschetst, werd mijn interesse in het
moleculair werk meteen opgewekt. De afgelegde weg heb ik als zeer leerrijk en boeiend
ervaren. Enkele mensen speelden een cruciale rol gedurende het volledige proces, door mij
keer op keer zowel emotioneel als mentaal bij te staan. Graag zou ik van de gelegenheid
gebruik willen maken om hen te bedanken.
In de eerste plaats dr. sc. Patrick Descheemaeker, wiens inzicht en raadgevingen dit werk tot
een goed einde hebben gebracht. Hij begeleidde mij in het AZ Sint-Jan te Brugge en ik kon
telkens op hem rekenen als ik een probleem had.
Ook dank aan mijn interne promotor prof. dr. Anita Van Landschoot voor de vele aanwijzingen
en hulp bij het vervolledigen van deze masterproef.
Hartelijk dank aan dr. Marijke Reynders die, als onuitputtelijke bron van kennis en
enthousiasme, het mogelijk maakte om dit thesisonderzoek uit te voeren. Bedankt ook aan de
mensen van het labo moleculaire diagnostiek, met name Thomas Van Landschoot, Laurien
Hoornaert, Sofie Maton, Ellen Van Neder, Charlotte Vercamer en Rani Goderis, die veel tips
gaven en geduld hadden om een nieuweling op te leiden. Iedere dag zorgden ze voor een
goede sfeer tijdens het praktisch werk en stelden ze mij op mijn gemak door hun vriendelijkheid
en behulpzaamheid.
Tot slot wil ik mijn ouders, familie en vrienden bedanken om mij te steunen tijdens het volledige
proces. Ze geloofden in mij en hadden veel geduld en begrip maar gaven mij vooral de moed
om tot het uiterste te gaan. Ze hebben elk op hun manier een steentje bijgedragen aan het
eindresultaat.
Abstract
Bartonellose wordt veroorzaakt door Bartonella species en kent een wereldwijde verspreiding.
De kattenkrabziekte of cat scratch disease is de meest voorkomende ziekte en wordt
veroorzaakt door Bartonella henselae. Het typisch humane ziektebeeld bestaat uit huidletsels
en lymfadenopathie, maar er kunnen zich ook atypische ziektebeelden voordoen met een
waaier aan symptomen. Een ander species is Bartonella quintana die de verwekker is van de
loopgravenkoorts of trench fever. Er bestaat zowel een acute als chronische vorm van de
ziekte. Vroegtijdige vaststelling aan de hand van serologische testen blijft voor beide species
een uitdaging.
Het doel van dit onderzoek is het ontwikkelen en valideren van een in-huis dual-target detectie-
en differentiatiemethode aan de hand van een multiplex real-time polymerase chain reaction.
Initieel worden functionaliteit en specificiteit van in silico ontwikkelde primers geëvalueerd
a.d.h.v. smeltcurveanalyse met de SYBR® Select Mastermix en vervolgens worden de
bijkomende probes geëvalueerd in een real-time PCR met de TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix. Met oog op hogere detectiesnelheid wordt de gevoeligste en meest specifieke
multiplexsamenstelling per organisme geselecteerd en onderworpen aan een validatieplan. In
dit onderzoek werd geopteerd om twee duplex RT-PCRs toe te passen, nl. een generische
PCR voor de genus-specifieke Bartonella detectie op basis van het 16S rRNA gen
gecombineerd met Phocine herpesvirus-1 als interne extractie- en amplificatiecontrole en een
species-specifieke PCR voor de differentiatie tussen de twee meest voorkomende species B.
henselae en B. quintana op basis van de respectievelijke targetgenen pap31 en yopP.
Uit de validatie kon geconcludeerd worden dat een correcte staalname van uitermate groot
belang is, en het meest gevoelige staaltype voor Bartonella selectie door middel van
moleculaire techniek bleek klierbioptie of abcespunctaat te betreffen, idealiter in e-
swabmedium (Liquid Amies). Zeer etterige stalen kunnen resulteren in een iets lagere
gevoeligheid van de species-specifieke test terwijl de generische test gebaseerd op 16S rRNA
gen gevoeliger blijft. Beide duplex PCRs samen geven aldus aanleiding tot een goede
Bartonella diagnose met simultane speciesconfirmatie. Aanvullend confirmeerde 16S rRNA
sequentieanalyse de correcte speciesidentificatie.
Kernwoorden: Bartonella spp., real-time polymerase chain reaction, validatie, typering
English abstract
Bartonellosis is caused by Bartonella species and is spread worldwide. Cat scratch disease is
the most common disease and is caused by Bartonella henselae. The typical human symptoms
are skin lesions and lymphadenopathy, but atypical symptoms with clinical variation may also
occur. Another species is Bartonella quintana which is the cause of trench fever that occurs
both in an acute and chronic form. Early diagnosis with serological testing remains a challenge
for detection of both species.
The purpose of this research is to develop and validate an in-house dual-target detection and
differentiation method using a multiplex real-time polymerase chain reaction. Initially,
functionality and specificity of in silico developed primers are evaluated with the SYBR® Select
Mastermix for a melting curve analysis and subsequently the additional probes are evaluated
in a real-time PCR using the TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. To achieve higher
detection rates, the most sensitive and most specific multiplex composition for each organism
is selected and validated according to plan. In this study, two duplex RT-PCRs were used, i.e.
a generic PCR for the genus-specific Bartonella detection based on the 16S rRNA gene
combined with Phocine herpesvirus-1 as internal extraction and amplification control and a
species-specific PCR for the differentiation between the most common species B. henselae
and B. Quintana based on the respective target genes pap31 and yopP.
From the results of the validation, it could be concluded that correct sampling is of utmost
importance and the most sensitive sample type appeared to be a ganglion biopsy or punction,
preferentially in e-swab medium (Liquid Amies). Samples with a lot of pus may result in a
slightly lower sensitivity of the species-specific test while the generic assay based on 16S rRNA
gene stays more sensitive. Both duplex PCRs cause a good Bartonella diagnosis with
simultaneous species confirmation. In addition, 16S rRNA sequence analysis confirmed the
correct species identification.
Keywords: Bartonella spp., real-time polymerase chain reaction, validation, typing
8
Inhoudsopgave Inleiding ................................................................................................................................14
1. Bartonella species .........................................................................................................15
1.1. Classificatie ............................................................................................................15
2. Bartonella henselae .......................................................................................................16
2.1. Kenmerken en eigenschappen ...............................................................................16
2.2. Epidemiologie .........................................................................................................18
2.3. Humaan ziektebeeld ...............................................................................................20
2.4. Behandeling en preventie .......................................................................................23
3. Bartonella quintana .......................................................................................................24
3.1. Kernmerken en eigenschappen ..............................................................................24
3.2. Epidemiologie .........................................................................................................25
3.3. Pathogenese ..........................................................................................................26
3.4. Therapie .................................................................................................................26
4. Moleculaire diagnostiek .................................................................................................28
4.1. Polymerase chain reaction .....................................................................................28
4.2. Real-time PCR .......................................................................................................29
4.2.1. Primers en probes ...........................................................................................30
4.2.2. Principe van fluorescentie ...............................................................................31
4.2.3. Niet-specifieke labels ......................................................................................32
4.2.4. Specifiek gelabelde probes .............................................................................33
4.2.5. Fluorescentie detectie .....................................................................................35
4.2.6. Interpretatie ruwe data ....................................................................................36
4.3. Sanger sequencing ................................................................................................38
4.3.1. 16S rRNA sequenering ...................................................................................39
5. Materiaal en methoden ..................................................................................................40
5.1. AmpliRun® Bartonella DNA-controles .....................................................................40
5.2. Extractieprotocol ....................................................................................................40
5.3. Ontwikkeling van specifieke primers en probes ......................................................40
5.4. Klinische stalen ......................................................................................................42
5.5. Real-time PCR .......................................................................................................42
5.5.1. SYBR® Select Mastermix ................................................................................42
5.5.2. TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix ............................................................43
5.6. Validatiecriteria .......................................................................................................46
5.6.1. Limit of detection (LOD) ..................................................................................46
5.6.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid .......................................................46
9
5.6.3. Juistheid ..........................................................................................................46
5.6.4. Interferentiestudie ...........................................................................................47
5.6.5. Bewaarcondities monstermateriaal ..................................................................48
5.7. Sanger sequencing ................................................................................................48
5.7.1. PCR-amplificatie .............................................................................................49
5.7.2. Agarosegelelektroforese .................................................................................50
5.7.3. DNA-sequentiebepaling ..................................................................................51
6. Resultaten en bespreking ..............................................................................................53
6.1. Selectie primers en probes .....................................................................................53
6.1.1. Bartonella spp. ................................................................................................53
6.1.2. Bartonella quintana .........................................................................................53
6.1.3. Bartonella henselae.........................................................................................53
6.2. Optimalisatie primers en probes aan de hand van uniplex PCR .............................53
6.2.1. Functionaliteit primers .....................................................................................53
6.2.2. PCR-efficiëntie ................................................................................................55
6.2.3. Smeltcurveanalyse ..........................................................................................57
6.2.4. Specificiteitscontrole........................................................................................58
6.2.5. Functionaliteit probe ........................................................................................59
6.2.6. Specificiteit probe ............................................................................................61
6.2.7. Primer/probeselectie .......................................................................................62
6.3. Multiplex PCR ........................................................................................................63
6.3.1. Efficiëntievergelijking .......................................................................................63
6.4. Validatie duplex PT-PCR ........................................................................................64
6.4.1. Limit of detection (LOD) ..................................................................................64
6.4.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid .......................................................65
6.4.3. Juistheid ..........................................................................................................67
6.4.4. Klinische stalen ...............................................................................................68
6.4.5. Specificiteit ......................................................................................................69
6.4.6. Bewaarcondities monstermateriaal ..................................................................70
6.5. Sanger sequencing ................................................................................................70
6.5.1. Identificatie m.b.v. 16S rRNA sequenering ......................................................71
Algemeen besluit ..................................................................................................................73
Bibliografische lijst ................................................................................................................75
Bijlagen ................................................................................................................................81
10
Lijst met afkortingen
A Adenine
BHQ Black-hole quencher
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
Bp Basenparen
C Cytosine
CCD Charge-coupled device
CT Threshold cycle
DNA Desoxyribonucleïnezuur
dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat
dsDNA Dubbelstrengig DNA (double-stranded DNA)
ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
FRET Fluorescence resonance energy transfer
G Guanine
Hbp Hemin-bindende proteïnen
IFA Immunofluorescence assay
IgG Immunoglobuline G
IgM Immunoglobuline M
MGB Minor groove binder
NCBI National Center for Biotechnology Information
NFQ Nonfluorescent quencher
PCR Polymerase chain reaction
PhHV-1 Phocine herpesvirus-1
QCMD Quality Control for Molecular Diagnostics
qPCR Quantitative polymerase chain reaction
RBC Rode bloedcel
RFU Relatieve fluorescentie-eenheid
Rn Normalized reporter
RNA Ribonucleïnezuur
Rnase Ribonuclease
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
SHV Seal Herpesvirus
ssDNA Enkelstrengig DNA (single-stranded DNA)
T Thymine
Tm Smelttemperatuur (melting temperature)
UNG Uracil N-glycosylase
ΔG Gibbsvrije energie
11
Lijst met figuren
Figuur 1: Fylogenetische boom van de belangrijkste en meest bekende Bartonella species.
Figuur 2: Verloop van bartonellose in zoogdier als reservoirgastheer.
Figuur 3: Relatie tussen het voorkomen van B. henselae in katten en ouderdom van de kat.
Figuur 4: Klassieke symptomen van kattenkrabziekte bij de mens.
Figuur 5: Seropositiviteit (IgM en IgG) in relatie tot duur van het ziektebeeld veroorzaakt door
B. henselae bepaalt met (a) immunofluorescence assay (IFA) en (b) Enzyme-Linked Immuno
Sorbent Assay (ELISA) (n=44).
Figuur 6: Pediculus humanus corporis, de lichaamsluis (x120).
Figuur 7: Principe van polymerase chain reaction.
Figuur 8: Principe van fluorescentie (Thermo Fisher Scientific, 2015b).
Figuur 9: Werking SYBR® Green I (Global Health, 2014).
Figuur 10: Smeltcurven met bijhorende smeltpieken.
Figuur 11: Overzicht van de reporterdyes.
Figuur 12: Werking TaqMan® probe.
Figuur 13: Schematische weergave werking charge-coupled device (CCD) camera.
Figuur 14: Amplificatie plot met bijhorende termen.
Figuur 15: Voorstelling dNTPs en ddNTPs.
Figuur 16: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix uitgevoerd op
het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).
Figuur 17: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix
uitgevoerd op het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).
Figuur 18: Schematisch overzicht van de stappen die werden gevolgd volgens de reeds
beschreven SOP om het 774 bp fragment van het 16S rRNA gen van stalen te sequeneren en
het betrokken micro-organisme te identificeren.
Figuur 19: Amplificatie plot van alle primerparen na toepassing van SYBR® Select Mastermix
op Vircell AmpliRun® Bartonella quintana.
Figuur 20: Amplificatie plot van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix
op zesvoudige verdunning van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae.
Figuur 21: Smeltcurve van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix op
zesvoudige verdunning van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae.
Figuur 22: Verschil tussen de amplificatie plot van 16S rRNA gene op mix 1 en 3 en positieve
Vircellcontrole.
Figuur 23: Multicomponent plot van de target 16S rRNA gene op de positieve Vircellcontrole,
negatieve controle en bacteriële mix 1-3.
Figuur 24: Verschil tussen de amplificatie plot en de multicomponent plot van beide duplex RT-
PCRs voor adenovirus en positieve controle Bartonella-plasmide (105).
Figuur 25: Controle PCR-amplificatie via agarosegelelektroforese.
Figuur 26: Het voorvallen van een dNTP-piek, grote roze piek, tijdens het sequeneren.
Figuur 27: Resultaat deel van het piekenpatroon van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae
DNA-controle na uitvoering op het softwareprogramma SeqMan Pro (DNAstar).
12
Lijst met tabellen
Tabel 1: Overzicht van de virulentiefactoren bij B. henselae, hun betekenis en omschrijving
van hun werking.
Tabel 2: Lijst van klinische abnormaliteiten veroorzaakt door B. henselae.
Tabel 3: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor primers.
Tabel 4: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor probes.
Tabel 5: Evaluatieparameters van RT-PCR.
Tabel 6: AmpliRun® Bartonella DNA-controles aangeschaft via de firma Vircell.
Tabel 7: Geselecteerde primers en probes specifiek voor de verschillende targetorganismen.
Tabel 8: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix.
Tabel 9: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix.
Tabel 10: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met 16S rRNA gene en SHV
met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix.
Tabel 11: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met yopP met pap31 met
TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix.
Tabel 12: Schema voor de verdunning van de mix gemaakt uit verschillende klinische stalen
positief voor B. henselae.
Tabel 13: De verschillende virussen en bacteriën die getest zijn om interferentie met de nieuwe
methode te onderzoeken.
Tabel 14: Overzicht timemanagement bewaarcondities voor validatie.
Tabel 15: Samenstelling van de AmpliTaq Gold PCR-mix voor één PCR-amplificatiereactie.
Tabel 16: Runprotocol om PCR-amplificatie uit te voeren met AmpliTaq Gold DNA polymerase.
Tabel 17: Runprotocol voor ExoSAP-IT voor de opzuivering van de PCR-producten.
Tabel 18: Samenstelling mastermix voor één sequentiereactie.
Tabel 19: Programma thermocycler voor de DNA-sequentiereactie.
Tabel 20: Efficiëntie van ieder primerpaar voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-
controle.
Tabel 21: CT-waarden en efficiëntie van de overgebleven primerparen, één voor ieder
organisme, op het Bartonella-plasmide.
Tabel 22: Efficiëntie van ieder primers/probe voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-
controle.
Tabel 23: Gemiddelde CT-waarden en efficiëntie van de primers/probe, één voor ieder
organisme, op het Bartonella-plasmide.
Tabel 24: Efficiëntie van zowel de duplex RT-PCRs als de primers/probe, één voor ieder
organisme uitgevoerd met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op het Bartonella-plasmide.
Tabel 25: Grove bepaling LOD.
Tabel 26: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bepaald a. d. h. v. de variatiecoëfficiënt
(%CV).
Tabel 27: Overzicht BLAST-analyse van de finale sequentie van de stalen en positieve
controle.
13
Tabel 28: Overzicht klinische monsters en DNA-extracten AZ Sint-Lucas (Gent) als
referentiemateriaal met het resultaat van zowel AZ Sint-Lucas (Gent) als de nieuwe methode
met de beide duplex RT-PCRs van AZ Sint-Jan te Brugge.
Tabel 29: Overzicht klinische stalen AZ Sint-Jan (Brugge) met klinische vaststelling en
respectievelijke conclusie van de beide duplex RT-PCRs.
Tabel 30: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op beide
Vircell AmpliRun® DNA-controle in tweevoud.
Tabel 31: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de
verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.
Tabel 32: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de
verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle.
Tabel 33: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select
Mastermix op bacteriële mixen.
Tabel 34: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.
Tabel 35: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle
en tweemaal op negatieve controle.
Tabel 36: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast
Virus 1-Step Mastermix op bacteriële mixen.
Tabel 37: CT-waarden voor de efficiëntieberekening van de duplex RT-PCRs.
Tabel 38: Ruwe data (CT-waarden) van de beide duplex RT-PCR voor de bepaling van
herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid.
Tabel 39: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute
waarde van het verschil in CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische
matrixen op de generische RT-PCR.
Tabel 40: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute
waarde van het verschil in CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische
matrixen op de species-specifieke RT-PCR.
Tabel 41: Ruwe data (CT-waarden) specificiteitscontrole van de beide duplex RT-PCRs met
TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op organismen aanwezig in klinische stalen en de
bacteriële mixen.
Tabel 42: Verder onderzoek voor de interferentiestudie op de bacteriële mixen, de bacteriële
culturen apart en het Human herpesvirus 6 (HHV-6).
Tabel 43: Resultaten CT-waarden onderzoek van de meest voorkomende bewaarcondities van
de staalflow binnen het AZ Sint-Jan te Brugge.
14
Inleiding
Bartonellose is een infectieziekte veroorzaakt door bacteriën van het geslacht Bartonella. De
bacterie kent een wereldwijde verspreiding en omvat een groot aantal species. Ze zijn elk op
zich, al dan niet accidenteel, veroorzakers van verschillende symptomen en ziektes bij zowel
mens als andere gastheren. De kattenkrabziekte, trench fever, de ziekte van Carrión,
endocarditis en lymfadenopathie zijn enkele voorbeelden van zo’n ziektes. Bartonella spp. zijn
facultatief intracellulaire bacteriën waarbij langdurige bacteriemie in hun reservoirgastheer
veelal het geval is. De bacteriële transmissie verloopt via een vector. Bij Bartonella spp. nemen
bloedzuigende insecten de rol van deze transmissie op zich (Jacomo et al., 2002; Müller et al.,
2016; Simard, 2015).
De kattenkrabziekte of cat scratch disease is veruit de meest voorkomende humane ziekte
gelinkt aan Bartonella, specifiek veroorzaakt door Bartonella henselae. Hoofdzakelijk worden
katten aangeduid als het reservoir voor de bacterie, zonder enige klinische en pathologische
aspecten te vertonen. Ook honden en hun vlooien, de kattenvlo, teken en andere
geleedpotigen kunnen een rol spelen in de epidemiologie. Huidletsels ter hoogte van de
handen en opzwellen van klieren zijn typische symptomen die gepaard gaan met de ziekte. Er
kunnen zich ook atypische ziektebeelden voordoen die sterkt variëren op klinisch vlak (Chomel
et al., 2006).
Bartonella quintana is een ander species van het overkoepelend geslacht Bartonella en is de
verwekker van de loopgravenkoorts of trench fever. Tot nog toe is enkel de mens aangeduid
als reservoir/gastheer voor deze bacterie. De lichaamsluis is aangewezen als vector voor de
transmissie van mens op mens. Er bestaat zowel een acute als chronische vorm van de ziekte,
elk met hun pathofysiologie (Rolain et al., 2004).
Vroegtijdig vaststellen van de ziekte blijft een uitdaging, maar door de ontwikkeling van
moleculaire detectiemethoden wordt de diagnose vergemakkelijkt. In het kader van deze
thesis werden moleculaire detectiemethodes voor de opsporing van B. henselae en B.
quintana gevalideerd en uitvoerig besproken. Het doel van het onderzoek is het ontwikkelen
van een brede en gevoelige in-huis methode voor het opsporen van Bartonella henselae en
Bartonella quintana in verschillende matrices.
De primers worden als eerste geoptimaliseerd met de SYBR® Select Mastermix. Daarna
worden de probes geoptimaliseerd en mogelijke samenstellingen uitgeprobeerd met de
TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. Uit deze resultaten zal de gevoeligste
multiplexsamenstelling per organisme geselecteerd worden. Tot slot wordt een
speciesconfirmatie van de bacterie uitgevoerd aan de hand van 16S rRNA sequenering.
Deze scriptie omvat verschillende hoofdstukken. Als eerste worden Bartonella spp., B.
henselae en B. quintana aangehaald waarbij een korte achtergrond wordt geschetst. Ook de
moleculaire methoden gehanteerd tijdens het praktisch werk worden nader toegelicht. In een
volgend hoofdstuk worden de gebuikte materialen en de gevolgde methoden behandeld.
Hierna volgen de resultaten van de optimalisatie, validatie en typering. Tot slot kan een
algemeen besluit gevormd worden betreffende de nieuw ontwikkelde methode.
15
1. Bartonella species
In volgend citaat van Robert Koch (1878) wordt vermeld dat er in normaal steriele sites geen
bacteriën gedetecteerd kunnen worden in gezonde personen of dieren. “I have, on many
occasions, examined normal blood and normal tissues using methods that ensure that such
organisms are not overlooked, and I have never, in a single instance, found bacteria. I therefore
conclude that bacteria do not occur in the blood or tissues of healthy animals or humans”.
Bartonella blijkt echter een uitzondering te zijn op deze regel. Er werden gevallen
waargenomen in zowel mensen als dieren zonder enige klinische symptomen waarbij
Bartonella toch aanwezig was. Voorbeelden zijn stammen van B. henselae en B. quintana die
in erythrocyten van respectievelijk katten en mensen werden teruggevonden (Jacomo et al.,
2002).
Bartonella species worden wereldwijd verspreid gevonden en sommigen van hen worden
gezien als opkomende en verontrustende (“emerging”) ziekteverwekkers. Mensen worden
grotendeels accidenteel besmet aangezien de bacterie vooral in reservoirgastheren zoals
honden en katten wordt teruggevonden. Dit zijn huisdieren die dicht bij de mens staan maar
die vaak zelf geen symptomen vertonen. Dit is een unieke eigenschap van Bartonella. De
bacteriën gebruiken een groot aantal zoogdieren als reservoirgastheren en diverse
geleedpotigen, zoals vlooien, luizen, mijten en teken, als vectoren (Jacomo et al., 2002; Müller
et al., 2016).
1.1. Classificatie
Alle Bartonella species zijn aeroob, Gramnegatief, facultatief intracellulair, staafvormige
bacteriën die zowel ziektes bij mens als dier veroorzaken. Ze behoren tot de klasse van de
alphaproteobacteria onder de orde Rhizobiales en tot de familie Bartonellaceae. Momenteel
zijn 31 soorten Bartonella beschreven waarvan ten minste 13 pathogeen zijn voor mensen
(Kaiser et al., 2011).
Figuur 1 geeft de fylogenese weer van de belangrijkste Bartonella spp. (Simard, 2015). Alle
species zijn nauw verwant met meer dan 98% homologe sequenties in het 16S rRNA en leiden
doorgaans tot aanhoudende en terugkerende bacteriemie (Jacomo et al., 2002). Hoofdzakelijk
zijn zoogdieren de reservoirgastheren en kan transmissie plaatsvinden door bloedzuigende
geleedpotigen. Incidentele besmetting kan door contact met de besmette geleedpotige, hun
uitwerpselen of met het besmette dier zelf. De twee meest prominente soorten in Europa zijn
Bartonella henselae, verwekker van de kattenkrabziekte, en Bartonella quintana, gekend voor
de loopgravenkoorts of 5-dagenkoorts (Müller et al., 2016). Daarom zullen deze twee species
uitvoerig besproken worden.
16
Figuur 1: Fylogenetische boom van de belangrijkste en meest bekende Bartonella species. Deze fylogenetische boom,
volgens Engel et al. (2011), is gebaseerd op de sequentie van 478 genoomgenen en vier house-keeping genes nl., rpoB, gltA,
ribC en groEL (aangepast uit Pulliainen & Dehio, 2012).
2. Bartonella henselae
Bartonella henselae is wereldwijd gekend als de verwekker van cat scratch disease of
kattenkrabziekte. In 1950 werd in Frankrijk de ziekte voor het eerst beschreven door Debré en
zijn collega’s maar pas in 1992 werd de bacterie, toen nog Rochalimaea henselae genoemd,
serologisch gelinkt aan de kattenkrabziekte. In dat jaar isoleerden Regnery et al. (1992) tot
tweemaal toe B. henselae uit het bloed van klinisch gezonde katten. Hierdoor werd snel een
link gelegd tussen het voorkomen van de ziekte en de kat als hoofdreservoir. Bij het toepassen
van immunofluorescence assay (IFA) werden door Regnery en zijn team antilichamen tegen
B. henselae gevonden in 88% van vermoedelijk geïnfecteerde patiënten. In 1993 isoleerden
Dolan et al. de verwekker van de ziekte uit de lymfeklieren van een patiënt (Chomel et al.,
2006; Margileth, 2000).
2.1. Kenmerken en eigenschappen
Pas in 1983 werd de bacterie voor het eerst microscopisch aangetoond. B. henselae behoort
tot de alphaproteobacteria en is een aerobe, oxidase-negatieve, traag groeiende, licht
gebogen, Gramnegatieve staaf. De gemiddelde lengte is 2 µm en 0,5-0,6 µm in breedte. De
bacterie beschikt niet over flagellen om zich voort te bewegen maar beschikt over pili die
bewegelijkheid verschaffen en aanhechting aan doelwitcellen mogelijk maken (Müller et al.,
2016). B. henselae heeft een onvolledige glycolyse waardoor glucose niet gebruikt kan worden
als energiebron. Ter compensatie worden aminozuren afgebroken om energie te verkrijgen
met verbruik van zuurstof en vorming van koolstofdioxide (Chenoweth et al., 2004). Het
17
kweken van de bacterie is niet eenvoudig ten gevolge van de traag groeiende eigenschap. Dit
bemoeilijkt het onderzoek (Margileth, 2000).
Binnen het species B. henselae worden minstens twee genotypen geïdentificeerd nl., Houston
1 en Marseille, elk dominant in een verschillende kattenpopulatie. Het eerste type wordt vooral
teruggevonden in Azië, vooral in Japan en de Filipijnen. Het voorkomen van het tweede type
is in Australië, het westen van de Verenigde Staten en West-Europa. Echter het
overheersende type kan ook variëren binnen eenzelfde kattenpopulatie. Zo zijn in Australië en
West-Europa het Marseille type dominant maar wordt ook het andere type frequent
gerapporteerd als oorzaak van kattenkrabziekte. Er wordt gesuggereerd dat stammen van het
type Houston 1 virulenter zijn voor de mens dan het Marseille type (Chomel et al., 2006). Van
Houston 1 zijn er twee stammen gedeponeerd in de ATTC-bank namelijk B. henselae Houston
1 ATCC 49882 en gemodificeerde Bartonella adhesine A-negatieve stam B. henselae Houston
1 ATCC 49882. Het Marseille genotype heeft enkel de referentiestam URLLY8 verkregen bij
het Instituut voor Medische Microbiologie en Infectiecontrole (Müller et al., 2016).
B. henselae scheidt verschillende virulentiefactoren af (Tabel 1) waardoor de bacterie
ziekteverwekkend wordt voor de mens. Deze helpen ook mee om te ontsnappen aan het
immuunsysteem van de gastheer. Anderzijds wordt de bacterie voorzien van nutriënten via de
gastheer. B. henselae beschikt over mechanismen om die bepaalde voedingsstoffen te
verkrijgen en zo zijn metabolisme in stand te houden (Pulliainen & Dehio, 2012).
Tabel 1: Overzicht van de virulentiefactoren bij B. henselae, hun betekenis en omschrijving van hun werking (Kaiser et
al., 2011; Pulliainen & Dehio, 2012; Simard, 2015).
Virulentiefactor Betekenis Omschrijving
BadA Bartonella adhesine
A
Onderdeel van de trimerische
autotransporter adhesines (TAA). Centrale
functie is adhesie aan gastheercellen.
Veroorzaken auto-aggregatie, binding aan
extracellulaire matrix en celoppervlak.
BepA-G Bartonella
effectorproteïne
BepC, BepF en BepG reorganiseren het
actinenetwerk waardoor de bacterie in
endotheelcel wordt opgenomen. BepA
inhibeert apoptose van endotheelcel.
Deformine Deformatiefactor Hydrofobe molecule betrokken bij de
invasie van RBC door het induceren van
kanalen in het membraan van RBC.
HbpB-E Hemine-bindende
proteïne B-E
Rol bij ijzerwinning.
IalA/ialB Invasiegeassocieerde
locusproteïne A en B
Buitenste membraancomponent betrokken
bij invasie van RBC. IalA is een nucleoside
fosfaathydrolase.
18
LPS Lipopolysaccharide Essentieel buitenste membraancomponent
met zeer lage endotoxiciteit. Zwakke
herkenning door toll-like receptor 4 (TLR4).
OMP43 Buitenste
membraanproteïne
Staat in voor de binding aan
endotheelcellen.
Pap31 Fibronectine-
bindende adhesine
Bindt BadA aan fibronectine en staat in
voor de ijzerwinning. Ook hemine-bindende
proteïne A (hbpA) genoemd.
Trw-T4SS complex Type IV
secretiesysteem
(T4SS)
Draagt bij tot de binding aan RBC en
endotheelcellen.
VirB/D4 T4SS Type IV
secretiesysteem
Zorgt voor de opname van de bacterie in
de endotheelcellen en remming van
apoptose van de endotheelcellen.
2.2. Epidemiologie
Kattenkrabziekte, ook al doet de naam anders vermoeden, wordt niet enkel door katten en
katachtigen veroorzaakt. Er zijn gevallen waarbij honden, en zeer zelden ook konijnen of
andere knaagdieren de bacteriële infectie overbrengen op de mens. DNA van B. henselae
werd gedetecteerd in enkele zieke honden die klinische abnormaliteiten vertoonden. Meestal
worden honden accidenteel besmet met B. henselae waardoor ze ook een infectiebron voor
mensen kunnen zijn (Chomel et al., 2006; Kaiser et al., 2011). Er wordt gesuggereerd dat de
bacterie ook via teken overgedragen kan worden aangezien het DNA van B. henselae
gedetecteerd werd tijdens het onderzoeken van teken uit Noord-Amerika, Oost- en Centraal-
Europa (Kaiser et al., 2011).
Besmetting met B. henselae gebeurt doorgaans door een intra- of subcutane inoculatie van
vlooienfaeces via kattenklauwen. Daarna zal een lag-fase plaatsvinden waar de bacterie zich
aanpast aan de gastheer en zich vermenigvuldigt. Enkele dagen na de infectie zal de bacterie
zich vanuit de primaire niche naar de bloedbaan verspreiden. De tijdspanne van verspreiding
kan een verklaring bieden aan het laat detecteren van de bacterie in het bloed. Kenmerkend
is een sterke stijging van het aantal bacteriën in de rode bloedcel na enkele dagen. Het
precieze migratieverloop is nog niet volledig onderzocht maar zou bestaan uit drie stappen nl.,
adhesie, invasie en intravacuolaire vermenigvuldiging (Figuur 2). Het prolifereren binnen de
rode bloedcel zal een plateau bereiken waarna de rode bloedcel afsterft. Tijdens een
bloedmaal kan de vector besmet raken en vervolgend een andere reservoirgastheer infecteren
(Simard, 2015).
19
Figuur 2: Verloop van bartonellose in zoogdier als reservoirgastheer. Na de eerste inoculatie door vlooienfaeces via krassen
van een kattenklauw in de huid, verblijft de bacterie in een tot nog toe raadselachtige primaire niche. Deze toestand vertaalt zich
in de lag fase (lag phase). Na enkele dagen is een snelle stijging van het aantal bacteriën in de bloedbaan vast te stellen (1).
Hierbij vindt er adhesie plaats van de bacterie aan RBC gevolgd door invasie of binnendringen in RBC. De bacterie vermeerdert
in de RBC tot een stationair aantal wordt bekomen. Dit herhaalt zich verschillende malen (2-4) tot het moment dat een specifieke
antilichaamrespons de invasie in RBC blokkeert en zo ook de infectie tegenwerkt. Na een slapende fase van enkele weken tot
maanden (dormant phase) is het mogelijk dat de bacterie zich opnieuw manifesteert met een nieuwe bacteriële piek als resultaat
(5). Vermoedelijk komt dit door een klonale expansie van antigeen en/of fasevarianten die in de bloedbaan aanwezig zijn onder
de vorm van de primaire niche. Tijdens het verloop is transmissie van de ene naar de andere gastheer mogelijk via bloedzuigende
geleedpotigen, voornamelijk vlooien (Pulliainen & Dehio, 2012).
De kat wordt gezien als het hoofdreservoir voor B. henselae en is de belangrijkste verwekker
van het ziektebeeld bij de mens. De kat zelf ondervindt geen last van de bacterie die zich heeft
aangepast zodat ze kan overleven in de gastheer, en aldaar kolonisatie geeft. Door dit
commensalisme zal de langdurige bacteriële infectie niet merkbaar zijn bij de geïnfecteerde
kat. Doorgaans zijn katten slechts een week tot een maand besmettelijk maar volgens Chomel
et al. (2006) zijn er gevallen gerapporteerd waarbij een periode van langer dan één jaar wordt
aangehaald. Vaak speelt de leeftijd van de kat een rol in het risico op besmetting (Margileth,
2000). Een infectie oplopen door een krab of beet van jonge katten, jonger dan één jaar, is
meer waarschijnlijk dan door oudere katten (Figuur 3). In Nederland bijvoorbeeld wordt de helft
van de katten, meestal in de eerst 6 levensmaanden, besmet met de bacterie (Bergmans et
al., 1997). Ook de levenswijze van de kat is een aspect waar rekening mee moet gehouden
worden. Straatkatten zijn vaak een grotere bron van infectie dan huiskatten. Aangezien de
eerste groep geen adequate verzorging krijgt is de kans op het hebben van vlooien groter en
dus ook de kans op besmetting met B. henselae (Chomel et al., 2006). De bacteriële infectie
kan niet overgedragen worden door geslachtsgemeenschap noch verticaal door
zwangerschap. Andere katachtigen zoals cheeta, poema, panter en leeuw, testten positief
voor B. henselae (Jacomo et al., 2002).
20
Figuur 3: Relatie tussen het voorkomen van B. henselae in katten en ouderdom van de kat (Azzag et al., 2012). Er is een
duidelijk verband tussen de leeftijd van de kat en de kans op besmetting. Katten jonger dan één jaar dragen meer bij tot
bacteriemie dan oudere katten. Als de kat de leeftijd van 36 maanden en ouder heeft bereikt, is er geen spoor meer van B.
henselae. M.a.w. hoe jonger de kat, hoe groter de kans op een bacteriële infectie met B. henselae. Er is nooit een verband
gevonden tussen de aanwezigheid van de bacterie in de kat en het geslacht of fysiologische status van de kat.
B. henselae wordt onderling tussen katten overgedragen door een vector nl., de kattenvlo
(Ctenocephalides felis). Vermoedelijk wordt een huidwonde van de kat met besmette
vlooienfaeces geïnfecteerd. Deze kat kan door middel van een kattenklauw de bacterie
overdragen naar de mens en bartonellose bewerkstelligen. Ook kan rechtstreeks contact van
bloed van de gastheer met die van de vlo een mogelijke infectiemanier zijn. Een intra- of
subcutane inoculatie door een bloedzuigende vector wordt soms beschouwd als een
natuurlijke transmissieweg. B. henselae kan aanwezig zijn in de speekselklieren van C. felis
die tijdens een bloedmaal een infectie in de hand werkt, maar werd nog niet aangetoond.
Contaminatie van de op dat moment aanwezige huidwonde met vlooienfaeces is eerder te
begrijpen (Simard, 2015). Het direct overdragen van de ziekte via de vlo op de mens via
vlooienbeten is nooit experimenteel aangetoond en wordt vooral hypothetisch gestaafd
(Chomel et al., 2006).
In tegenstelling tot de kat, ondervindt de hond als gastheer een waaier aan klinische en
pathologische aspecten. De symptomen zijn te vergelijken met het menselijke ziektebeeld
voornamelijk, granulomateuze hepatitis, peliosis hepatitis van de lever en epistaxis
(neusbloeding) (Chomel et al., 2006).
Teken voeden zich met het bloed van mens en dier waardoor bacteriële besmetting kan
optreden. Dietrich et al. (2010) toonden aan dat in vier regio’s van Europa het DNA van B.
henselae in 40% van de tekenpopulatie aanwezig was. De link tussen een tekenbeet en het
optreden van de bacteriële infectie in mens en dier werd snel gelegd (Kaiser et al., 2011).
2.3. Humaan ziektebeeld
Meest voorkomend bij kattenkrabziekte is het ontstaan van een gering aantal rode papels 3
tot 10 dagen na de besmetting met B. henselae. Deze huidknobbeltjes kunnen overgaan in
vesikels die binnen 3 weken tot enkele maanden volledig verdwijnen zonder littekenweefsel.
21
Ze komen dikwijls voor op de handen aangezien de kattenkrab/-beet meestal op die plaats
gebeurt. Typerend is lymfadenopathie gekenmerkt door een nabije lymfeklierzwelling die
doorgaans 1 tot 3 weken na de inoculatie optreedt (Figuur 4). De klieren zijn meestal pijnloos
en 1 tot 5 cm groot. Soms kan de zwelling oplopen tot een grootte van 12 cm gepaard met
ettervorming. De locatie is meestal beperkt tot één regio nl., de plaats van besmetting. In het
algemeen verdwijnt de lymfadenitis binnen de 1 tot 4 maanden, uitzonderingen zijn gevallen
van 1 tot 3 jaar (Florin et al., 2008; Vermeulen et al., 2009).
Figuur 4: Klassieke symptomen van kattenkrabziekte bij de mens (Centers for Disease Control and Prevention, 2014).
Voornamelijk de handen komen in contact met de kat, de plaats waar de meeste huidknobbels worden vastgesteld. In een verder
stadium is lymfadenopathie of lymfeklierzwelling zeer typerend voor de ziekte en dit is een broeiplaats van B. henselae.
Atypische manifestaties worden bij circa 10% van de patiënten vastgesteld. De bacterie heeft
zich verspreid naar andere delen van het lichaam, vooral naar het orgaansysteem. In het
bijzonder worden de lever, de milt, het oog en centraal zenuwstelsel aangetast. Enkele
afwijkende symptomen staan opgelijst in Tabel 2. Na afweging van zowel klinische
bevindingen als een voorgeschiedenis met kattencontact, uitvoeren van specifieke
serologische testen, al dan niet aangevuld met PCR, kan een diagnose gesteld worden.
Mensen met zowel typische als atypische symptomen dienen niet in quarantaine gebracht te
worden aangezien de ziekte niet overdraagbaar is van mens op mens.
22
Tabel 2: Lijst van klinische abnormaliteiten veroorzaakt door B. henselae (Chomel et al., 2006; Vermeulen et al., 2009).
Symptoom
aanhoudende koorts van onbekende oorsprong
bacillaire angiomatosis (huidnodules)
peliosis hepatis (met bloed gevulde holtes in de lever)
granulomateuze hepatitis
hepatosplenomegalie (lever- en miltvergroting)
uveitis (inwendige oogontsteking)
neuroretinitis (ontsteking oogzenuw)
erytheem (roodheid)
glomerulonefritis (nierfilterontsteking)
endocarditis (ontsteking hartkleppen)
pneumonie (longontsteking)
hemolytische anemie
artritis of artralgie (ontsteking of pijnlijke gewrichten)
osteomyelitis (infectie van bot of beenmerg)
Het ziektebeeld veroorzaakt door B. henselae is afhankelijk van de onderliggende
immuunstatus van de gastheer. Deze status kan onderverdeeld worden in twee groepen nl.,
immunocompetente en immuungecompromitteerde patiënten.
In de eerste groep is de gastheer in staat om antistoffen aan te maken tegen de bacterie. De
infectie wordt dan meestal beperkt tot de huid en het goedaardig zwellen van de lymfeklieren,
lymfadenopathie genaamd. De huidzwelling (al dan niet met etter) ontwikkelt zich 3 tot 10
dagen na de aanvaring met de kat. Het opzetten van de lymfeklieren kan 1 tot 3 weken later
zichtbaar zijn en kan enkele weken tot maanden aanhouden. Frequent voorkomende
symptomen zijn verhoogde temperatuur, pijn, vermoeidheid en een onwel gevoel (Chomel et
al., 2006). Serologie toont aan dat er productie van IgM en IgG optreedt als respons op de
infectie met B. henselae (Figuur 5). Eerst wordt IgM geproduceerd dat gewoonlijk binnen 100
dagen verdwijnt. IgG zal iets later een stijging tonen maar kan tot 2 jaar of langer meetbaar
blijven. Zo blijkt dat B. henselae een levenslange immuniteit kan teweegbrengen (Vermeulen
et al., 2009).
23
Figuur 5: Seropositiviteit (IgM en IgG) in relatie tot duur van het ziektebeeld veroorzaakt door B. henselae bepaalt met
(a) immunofluorescence assay (IFA) en (b) Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) (n=44). De datum van de eerste
klinische symptomen van 41 patiënten (44 sera) is gekend zodat de duur van het ziektebeeld opgevolgd kan worden. Ondanks
de kleine aantallen kan er een bepaald patroon in serologische positiviteit opgesteld worden. Bij IFA neem de IgM af na 8 weken
terwijl voor IgG er een piek werd vastgesteld op 6-8 weken. Dit patroon is niet terug te vinden bij ELISA voornamelijk te wijten aan
de lage gevoeligheid voor IgG (Vermeulen et al., 2007).
Bij immuungecompromitteerde patiënten heeft de gastheer een verzwakt immuunsysteem met
een grotere kans op infecties met vaak een ernstiger verloop. De bacteriële infectie beperkt
zich niet enkel tot de huid en lymfeklieren maar ook atypische symptomen kunnen zich
voordoen (Tabel 2). B. henselae is de oorzaak van langdurige koorts en/of aanhoudende
bacteriemie en systemische infectie met aantasting van diverse orgaansystemen vindt plaats
(Chomel et al., 2006; Vermeulen et al., 2009).
2.4. Behandeling en preventie
Bij patiënten met de klassieke knobbelvorming of lymfadenitis verdwijnen de symptomen
gewoonlijk zonder behandeling. Er werden verscheidene studies uitgevoerd om antibiotica als
therapie toe te passen en het effect te bestuderen. De meeste studies concludeerden dat B.
henselae niet adequaat reageert op de antibiotica maar enkelen gaven toch in vivo een effect
weer. Margileth (1992) testte de duur van de symptomen bij 268 patiënten met
kattenkrabziekte. De gemiddelde duur bij met antibiotica behandelde en niet behandelde
patiënten is respectievelijk 2,8 weken en 14,5 weken, dus toch significant verschillend. Tijdens
de studie werden verschillende antibiotica onderzocht waaruit rifampicine, ciprofloxacine,
gentamicine en trimethoprim-sulfamethoxazol (TMP-SMX) effectief bleken te werken tegen de
kattenkrabziekte met een range van 58% tot 87%. De niet behandelde patiënten werden in
iedere studie een placebo toegediend om een vergelijking te kunnen uitvoeren met de
behandelde patiënten. Een andere studie (Arisoy et al., 1999) toonde het verschil aan tussen
het gebruik van rifampicine, eventueel in combinatie met andere antibiotica, en gentamicine of
TMP-SMX. Bij de eerste groep van patiënten werd na 1 tot 5 dagen na de inname verbetering
van het ziektebeeld vastgesteld. Bij de tweede groep, met gentamicine of TMP-SMX, werd de
verbetering na 3 tot 4 dagen opgemerkt. Opmerkelijk is dat de aanbevolen behandeling met
azithromycine in één enkele studie (Rolain et al., 2004) wordt geëvalueerd als zijnde een
goede therapie. Er kan gesteld worden dat de keuze van de juiste (combinatie van) antibiotica
voor de behandeling van B. henselae voor ieder individu verschillend is, wat het vaak voor de
behandelende clinicus erg moeilijk maakt, naast het feit dat het geduld op de proef wordt
24
gesteld alvorens opklaring van de symptomen. Vaak reageren immuungecompromitteerde
patiënten onverwacht zeer goed op de antibiotica in vergelijking met de immunocompetente
mensen (Florin et al., 2008; Prutsky et al., 2013).
Het onder controle houden van vlooien op zowel katten als honden is een goede preventie
tegen kattenkrabziekte. Het verwijderen van de klauwen of regelmatig knippen van nagels van
jonge katten wordt ook voorgesteld. Andere mogelijke maatregelen zijn katten niet buiten laten,
vlooiencontrole, wassen van handen na contact met katten voornamelijk kittens, correcte
handeling van de kattenbak en na beten of krabben de wonde schoonmaken met water en
zeep (Margileth, 2000).
3. Bartonella quintana
Bartonella quintana is algemeen gekend als de verwekker van de loopgravenkoorts of trench
fever. Naast deze acute vorm van infectie met B. quintana bestaat ook een tweede, chronische
vorm die gedetecteerd werd bij immunocompetente personen. Tot nog toe is de mens het
enige reservoir voor de bacterie en de lichaamsluis, Pediculus humanus corporis, zorgt voor
het overdragen van patiënt op patiënt (Rolain et al., 2004).
DNA van B. quintana werd gedetecteerd in de pulpa van een 4000 jaar oude man (Drancourt
et al., 2005). In Litouwen identificeerden Raoult et al. (2006) het DNA van de bacterie in luizen
gevonden in graven van soldaten van Napoleon. Hierdoor werd gesuggereerd dat vele
soldaten geïnfecteerd waren met B. quintana. De naam van de acute vorm van de ziekte,
namelijk loopgravenkoorts, kwam er toen tijdens de Eerste Wereldoorlog zowel geallieerden
als Duitse troepen getroffen waren door de ziekte. Tijdens de twee wereldoorlogen, met name
in Rusland en op de Oost-, Midden- en West-Europese fronten, wordt geschat dat wereldwijd
enkele miljoenen mensen leden aan de ziekte. Na Wereldoorlog II namen incidenten van de
loopgravenkoorts steeds meer af. Tot in 1990 de ziekte terug de kop kwam opsteken vooral
bij dakloze mensen in ontwikkelde landen, die geconfronteerd worden met extreme armoede,
gebrek aan hygiëne én extreem lage temperaturen. De ziekte werd één van de belangrijkste
opduikende infectieziekten van de vroege jaren ’90 (Badiaga & Brouqui, 2012).
3.1. Kernmerken en eigenschappen
Bartonella quintana behoort, zoals B. henselae, tot de alphaproteobacteria en werd vroeger
Rochalimaea quintana genoemd. Het is een facultatief, intracellulaire, Gramnegatieve bacillus
die 0,3 tot 0,5 µm breed is en 1 tot 1,7 µm lang. Zowel katalase als oxidase is negatief
gebleken. De bacterie beschikt niet over flagellen maar wel over fimbria. Deze zijn korter en
dunner dan flagellen en zorgen voor de aanhechting aan andere bacteriën en aan dierlijke
cellen. Ze zijn enkel zichtbaar met een elektronenmicroscoop en kunnen recht of gebogen zijn.
Er zijn pili aanwezig die typerende spiertrekkingen veroorzaken voor de voortbeweging en die
zelf-aggregatie verwezenlijken. De bacterie haalt energie uit succinaat, pyruvaat en glutamaat
maar is niet in staat om glucose als energiebron te gebruikten. Net als B. henselae is B.
quintana een traag groeiende bacterie met bijgevolg moeizaam kweekbare kolonies. Slechts
12 tot 14 dagen na enten kunnen primaire isolaties gevonden worden en pas na een
25
incubatieperiode van 45 dagen kunnen isolaten verder gebruikt worden voor verscheidene
technieken. Daarom wordt het kweken van de bacterie niet routinematig toegepast waardoor
verder onderzoek bemoeilijkt wordt (Foucault, 2006; Thamawatanakul, 2010).
Vele bacteriële pathogenen zijn geëvolueerd zodat ze intussen heemverbindingen kunnen
accumuleren om hun ijzervoorraad op te bouwen. Er kan gesteld worden dat rode bloedcellen
of hemine-supplementen vereisten zijn om in vitro te kunnen groeien. De bacterie beschikt
over hemine-bindende proteïnen (Hbp), zoals bij B. henselae, die dienen als hemine-
receptoren (Thamawatanakul, 2010).
3.2. Epidemiologie
Bartonella quintana wordt vooral op de mens overgedragen door de lichaamsluis, Pediculus
humanus corporis (Figuur 6). De mens vormt het natuurlijk reservoir van de bacterie, die
resideert in de rode bloedcellen (Badiaga & Brouqui, 2012).
De lichaamsluis is afkomstig vanuit de hoofdluis, Pediculus humanus capitis, toen mensen
kleren begonnen te dragen. Beide luizentypes zijn eeuwenoude humane parasieten. De
lichaamsluis leeft onrechtstreeks in kleren van de mens en wordt geassocieerd met armoede,
gebrek aan hygiëne en koude weersomstandigheden. Door constant met mensen die luizen
met zich meedragen en hun kleren, wordt een luizenplaag of pediculose veroorzaakt. Dit komt
hoofdzakelijk voor bij de dakloze bevolking in grote steden (Badiaga & Brouqui, 2012), maar
tevens rapporten betreffende B. quintana infecties die prevalent zijn in nieuwe populaties in
het Andesgebergte en in HIV-geïnfecteerden die niet adequaat worden opgevolgd.
Figuur 6: Pediculus humanus corporis, de lichaamsluis (x120) (Foucault, 2006). De luizen zitten op het lichaam van de mens
om zich zo van bloedmaaltijden te voorzien. Ze hechten zich ook vast aan kledij van de persoon in kwestie zodat contact de
verspreiding en het ontstaan van een luizenplaag vergemakkelijkt.
B. quintana vermenigvuldigt zich in de darm van de luis en wordt op de mens overgedragen
door uitwerpselen die door aangetaste huid migreren. Lichaamsluizen voeden zich tot wel
vijfmaal per dag met bloed. Hierbij worden eiwitten geïnjecteerd, waaronder een soort
verdovingsmiddel die een allergische reactie veroorzaakt met jeuk tot gevolg. Het krabben
brengt onvermijdelijk wondjes met zich mee die de fecale transmissie van de bacterie
26
vergemakkelijkt. De aanhoudende bacteriemie wordt bevorderd door voortdurende
verspreiding van de lichaamsluis (Foucault, 2006).
B. quintana werd ook reeds aangetoond in kattenvlooien en patiënten met lymfeklierzwelling
die een kat als huisdier hebben. Dit ligt in dezelfde trend als de transmissie van B. henselae.
Deze bevindingen suggereren dat ook andere vectoren de verspreiding van B. quintana, met
bijhorende symptomen, mogelijk maken (Foucault, 2006; Badiaga & Brouqui, 2012).
3.3. Pathogenese
Als een persoon geïnfecteerd is door B. quintana kan het even duren eer de ziekte tot uiting
komt. Dit door de lange incubatieperiode van 15 tot 25 dagen. De ziekte kan in twee vormen
voorkomen, een acute en chronische vorm (Badiaga & Brouqui, 2012).
De acute vorm, loopgravenkoorts in de volksmond, manifesteert zich door cyclisch
weerkerende hoge koorts (“relapsing fever”) die gewoonlijk 2 tot 4 dagen aanhoudt met
mogelijks terugval om de 4 tot 5 dagen. Ook hoofdpijn, duizeligheid, overgevoeligheid in het
scheenbeen en pijn in de spieren en rug zijn karakteristiek voor een primaire, acute infectie
met B. quintana. Het ziektebeeld kent geen continu verloop en wordt gekoppeld aan een
langdurig herstel tot enkele maanden. Hoewel dodelijke gevallen zeldzaam zijn, kan toch
gesteld worden dat de langdurige koorts secundair hartfalen met zich mee kan brengen
(Badiaga & Brouqui, 2012; Rolain et al., 2004).
Chronische bacteriemie is de andere vorm van infectie met B. quintana. In een studie in
Marseille werd bij 14% van de daklozen chronische B. quintana infectie gediagnostiseerd. Er
werd ook aangetoond dat de bacterie nog tot 8 jaar na infectie aanwezig kan zijn in het bloed
van de patiënt (Kostrzewski, 1949). Foucault et al. (2002) toonden aan dat 16 van de 24
patiënten geen ziekteverschijnselen vertoonden maar dat er wel een chronische bacteriemie
werd gedetecteerd. De ziekte bleef bij één van de patiënten 78 weken aanwezig, bij 2 andere
patiënten 53 en 17 weken en bij de overige 13 werd een range van 1 tot 8 weken vastgesteld.
Het linken van chronische bacteriemie aan endocarditis is nog niet volledig onderbouwd. Wel
werden in recente literatuur 38 van de 48 gevallen van endocarditis als gevolg van
Bartonellose toegeschreven aan B. quintana (Badiaga & Brouqui, 2012; Foucault, 2006).
3.4. Therapie
Vele gevallen van de loopgravenkoorts, voornamelijk de acute vorm, vonden plaats voor het
tijdperk van de antibiotica. De klinische manifestaties hielden 4 tot 6 weken aan gevolgd door
volledige genezing. De beste remedie om de pijn te onderdrukken was aspirine. Tijdens de
Tweede Wereldoorlog werden soldaten met trench fever vanuit ziekenhuizen naar een depot
verplaatst om te herstellen. Daar waren frisse lucht, goed gebalanceerd voedsel en
spierversterkende oefeningen om de zieke soldaten terug aan te sterken zodat ze snel terug
konden keren om hun plicht te vervullen. Ook tijdens Wereldoorlog I konden soldaten met B.
quintana infectie genezen zonder tussenkomst van enige antibioticakuur. Men rekende er toen
op dat een patiënt met loopgravenkoorts gemiddeld een 60-tal dagen ongeschikt zou zijn voor
zijn militaire taken. Na de wereldoorlogen kwamen verscheidene antibiotica ter beschikking en
27
werden deze middelen aan patiënten voorgesteld als therapie, hoewel daar geen specifieke
en overtuigende data van bestaan (Rolain et al., 2004).
Antibioticatherapie tegen de bestrijding van B. quintana blijft een uitdaging. De
voorgeschreven behandeling voor patiënten met chronische bacteriemie bestaat uit een
combinatie van gentamicine (3 mg/kg lichaamsgewicht intraveneus per dag) en doxycycline
(200 mg oraal per dag) gedurende 14 en 28 dagen respectievelijk. Patiënten met endocarditis
wordt een doxycyclinekuur van 42 dagen aangeraden om de genezing te versnellen (Badiaga
& Brouqui, 2012; Rolain et al., 2004).
28
4. Moleculaire diagnostiek
Voor de detectie en identificatie van Bartonella species wordt in dit werk de hieronder kort
beschreven moleculaire diagnostiek toegepast.
4.1. Polymerase chain reaction
Polymerase chain reaction (PCR) is een courante, moleculaire amplificatietechniek ontwikkeld
in 1983 door de Amerikaanse biochemicus Kary Mullis. Door deze techniek kunnen in korte
tijd kleine hoeveelheden DNA vermeerderd worden tot miljoenen kopijen.
Een DNA-doelwitstreng (=template) waaraan primers zijn verbonden dienen als basis voor
DNA-polymerasen om de template te verdubbelen of kopiëren. De te amplificeren sequenties,
targets genaamd, zijn uniek voor een bepaald micro-organisme. Verder dienen
deoxyribonucleotide trifosfaten (dNTPs) aanwezig te zijn die de bouwstenen vormen van het
amplicon. Dit betreft de basen thymine (T), adenine (A), cytosine (C) en guanine (G).
Een PCR-reactie bestaat uit drie specifieke stappen (Figuur 7).
1) Denaturatie
De PCR-mix wordt verwarmd tot 95°C om de waterstofbruggen in de dubbele helix van
het dsDNA te verbreken. Zo wordt enkelstrengig DNA (ssDNA) gevormd waarvan elke
streng op zich geamplificeerd kan worden.
2) Annealing
De annealingstemperatuur is afhankelijk van de smelttemperatuur (Tm) van de primers
(± 50-70°C, ongeveer 5°C onder Tm). Bij deze temperatuur kunnen de primers hechten
aan het complementair deel van het template-DNA.
3) Elongatie
De DNA-polymerase hecht zich op het 3’-uiteinde van de primer/template dubbelstreng
bij een optimale temperatuur van 72°C. De synthese van het amplicon start en verloopt
volgens complementariteit van de basenparen.
Na één cyclus is de targetsequentie verdubbeld. Het meerdere malen herhalen van de cyclus
laat toe het doelwit-DNA exponentieel te vermeerderen. Uiteindelijk bereikt de PCR een
plateau aangezien de activiteit van het polymerase daalt, de dNTPs uitgeput raken en de
reactie geïnhibeerd raakt door een overmaat aan amplicon. Theoretisch worden 2n kopijen van
het target-DNA gevormd, met n het aantal doorlopen cycli (Joshi & Deshpande, 2011; Julin,
2014).
29
Figuur 7: Principe van polymerase chain reaction (Jansma et al., 2014). De eerste stap bestaat uit de denaturatie van dsDNA
tot ssDNA. Vervolgens is de aanhechting van de primers aan de enkelstreng mogelijk bij een welbepaalde temperatuur, afhankelijk
van de gebruikte primers. Als laatste stap vindt er elongatie plaats waarbij DNA-polymerase zorgt voor de verlenging van de
streng zodat dsDNA wordt gevormd. Deze stappen worden een bepaald aantal keer herhaald waardoor een miljoenen kopijen
van het doelwit-DNA worden bekomen.
PCR is een snelle methode met goede gevoeligheid en specificiteit maar deze techniek kent
ook enkele nadelen. Er dienen correcte sequenties gekend te zijn om geschikte primers te
ontwikkelen. Visualisatie en evaluatie gebeurt door middel van gelelektroforese en er is echter
geen echte concentratiebepaling.
4.2. Real-time PCR
Kwantitatieve PCR (qPCR) of real-time PCR maakt het mogelijk om de hoeveelheid DNA of
RNA (na reversed transcriptie) te analyseren door tijdens het amplificatieproces de reactie te
meten. Er worden fluorescente probes of labels gebruikt om fluorescentieveranderingen te
detecteren.
Het verschil met de conventionele PCR ligt in het analyseren van het geamplificeerd DNA. Bij
de conventionele PCR kan pas na het beëindigen van de reactie via gelelektroforese een
beeldanalyse geëvalueerd worden: is er een bandje zichtbaar of niet. Hierdoor kan deze PCR-
methode omschreven worden als een kwalitatieve bepaling. Eventueel kan een semi-
kwantitatieve bepaling bekomen worden door de intensiteit van het bandje op de gel te
bestuderen. Bij real-time PCR is het mogelijk om, naast de kwalitatieve bepaling, ook een
kwantitatieve analyse te bekomen. Dit kan gerealiseerd worden door gebruik te maken van
fluorescente probes of labels. Na iedere cyclus zal het fluorescent signaal toenemen
proportioneel aan de hoeveelheid geamplificeerd product.
Een voordeel aan qPCR is dat zowel detectie als kwantificatie van het doelwit-DNA mogelijk
is in éénzelfde reactie. De verandering in fluorescentiesignaal is evenredig met de hoeveelheid
geamplificeerd product. Ook de accuraatheid en grote detectierange (lineair meetbereik) zijn
voordelen verbonden aan de techniek. Ook de kans op contaminatie door post-PCR-
handelingen kan voorkomen worden (Smith & Osborn, 2009).
Als er gebruik wordt gemaakt van RNA als template wordt de qPCR (RT-PCR) vooraf gegaan
door een reverse transcriptie stap. Deze twee termen worden door elkaar gebruikt. Het RNA
wordt door het enzym reverse transcriptase omgezet naar cDNA om vervolgens een PCR-
30
reactie op uit te voeren. Dit kan op twee verschillende manieren gebeuren met elk hun voor-
en nadelen. De voorafgaande stap kan samen met de qPCR in één en dezelfde reactietube
gebeuren en wordt dan one-step qRT-PCR genoemd. Er worden minder pipetteerstappen
gevergd waardoor een efficiëntere tijdsbesteding mogelijk is en ook is er geen contaminatie
tussen de twee verschillende reactiestappen. Maar doorgaans is deze methode minder
gevoelig. Als er wordt gewerkt in twee gescheiden reactiebuisjes wordt er gesproken van two-
step qRT-PCR. Het is een meer flexibele methode waarbij de keuze van de primers meer
gevarieerd is en er mogelijkheid is tot stockeren van cDNA om meerdere doelwitstrengen te
kwantificeren. Negatief is de invloed van Rnase inhibitoren op de eigenlijke PCR-reactie
(Vandesompele, 2013).
4.2.1. Primers en probes
Een PCR-reactie valt of staat met goed ontworpen primers. Er is zowel een forward als reverse
primer nodig om de amplificatie te vervolledigen. Primers zijn ssDNA oligonucleotiden
complementair aan de begin- en eindsequentie van het targetgenoom. Tijdens het ontwerpen
van het primerpaar, met forward- (fw) en reverse (rv) primer moeten volgende voorwaarden
(Tabel 3) in acht genomen worden.
Tabel 3: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor primers (Pestana et al., 2010; Vandesompele, 2013).
Criterium Uitleg
Kruis homologie Te vermijden, primersequentie moet idealiter uniek zijn voor targettemplate
Lengte 18 tot 25 basen
GC-inhoud 40 tot 60%, verdeeld over de primersequentie
GC klem 2 tot 3 GC-nucleotiden aan 3’-uiteinde van de primer zorgt voor hogere templatebindingsspecificiteit.
Tm 55 tot 60°C, afhankelijk van de nucleotidensequentie Als Tm te hoog, dan is er neiging om secundaire structuren te vormen. Het verschil in Tm tussen fw en rv primer maximaal 5°C, anders bestaat de kans dat er geen amplificatie optreedt.
Secundaire structuren Door intra- of intermoleculaire interacties bij de primers die niet meer (of inefficiënt) aanhechten aan de template. Dit geeft aanleiding tot lagere productopbrengst. Voorbeelden zijn: - Hairpin/loop: complementaire basen in de primer waarbij een lus wordt gevormd - Self-dimer: twee gelijke primers hybridiseren met elkaar (fw-fw / rv-rv) - Cross-dimer: twee verschillende primers hybridiseren met elkaar (fw-rv)
Di-nucleotiderepetities Meer dan vier herhalingen van di-nucleotiden vermijden, bv. CTCTCTCT , gezien verhoogde kans op aspecificiteit
Nucleotiderepetities Meer dan vier herhalingen van gelijke nucleotiden vermijden, bv. AAAAA, gezien verhoogde kans op aspecificiteit
De probes worden gesynthetiseerd op basis van de sequenties die worden afgebakend
door het primerpaar. Ze dienen ook aan bepaalde voorwaarden (Tabel 4) te voldoen
vooraleer de PCR-reactie goed kan verlopen.
31
Tabel 4: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor probes (Pestana et al., 2010; Vandesompele, 2013).
Criterium Uitleg
Lengte 18 tot 30 baseparen Langer dan 30 basen mogelijk, maar dan kan de quencher best in de probe geplaatst worden (en niet aan 3’ einde) op minder dan 18 tot 25 basen van de reporter
%GC 30 tot 80%
Tm 8 tot 10°C hoger dan Tm van de primers
Hybridisatielocatie Probe zo dicht mogelijk bij primers aanhechten, zonder overlap, om snelle detectie mogelijk te maken
Te vermijden - Mismatchen tussen probe en template - Repetities van eenzelfde nucleotide, vooral G - G op het 5’ einde aangezien deze base een quencherfunctie heeft die reporterfluorescentie zal doen afnemen
4.2.2. Principe van fluorescentie
Fluorescentie is een verschijnsel waarbij energie met een bepaalde golflengte door een
molecule wordt geabsorbeerd en terug uitgezonden met een langere golflengte. De excitatie-
energie zal elektronen van grondtoestand laten overgaan naar een schil met hoger
energieniveau. Dit is de aangeslagen of geëxciteerde toestand van een elektron. De stabiliteit
van deze toestand is laag waardoor het elektron terugkeert naar de grondtoestand. Hierbij zal
energie geëmitteerd worden onder de vorm van warmte of licht. In het laatste geval wordt van
fluorochromen gesproken en kan een fluorescentiespectrum ontstaan. Hierbij bestaat het
uitgezonden licht uit verschillende golflengtes als gevolg van de verschillende vibratieniveaus
met verschillende hoeveelheden emissie-energie (Lakowicz, 2013; Valeur & Berberan-Santos,
2012).
Figuur 8: Principe van fluorescentie (Thermo Fisher Scientific, 2015b). De blauwe pijl toont de excitatie-energie die nodig is
om een elektron in aangeslagen toestand te brengen. Na een klein energieverschil valt het elektron terug naar de grondtoestand.
De rode pijl stelt de energie voor die op dat moment nog vrij kan komen onder de vorm van ofwel licht ofwel warmte.
Om de fluorescentieverandering te kunnen meten wordt een fluorescent label of fluorochroom
toegevoegd aan de reactie. De fluorescentietechnieken maken hierin onderscheid tussen niet-
32
specifieke labels en specifieke probes. Voor de kwantitatieve bepaling van het amplicon moet
het te meten fluorescentiesignaal de achtergrond overschrijden (Vandesompele, 2013).
4.2.3. Niet-specifieke labels
Bij niet-specifieke labels wordt geen onderscheid gemaakt tussen target en eventueel
aanwezige aspecifieke amplificatieproducten. Ze binden zich op alle dsDNA sequenties zodat
alle aanwezige dsDNA een signaal genereert. Eén van de meest gebruikte fluorochromen is
SYBR® Green I (Smith & Osborn, 2009; Vandesompele, 2013).
4.2.3.1. SYBR® Green I
SYBR® Green I is een asymmetrische cyanine
kleurstof die bindt in de kleine groef van dsDNA.
De molecule absorbeert blauw licht (λmax = 497
nm) en emitteert groen licht (λmax = 520 nm). De
fluorescentie-intensiteit van de vrije molecule is
lager dan die van het gebonden fluorochroom.
Tijdens de PCR-reactie wordt het target-DNA per
cyclus verdubbeld waardoor steeds meer vrij
SYBR® Green I gebonden kan worden (Figuur 9).
Tot gevolg zal het fluorescent signaal stijgen in
functie van het aanwezige dsDNA.
Voordelen aan deze methode is dat het
goedkoop en makkelijk in gebruik is. Het grootste
nadeel is dat het signaal niet sequentie-specifiek
is. SYBR® Green I bindt met iedere dsDNA-
molecule, ook met eventueel aanwezig
gecontamineerd dsDNA of primer-dimeren. De
controle van contaminatie is mogelijk door
analyse van de smeltpiekcurve. Als meerdere
pieken aanwezig zijn, is er vermoedelijk
aspecifieke amplificatie opgetreden (Smith &
Osborn, 2009).
4.2.3.2. Smeltcurveanalyse
Om te bevestigen dat het gedetecteerd signaal bekomen door SYBR® Green I enkel afkomstig
is van de geamplificeerde doelwit-sequentie, wordt op het einde van de qPCR-cyclus een
smeltcurve analyse uitgevoerd. Dit geeft de verandering in fluorescentie-intensiteit weer in
functie van de temperatuur.
Om een smeltcurveanalyse te kunnen uitvoeren wordt het dubbelstrengig template-DNA verhit
over een temperatuurgradiënt waarbij telkens de fluorescentie wordt gemeten. Door de
opwarming zal dsDNA in het temperatuurgebied rond de smelttemperatuur van het amplicon
denatureren. Hierdoor zal meer gebonden SYBR® Green I vrijkomen met een daling in de
Figuur 9: Werking SYBR® Green I (Global Health, 2014).
SYBR® Green I bindt in de kleine groef van dsDNA.
Naarmate de PCR-reactie vordert zal er meer vrij SYBR®
Green I gebonden kunnen worden. De fluorescentie-
intensiteit stijgt eens de molecule gebonden is.
33
fluorescentie-intensiteit als gevolg. De smelttemperatuur Tm is de temperatuur waarbij 50%
van de dsDNA gedenatureerd is en hangt af van de sequentielengte en het %GC van het
amplicon. Hoe langer de sequentie en hoe hoger het percentage aan nucleotiden G en C, des
te hoger de Tm van de template (Smith & Osborn, 2009).
Ook kunnen smeltpieken voorgesteld worden door de eerste afgeleide van de smeltcurve uit
te zetten in functie van de ingestelde temperatuur. Een ononderbroken, vloeiende smeltcurve
komt overeen met een unieke smeltpiek (Figuur 10 A). Dit wordt verkregen als het doelwit-
DNA bestaat uit één specifieke sequentie met een bepaalde smelttemperatuur Tm. Als
aspecifieke, ongewenste amplificatieproducten en/of primerdimeren aanwezig zijn in het staal
van het gewenste amplicon zullen bijkomende pieken met een afwijkende Tm opduiken.
Hierdoor zal de smeltcurve een discontinue daling vertonen (Figuur 10 B). Primerdimeren
smelten vroeg uit en vertonen een piek rond het temperatuurgebied van 60°C-70°C,
afhankelijk van de primersequentie. Hierdoor is deze piek meestal goed te onderscheiden van
de gewenste piek(en) van het amplicon (Life Technologies Corporation, 2013; Vandesompele,
2013).
Figuur 10: Smeltcurven met bijhorende smeltpieken. A: Verschillende ononderbroken smeltcurven die overeenstemmen met
een unieke smeltpiek (Neuzil et al., 2010). B: Aspecifieke smeltcurve met een duidelijk discontinue daling. Hierdoor zullen
meerdere pieken opduiken in de smeltpiekcurve (Downey, 2014).
4.2.4. Specifiek gelabelde probes
Een sequentie specifieke probe bevat twee moleculen waarbij de emissiegolflengte van de
ene (donor) overeenstemt met de excitatiegolflengte van de andere (acceptor), respectievelijk
reporter en quencher genoemd. De quencher is aanwezig op het 3’-uiteinde en de reporter op
het 5’-uiteinde van de probe. De reporter wordt met licht van een specifieke golflengte
A
B
34
geëxciteerd om vervolgens licht van een hogere golflengte dan de gebruikte excitatiegolflengte
te emitteren. De quencher capteert de uitgezonden energie van de reporter waardoor de
fluorescentie van de reporter wordt onderdrukt. Het vrijgeven van de energie van de quencher
kan enerzijds onder de vorm van licht en wordt fluorescentiequencher genoemd, of anderzijds
onder de vorm van warmte in het geval van een black-hole quencher (BHQ). In het laatste
geval is er geen fluorescentieverschijnsel door de quencher waardoor een beter signal-to-
noise resultaat wordt bekomen. In dit onderzoek werd voornamelijk een BHQ gebruikt omwille
van het feit dat een verlaagd achtergrondsignaal typerend is. De wisselwerking tussen reporter
en quencher kan enkel plaatsvinden als de twee fluorochromen zich in elkaars onmiddellijke
nabijheid bevinden. Eens de te overbruggen afstand te groot is, zal enkel de emissiegolflengte
van de reporter te meten zijn als fluorescentie-intensiteit (en de quencher enkel in het geval
van fluorescerende quencher) (Hussain, 2009; Vandesompele, 2013).
Er zijn verschillende soorten probes die volgens verschillende principes werken, waarbij de
meest gebruikte reporters derivaten zijn van fluoresceïne, rhodamine of cyanine. In dit
onderzoek werden specifiek FAM, Cy5, VIC, ROX (internal reference dye) en ABY gebruikt,
hieronder weergegeven met specifieke golflengteprofiel (Figuur 11).
Figuur 11: Overzicht van de reporterdyes (Thermo Fisher Scientific, 2015a).
Om de amplificatie te volgen d.m.v. specifiek gelabelde probes wordt gebruik gemaakt van het
principe van Förster resonance energy transfer, genoemd naar de Duitse wetenschapper
Theodor Förster, maar veelal wordt de term fluorescence resonance energy transfer (FRET)
gebruikt (Helms, 2008).
35
De TaqMan® probe maakt gebruikt van FRET en
bestaat uit korte DNA-sequenties (15-30 bp)
complementair aan de reporter (5’-uiteinde) en de
quencher (3’-uiteinde) van het te amplificeren
targetgenoom. Tijdens de annealing zal de probe
binden aan de doelwitsequentie waardoor reporter
en quencher nog steeds in elkaars nabijheid
aanwezig zijn. Pas in de elongatiestap zal het Taq-
DNA-polymerase in werking treden en de probe
vanaf het 5’-uiteinde losmaken. Door de 5’-3’
exonuclease activiteit van het enzym wordt de
TaqMan® probe afgebroken waardoor reporter en
quencher zich in oplossing en ver van elkaar
bevinden zodat het fluorescentiesignaal van de
reporter gedetecteerd wordt. Naarmate de PCR
vordert zullen meer TaqMan® probes afgebroken
worden en zal de fluorescentie-intensiteit toenemen
(Figuur 12). Als reporter en quencher worden
respectievelijk FAM en een niet-fluorescerende
(NFQ) of BHQ met een kleine groef-
bindingsmolecule (MGB) gebruikt. De MGB of minor
groove binder verhoogt de stabiliteit van de
quencher zonder de sequentielengte te vergroten,
m.a.w. een kortere probe met behoud van Tm. De afstand tussen de reporter en quencher is
op die manier dusdanig klein dat de fluorescentiegolflengte uitgezonden door de reporter via
FRET opgevangen wordt door de quencher waardoor geen signaal gedetecteerd wordt
(PREMIER Biosoft; Vandesompele, 2013).
4.2.5. Fluorescentie detectie
RT-PCR werd uitgevoerd met het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System van
Life Technologies dat werkt op basis van fluorescentietechieken. Een Tungsten-halogen lamp
exciteert licht dat via een filterwiel door een excitatiefilter gestuurd wordt en vervolgens door
een dichroïsche beam splitter op de plaat gericht wordt met excitatie van de probes tot gevolg.
Geëmitteerd licht wordt door een reeks van optische lenzen gestuurd met daaraan gekoppeld
de corresponderende emissiefilter. Een charge-coupled device (ccd) camera detecteert de
emissiegolflengte die aan de hand van een foto in beeld gebracht wordt (Figuur 13) (Nollet,
2013).
Figuur 12: Werking TaqMan® probe (Global Health,
2014). De annealingsfase zorgt voor binding van de
probe aan de target. Bij excitatie van de reporter wordt
energie via FRET aan de quencher doorgegeven.
Tijdens de elongatie wordt de probe los gemaakt en
afgebroken tot reporter en quencher in oplossing zijn.
Op dat moment wordt fluorescentie van de reporter
gemeten.
36
Figuur 13: Schematische weergave werking charge-coupled device (CCD) camera (Nollet, 2013).
4.2.6. Interpretatie ruwe data
Tijdens en na de run wordt de fluorescentiedata verwerkt. De output van een qPCR geeft
grafisch de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU, Rn of ΔRn) weer t.o.v. de amplificatiecyclus.
Dit wordt eenvoudigweg de amplificatieplot genoemd. Er worden drie fasen onderscheiden nl.,
een lineaire fase als achtergrond, een exponentiële fase waarbij het product per cyclus
verdubbeld wordt en als laatste de plateaufase eens teveel amplicon aanwezig zodat inhibitie
optreedt (Figuur 14). In die laatste fase wordt er geen product meer bijgevormd wat eveneens
het eindpunt van de amplificatie aanduidt. Om meer accurate gegevens te bekomen wordt de
kwantificatie van de real-time PCR in de exponentiële fase uitgevoerd. In deze fase zijn alle
nodige reagentia aanwezig, is de efficiëntie van de polymerase het hoogst en de vorming van
primer-dimeren beperkt.
Een achtergrondsignaal of ruis afkomstig van veranderingen in reactie- en omgevingscondities
beïnvloedt het gemeten fluorescentiesignaal. In het begin van de qPCR, als nog geen
eigenlijke amplificatie gedetecteerd wordt, wordt de ruis omgezet in een baseline die dient als
grens waarboven de fluorescentie niet meer tot de achtergrond wordt gerekend.
De drempelwaarde of threshold ligt iets hoger dan het fluorescentieniveau van de baseline en
is de detectielimiet van het toestel voor iedere staal in eenzelfde qPCR. De threshold cycle of
CT-waarde is het aantal cycli nodig om de drempelwaarde te overschrijden en wordt gebruikt
voor de kwantificering van de template. Grafisch is dit de plaats waar de amplificatiecurve de
threshold snijdt (Figuur 14) (Applied Biosystems, 2008; Life Technologies Corporation, 2012).
37
Figuur 14: Amplificatie plot met bijhorende termen (Ahmed, 2005).
Verder kan een standaardcurve opgesteld worden die de uitvoering van een RT-PCR-reactie
evalueert aan de hand van bepaalde parameters (Tabel 5).
Tabel 5: Evaluatieparameters van RT-PCR (Vandesompele, 2013; Life Technologies Corporation, 2012).
Parameter Definitie
Dynamische range Het bereik van CT-waarden van opeenvolgende
verdunningen. Wordt gebruikt om resultaten te
standaardiseren. Idealiter: 7-8 waarden, minimum: 5
waarden.
Helling (slope) De richtingscoëfficiënt van de standaardcurve over de
dynamische range.
Efficiëntie = 10(-1/slope) -1
100% voor ideale omstandigheden gaat gepaard met een
helling van -3.32. Afwijkingen zorgen voor nuttige
amplificatie-informatie. Lengte, %GC, secundaire structuren
en concentraties zijn factoren die variatie kunnen
veroorzaken.
Ideaal: Eff=10(-1/-3.32) -1=1,00 100%
Correlatiecoëfficiënt (R²) Maat voor hoe goed de gemeten waarden op de ingestelde
standaardcurve liggen. Hoe groter de afwijking van de CT-
waarden, hoe meer de coëfficiënt onder de ideale waarde 1
ligt.
Y-intercept De theoretische detectielimiet. M.a.w. Ct-waarden als één
enkel target voor significante amplificatie zou zorgen.
Gevoeligheid of sensitiviteit De minimale hoeveelheid target te onderscheiden van het
achtergrondsignaal. Hoe lager de detecteerbare Ct-waarden
binnen dezelfde verdunning en omstandigheden, hoe hoger
de sensitiviteit.
Reproduceerbaarheid Het bekomen van eenzelfde resultaat bij het telkens
opnieuw uitvoeren van een PCR-reactie.
38
4.3. Sanger sequencing
De techniek werd de midden jaren ’70 ontwikkeld door Frederick Sanger en laat toe om de
DNA-sequentie te bepalen. De methode wordt ook dideoxy sequencing genoemd aangezien
dideoxynucleotiden (ddNTP) worden gebruikt voor de specifieke terminatie van een DNA-
synthesereactie. In vergelijking tot normale deoxynucleotiden (dNTPs) bevatten de vier
ddNTPs een H-groep op de 3'-plaats in plaats van een OH-groep (Figuur 15). Hierdoor kan
geen fosfodi-esterbinding gevormd worden en de streng niet verlengd worden. Iedere ddNTP
is fluorescent gelabeld met elk een specifieke emissiegolflengte. Het DNA-polymerase zorgt
voor de inbouw van dNTPs of ddNTPs en op basis van competitie tussen beide ontstaan
fragmenten van verschillende lengte (Applied Biosystems, 2009; Munshi, 2012).
Figuur 15: Voorstelling dNTPs en ddNTPs (Snipcademy). Er is een duidelijk verschil op de 3’ koolstofgroep waarbij ddNTPs
in plaats van een OH-groep een H-groep bevatten. Het DNA-polymerase kan hierdoor geen nieuwe nucleotiden aan de groeiende
streng bouwen. Per ingebouwd ddNTP is een fragment van bepaalde lengte gevormd.
Praktisch houdt de techniek bepaalde stappen in. Eerst wordt een PCR-amplificatie uitgevoerd
en gecontroleerd door agarosegelelektroforese. Vervolgens kan het bekomen
amplificatieproduct opgezuiverd worden door ExoSAP-IT. Bij deze zuivering wordt gebruik
gemaakt van twee enzymen nl., Exonuclease I en Shrimp Alkalisch Fosfatase. Exonuclease I
hydrolyseert enkelstrengig DNA in een 5’-3’ richting, waardoor de primers worden afgebroken.
Alkalisch Fosfatase verwijdert de fosfaatgroepen van de dNTPs zodat deze geïnactiveerd
worden. Een volgende stap houdt de eigenlijke sequentiereactie in waarbij specifieke primers
worden gebruikt. Zuivere sequentieproducten worden bekomen door gelfiltratie met
SephadexTM G-50 superfine (GE Healthcare) toe te passen. De componenten in het mengsel
worden gescheiden op basis van grootte. Sephadex bestaat uit dextraan en epichloorhydrine
waardoor, na toevoeging van water, de dextraanketens gecrosslinkt worden met
erepichloorhydrine. De gevormde poriën kunnen kleinere moleculen weerhouden terwijl
grotere uit de kolom elueren. De amplicons passeren langs de poriën en restanten worden
weerhouden.
39
Om verschillende fragmenten van elkaar te scheiden en te analyseren, wordt capillaire
elektroforese toegepast. De opgezuiverde fragmenten worden gescheiden op basis van het
gedrag in een gecreëerd elektrisch veld. Onder invloed van een aangelegde spanning,
opgewerkt tussen anode en kathode, zal het staal aangezogen worden en de geladen DNA-
fragmenten zullen migreren door het capillair gevuld met scheidingspolymeer. Aangezien DNA
bij een neutrale pH negatief geladen is, zal de anode aan het begin en de kathode aan het
einde van het capillair opgesteld staan. Kortste fragmenten zullen als eerste de detector
bereiken. Door excitatie met een laser en de daaropvolgende emissie van fotonen, wordt een
signaal gedetecteerd. De verschillende ddNTPs met elk hun specifieke fluorescente label
zullen licht van een verschillende golflengte emitteren. Deze detector window bevindt zich
voor een CCD (Charge Coupled Device Detector) camera. In deze toepassing werd ABI
3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems®) gebruikt voor staalanalyse (Applied
Biosystems, 2009; Franca et al., 2002).
4.3.1. 16S rRNA sequenering
In ieder bacterieel ribosoom is een stuk RNA aanwezig dat uitermate geschikt is voor
microbiële identificatie. Dit stuk RNA wordt 16S ribosomaal RNA (rRNA) genoemd en is
ongeveer 1500 basenparen lang. De relatief korte sequentie heeft verschillende functies die
noodzakelijk zijn voor het overleven en in stand houden van de cel. Hierdoor wordt het 16S
rRNA gen als een huishoudgen beschouwd. Gedurende de evolutie is de sequentievolgorde
slechts weinig veranderd maar de variabele regio’s maken bacteriële identificatie mogelijk. De
basenvolgorde aan het begin en einde van het gen zijn in alle bacteriecellen geconserveerd
en dienen als primerbindingsplaatsen. Het 16S rRNA gen bevat 9 variabele regio’s tussen de
geconserveerde regio’s (Illumina). Sequenering van het 16S rRNA gen is de meest
voorkomende methode voor bacteriële identificatie en kan eenvoudig en snel uitgevoerd
worden (Pauwels, 2012; Wiersema, 2005; Yang et al., 2016).
Om bacteriën aanwezig in een gegeven staal te identificeren, wordt vooral 16S rRNA
sequenering toegepast. Het te sequeneren fragment moet voldoende groot zijn om de nodige
informatie uit af te kunnen leiden maar mag niet groter zijn dan 1000 basenparen aangezien
de snelheid van de test in het gedrang zou komen. Het onderscheiden van alle mogelijke
bacteriën is echter niet mogelijk met de variabele regio’s op zich. De genetische variatie binnen
de variabele regio’s is vaak niet hoog genoeg voor exacte differentiatie. Aangezien de techniek
een snelle en vrij betrouwbare methode is om verscheidene bacteriën te identificeren, wordt
16S rRNA nog steeds gebruikt binnen de moleculaire microbiologie (Illumina; Janda & Abbott,
2007; Pauwels, 2012).
40
5. Materiaal en methoden
5.1. AmpliRun® Bartonella DNA-controles
Gezuiverd microbieel DNA van twee stammen van verschillende species, namelijk van
Bartonella quintana en Bartonella henselae, werden aangekocht bij de firma Vircell (Tabel 6).
Dit referentiemateriaal bevat het targetgenoom, uitgedrukt in kopieën/µl, en werd gebruikt als
positieve controle tijdens de validatie van de verschillende primer/probeparen voor RT-PCR.
Ook werd aan de hand van deze controles de limit of detection (LOD) bepaald. Ze werden
bewaard bij -35°C en werden voor kwaliteitsbehoud aan zo weinig mogelijk vries-dooicycli
blootgesteld.
Tabel 6: AmpliRun® Bartonella DNA-controles aangeschaft via de firma Vircell.
Naam Lotnummer Concentratie
AmpliRun® Bartonella quintana
DNA control 16MBC006001 13000 copies/µl
AmpliRun® Bartonella henselae
DNA control 16MBC005001 17500 copies/µl
5.2. Extractieprotocol
Om het DNA te extraheren uit klinische stalen, verschillende matrixen, verdunningsreeksen,
e.d. werd gebruik gemaakt van QiaSymphony SP (Qiagen) en het “pathogen complex 800”
protocol. 800 µl staal wordt geëxtraheerd en na opzuivering finaal geëlueerd in 130 µl.
Rekening houdend met het doodvolume van de QiaSymphony SP (ca. 150 µl) moet een
staalvolume van minimaal 950 µl geladen worden op het toestel. Tijdens het extractieproces
wordt Phocine herpesvirus-1 (PhHV-1) toegevoegd aan ieder te extraheren staal als interne
amplificatie- en inhibitiecontrole. PhHV-1 is een DNA-virus afkomstig van zeehonden, ook Seal
Herpesvirus (SHV) genoemd, zonder enige gelijkenis met de sequenties van andere virussen
of humane pathogenen van interesse (Dorak, 2007).
5.3. Ontwikkeling van specifieke primers en probes
Rekening houdend met de voorwaarden voor zowel primers als probes, aangehaald in
onderdeel 4.2.1 (Tabel 3 en Tabel 4), kunnen primers en probes ontworpen worden.
Via Primer Express® Software v3.0.1, een commercieel programma, konden primers en probes
ontwikkeld worden. Aan de hand van een literatuurstudie worden de meest geschikte
doelwitgenen opgelijst. Met BLAST analyses worden de corresponderende doelwitsequenties
opgezocht en aangeboden aan het programma dat volledig automatisch (met de mogelijkheid
om eventueel handmatig te werken) de nodige primers en probes ontwikkelt met behoud van
de ontwikkelingscriteria (Thermo Fisher Scientific, 2015c).
Vervolgens werden de bekomen sequenties onderzocht via Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST). Dit is een computeralgoritme dat de DNA-sequentie of eiwitsequentie vergelijkt
met verschillende databanken. Regio's van lokale gelijkenis tussen sequenties worden
doorzocht en de statistische significantie van resultaten worden berekend (Madden, 2013).
41
Zowel de forward primer als reverse primer werden ingegeven en vergeleken met een lijst van
sequentiedatabanken. Organismen die de opgegeven sequenties bevatten werden
weergegeven met het aantal optredende mismatches. Hierdoor konden goede primers en
probes geselecteerd en besteld worden met een hoge specificiteit voor het detecteren van de
doelwitorganismen.
OligoAnalyzer 3.1 werd gebruikt om de ontworpen primersequenties verder te onderwerpen
aan specificaties. Via het programma kan een oligonucleotidesequentie onderzocht worden
op hairpin/loop, self-dimer, cross-dimer en Tm-mismatch. Alle mogelijke secundaire structuren
worden weergegeven met bijhorende specificaties. Een algemene analyse van de sequentie
toont informatie over o.a. lengte, %GC, moleculair gewicht, Tm en extinctiecoëfficiënt bij 260
nm (Owczarzy et al., 2008; Youtsey, 2012).
Er werden verschillende primers en probes ontworpen per organisme. Ieder primer/probepaar
werd voor een specifieke targetsequentie gehanteerd (Tabel 7). Sequenties worden om
confidentialiteitsredenen niet weergegeven.
Tabel 7: Geselecteerde primers en probes specifiek voor de verschillende targetorganismen.
Organisme Doelwitgen Naam Type Tm (°C) Lengte
(bp)
Bartonella spp.
16S-23S RNA intergenic
region
p715 Bart Fw Forward 59,5
76 p716 Bart Rv Reverse 59
p717 Bart Pr Probe 68,2
16S rRNA gene
p718 Bart 16 Fw Forward 60-58,9
77 p719 Bart 16 Rv Reverse 58,2-61
p720 Bart 16 Pr Probe 69,5
Bartonella quintana
Hypothetical intracellular
effector (yopP)
p721 Bq Yop Fw Forward 58,8
77 p722 Bq Yop Rv Reverse 58,7
p723 Bq Yop Pr Probe 68,5
Transcriptional regulatory
protein gene (bqtR)
p724 Bq bqtr Fw Forward 58
85 p725 Bq bqtr Rv Reverse 58,3
p726 Bq bqtr Pr Probe 68,1
Bartonella henselae
Fibronectin binding adhesin (pap31)
p727 Bh pap Fw Forward 58,8
67 p728 Bh pap Rv Reverse 57,3-58,1
p729 Bh pap Pr Probe 68,7-71,6
42
Citrate synthase-encoding
gene (gltA)
p730 Bh glta Fw Forward 59,1
83 p731 Bh glta Rv Reverse 58,7
p732 Bh glta Pr Probe 68,6
Om de juiste targetsequentie te amplificeren worden specifieke primers en probes
geselecteerd. De primers en probes zijn aangekocht bij de firma IDT (Integrated DNA
Technologies) aan een concentratie van 100 μM. Om eenvoudiger te werken werden de
primers en probes verdund tot 20 µM.
5.4. Klinische stalen
Naast de AmpliRun® Bartonella DNA-controles werden als positief referentiemateriaal ook
klinische monsters (Tabel 28, Bijlage I) gebruikt. Ten eerste vond er een retrospectief luik
plaats, nl. klinische monsters die in het verleden reeds correct geïdentificeerd waren door AZ
Sint-Lucas (Gent) werden binnen dit onderzoek getest in AZ Sint-Jan te Brugge. Tijdens een
verder stadium van het onderzoek (prospectief luik) werden klinische stalen (Tabel 29, Bijlage
I) getest met de nieuwe methode en vergeleken met de vastgestelde klinische interpretatie.
5.5. Real-time PCR
5.5.1. SYBR® Select Mastermix
SYBR® Select Mastermix (Life Technologies) voor RT-PCR wordt bewaard bij 4°C en is
samengesteld uit:
- SYBR® GreenERTM Dye (SYBR®Green)
- AmpliTaq® DNA-Polymerase (hot start)
- Hitte-labiele Uracil-N-Glycosylase (UNG)
- Passieve referentie ROXTM Dye
- dNTP mix met dUTP en dTTP
- Geoptimaliseerde buffer componenten
De SYBR® Select Mastermix werd gebruikt om de functionaliteit en specificiteit van de
ontworpen primers na te gaan op basis van smeltcurveanalyse van het bekomen amplicon.
Tabel 8 geeft de samenstelling van deze mix weer die werd gehanteerd voor één reactie. Het
aantal gewenste reacties werd hiermee omgerekend naar de juiste hoeveelheden. Na
homogeniseren en kort centrifugeren (short spin) werd de reactieplaat samengesteld met
enerzijds 15 µl mix en anderzijds 5 µl van het geëxtraheerd DNA. Na sluiten van de reactieplaat
werd er nogmaals een short spin uitgevoerd om vervolgens het runprotocol (Figuur 16) in het
Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies) te doorlopen. De
eerste stap van het protocol dient voor de activatie van het UNG-enzym die ervoor zorgt dat
er geen kruiscontaminatie kan plaatsvinden. Als in een wildtype genoom een U (RNA) wordt
geamplificeerd i.p.v. T dan wordt dit door het enzym opgemerkt en wordt de contaminatie eruit
geknipt.
43
Tabel 8: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix.
Component Stockconcentratie Volume (µl) Finale concentratie
SYBR® Select
Mastermix 2x 10 1x
Enzym mix 125x 0,16 1x
Forward primer 20 pmol/µl 0,3 300 nM
Reverse primer 20 pmol/µl 0,3 300 nM
H2O 4,4
Volume 15
DNA 5
Totaal volume 20
Figuur 16: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix uitgevoerd op het Applied Biosystems®
ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).
5.5.2. TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix
TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix wordt bewaard bij -20°C en dient eerst te ontdooien
alvorens bruikbaar in de test. Belangrijk is dat de mastermix zo weinig mogelijk vries-dooicycli
ondergaat. De mix is zeer viskeus en is samengesteld uit:
- AmpliTaq® Fast DNA-Polymerase
- Thermostabiel MMLV enzym (reverse transcriptase)
- dNTPs mix met dATP, dGTP, dCTP, and dTTP
- RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor
- Passieve referentie ROX™ dye
- Geoptimaliseerde buffer componenten (maximale gevoeligheid en inhibitietolerantie)
TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix werd gebruikt om een mix te maken met de ontworpen
primers en de corresponderende probe. Tabel 9 geeft de samenstelling van deze mix voor één
RT-PCR reactie weer. De volumes werden omgerekend naargelang het gewenste aantal
reacties. Na homogeniseren en kort centrifugeren (short spin) werd de reactieplaat
44
samengesteld met enerzijds 30 µl mix en anderzijds 20 µl van het geëxtraheerd DNA. Bij
iedere run werd er een positieve en negatieve controle (no template) of blanco meegenomen.
Bij een negatieve controle werd 20 µl water toegevoegd dat hetzelfde extractieproces doorliep
als de DNA-stalen wat dient als controle op het extractieverloop en op kruiscontaminatie. Ter
controle van de mastermix werd een blanco meegelopen waarbij 20 µl puur water werd
gebruikt. Als positieve controle werd gebruik gemaakt van de AmpliRun® controls van Vircell.
Na sluiten van de reactieplaats werd er nogmaals een short spin uitgevoerd om vervolgens
het runprotocol (Figuur 17) in het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life
Technologies) te doorlopen. De eerste stap in het protocol dient om het enzym reverse
transcriptase te activeren.
Tabel 9: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix.
Component Stockconcentratie Volume (µl) Finale concentratie
TaqMan® Fast Virus
1-Step Mastermix 4x 12,5 1x
Forward primer 20 pmol/µl 0,75 300 nM
Reverse primer 20 pmol/µl 0,75 300 nM
Probe 20 pmol/µl 0,625 250 nM
H2O 15,375
Totaal 30
DNA 20
Totaal volume 50
Figuur 17: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix uitgevoerd op het Applied
Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).
45
Tabel 10 geeft de samenstelling weer van de mix voor de duplex 16S rRNA gene en SHV RT-
PCR, Tabel 11 geeft de gebruikte samenstelling weer van de mix van de duplex yopP met
pap31 RT-PCR. Er werd voor beiden gebruik gemaakt van TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix waardoor het voorgaande runprotocol behouden werd (Figuur 17).
Tabel 10: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met 16S rRNA gene en SHV met TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix. SHV werd gebruikt als interne controle.
Component Stockconcentratie Volume (µl) Finale concentratie
TaqMan® Fast Virus
1-Step Mastermix 4x 12,5 1x
p718 Bart 16 Fw 20 pmol/µl 0,75 300 nM
p719 Bart 16 Rv 20 pmol/µl 0,75 300 nM
p720 Bart 16 Pr 20 pmol/µl 0,625 250 nM
P019 PhHV-1FW VD 20 pmol/µl 0,25 100 nM
P020 PhHV-1RV VD 20 pmol/µl 0,25 100 nM
P021.4 PhHV-1YY
zen probeVD 20 pmol/µl 0,375 150 nM
H2O 14,5
Totaal 30
DNA 20
Totaal volume 50
Tabel 11: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met yopP met pap31 met TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix.
Component Stockconcentratie Volume (µl) Finale concentratie
TaqMan® Fast Virus
1-Step Mastermix 4x 12,5 1x
p721 Bq Yop Fw 20 pmol/µl 0,75 300 nM
p722 Bq Yop Rv 20 pmol/µl 0,75 300 nM
p723 Bq Yop Pr 20 pmol/µl 0,625 250 nM
p727 Bh pap Fw 20 pmol/µl 0,75 300 nM
p728 Bh pap Rv 20 pmol/µl 0,75 300 nM
p729 Bh pap Pr 20 pmol/µl 0,625 250 nM
H2O 13,25
Totaal 30
DNA 20
Totaal volume 50
46
5.6. Validatiecriteria
5.6.1. Limit of detection (LOD)
De detectielimiet of “Limiet of detection” (LOD) is de laagste concentratie of de kleinste
hoeveelheid analyt waarbij ≥95% van de testen een positief resultaat geven, toegepast op een
verdunningsreeks van referentiemateriaal onder routinematige laboratoriumomstandigheden.
In dit onderzoek werd een verdunningsreeks van zowel de Vircell AmpliRun® Bartonella
quintana als Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle (5.1, Tabel 6) gebruikt als
referentiemateriaal.
5.6.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid
Om de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van de techniek te onderzoeken werden
respectievelijk een intrarun en interrun evaluatie uitgevoerd met Liquid Amies medium als
matrix. Iedere verdunning werd in drievoud ingezet om nazicht van herhaalbaarheid (intrarun)
te bekomen en werd samen met twee andere runs als evaluatie van reproduceerbaarheid
(interrun) gezien.
5.6.3. Juistheid
Om een correcte validatie voor een klinische setting te vervolledigen werden verschillende
klinische matrixen onderzocht om te achterhalen of een bepaalde matrix invloed heeft op de
gevoeligheid van de ontworpen RT-PCR.
De matrixen die gebruikt werden zijn:
- Liquid Amies medium (Copan): E-SwabTM is een vloeistof-gebaseerd systeem voor
staalcollectie, transport en bewaring. De staalname wordt verwezenlijkt door het
bestrijken van de geïnfecteerde plaats met de Nylon® Flocked Swab in een poging om
genoeg (cellulair) materiaal te bekomen. De wisser wordt terug in de huls gebracht die
1 ml Liquid Amies medium (Copan) bevat.
- Klierweefsel/weefselbiopt: een veel voorkomend symptoom, voornamelijk bij B.
henselae, is klierzwelling. Deze matrix werd meegenomen in de testreeks. Ter
voorbereiding werd het weefsel in een tube gebracht voor dissociatie van het weefsel
tot aparte cellen, met de gentleMACSTM dissociator (GentleMacs programma
m_spleen_01, 60 s).
- Etter: bartonellose veroorzaakt vaak wonden (en secundaire abcessen) met
pusvorming. Dit wondvocht is dikwijls de broedplaats van Bartonella spp. maar ook van
andere bacteriën en pathogenen. Het is van groot belang dat deze matrix onderzocht
wordt op eventuele reductie van de gevoeligheid.
- Volbloed: ook al wordt Bartonella spp. nauwelijks gedetecteerd in bloedstalen, werd
deze matrix toch meegenomen ter controle van de test. Theoretisch wordt Bartonella
spp. gekenmerkt door een intra-erytrocytaire replicatie.
47
Verschillende klinische stalen: klierweefsel, wondvocht en e-swab, positief voor Bartonella
henselae werden gemengd en gehomogeniseerd in één enkele tube. Vanuit dit B. henselae
positief mengstaal werd een verdunningsreeks opgesteld in 1X Tris-EDTA-buffer (1X TE)
volgens Tabel 12 zodat er 5 stalen bekomen werden (S0-S4) in een totaalvolume van 3 ml.
Tabel 12: Schema voor de verdunning van de mix gemaakt uit verschillende klinische stalen positief voor B. henselae.
Notatie Verdunnings-
factor Staalvolume
(µl) 1X TE (µl)
Totaal volume (µl)
Eindvolume (µl)
S0 0 3000 0 3000 2700
S1 10 300 dilutie 0 2700 3000 2100
S2 33 900 dilutie 1 2100 3000 2100
S3 100 900 dilutie 2 2100 3000 2700
S4 1000 300 dilutie 3 2700 3000 3000
Het eindvolume werd verdeeld in hoeveelheden van 100 µl om de verschillende matrixen mee
te spiken. Van iedere matrix werd 900 µl toegevoegd aan de respectievelijke mixverdunning
(S0 t.e.m. S4) zodat een eindvolume van 1 ml werd bekomen om te extraheren. Na het
uitvoeren van de RT-PCR konden de bekomen CT-waarden vergeleken worden met een
referentie, namelijk elke verdunning (S0 t.e.m. S4, 100 µl) met 900 µl 1X TE-buffer.
5.6.4. Interferentiestudie
Om de specificiteit van de RT-PCR te testen werden virussen, bacteriële culturen en protozoa
onderworpen aan de test. Tabel 13 toont de lijst van klinische pathogenen die getest zijn.
Tabel 13: De verschillende virussen en bacteriën die getest zijn om interferentie met de nieuwe methode te onderzoeken.
Virussen Bacteriën Protozoa
Adenoviridae Acinetobacter Toxoplasma
Cytomegalovirus (CMV) Atopobium vaginae
Enterovirus Enterococcus faecalis
Epstein–Barr virus (EBV) Escherichia coli
Human herpesvirus 1 (HHV-1) Gardnerella vaginalis
Human herpesvirus 2 (HHV-2) Haemophilus influenzae
Human herpesvirus 6 (HHV-6) Lactobacillus crispatus
Respiratoir Syncytiaal virus (RSV) Lactobacillus iners
Rhinovirus Pseudomonas aeruginosa
Varicella-zostervirus (VZV) Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus dysgalactiae
Streptococcus pneumoniae
Drie bacteriële suspensies (mix 1-3) werden aangemaakt (samenstelling hieronder) door met
een entlus bacteriële cultuur van de respectievelijke gegroeide agarplaat te schrapen en te
suspenderen in 1 ml fysiologisch water. Deze suspensie werd opgewarmd tot ongeveer 95°C
48
om de cellen open te breken. Na centrifugeren werd 500 µl supernatans gebruikt om extractie
op uit te voeren. De mixen bestonden uit:
- Mix 1: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus dysgalactiae
- Mix 2: Escherichia coli, Streptococcus agalactiae
- Mix 3: Acinetobacter, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus
De andere pathogenen vermeld in Tabel 13 werden getest door verschillende klinische stalen,
reeds positief bevonden aan bepaalde organismen, te hertesten tijdens de interferentiestudie.
5.6.5. Bewaarcondities monstermateriaal
Om de bewaarcondities van het monstermateriaal te onderzoeken werd de staalflow binnen
het ziekenhuis en van een extern afgenomen staal, inclusief transport, nagebootst. Dit werd
toegepast op zowel 1X TE als Liquid Amies medium (LA) als matrix. Tabel 14 geeft een
overzicht van de planning die gevolgd werd tijdens het uitvoeren van de testen.
Tabel 14: Overzicht timemanagement bewaarcondities voor validatie. Alle stalen werden op dezelfde dag onderworpen aan
RT-PCR. Reeds geëxtraheerde stalen werden in de koelkast bewaard.
Legende: oranje=extractie, groen=RT-PCR, KT=kamertemperatuur, 3-8°C=koelkasttemperatuur, -20°C=diepvriestemperatuur.
Staaln° Samenstelling Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag 5 Dag 6 Dag 7
1 100µL S0 + 900µL LA
KT
2 100µL S0 + 900µL LA
KT 3-8°C 3-8°C
3 100µL S0 + 900µL LA
KT -20°C -20°C
4 100µL S0 + 900µL LA
KT 3-8°C 3-8°C KT KT
5 100µL S0 + 900µL LA
KT -20°C -20°C KT KT -20°C
6 100µL S0 +
900µL punctie KT
7 100µL S0 +
900µL punctie KT 3-8°C 3-8°C
8 100µL S0 +
900µL punctie KT -20°C -20°C
9 100µL S0 +
900µL punctie KT 3-8°C 3-8°C KT KT
10 100µL S0 +
900µL punctie KT -20°C -20°C KT KT -20°C
5.7. Sanger sequencing
Tijdens het uitvoeren van de sequenering werd gewerkt volgens de standard operating
procedure (SOP) die reeds gebruikt wordt in het AZ Sint-Jan te Brugge. De SOP beschrijft de
methode ter identificatie van onbekende bacteriële isolaten aan de hand van 16S rRNA-
gensequenering. Deze methode is gebaseerd op een PCR reactie voor het specifiek
amplificeren van een 774 bp fragment van het 16S rRNA-gen. Na amplificatie werd het
bekomen fragment gesequeneerd. Als de definitieve sequentie gekend is, werd identificatie
bekomen door te vergeleken t.o.v. een database met sequenties van 16S rRNA gen
49
fragmenten van gekende bacteriën. Hiervoor werd Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST) gebruikt. Figuur 18 geeft een schematische voorstelling van alle stappen.
Figuur 18: Schematisch overzicht van de stappen die werden gevolgd volgens de reeds beschreven SOP om het 774 bp
fragment van het 16S rRNA gen van stalen te sequeneren en het betrokken micro-organisme te identificeren.
5.7.1. PCR-amplificatie
Er werd een reactiemix (20 µl/reactie) aangemaakt volgens Tabel 15. De volumes werden
vermenigvuldigd met het aantal reacties die uitgevoerd werden. Bij iedere toevoeging aan de
mix werd gemengd door telkens op en neer te pipetteren. Aan iedere MicroAMP reaction tube
werd 5 µl DNA toegevoegd.
Tabel 15: Samenstelling van de AmpliTaq Gold PCR-mix voor één PCR-amplificatiereactie.
Component Stockconcentratie Volume (µl) Finale concentratie
AmpliTaq Gold DNA
polymerase 0,2
Buffer 10x 2,5 1x
dNTP 5 mM 1 200 µM
Forward primer (140-27F) 20 pmol/µl 1 0,8 µM
Reverse primer (141-801R) 20 pmol/µl 1 0,8 µM
MgCl2 25 mM 1,5 1,5 mM
RNase/DNase vrij water 12,8
Volume 20
DNA 5
Totaal volume 25
Praktische opmerkingen:
DNA-polymerase werd kort voor gebruik uit de diepvries gehaald en na gebruik onmiddellijk
terug geplaatst. Als negatieve controle werd 5 µl pure water toegevoegd i.p.v. DNA.
Alle MicroAMP reaction tubes werden in de blok van de thermocycler (GeneAmp® PCR
System 9700, Applied Biosystems®) geplaatst en volgens onderstaand programma (Tabel 16)
uitgevoerd.
50
Tabel 16: Runprotocol om PCR-amplificatie uit te voeren met AmpliTaq Gold DNA polymerase.
Stap Tijd Temperatuur # cycli
Hot start 5 min 95°C
Denaturatie 45 s 95°C
35 Annealing 45 s 50°C
Extensie 1 min 30 72°C
Einde PCR-cyclus/
bewaring ∞ 4°C
5.7.2. Agarosegelelektroforese
Er werd een 1.5 % agarosegel aangemaakt volgens onderstaande werkwijze:
- Weeg 1,5 g agarosegel af in een erlenmeyer.
- Voeg 40 ml TBE-buffer en 4 µl SYBR SAFE toe.
- Verwarm nu de agaroseoplossing in de microgolf op 900 W gedurende 2 min.
- Neem een gelhouder en plak af met plakband.
- Haal de warme erlenmeyer met de agaroseoplossing uit de microgolf en laat
gedeeltelijk afkoelen.
- Giet de erlenmeyer leeg in de afgeplakte gelhouder zodat alles goed verdeeld is.
(Vermijd luchtbellen)
- Plaats de kam in de gel (voordat de gel stolt).
- Laat de gel gedurende minstens 20 minuten en maximum 60 minuten stollen.
De gel werd geladen door het uitvoeren van volgende stappen:
- Neem een microtiterplaat, de bekomen amplicons en een tube Nucleic Acid Sample
Loading Buffer.
- Breng 3 µl 5x loading buffer over in een microtiterplaat op evenveel cupjes als er stalen
zijn.
- Voeg 5 µl amplicon toe en meng goed op.
- Plaats nu de vooraf gemaakt agarosegel in de elektroforesetank zodat deze volledig
onder de buffer zit.
- Voeg 2 µl 100 bp ladder (EZ loadTM 100 bp PCR Molecular Ruler, Bio-Rad) in het eerste
welletje.
- Voeg 8 µl van het amplicon-Nucleic Acid Sample Loading Buffer-mengsel toe aan de
volgende welletjes, zorg dat alles in het overeenkomstig welletje terecht komt.
- Eindig door terug 2 µl 100 bp ladder aan te brengen.
De elektroforesetank (Bio-Rad) werd gesloten en de elektroforese werd gedurende 50 min. bij
150 V uitgevoerd. Het DNA (negatieve fosfaatgroepen) loopt van de negatieve pool naar de
positieve pool. De elektroforesetank is goed gemonteerd als aan de kant van de stalen (de
negatieve pool) belletjes verschijnen als de spanning aangelegd wordt.
51
Er werd een foto van het gel gemaakt met behulp van het aanwezige camerasysteem
(GenoSmart2, VWR®). Banden van ongeveer 774 bp moeten zichtbaar zijn om de procedure
verder te kunnen zetten.
5.7.3. DNA-sequentiebepaling
5.7.3.1. Opzuiveren van het PCR-product
Er werden eenzelfde aantal 200 µl MicroAMP reaction tubes met dekseltje als bij de PCR-
amplificatie in een 96-well PCR-cooler geplaatst. Vervolgens werd ExoSAP-IT uit de diepvries
gehaald en op een Mini Cooler geplaatst gedurende de ganse procedure. In ieder tube werd
3,0 µl ExoSAP-IT® en 7,5 µl PCR-amplificatieproduct toegevoegd. Aangezien ExoSAP-IT zeer
visceus is, werd goed gemengd. Onmiddellijk na de uitvoering werd ExoSAP-IT in de diepvries
en de tubes in de thermocycler geplaatst. Tabel 17 toont het uitgevoerde runprotocol voor
ExoSap-IT.
Tabel 17: Runprotocol voor ExoSAP-IT voor de opzuivering van de PCR-producten.
Stap Tijd Temperatuur
Degradatie van primers en dNTP’s 30 min 37°C
Degradatie van enzymen 20 min 80°C
Einde PCR-cyclus/bewaring ∞ 4°C
Na het beëindigen van het programma zijn de producten klaar om gebruikt te worden voor
DNA-sequentiebepaling. Opgezuiverde producten werden bewaard gedurende enkele dagen
bij 2°C-8°C, indien langer bij -20°C tot -24°C.
5.7.3.2. DNA-sequentiereactie
Voor iedere primer apart (één forward en één reverse) werd een sequencing mastermix (9
µl/reactie) aangemaakt volgens Tabel 18. Het aantal reacties werden vermenigvuldigd met de
volumes om een correct eindvolume te bekomen. De mix werd verdeeld (9 µl/tube) over het
nodige aantal 200 µl MicroAMP reaction tube met dekseltje. Er werd 1 µl gezuiverd PCR-
product toegevoegd per reagensmix (FW en RV).
Tabel 18: Samenstelling mastermix voor één sequentiereactie. Er moet voor elke primer apart een mix aangemaakt worden.
Component Stockconcentratie Volume (µl) Finale concentratie
BigDye Mix v1,1 1
BigDye buffer 1
FW/RV-primer* 20 pmol/µl 1 2 µM
RNase/DNase vrij water 6
Volume 9
DNA 1
Totaal volume 10
* FW-primer = p140-27F; RV-primer = p141-801R
52
De stalen werden in de blok van de thermocycler gebracht en het programma volgens
onderstaande tabel (Tabel 19) werd gestart.
Tabel 19: Programma thermocycler voor de DNA-sequentiereactie.
Stap Tijd Temperatuur # cycli
Hot start 6 min 98°C
Denaturatie 10 s 96°C
25 x Annealing 10 s 50°C
Extensie 2 min 60°C
Bewaring ∞ 4°C
5.7.3.3. Sephadex kolomzuivering
Een Sephadex kolom werd aangemaakt volgens onderstaande werkwijze:
- Neem de Multiscreen 45 µl Column loader en de Scraper en plaats op een wit, proper
papier.
- Giet SephadexTM G-50 op de Multiscreen 45 µl Column loader en vul de wells van de
door open te wrijven/ schrapen met behulp van de bijgeleverde Scraper.
- Plaats multiscreen HV plaat op de Multiscreen 45 µl Column loader en draai in een
vlotte beweging om. De SephadexTM G-50 zou in de multiscreen HV plaat moeten
vallen. Tik nog even op de Multiscreen 45 µl Column loader om zeker te zijn dat alles
uit de Multiscreen 45 µl Column loader is overgebracht.
De Sephadex kolom ‘wellen’ werd bekomen door 300 µl gedeïoniseerd water toe te voegen
aan iedere well die men wenst te gebruiken. De kolommen vormden zich door de plaat
gedurende minimum 3 uur en maximum 24 uur afgedekt met EASYseal kleeffolie te laten staan
in de koelkast. De Multiscreen HV plate werd op een 96 well microtiterplaat geplaatst met een
Multiscreen Align Frame Blue er tussenin. Er werd gecentrifugeerd bij 2500 rpm (= 750 x g)
gedurende 5 minuten. Aan ieder sequencingproduct werd 20 µl gedeïoniseerd water
toegevoegd. Vervolgens werd de Multiscreen HV plate op een 96-well PCR-plaat geplaatst en
werd 20 µl van het respectievelijke staal over gepipetteerd op de overeenkomstige Sephadex
kolom in het midden van de well. De platen werden bij 2500 rpm (= 750 x g) gedurende 5
minuten gecentrifugeerd. Aangezien de apparatuur (3500XL) 3 kolommen (24 injecties) per
run gebruikt en omdat de capillairen niet droog mogen staan, werd in de nodige lege cupjes
water toegevoegd. Indien de 96-well PCR-plaat niet onmiddellijk op de sequencer werd
geplaatst, werd de plaat bewaard in de koelkast (2°C tot 8°C). Indien het tijdsinterval langer
dan 24 uur was, werd het in de diepvries (-20°C tot -24°C) bewaard.
Na de run op ABI 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems®) werd de bekomen
sequentie geanalyseerd door het softwareprogramma SeqMan Pro, aangeboden door
DNAstar. De finale sequenties worden verwerkt aan de hand van het BLAST-programma
aangeboden door de website van National Center for Biotechnology Information (NCBI).
53
6. Resultaten en bespreking
6.1. Selectie primers en probes
In deze studie werd voor elk organisme telkens twee primer/probeparen ontworpen met elk
hun specifieke target. De sequenties en details van de hieronder geselecteerde primers en
probes worden niet weergegeven wegens confidentialiteit.
6.1.1. Bartonella spp.
In de literatuur worden voornamelijk het 16S rRNA-gen en de regio tussen het 16S- en
23S rRNA-gen als mogelijke doelwitsequentie beschreven (Johnson et al., 2003) voor het
ontwikkelen van een generische Bartonella PCR. Het ontwikkelen van een PCR-analyse op
basis van deze targets is complex aangezien in deze regio’s van het genoom enige
heterogeniteit bestaat tussen verschillende Bartonella-species. Het zoeken naar
geconserveerde regio’s, eventueel in combinatie met degeneraties in primers en probes, laat
het toe om een generische PCR te ontwikkelen. Edouard et al. (2015) omschrijft de RT-PCR
techniek als een bruikbare, gevoelige, specifieke en snelle tool voor de diagnose van
Bartonella endocarditis op basis van hartklepbiopten, dit in tegenstelling tot de mindere
gevoeligheid indien rechtstreeks op bloed of serum gewerkt wordt.
6.1.2. Bartonella quintana
Michelet et al. (2014) beschrijft het bqtR gen als doelwitsequentie en dient als basis voor de
ontwikkeling van de primers voor de TaqMan RT-PCR. Het bqtR gen werd ook al bij Arvand
et al. (2010) beschouwd als mogelijk target aangezien die regio constant blijft over
verschillende stammen van B. quintana. Uit het onderzoek van Liberto et al. (2013) bleek dat
de ontwikkelde primers voor het bqtR gen zowel B. quintana als B. henselae amplificeren. Een
mogelijke verklaring is dat het bqtR gen van B. quintana homoloog is aan het batR gen van B.
henselae.
Naast bqtR als target werd ook yopP gen omschreven als doelwitsequentie voor amplificatie
van B. quintana (Angelakis et al., 2011; Edouard et al., 2015). In deze studies werden de
regio’s dermate geselecteerd dat de in silico gegenereerd primers species-specifiek waren,
geconfirmeerd met de BLAST-analyse.
6.1.3. Bartonella henselae
Een onderzoek van Michelet et al. (2014) toonde aan dat het pap31 gen als target toelaat om
B. henselae te detecteren. Een ander doelwitsequentie, nl. het gltA gen wordt beschreven door
Klangthong et al. (2015) en Fard et al. (2016). In de laatst genoemde studie gaf slechts 7,14%
van de nagelstalen en 1,42% van de speekselstalen positieve resultaten voor B. henselae.
6.2. Optimalisatie primers en probes aan de hand van uniplex PCR
6.2.1. Functionaliteit primers
In eerste instantie werden de aangekochte primers (5.3, Tabel 7) getest op hun functionaliteit
door gebruik te maken van een RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix. Alle primers
werden aangekocht bij de firma IDT (Integrated DNA Technologies) aan een concentratie van
54
100 μM. Tijdens de RT-PCR-reactie bedroeg de finale concentratie van iedere primer 300 nM.
De test werd in tweevoud uitgevoerd op zowel de Vircell AmpliRun® Bartonella quintana als
Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle (resultaten in Bijlage II, Tabel 30). Het
beoogde resultaat is, per uniplex, het optreden van amplificatie met CT-waarde onder 30 en
zonder indicatie van aspecifieke amplificatie tijdens de smeltcurve-analyse.
Alle primerparen voldoen aan het vooropgestelde doel en gaven een goede amplificatiecurve
(Figuur 19), uitgezonderd voor de primerparen pap31 en gltA waarvoor minstens 50% vals
positieve waarden werden bekomen voor de Vircell AmpliRun® Bartonella quintana.
Om mogelijke fouten uit te sluiten werd er op alle primerparen nogmaals een RT-PCR met
SYBR® Select Mastermix uitgevoerd, ditmaal op een verdunningsreeks van de Vircellcontroles.
Voor uitgebreide resultaten wordt verwezen naar Tabel 31 en Tabel 32 in Bijlage II.
Opnieuw werden goede resultaten bekomen behalve voor de primerparen pap31 en gltA als
de test werd uitgevoerd op Vircell AmpliRun® Bartonella quintana. Opmerkelijk was dat de CT-
waarden voor het primerpaar pap31 ongeveer gelijk waren en rond een gemiddelde waarde
van 38 lagen. Nader onderzoek toonde aan dat de forwardprimer van pap31 een self-dimer
kan vormen, wat mogelijks de reden is van de bekomen vals positieve resultaten. Na het
uitvoeren van een negatieve controle werd vastgesteld dat een CT-waarde van 38,56 werd
bekomen. De bijhorende smelttemperatuur van 73,4°C stemt overeen met de
smelttemperatuur van het primer-dimeer van de forwardprimer. Er werd verondersteld dat het
probleem eventueel opgelost zou worden door gebruikt te maken van een probe in RT-PCR
met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. De vals positieve resultaten voor het primerpaar
gltA lag minder voor de hand aangezien de CT-waarden niet overeenstemden. Na enig
opzoekingswerk bleek dat het doelwitsequentie leek op een sequentie van Bartonella
quintana. Met slechts één mismatch in de forwardprimer en twee mismatches in de
reverseprimer kon ook Vircell AmpliRun® Bartonella quintana geamplificeerd worden.
Er kan besloten worden dat de primers bruikbaar zijn voor verdere evaluatie en functioneel zijn
mits verder onderzoek aan de hand van probes. Voor B. henselae gaat de voorkeur uit naar
de primerparen pap31 maar het andere primerpaar wordt nog niet verworpen en wordt
meegenomen in verder onderzoek.
55
Figuur 19: Amplificatie plot van alle primerparen na toepassing van SYBR® Select Mastermix op Vircell AmpliRun®
Bartonella quintana.
6.2.2. PCR-efficiëntie
Per pathogeen werden meerdere primerparen getest op hun functionaliteit. De volgende stap
in het optimalisatieproces was per pathogeen en per target het meest gevoelige en efficiëntste
paar te selecteren. Om de resultaten te evalueren werd rekening gehouden met
vooropgestelde voorwaarden voor meetbereik en lineariteit. Deze voorwaarden zijn:
- Meetbereik: 102-106 kopijen/ml
- Regressiecoëfficiënt R² > 0,95 (over minstens 4 diluties)
- 0,9 ≤ efficiëntie ≤ 1,1
Er werd een zesvoudige verdunningsreeks aangemaakt van de twee Vircellcontroles. Voor
iedere verdunning werden de bekomen CT-waarden geregistreerd (ruwe data Bijlage II, Tabel
31 en Tabel 32) en in functie van log10 van de concentratie grafisch uitgezet. Uit deze
grafische weergave kan de efficiëntie van de betreffende RT-PCR berekend worden, welke
gecorreleerd is met de gevoeligheid van de test (Tabel 20). De efficiëntie wordt berekend aan
de hand van volgende formule:
E = 10(-1/helling) – 1
gltA
pap31
16S-23S RNA
16S rRNA gene
yopP
bqtR
56
Tabel 20: Efficiëntie van ieder primerpaar voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-controle.
groen: voldoet aan de voorwaarde; rood: voldoet niet aan de voorwaarde.
Organisme Naam Vircell AmpliRun® DNA-controle
Bartonella quintana Bartonella henselae
Helling R² E Helling R² E
Bartonella spp.
p715 Bart Fw -3,69 1,00 0,87 -3,81 1,00 0,83
p716 Bart Rv
p718 Bart 16 Fw -3,35 1,00 0,99 -3,42 1,00 0,96
p719 Bart 16 Rv
Bartonella quintana
p721 Bq Yop Fw -3,08 0,99 1,11 - - -
p722 Bq Yop Rv
p724 Bq bqtr Fw -3,67 1,00 0,87 - - -
p725 Bq bqtr Rv
Bartonella henselae
p727 Bh pap Fw - - - -3,71 1,00 0,86
p728 Bh pap Rv
p730 Bh glta Fw - - - -3,72 0,98 0,86
p731 Bh glta Rv
Zowel 16S rRNA gene voor Bartonella spp. als yopP voor B. quintana geeft de gevoeligste en
efficiëntste RT-PCR-resultaten. Voor B. henselae is er nog steeds een probleem van de
forwardprimer die een self-dimer kan vormen bij pap31 waardoor een lage efficiëntie bekomen
wordt. Aan dit primerpaar werd nog een kans gegeven wegens het eventueel wegvallen van
het probleem eens een probe gebruikt zal worden. Het andere primerpaar, nl. gltA, heeft ook
een efficiëntie die afwijkt van de vooropgestelde voorwaarde. Ook de andere primerparen voor
Bartonella spp. en B. quintana, respectievelijk 16S-23S RNA intergenic region en bqtR gaven
geen optimale efficiëntiewaarden.
De overgebleven primerparen, één voor ieder organisme, werden nogmaals onderworpen aan
een RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix maar ditmaal op een verdunningsreeks van
Bartonella-plasmide DNA. Hieruit werden opnieuw een grafische weergave bekomen door de
CT-waarden uit te zetten in functie van log10 van de concentratie. Na efficiëntieberekening kon
geconcludeerd worden dat alle geselecteerde primerparen tussen de opgestelde grenzen
lagen (Tabel 21).
57
Tabel 21: CT-waarden en efficiëntie van de overgebleven primerparen, één voor ieder organisme, op het Bartonella-
plasmide.
groen: goed resultaat/voldoet aan de voorwaarde.
Organisme Naam CT-waarden Parameter
107 106 105 104 103 Helling R² E
Bartonella
spp.
p718 Bart 16 Fw 21,13 24,70 28,49 31,20 35,89 -3,56 0,98 0,91
p719 Bart 16 Rv
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw 21,77 25,13 28,98 31,89 35,15 -3,44 1,00 0,95
p722 Bq Yop Rv
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw 22,62 26,49 30,61 33,19 37,63 -3,44 1,00 0,95
p728 Bh pap Rv
6.2.3. Smeltcurveanalyse
Volgend op de efficiëntiebepaling van de RT-PCR-reactie (6.2.2) werd de smeltcurve
geëvalueerd. Er is een mogelijkheid dat aspecifieke amplificatie optreedt door een afnemende
targetconcentratie ten opzichte van een constante primerconcentratie. Relatief gezien, in een
verdunningsreeks, neemt de primerconcentratie toe ten opzichte van de dalende
targetconcentratie waardoor aspecifieke fragmenten zoals primer-dimeren sneller gevormd
kunnen worden. In deze analyse wordt de amplificatiecurve samen met de respectievelijke
smeltcurve bekeken (Figuur 20 en Figuur 21).
Bij de smeltcurveanalyse van primerpaar pap31 werd al snel een aspecifieke piek opgemerkt
bij 73,5°C voor verdunning 102. Dit bevestigt nogmaals het vermoeden van de forwardprimer
van pap31 die een self-dimer kan vormen.
Figuur 20: Amplificatie plot van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix op zesvoudige verdunning
van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae.
58
Figuur 21: Smeltcurve van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix op zesvoudige verdunning van
Vircell AmpliRun® Bartonella henselae. Er is duidelijk een aspecifieke piek bij 73,5°C voor verdunning 102 wat wijst op het
primer-dimeer.
6.2.4. Specificiteitscontrole
De specificiteit van de primerparen werd getest door gebruik te maken van bacteriële culturen.
Van deze culturen werden 3 mixen aangemaakt met volgende samenstelling:
- Mix 1: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus dysgalactiae
- Mix 2: Escherichia coli, Streptococcus agalactiae
- Mix 3: Acinetobacter, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus
De mixen werden onderworpen aan de RT-PCR met SYBR® Select Mastermix in combinatie
met alle primerparen. De bekomen resultaten zijn terug te vinden in Bijlage III, Tabel 33. De
verwachting bij een zeer specifieke reactie is dat geen amplificatie plaatsvindt in aanwezigheid
van vreemd DNA.
Voor beide primerparen van het organisme B. quintana, nl. yopP en bqtR werd het vreemd
DNA niet geamplificeerd waardoor besloten kan worden dat beide primerparen zeer specifiek
zijn. Ook het primerpaar gltA voldeden aan de specificiteitscontrole maar het primerpaar pap31
vertoonde wel amplificatie bij mix 1. Hierbij viel op dat de CT-waarde 39 is, wat in de buurt ligt
van het reeds bekomen CT-waarden van de verdunningsreeks van Vircell AmpliRun®
Bartonella quintana (Tabel 31, Bijlage II). Uit verder onderzoek werd vastgesteld dat zowel de
vooraf opgemerkte CT-waarden als het voorval van de amplificatie bij mix 1 eenzelfde
smelttemperatuur van 73°C vertonen. Deze temperatuur stemt namelijk overeen met de
59
smelttemperatuur van het primer-dimer van de forwardprimer. Dit bevestigt nogmaals het
vermoeden van self-dimeervorming als er te weinig target aanwezig is. Verder onderzoek moet
gebeuren en het probleem kan eventueel opgelost worden door gebruik te maken van een
probe.
16S-23S RNA intergenic region vertoont bij elke bacteriële mix amplificatie. Voor target 16S
rRNA gene is dit minder het geval, nl. enkel mix 3 gaf een vals positief resultaat. Dit dient
verder onderzocht te worden en kan eventueel ook met tussenkomst van een probe vermeden
worden.
6.2.5. Functionaliteit probe
Na de eerste optimalisatiestap waarbij SYBR® Select Mastermix werd gebruikt, kon
overgegaan worden naar een verdere optimalisatie met TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix. Deze mastermix wordt gebruikt voor virale DNA en RNA targets met als gevolg
een hoge gevoeligheid, minder inhibitie en een snellere amplificatierun.
Het toevoegen van een fluorescente probe dient om, in combinatie met de geselecteerde
primers, absolute specificiteit te garanderen. Voor ieder primerpaar, twee per organisme, werd
een probe ontworpen (5.3, Tabel 7) en aangekocht bij de firma IDT (Integrated DNA
Technologies) aan een stockconcentratie van 100 µM. Vanaf deze stap wordt overgeschakeld
op TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix waarbij vaste concentraties voor zowel primers en
probe worden aangehouden, respectievelijk 300 nM en 250 nM. Opnieuw werden de beide
verdunningsreeksen van de Vircell DNA-controles gebruikt (ruwe data Tabel 34 en Tabel 35
in Bijlage IV).
Uit deze preliminaire resultaten kan er voor Bartonella spp. besloten worden dat enkel met
16S rRNA gene verder kan gewerkt worden. Het andere doelwitgen, nl. 16S-23S RNA
intergenic region, gaf goede resultaten voor de beide Vircellcontroles maar gaf een vals positief
resultaat voor de negatieve controle. Bij een tweede maal uitvoeren van de test dook dit
probleem nogmaals op.
Voor Bartonella quintana trad bij doelwitgen bqtR slechts éénmaal amplificatie op. Dit duidt op
slechte gevoeligheid. Bij doelwitgen yopP werd eenzelfde gevoeligheid bekomen als voor
doelwitgen 16S rRNA gene bij Bartonella spp. waaruit besloten kan worden dat de probe zorgt
voor een goede gevoeligheid van de test.
Als laatste werden de resultaten van Bartonella henselae geanalyseerd en werd geconstateerd
dat doelwitgen pap31 ongeveer 100x gevoeliger is dan doelwitgen gltA.
Vervolgens werd opnieuw per pathogeen en per target de meest gevoelige en efficiëntste
primers-probe geselecteerd door de resultaten te evalueren. Hierbij werd rekening gehouden
met vooropgestelde voorwaarden voor meetbereik en lineariteit:
- Meetbereik: 102-106 kopijen/ml
- Regressiecoëfficiënt R² > 0,95 (over minstens 4 diluties)
- 0,9 ≤ efficiëntie ≤ 1,1
60
Net zoals in 6.2.2 werd aan de hand van een verdunningsreeks van de twee Vircell DNA-
controles de efficiëntie berekend. De bekomen CT-waarden (Bijlage IV, Tabel 34 en Tabel 35)
voor iedere verdunning werd in functie van log10 van de concentratie grafisch uitgezet waarbij
de efficiëntie werd berekend (Tabel 22) aan de hand van de reeds gegeven formule:
E = 10(-1/helling) – 1
Tabel 22: Efficiëntie van ieder primers/probe voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-controle.
groen: voldoet aan de voorwaarde; rood: voldoet niet aan de voorwaarde.
Organisme Naam Vircell AmpliRun® DNA-controle
Bartonella quintana Bartonella henselae
Helling R² E Helling R² E
Bartonella spp.
p715 Bart Fw
-2,05 0,86 2,07 -2,63 0,97 1,40 p716 Bart Rv
p717 Bart Pr
p718 Bart 16 Fw
-3,62 1,00 0,89 -3,66 1,00 0,88 p719 Bart 16 Rv
p720 Bart 16 Pr
Bartonella quintana
p721 Bq Yop Fw
-3,32 0,94 1,00 - - - p722 Bq Yop Rv
p723 Bq Yop Pr
p724 Bq bqtr Fw
Niet voldoende
data - - - p725 Bq bqtr Rv
p726 Bq bqtr Pr
Bartonella henselae
p727 Bh pap Fw
- - - -3,88 1,00 0,81 p728 Bh pap Rv
p729 Bh pap Pr
p730 Bh glta Fw
- - - Niet voldoende
data p731 Bh glta Rv
p732 Bh glta Pr
Uit de resultaten kan besloten worden dat met de primers/probe van zowel bqtR als gltA niet
kan verder gewerkt worden in het validatieplan aangezien de bekomen data van die mate zijn
dat er geen efficiëntie kan berekend worden. De efficiëntie van het doelwitgen yopP is in
vergelijking met de vorige berekeningen (Tabel 20) verbeterd. De efficiëntie van het doelwitgen
pap31 geeft na vergelijking ongeveer hetzelfde resultaat.
Voor Bartonella spp. is duidelijk dat er geen betrouwbare waarde voor de efficiëntie aanwezig
is bij 16S-23S RNA intergenic region.
Om de volledigheid van de optimalisatie te bekomen werden, net zoals in 6.2.2, de
primers/probe van 16S rRNA gene, yopP en pap31 opnieuw onderworpen aan een test met
de TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix, maar dit maal werd een verdunningsreeks van
Bartonella-plasmide DNA gebruikt en werd in tweevoud uitgetest. Na efficiëntieberekening
(Tabel 23) werden de resultaten vergeleken met de efficiëntieresultaten van Tabel 21 waaruit
bleek dat de efficiëntie nog beter is door gebruik te maken van een probe voor detectie.
61
Tabel 23: Gemiddelde CT-waarden en efficiëntie van de primers/probe, één voor ieder organisme, op het Bartonella-
plasmide.
groen: goed resultaat/voldoet aan de voorwaarde.
Organisme Naam CT-waarden Parameter
107 106 105 104 103 Helling R² E
Bartonella
spp.
p718 Bart 16 Fw
21,47 25,21 28,19 31,06 35,53 -3,40 0,99 0,97 p719 Bart 16 Rv
p720 Bart 16 Pr
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw
20,88 24,49 27,63 31,05 34,47 -3,37 1,00 0,98 p722 Bq Yop Rv
p723 Bq Yop Pr
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw
21,71 25,48 28,52 31,68 35,31 -3,34 1,00 0,99 p728 Bh pap Rv
p729 Bh pap Pr
6.2.6. Specificiteit probe
De specificiteitscontrole gerelateerd aan de tussenkomst van de probes werd op dezelfde
manier getest als deze van de primers. De drie bacteriële mixen aangehaald in 6.2.4 werden
onderworpen aan TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. De bekomen resultaten zijn
opgenomen in Bijlage V, Tabel 36.
Voor de beide primers/probe van zowel B. quintana als B. henselae trad geen amplificatie op
bij de bacteriële mixen. Dit lost de verwachting van een zeer specifieke reactie in, ook in
aanwezigheid van vreemd DNA. Ook is op te merken dat voor pap31 geen vals positief
resultaat meer te bespeuren is bij zowel de negatieve controle als mix 1. Dit duidt op het
wegvallen van het eerder vastgestelde probleem toen enkel primers gebruikt werden. De
primer-dimeren zijn waarschijnlijk nog aanwezig maar worden niet gedetecteerd door de
probe, in tegenstelling tot de toepassing met SYBR® Select Mastermix. De probe kan het
primer-dimeer omzeilen zodat de test een hogere specificiteit vertoont.
16S-23S RNA intergenic region geeft, in vergelijking met de specificiteitscontrole met SYBR®
Select Mastermix (6.2.4), enkel een vals positief resultaat bij mix 2. Een groter probleem stelt
zich bij 16S rRNA gene waarbij zowel bij mix 1 als mix 3 een vals positief resultaat opduikt,
wat in tegenstrijd is met de specificiteitscontrole met SYBR® Select Mastermix (6.2.4). Nader
onderzoek wees uit dat een verhoging van de threshold van 0,05 naar 0,225 het probleem van
de vals positieve resultaten van mix 1 en mix 3 wegwerkt. Figuur 22 toont aan dat bij een
threshold van 0,225 mix 1 en mix 3 niet meer gedetecteerd worden maar de positieve controle
wel nog stand houdt. Figuur 23 benadrukt het belang van het bekijken van de multicomponent
plot om mogelijke aspecifieke amplificatie uit te sluiten, die makkelijk te onderscheiden is van
de positieve controles door hun lage ΔRn. Deze vaststellingen dienen meegenomen te worden
in het verder onderzoek.
62
Figuur 22: Verschil tussen de amplificatie plot van 16S rRNA gene op mix 1 en 3 en positieve Vircellcontrole.
A: Amplificatie plot van 16S rRNA gene als de threshold zoals anders op 0,05 wordt gehouden. B: : Amplificatie plot van 16S
rRNA gene met een verhoogde threshold naar 0,225.
Figuur 23: Multicomponent plot van de target 16S rRNA gene op de positieve Vircellcontrole, negatieve controle en
bacteriële mix 1-3.
6.2.7. Primer/probeselectie
Op basis van de voorgaande testen werd per organisme een verdere selectie doorgevoerd. Er
werd telkens één primerpaar met respectievelijke probe aangewezen als beste methode om
multiplex op toe te passen.
Aangezien het primerpaar van de doelwitsequentie 16S-23S RNA intergenic region bij de
specificiteitscontrole voor alle bacteriële mixen vals positieve resultaten gaf en dit probleem
niet werd opgelost door tussenkomst van een probe, werd dit paar verworpen om nog verdere
testen mee uit te voeren. Bartonella spp. zal door het primerpaar en de probe van het target
A B
Positieve
Vircellcontrole
Mix 1
Mix 3
Mix 2
Negatieve controle
63
16S rRNA gene gedetecteerd kunnen worden mits verder onderzoek in verband met de
specificiteit.
Voor B. quintana kan geconcludeerd worden dat het primerpaar en de probe yopP behouden
wordt gezien betere efficiëntie dan het primerpaar en de probe bqtR. Er werd voor
primers/probe bqtR geen efficiëntie teruggevonden door te weinig betrouwbare data wat wijst
op lage gevoeligheid.
Als laatste werd voor B. henselae het primerpaar pap31 uitgekozen. De veronderstelling dat
het probleem van self-dimer opgelost zou worden door een probe te gebruiken, werd
bevestigd. Het andere primerpaar, nl. gltA, gaf vals positieve waarden voor Vircell AmpliRun®
Bartonella quintana en dit kon niet opgelost worden met tussenkomst van een probe. Ook de
efficiëntie van primers/probe kon niet berekend worden door een gebrek aan resultaten wat
wijst op lagere gevoeligheid.
Samengevat, wordt mee verder gewerkt:
- Uniplex 16S rRNA gene voor de detectie van Bartonella spp.
- Uniplex yopP voor de detectie van B. quintana
- Uniplex pap31 voor de detectie van B. henselae
6.3. Multiplex PCR
Om de reactie- en detectiesnelheid op te drijven, werden de geselecteerde primers en probe
per organisme onderworpen aan een multiplex RT-PCR setting. Dit betekent dat de uniplex
RT-PCRs samen worden genomen tot twee, drie of zelfs vier testen in één PCR-reactie. Er
werd tijdens het onderzoek, naast de geselecteerde uniplex RT-PCRs, gebruik gemaakt van
een reeds gevalideerde interne inhibitie- en amplificatiecontrole, nl. SHV.
In dit onderzoek werd geopteerd om twee duplex RT-PCRs toe te passen aangezien triplex of
quadruplex vermoedelijk interferentie met zich mee zou brengen. M.a.w. het zou een te
complexe optimalisatie inhouden met een hogere kans op onderlinge interactie van de primers.
Er werd gewerkt met een generische RT-PCR voor algemene gevoelige detectie van 16S
rRNA gene gecombineerd met SHV als detectie van de interne controle. Als tweede duplex
RT-PCR werd een species-specifieke methode toegepast door zowel pap31 als yopP in één
reactie te verwerken. De beide duplex RT-PCRs moeten elkaar confirmeren voordat een
conclusie kan getrokken worden.
Vanaf dit onderdeel wordt de duplex RT-PCR 16S rRNA gene en SHV vaak besproken als
“generische RT-PCR” terwijl aan de duplex RT-PCR yopP en pap31 de term “specifieke RT-
PCR” wordt gegeven.
6.3.1. Efficiëntievergelijking
Om de efficiëntie van de duplex RT-PCRs te vergelijken met deze van de respectievelijke
uniplex RT-PCR (Tabel 23), wordt voor iedere duplex RT-PCR een verdunningsreeks van
Bartonella-plasmide DNA onderworpen aan de TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. De
ruwe data van de bekomen CT-waarden voor iedere duplex RT-PCR zijn opgenomen in Bijlage
VI (Tabel 37). Tabel 24 geeft een vergelijkende studie van de efficiëntie bekomen door uniplex
64
en duplex RT-PCR. Ook hier werd rekening gehouden met vooropgestelde voorwaarden voor
meetbereik en lineariteit:
- Meetbereik: 102-106 kopijen/ml
- Regressiecoëfficiënt R² > 0,95 (over minstens 4 diluties)
- 0,9 ≤ efficiëntie ≤ 1,1
De efficiëntie werd berekend aan de hand van de formule:
E = 10(-1/helling) – 1
Tabel 24: Efficiëntie van zowel de duplex RT-PCRs als de primers/probe, één voor ieder organisme uitgevoerd met
TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op het Bartonella-plasmide.
Duplex RT-PCR Uniplex RT-PCR
Generisch Specifiek
Bartonella spp. B.
quintana
B.
henselae
Bartonella
spp.
B.
quintana
B.
henselae
Helling -3,23 -3,31 -3,23 -3,40 -3,37 -3,34
R² 1,00 1,00 1,00 0,99 1,00 1,00
E 1,04 1,01 1,04 0,97 0,98 0,99
Er is duidelijk een gelijkaardige efficiëntie als er duplex RT-PCR wordt toegepast t.o.v. de
aparte uniplex RT-PCRs, ook al gaven deze PCRs reeds de gewenste efficiëntieresultaten
binnen de afgesproken grenzen. Er wordt in de moleculaire diagnostiek steeds gestreefd naar
de efficiëntste en gevoeligste methode om organismen te detecteren. Hierbij kan besloten
worden dat het toepassen van de beide duplex RT-PCRs een geschikte, gecombineerde test
is om zowel op generiek als op species-specifiek niveau organismen op te sporen.
6.4. Validatie duplex PT-PCR
Om beide duplex RT-PCRs te integreren in de dagdagelijkse routine van het AZ Sint-Jan te
Brugge, dient er een intensieve validatie uitgevoerd te worden. Elke parameter van het
validatieplan moet behandeld en besproken worden vooraleer de test kan opgenomen worden
in het ziekenhuis.
6.4.1. Limit of detection (LOD)
De detectielimiet of “Limiet of detection” (LOD) wordt gedefinieerd als de laagste concentratie
van een stof die kan onderscheiden worden van de afwezigheid van die component (blanco)
binnen een 95% betrouwbaarheid. M.a.w. de concentratiegrens waaronder de component niet
meer betrouwbaar kan gemeten worden. De verdunningsreeks van de Vircell AmpliRun®
Bartonella quintana en de Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle werd 20 maal
uitgevoerd met beide duplex RT-PCRs. Minstens 19 van de 20 keer (95%) dient er amplificatie
op te treden waarbij de LOD ligt tussen de verdunningen waar dit wel, en niet meer het geval
is.
65
Tabel 25 geeft per Vircellcontrole en bijhorende duplex RT-PCR het resultaat aan aanwezige
amplificatie weer. Van iedere verdunning werd de concentratie omgerekend naar aantal
kopieën/ml staal.
Tabel 25: Grove bepaling LOD. Groen is de aanvaardbare amplificatiegrens. Rood duidt op niet voldoende
amplificatiepercentage.
Generische RT-PCR
Concentratie (kopieën/ml)
10563 5281 2113 1056 528 106
AmpliRun® Bartonella quintana
DNA control 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 14/20
AmpliRun® Bartonella henselae
DNA control 20/20 20/20 17/20 16/20 6/20 5/20
Specifieke RT-PCR
AmpliRun® Bartonella quintana
DNA control 20/20 20/20 16/20 6/20 4/20 1/20
AmpliRun® Bartonella henselae
DNA control 20/20 19/20 12/20 11/20 8/20 0/20
Hieruit kan besloten worden dat de generische PCR ongeveer een factor 10 gevoeliger is dan
de specifiek PCR voor de detectie van B. quintana en dit verschil in gevoeligheid is minder
uitgesproken voor de detectie van B. henselae. Deze verhoogde gevoeligheid wordt
toegeschreven aan de detectie van het 16S rRNA gen in de generische PCR, die multicopy is
ten opzichte van de specifieke PCR van het yopP gen en het pap31 gen, respectievelijk voor
de detectie van B. quintana en B. henselae. Bij AmpliRun® Bartonella henselae DNA control
is er op het eerste zicht geen duidelijk onderscheid tussen de twee duplex RT-PCRs. Er is wel
een daling in aantal positieve testen als de specifieke PCR yopP en pap31 wordt toegepast.
De LOD voor de detectie van B. quintana aan de hand van de generische duplex RT-PCR 16S
rRNA gene en SHV ligt tussen 528 en 106 kopieën/ml terwijl voor de detectie van B. henselae
ligt de LOD tussen 5281 en 2113 kopieën/ml.
Voor de specifieke duplex RT-PCR yopP en pap31 werd voor de twee targetgenen dezelfde
LOD bekomen, nl. tussen 5281 en 2113 kopieën/ml.
Uit deze resultaten kan geconcludeerd worden dat de generische RT-PCR een algemeen
globale techniek is om Bartonella spp. op te sporen met SHV als interne controle. De specifieke
RT-PCR is een verdere discriminatie van twee species met een gelijke gevoeligheid voor beide
targetgenen. Deze tweede duplex RT-PCR is minder gevoelig dan de eerste maar wel
specifieker voor de te detecteren doelwitsequentie, en zal dus voornamelijk species-
identificatie als doel hebben.
6.4.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid
Vier klinische stalen (klierweefsel, wondvocht en e-swab) positief voor Bartonella henselae
werden gemengd en gehomogeniseerd in één enkele tube. Hiervan werd een
66
verdunningsreeks aangemaakt (5.6.3, Tabel 12) en elke verdunning werd met de matrix Liquid
Amies medium (e-swab) vijfmaal onderworpen aan de beide duplex RT-PCRs. Iedere
verdunning werd drie keer binnen eenzelfde run doorgevoerd (herhaalbaarheid, intrarun) en
twee keer herhaald in twee bijkomende runs (reproduceerbaarheid, interrun). Ruwe data
beschikbaar in Bijlage VII, Tabel 38. Het doel is de variatie op de verschillende resultaten te
bepalen. De variatie, bepaald aan de hand van de variatiecoëfficiënt %CV, mag voor
herhaalbaarheid niet meer dan 5% bedragen en voor reproduceerbaarheid niet meer dan 10%.
De formule voor de variatieberekening is:
%CV = 100 * 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑎𝑟𝑑𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑡𝑖𝑒
𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑑𝑒
De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid per verdunning en per RT-PCR worden samen
met bijhorende standaarddeviatie (stdev) en variatiecoëfficiënt samengevat in Tabel 26.
Aangezien de klinische stalen om de verdunningsreeks S0 tot S4 aan te maken enkel
Bartonella henselae bevatten, werd geen amplificatie gevonden voor Bartonella quintana. Voor
dit targetgen werd geen CT-waarden gevonden en werd dus bijgevolg ook niet opgenomen in
de tabel.
Tabel 26: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bepaald a. d. h. v. de variatiecoëfficiënt (%CV).
Gem = gemiddelde waarde; een streepje duidt op niet gedetecteerde amplificatie waardoor geen resultaat gevonden werd.
Generische RT-PCR
Herhaalbaarheid Reproduceerbaarheid
S0 S1 S2 S3 S4 S0 S1 S2 S3 S4
Bartonella spp.
Gem 27,38 32,17 33,87 35,93 39,14 27,34 32,10 33,98 36,31 39,54
Stdev 0,09 0,38 0,40 0,61 1,20 0,22 0,30 0,46 0,68 1,09
%CV 0,34 1,19 1,17 1,69 3,06 0,80 0,95 1,34 1,86 2,77
SHV
Gem 28,78 29,21 29,65 29,74 29,94 28,73 29,23 29,82 30,04 30,24
Stdev 0,14 0,30 0,34 0,37 0,43 0,14 0,22 0,35 0,49 0,54
%CV 0,49 1,03 1,14 1,24 1,43 0,48 0,75 1,18 1,63 1,79
Specifieke RT-PCR
Bartonella henselae
Gem 29,01 33,58 35,72 37,83 - 28,96 33,70 35,66 38,04 -
Stdev 0,08 0,34 0,45 0,56 - 0,22 0,35 0,48 0,65 -
%CV 0,29 1,02 1,27 1,47 - 0,77 1,04 1,34 1,71 -
Zowel voor herhaalbaarheid als reproduceerbaarheid blijven de bekomen waarden onder de
vooraf opgestelde percentages. Dit wijst op een goede test wat betreft de validatiecriteria
herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Er werd opgemerkt dat een hogere
verdunningsgraad gepaard gaat met een stijgende %CV.
67
6.4.3. Juistheid
De term juistheid wordt gedefinieerd als de mate van overeenstemming van een gemeten of
berekende hoeveelheid naar de werkelijke waarde en kan aan de hand van analyses van
referentiemateriaal geschat worden.
Om de juistheid van de test te bepalen wordt verondersteld een kwaliteitscontrole uit te voeren.
Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD) heeft geen dergelijke controles voor
Bartonella ter beschikking. Als alternatief werden vijf reeds positief geteste stalen en vier
Bartonella DNA-extracten van AZ Sint-Lucas aan de test onderworpen. De resultaten (Bijlage
I, Tabel 28) hiervan bevestigden de positieve resultaten.
Om het matrix geïnduceerd effect te onderzoeken werd een mix gemaakt van verschillende
klinische stalen positief voor Bartonella henselae. Deze werd verdund (5.6.3, Tabel 12) en
gespiked met verschillende matrixen en vervolgens geëxtraheerd met het complex 800
protocol van de QiaSymphony SP (behalve voor bloed werden 2 extractieprotocollen
toegepast). De betreffende matrixen zijn: Liquid Amies medium (e-swab), lumbaal vocht (LV),
etter (pus1, pus2, pus3), volbloed geëxtraheerd met protocol complex 800 (VB1), volbloed
geëxtraheerd met DNA blood 200 protocol (VB0,2), gewrichtsvocht (GV1, GV2), klierweefsel
met 106 cellen/cm3 (kl106) en klierweefsel met 105 cellen/cm3 (kl105). De CT-waarden werden
vergeleken met deze van een referentie, nl. de doorverdunning van de mix met 1x TE-buffer.
Tabel 39 en Tabel 40 in Bijlage VIII geven de ruwe data en de vergelijkende CT-waarden voor
beide duplex RT-PCRs weer. Aangezien opnieuw gewerkt werd met de verdunningsreeks S0
tot S4 zal voor Bartonella quintana geen resultaat gevonden worden. Voor dit targetgen
werden de resultaten niet opgenomen in de tabel.
Er kan geconcludeerd worden of er inhibitie optreedt ten gevolge van de gekozen matrix.
Inhibitie treedt op als het verschil in CT-waarden groter is dan 3. Bij het overlopen van de
resultaten wordt rekening gehouden met het feit dat een verschil van 3 CT-waarden
overeenstemt met één logaritme van de concentratie, m.a.w. een staal dat tien keer meer
verdund is.
Bij de eerste duplex RT-PCR treedt voor matrixen e-swab, lumbaal vocht en de twee
klierverdunningen weinig opvallende variatie op zowel bij 16S rRNA gene als target als bij de
interne controle SHV. De gevoeligheid is echter erg gedaald als er gebruik wordt gemaakt van
de andere matrixen. De drie etter/pusmixen wegen hierbij het zwaarst door qua interfererende
matrix, wat eventueel te wijten is aan achtergrond ten gevolge van een grote hoeveelheid
inhiberende substanties zoals bijvoorbeeld dode weefselcellen, witte bloedcellen en bacteriën.
Bij de twee gewrichtsvochten werd een verschil waargenomen van bijna 2 CT-waarden. Dit
kan toe te schrijven zijn aan het verschil in samenstelling, kleur en consistentie, van de
gebruikte klinische stalen. GV1 was een geel etterig vocht met bloedklonters en GV2 was een
dieprood vocht (mogelijks afkomstig van een traumatische punctie of van haemarthros ter
hoogte van het gewricht).
68
Bij de tweede duplex RT-PCR is er een duidelijke reductie van de sensitiviteit. Bij alle matrixen,
uitgezonderd e-swab, wordt bijna geen amplificatie meer waargenomen. Er kan eenzelfde
uitleg aan gegeven worden als reeds beschreven voor de eerste RT-PCR.
Er is een duidelijke verschil in het matrix geïnduceerd effect tussen de beide duplex RT-PCRs.
Er kan vastgesteld worden dat de species-specifieke RT-PCR meer inhibitie ondervindt door
de gebruikte matrixen dan de generische RT-PCR.
Over het algemeen is e-swab met Liquid Amies medium de beste methode om stalen te nemen
waarbij geen matrix geïnduceerd effect is aangetoond. Ook klierweefsel kan gebruikt worden
aangezien er geen uitgesproken probleem opduikt. Er moet echter wel voor RT-PCR yopP en
pap31 rekening gehouden worden met een kleine daling in gevoeligheid. Er wordt actueel
weinig aandacht besteedt aan de verminderde sensitiviteit van de PCR in volbloed als matrix
aangezien detectie van Bartonella spp. op volbloed weinig gebruikt wordt door de clinici. In
West-Europa, en zeker in de regio West-Vlaanderen worden we meestal geconfronteerd met
B. henselae infecties. Meestal confirmeert men het klinisch vermoeden daarvan aan de hand
van een combinatie van serologische bepaling van anti-Bartonella antistoffen en een PCR-
analyse op punctievocht (afkomstig van adenopathie of abces). Het grootste probleem bevndt
zich ter hoogte van de matrix etter/pus. Aangezien pusvorming een veel voorkomend
symptoom is, wordt verondersteld dat deze matrix een goede indicatie is voor het vaststellen
van de ziekte. Uit de resultaten van het onderzoek blijkt echter dat er inhibitie optreedt en de
bacterie niet gedetecteerd wordt ook al is die aanwezig. Als dit het geval is, kan het staal 10x
verdund en vervolgens hertest worden in de hoop dat de inhiberende substanties tevens
voldoende gedilueerd zijn opdat de PCR-reactie toch adequaat kan opgaan. Een andere
mogelijke oplossing is het gebruik van een e-swab die men aanbrengt in de geïnfecteerde
zone.
6.4.4. Klinische stalen
Er werden klinische stalen van het AZ Sint-Jan te Brugge onderworpen aan de nieuwe
methode. Tabel 29 (Bijlage I) geeft een overzicht van het soort staalmateriaal met de
bijhorende klinische interpretatie en het respectievelijke resultaat van de RT-PCRs. Het is
belangrijk dat er een juiste correlatie wordt vastgesteld tussen de klinische interpretatie en de
conclusie van de RT-PCR. Hieronder worden de stalen kort besproken.
Voor staal 2732302 (vocht leverabces) werd de test aangevraagd ter uitsluiting van een
Bartonella infectie wat klopt met de kliniek. Voor patiënt 2504065 (longbiopt) bleek achteraf
gezien meest waarschijnlijk dat de serologische handtekening van voorgaande Bartonella
infectie ging over een doorgemaakt probleem en klinisch perfect compatibel was met een
atypische Mycobacteriële infectie met B-symptomen. Beide kiemen werden echter wel volledig
behandeld. De aanvraag voor patiënt 2663842 (klierweefsel) diende enkel ter uitsluiting van
bartonellose. Uit de resultaten (2209798, 2273998, 2399868, 2521239) kon ook besloten
worden dat serum van de patiënt met chronische bartonellose (2293890) geen ideale matrix
is om B. henselae, die intracellulair voorkomt in RBC, te detecteren. Dit duidt het belang aan
van de correcte staalname en matrix. Staal 2740200 (volbloed) geeft een negatief resultaat
69
maar is B. henselae positief op de punctie (2749731), wat wijst op een weinig gevoelige matrix
als volbloed wordt gekozen. Als laatste is staal 2742003 een complex geval aangezien er een
onzeker PCR-resultaat was voor B. henselae, maar kon zonder differentiatie en met de juiste
kliniek wel behandeld worden als B. henselae.
6.4.5. Specificiteit
Voor de validatie werd nagegaan of kruiscontaminatie optreedt met andere mogelijke klinische
pathogenen. Zowel de aangemaakte bacteriële mixen als andere organismen aanwezig in
klinische stalen (5.6.4, Tabel 13) werden aan een interferentiestudie onderworpen. Ruwe data
zijn terug te vinden in Tabel 41 in Bijlage IX.
Voor de bacteriële mixen (mix1-mix3) werden geen vals positieve reacties gedetecteerd
behalve bij duplex RT-PCR 16S rRNA gene en SHV werd voor mix 1 en mix 3 amplificatie
waargenomen. Deze twee mixen werden nogmaals in drievoud uitgevoerd alsook de
bacteriële culturen apart (Bijlage IX, Tabel 42). Als resultaat werd bij geen enkele mix of aparte
cultuur amplificatie vastgesteld.
Een ander probleem stelde zich bij Human herpesvirus 6 (HHV-6) waarbij voor beide duplex
RT-PCRs een vals positief resultaat werd bekomen. Uit verder onderzoek (Bijlage IX, Tabel
42), van zowel vijftal herhalingen van de HHV-6 als vier klinische HHV-6-stalen, bleek dat er
geen amplificatie meer optrad bij duplex RT-PCR 16S rRNA gene en SHV en slechts 1/9 keer
werd een vals positief resultaat bekomen bij duplex RT-PCR yopP en pap31. Deze laatste
vaststelling dient verder onderzocht te worden binnen het AZ Sint-Jan.
Voor adenovirus, dat een vals positief resultaat gaf voor duplex RT-PCR 16S rRNA gene en
SHV, werd de amplificatie plot met respectievelijke multicomponent curve bekeken en
vergeleken met het Bartonella-plasmide (105) (Figuur 24). Er werd vastgesteld dat slechts een
zeer zwak signaal gedetecteerd wordt t.o.v. de positieve controle en het vals positief resultaat
niet bevestigd wordt door de species-specifieke duplex RT-PCR. Hierdoor kon het vals positief
resultaat verwaarloosd en als negatieve amplificatie beschouwd worden.
A B
70
Figuur 24: Verschil tussen de amplificatie plot en de multicomponent plot van beide duplex RT-PCRs voor adenovirus
en positieve controle Bartonella-plasmide (105). A: amplificatie plot van de duplex RT-PCRs voor adenovirus. B: amplificatie
plot van de duplex RT-PCRs voor de positieve controle Bartonella-plasmide (105). C: multicomponent plot van de duplex RT-
PCRs voor adenovirus. D: multicomponent plot van de beide duplex RT-PCRs voor de positieve controle Bartonella-plasmide
(105).
(Legende multicomponent plot: rood=ROX; roze=CY5; geel=ABY; blauw=FAM)
6.4.6. Bewaarcondities monstermateriaal
De bedoeling van deze onderzoekstap is het nabootsen van de verschillende transport- en
bewaarcondities die stalen kunnen ondergaan alvorens ze in het labo van AZ Sint-Jan
belanden om zo de mogelijke variatie in resultaten, voor deze verschillende condities, na te
gaan. Er werd een staalflow voor interne en externe stalen nagebootst volgens Tabel 14
(5.6.5). Interne routine binnen AZ Sint-Jan Brugge omvat staalafname, transport naar centrale
receptie bij kamertemperatuur, ontvangst in core labo waar het klinisch monster in een grote
koelkast zal geplaatst worden (2-8°C) en vervolgens ontvangst op labo moleculaire
microbiologie, verdeling van het staal, één deel in archief bij -20°C, ander deel extraheren. Als
de extractie de dag zelf nog zal plaatsvinden dan wordt het staal bewaard in de koelkast, zo
niet wordt het in de diepvries bewaard. Er werd opnieuw gewerkt met de verdunning van de
aangemaakte mix (5.6.3, Tabel 12) gespiked met Liquid Amies medium (e-swab) en
gewrichtsvocht (GV2), aangezien gebleken is dat er bij deze matrixen geen inhibitie optreedt.
Uit de algemene resultaten (Bijlage X, Tabel 43) kan geconcludeerd worden dat er geen
problemen opduiken bij de verschillende, meest voorkomende bewaarcondities.
6.5. Sanger sequencing
Aan de hand van 16S rRNA-gensequenering kon de identificatie van Bartonella uitgevoerd
worden. De specifieke amplificatie van het 16S rRNA-gen maakt het mogelijk om, na controle
via agarosegelelektroforese, het fragment van 774 bp te sequeneren.
Er werd gewerkt volgens de reeds aanwezige, gevalideerde SOP van het AZ Sint-Jan. In dit
onderzoek werden zowel de positieve Vircell DNA-controles als klinische stalen gebruikt als
templatemateriaal. Het staalmateriaal was abcesvocht op e-swab (staal 1), lymfeklierpunctie
(staal 2), e-swab (staal 3) en spuit abcesvocht lymfadenitis (staal 4). Als positieve controle
werd Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle gebruikt.
Het resultaat na amplificatie en controle door gelelektroforese wordt weergegeven in Figuur
25. Door het gebruik van een 100 bp ladder kon de grootte van de verkregen banden geschat
worden. Voor alle positieve stalen werd een lengte tussen 700 en 800 bp bekomen, behalve
C D
71
voor staal 2 wat wijst op onvoldoende geamplificeerd DNA om mee verder te werken. De
geanalyseerde lengtes stemmen overeen met de gebruikte forward- en reverse primer (140-
27F en 141-801R) die een fragment van 774 bp genereren. Voor staal 3 en 4 zijn de bandjes
minder helder dan voor staal 1 en de positieve controle (PC), hier Vircell AmpliRun® Bartonella
henselae DNA-controle. Hoe helder de band, hoe meer geamplificeerd fragment-DNA
aanwezig is in het PCR-product. Een blanco wordt bij iedere run meegenomen om te
controleren of er geen contaminatie optrad. Uit dit resultaat zijn er bij de blanco geen bandjes
zichtbaar en is er dus nergens contaminatie opgetreden.
Figuur 25: Controle PCR-amplificatie via agarosegelelektroforese.
Ladder = EZ loadTM 100 bp PCR Molecular Ruler, Bio-Rad; NC = negatieve controle; PC = Vircell AmpliRun® Bartonella henselae
DNA-controle.
6.5.1. Identificatie m.b.v. 16S rRNA sequenering
Na PCR-amplificatie en controle via gelelektroforese kunnen de positieve
amplificatieproducten onderworpen worden aan een opzuiveringsproces met ExoSAP-IT.
Nadat de DNA-sequentiereactie uitgevoerd is, vindt een volgende opzuivering plaats aan de
hand van SephadexTM G-50 superfine. Met behulp van capillaire elektroforese werden de
fragmenten gescheiden en geanalyseerd.
De output van het programma DNA Sequencing Analysis Software (Applied Biosystems®)
genereert de pieken die geanalyseerd werden in de ABI 3500XL Genetic Analyzer (Applied
Biosystems®). Ook in het softwareprogramma SeqMan Pro (DNAstar) worden dezelfde pieken
weergegeven. Een voorbeeld van zo’n piekenpatroon wordt voorgesteld in Bijlage XI, Figuur
27. Elke piek heeft een bepaalde kleur eigen aan het nucleotide. Deze vaste kleurencode is
over heel de wereld gelijk en wordt door iedere wetenschapper begrepen. Dit werd ook
uitgevoerd voor de verschillende Bartonella-stalen en de positieve controle Vircell AmpliRun®
Bartonella henselae DNA.
72
Soms was een grote piek te zien op het piekenpatroon wat wijst op een dNTP-piek (Figuur
26). Dit kan enkel voorvallen als een slechte opzuivering met SephadexTM G-50 superfine heeft
plaats gevonden. Als het staal niet precies in het midden van de kolom wordt gepipetteerd,
dan kunnen dNTPs langs de zijkant van de kolom in het te sequeneren welletje komen. Vaak
zijn de pieken van de nucleotiden van deze mate dat er toch een sequentievolgorde met
voldoende zekerheid kan bekomen worden.
Figuur 26: Het voorvallen van een dNTP-piek, grote roze piek, tijdens het sequeneren.
Resultaten bekomen na het uitvoeren van een BLAST op de finale sequentie zijn weergegeven
in Tabel 27 (ruwe data in Bijlage XII). De geanalyseerde lengtes zijn korter dan de
amplificatielengte (774 bp) aangezien de primerlengtes en de onbetrouwbare uiteinden van de
sequentie achterwege werden gelaten. Over het algemeen wordt met zekere betrouwbaarheid
de juiste identificatie bekomen voor alle stalen en de positieve controle Vircell AmpliRun®
Bartonella henselae DNA.
Tabel 27: Overzicht BLAST-analyse van de finale sequentie van de stalen en positieve controle.
Naam Species Sequentie-
lengte (bp)
BLAST
identificatie
Identiteits-
score (%)
Staal 1 (2749731) B. henselae 716 B. henselae 99
Staal 2 (2742003) Bartonella spp. - - -
Staal 3 (2740748) B. henselae 651 B. henselae 99
Staal 4 (2655574) B. henselae 674 B. henselae 99
PC B. henselae 665 B. henselae 100
73
Algemeen besluit
Ter validatie van een multi-target real-time PCR voor de detectie en differentiatie van
Bartonella species konden vier grote fasen in het onderzoek onderscheiden worden. De
uniplex evaluatie met SYBR® Select Mastermix van de verschillende ontwikkelde primers,
gevold door de evaluatie van de primer-probe mix aan de hand van de TaqMan® Fast Virus 1-
Step Mastermix. In een derde fase werd de reactie- en detectiesnelheid opgedreven door het
samenstellen van twee duplex real time PCRs, een generische en species-specifieke duplex
RT-PCR, gevolgd door een intensieve validatie van deze laatste. Tot slot werd de typering van
het organisme onderzocht aan de hand van 16S rRNA sequenering.
Bij de aanvang van het project werden per organisme, Bartonella henselae en Bartonella
quintana, twee paar primerparen ontworpen die werden getest op hun functionaliteit,
specificiteit en gevoeligheid door gebruik van het niet-specifieke label SYBR® Green.
Aan de hand van TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix werden de respectievelijke probes
getest op functionaliteit en specificiteit. Hierbij werd voor de detectie van Bartonella spp. enige
niet verklaarbare en niet herhaalbare kruisreactie waargenomen met een zwak
fluorescentiesignaal tijdens amplificatie. Deze vaststelling benadrukt het belang van het
bekijken van de multicomponent plot om mogelijke aspecifieke amplificatie uit te sluiten. Na
deze evaluatiestap konden per organisme een primerpaar met respectievelijke probe
geselecteerd worden, nl. uniplex 16S rRNA gene voor de detectie van Bartonella spp., uniplex
yopP voor de detectie van B. quintana en uniplex pap31 voor de detectie van B. henselae.
Vervolgens werd er gewerkt met twee duplex RT-PCRs, nl. een generische en species-
specifieke PCR, die geëvalueerd werden in combinatie met de TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix. Naast de geselecteerde uniplex RT-PCRs werd gebruik gemaakt van een reeds
gevalideerde interne controle PCR die Phocine herpesviris-1 detecteert, toegevoegd aan ieder
monster gedurende extractie. De generische duplex RT-PCR voor algemene gevoelige
detectie van Bartonella species a.d.h.v. 16S rRNA gene werd gecombineerd met SHV. Als
species-specifieke duplex RT-PCR werden pap31 en yopP in één reactie verwerkt. De beide
duplex RT-PCRs moeten elkaar confirmeren voordat een conclusie kan genomen worden.
Aansluitend werd een volledig validatieplan doorlopen. Uit de resultaten van LOD werd
geconcludeerd dat de generische duplex RT-PCR een algemeen globale techniek is om
Bartonella spp. op te sporen met SHV als interne controle. De specifieke duplex RT-PCR is
een verdere discriminatie van twee species met een lagere gevoeligheid dan de generische
test maar wel specifieker voor de te detecteren doelwitsequentie. Voor de parameters
herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden telkens resultaten bekomen die binnen de
aanvaardbare grenzen lagen. Na het onderzoek op het matrix geïnduceerd effect kan
vastgesteld worden dat de species-specifieke RT-PCR meer inhibitie ondervindt dan de
generische RT-PCR. Over het algemeen is e-swab met Liquid Amies medium de beste
methode om stalen te nemen en ook klierweefsel kan gehanteerd worden rekening houdend
met een kleine daling in gevoeligheid bij de species-specifieke duplex RT-PCR. Uit de
resultaten van het onderzoek blijkt echter dat de bacterie minder gevoelig gedetecteerd wordt
74
als etter/pus als matrix wordt gespiked. Als oplossing kan enerzijds het staal 10x verdund
worden om inhibiterende substanties te verdunnen en hertest worden of anderzijds een e-
swab op de geïnfecteerde zone gebruikt worden. Bij de specificiteitscontrole werd voor Human
herpesvirus 6 (HHV-6) 2/10 keer een vals positief resultaat bekomen bij duplex RT-PCR yopP
en pap31 op aangekocht HHV-6 DNA maar niet op HHV-6 positieve klinische monsters en
dient verder onderzocht te worden binnen het AZ Sint-Jan. De bewaarconditie van het
monstermateriaal werd onderzocht aan de hand van meest voorkomende interne en externe
bewaarcondities waaruit geconcludeerd kon worden dat er geen problemen opduiken.
Bijkomend aan het onderzoek werden verschillende stalen onderworpen aan een
typeringsmethode, nl. 16S rRNA sequenering. Het is een robuuste amplificatiemethode en
leidde tot de correcte species-identificatie, wat de geschiktheid van de methode bevestigde.
De gevalideerde duplex RT-PCRs worden in het moleculair labo van AZ Sint-Jan Brugge in
gebruik genomen en maakt het mogelijk om Bartonella spp. op een snelle, sensitieve en
specifieke manier te detecteren. De methode zal door gebruik in het labo keer op keer blijvend
gevalideerd worden met mogelijkheid tot verdere optimalisatie.
75
Bibliografische lijst
Ahmed, F. E. (2005). Quantitative real-time RT-PCR: application to carcinogenesis. Cancer
Genomics-Proteomics, 2(6), 317-332.
Angelakis, E., Rolain, J. M., Raoult, D., & Brouqui, P. (2011). Bartonella quintana in head louse
nits. Pathogens and Disease, 62(2), 244-246.
Applied Biosystems (2008). Real-Time PCR: Understanding CT.
Applied Biosystems (2009). DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.
Arisoy, E. S., Correa, A. G., Wagner, M. L., & Kaplan, S. L. (1999). Hepatosplenic cat-scratch
disease in children: selected clinical features and treatment. Clinical Infectious
Diseases, 28(4), 778-784.
Arvand, M., Raoult, D., & Feil, E. J. (2010). Multi-locus sequence typing of a geographically
and temporally diverse sample of the highly clonal human pathogen Bartonella quintana. PLoS
One, 5(3), e9765.
Azzag, N., Haddad, N., Durand, B., Petit, E., Ammouche, A., Chomel, B., & Boulouis, H. J.
(2012). Population structure of Bartonella henselae in Algerian urban stray cats. PloS
one, 7(8), e43621.
Badiaga, S., & Brouqui, P. (2012). Human louse‐transmitted infectious diseases. Clinical
Microbiology and Infection, 18(4), 332-337.
Bergmans, A. M., De Jong, C. M., Van Amerongen, G., Schot, C. S., & Schouls, L. M. (1997).
Prevalence of Bartonella species in domestic cats in The Netherlands. Journal of clinical
microbiology, 35(9), 2256-2261.
Centers for Disease Control and Prevention. (2014). Cat-Scratch Disease. Geraadpleegd op
5 februari 2017 via https://www.cdc.gov/healthypets/diseases/cat-scratch.html.
Chenoweth, M. R., Somerville, G. A., Krause, D. C., O'Reilly, K. L., & Gherardini, F. C. (2004).
Growth characteristics of Bartonella henselae in a novel liquid medium: primary isolation,
growth-phase-dependent phage induction, and metabolic studies. Applied and environmental
microbiology, 70(2), 656-663.
Chomel, B. B., Boulouis, H., Maruyama, S., & Breitschwerdt, E.B. (2006). Bartonella Spp. in
Pets and Effect on Human Health. Emerging infectious disease, 12(3), 389.
Dietrich, F., Schmidgen, T., Maggi, R. G., Richter, D., Matuschka, F. R., Vonthein, R.,
Breitschwerdt, E. B., & Kempf, V. A. J. (2010). Prevalence of Bartonella henselae and Borrelia
burgdorferi Sensu Lato DNA in Ixodes ricinus ticks in Europe. Applied and environmental
microbiology, 76(5), 1395-1398.
76
Dolan, M. J., Wong, M. T., Regnery, R. L., Jorgensen, J. H., Garcia, M., Peters, J., & Drehner,
D. (1993). Syndrome of Rochalimaea henselae adenitis suggesting cat scratch
disease. Annals of internal medicine, 118(5), 331-336.
Dorak, M. T. (2007). Real-time PCR. Taylor & Francis.
Downey, N. (2014). Interpreting melt curves: An indicator, not a diagnosis. Integrated DNA
Technologies, Inc. Geraadpleegd op 30 oktober 2016 via
http://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/core-
concepts/decoded/2014/01/20/interpreting-melt-curves-an-indicator-not-a-diagnosis.
Drancourt, M., Tran-Hung, L., Courtin, J., de Lumley, H., & Raoult, D. (2005). Bartonella
quintana in a 4000-year-old human tooth. Journal of Infectious Diseases, 191(4), 607-611.
Edouard, S., Nabet, C., Lepidi, H., Fournier, P. E., & Raoult, D. (2015). Bartonella, a common
cause of endocarditis: a report on 106 cases and review. Journal of clinical microbiology, 53(3),
824-829.
Engel, P., Salzburger, W., Liesch, M., Chang, C. C., Maruyama, S., Lanz, C., Calteau, A.,
Lajus, A., Médigue, C., Schuster, S. C., & Dehio, C. (2011). Parallel evolution of a type IV
secretion system in radiating lineages of the host-restricted bacterial pathogen
Bartonella. PLoS Genet, 7(2), e1001296.
Fard, R. M. N., Vahedi, S. M., Ashrafi, I., Alipour, F., Sharafi, G., Akbarein, H., & Aldavood, S.
J. (2016). Molecular identification and phylogenic analysis of Bartonella henselae isolated from
Iranian cats based on gltA gene. In Veterinary Research Forum (Vol. 7, No. 1, p. 69). Faculty
of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran.
Florin, T. A., Zaoutis, T. E., & Zaoutis, L. B. (2008). Beyond cat scratch disease: widening
spectrum of Bartonella henselae infection. Pediatrics, 121(5), e1413-e1425.
Foucault, C. (2006). Bartonella quintana Characteristics and Clinical Management. Emerging
infectious disease, 12(2), 217.
Foucault, C., Barrau, K., Brouqui, P., & Raoult, D. (2002). Bartonella quintana bacteremia
among homeless people. Clinical infectious diseases, 35(6), 684-689.
Franca, L. T., Carrilho, E., & Kist, T. B. (2002). A review of DNA sequencing
techniques. Quarterly reviews of biophysics, 35(02), 169-200.
Global Health, Division of Parasitic Diseases and Malaria (2014). Diagnostic Procedures: Stool
Specimens. Geraadpleegd op 26 oktober 2016 via
https://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/stool/moleculardx.html.
Helms, V. (2008). Principles of computational cell biology. John Wiley & Sons.
77
Hussain, S. A. (2009). An introduction to fluorescence resonance energy transfer
(FRET). arXiv preprint arXiv:0908.1815.
Illumina, Inc. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation. Geraadpleegd op 22 april
2017 via https://www.illumina.com/content/dam/illumina-
support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-
prep-guide-15044223-b.pdf.
Jacomo, V., Kelly, P. J., & Raoult, D. (2002). Natural history of Bartonella infections (an
exception to Koch’s postulate). Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9(1), 8-18.
Janda, J. M., & Abbott, S. L. (2007). 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in
the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of clinical microbiology, 45(9),
2761-2764.
Jansma, M., Aalbers, F. S., & Poolman, B. (2014). Zelf kopiëren, knippen en plakken. Stichting
Biowetenschappen en Maatschappij. Geraadpleegd op 6 oktober 2016 via
https://www.nemokennislink.nl/publicaties/zelf-kopieren-knippen-en-plakken.
Johnson, G., Ayers, M., McClure, S. C. C., Richardson, S. E., & Tellier, R. (2003). Detection
and identification of Bartonella species pathogenic for humans by PCR amplification targeting
the riboflavin synthase gene (ribC). Journal of clinical microbiology, 41(3), 1069-1072.
Joshi, M., & Deshpande, J. D. (2011). Polymerase chain reaction: methods, principles and
application. International Journal of Biomedical Research, 2(1), 81-97.
Julin, D. (2014). Polymerase Chain Reaction. USA, University of Maryland, College Park,
Department of Chemistry & Biochemistry, 3blz. New York, Springer Science+Business Media.
Kaiser, P. O., Riess, T., O’Rourke, F., Linke, D., & Kempf, V. A. (2011). Bartonella spp.:
throwing light on uncommon human infections. International Journal of Medical
Microbiology, 301(1), 7-15.
Klangthong, K., Promsthaporn, S., Leepitakrat, S., Schuster, A. L., McCardle, P. W., Kosoy,
M., & Takhampunya, R. (2015). The distribution and diversity of Bartonella species in rodents
and their ectoparasites across Thailand. PloS one, 10(10), e0140856.
Kostrzewski, J. (1949). The epidemiology of trench fever. Bull. Internat. Acad. Polonaise des
Sci. et des Lettres., (7/10), 233-263.
Lakowicz, J. R. (Ed.) (2013). Principles of fluorescence spectroscopy. Springer Science &
Business Media.
Liberto, M. C., Matera, G., Lamberti, A. G., Quirino, A., Barreca, G. S., Marascio, N., Baudi, F.,
Caroleo, B., Staltari, O., & Focà, A. (2013). Diagnosis and follow-up of Bartonella henselae
infection in the spleen of an immunocompetent patient by real-time quantitative PCR. Journal
of medical microbiology, 62(7), 1081-1085.
78
Life Technologies Corporation (2012). Real-time PCR handbook.
Life Technologies Corporation (2013). SYBR® Select Master Mix User Gide.
Madden, T. (2013). The BLAST sequence analysis tool.
Margileth, A. M. (1992). Antibiotic therapy for cat-scratch disease: clinical study of therapeutic
outcome in 268 patients and a review of the literature. The Pediatric infectious disease
journal, 11(6), 474-478.
Margileth, A. M. (2000). Recent advances in diagnosis and treatment of cat scratch
disease. Current Infectious Disease Reports, 2(2), 141-146.
Michelet, L., Delannoy, S., Devillers, E., Umhang, G., Aspan, A., Juremalm, M., Chirico, J.,
van der Wal, F. J., Sprong, H., Pihl, T. P. B., Klitgaard, K., Bødker, R., Fach, P., & Moutailler,
S. (2014). High-throughput screening of tick-borne pathogens in Europe. Frontiers in cellular
and infection microbiology, 4(103).
Müller, A., Reiter, M., Mantlik, K., Schötta, A. M., Stockinger, H., & Stanek, G. (2016).
Development of a serum-free liquid medium for Bartonella species. Folia microbiologica, 61(5),
393-398.
Munshi, A. (2012). DNA Sequencing-Methods and Applications.
Neuzil, P., Cheng, F., Soon, J. B. W., Qian, L. L., & Reboud, J. (2010). Non-contact fluorescent
bleaching-independent method for temperature measurement in microfluidic systems based
on DNA melting curves. Lab on a chip, 10(20), 2818-2821.
Nollet, F. (2013). ViiA7 Life Technologies. Eerste druk. AZ Sint-Jan Brugge: Dienst
Laboratoriumgeneeskunde.
Owczarzy, R., Tataurov, A. V., Wu, Y., Manthey, J. A., McQuisten, K. A., Almabrazi, H. G.,
Pedersen, K. F., Lin, Y., Garretson, J., McEntaggart, N. O., Sailor, C. A., Dawson, R. B., &
Peek, A. S. (2008). IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid
oligomers. Nucleic Acids Research, 36(suppl 2), W163-W169.
Pauwels, E. (2012). Identificatie van nonfermenters en mycobacteria. Thesis, Gent,
Hogeschool Gent, 93 blz.
Pestana, E., Belak, S., Diallo, A., Crowther, J. R., & Viljoen, G. J. (2010). Early, rapid and
sensitive veterinary molecular diagnostics-real time PCR applications. Springer Science &
Business Media, 310 blz.
Pieters, J. (2014). Ontwikkeling van een TaqMan Array Card voor de simultane detectie van
seksueel overdraagbare pathogenen. Thesis, Gent, Universiteit Gent, 108 blz.
PREMIER Biosoft. TaqMan® Probes. Gereedpleegd op 1 november 2016 via
http://premierbiosoft.com/tech_notes/TaqMan.html.
79
Prutsky, G., Domecq, J. P., Mori, L., Bebko, S., Matzumura, M., Sabouni, A., Shahrour, A.,
Erwin, P. J., Boyce, T. G., Montori, V. M., Malaga, G., & Murad, M. H. (2013). Treatment
outcomes of human bartonellosis: a systematic review and meta-analysis. International
Journal of Infectious Diseases, 17(10), e811-e819.
Pulliainen, A. T., & Dehio, C. (2012). Persistence of Bartonella spp. stealth pathogens: from
subclinical infections to vasoproliferative tumor formation. FEMS microbiology reviews, 36(3),
563-599.
Raoult, D., Dutour, O., Houhamdi, L., Jankauskas, R., Fournier, P. E., Ardagna, Y., Drancourt,
M., Signoli, M., Dang La, V., Macia, Y., & Aboudharam, G. (2006). Evidence for louse-
transmitted diseases in soldiers of Napoleon’s Grand Army in Vilnius. Journal of Infectious
Diseases, 193(1), 112-120.
Regnery, R. L., Olson, J. G., Perkins, B. A., & Bibb, W. (1992). Serological response to. The
Lancet, 339(8807), 1443-1445.
Rolain, J. M., Brouqui, P., Koehler, J. E., Maguina, C., Dolan, M. J., & Raoult, D. (2004).
Recommendations for treatment of human infections caused by Bartonella
species. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48(6), 1921-1933.
Simard, J. (2015). KATTENKRABZIEKTE Belang bij mens en dier. Thesis, Gent, Universiteit
Gent, 2015, 54 blz.
Smith, C. J., & Osborn, A. M. (2009). Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-
based approaches in microbial ecology. FEMS microbiology ecology, 67(1), 6-20.
Snipcademy. Sanger sequencing - chain-termination method. Geraadpleegd op 14 april 2017
via https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/sanger-
dideoxynucleotide.
Thamawatanakul, R. (2010). Bartonella quintana. Geraadpleegd op 25 februari 2017 via
https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bartonella_quintana.
Thermo Fisher Scientific, Inc. (2015a). 7500 and 7500 Fast Real-Time PCR Systems Support
- Getting Started. Geraadpleegd op 30 oktober 2016 via
http://www.thermofisher.com/be/en/home/technical-resources/technical-reference-
library/real-time-digital-PCR-instruments-support-center/7500-real-time-pcr-systems-
support/7500-real-time-pcr-systems-support-getting-started.html.
Thermo Fisher Scientific, Inc. (2015b). Fluorescent Probes. Geraadpleegd op 8 oktober 2016
via https://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-
learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/fluorescent-
probes.html.
80
Thermo Fisher Scientific, Inc. (2015c). Getting Started Guide: Primer Express® Software
Version 3.0. Geraadpleegd op 6 maart 2017 via
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_041902.pdf.
Valeur, B., & Berberan-Santos, M. N. (2012). Molecular fluorescence: principles and
applications. John Wiley & Sons.
Vandesompele, J. (2013). qPCR Guide. Eurogentec.
Vermeulen, M. J., Herremans, M., Verbakel, H., Bergmans, A. M. C., Roord, J. J., Van Dijken,
P. J., & Peeters, M. F. (2007). Serological testing for Bartonella henselae infections in The
Netherlands: clinical evaluation of immunofluorescence assay and ELISA. Clinical
microbiology and infection, 13(6), 627-634.
Vermeulen, M. J., Roord, J.J., & Peeters, M.F. (2009). Kattenkrabziekte: infectie door
Bartonella henselae. Ned Tijdschr Infect, 4, 18-23.
Wiersema, I. (2005). Identificatie door vergelijking ribosomaal bacterieRNA (16S-rRNA).
Geraadpleegd op 22 april 2017 via http://www.microbiologie.info/16s%20rrna.html#.
Yang, B., Wang, Y., & Qian, P. Y. (2016). Sensitivity and correlation of hypervariable regions
in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC bioinformatics, 17(1), 135.
Youtsey, S. (2012). Determining the physical characteristics of your oligos—the OligoAnalyzer
Tool. Geraadpleegd op 7 maart 2017 via https://eu.idtdna.com/pages/decoded/decoded-
articles/web-tools/decoded/2012/06/15/using-the-oligoanalyzer-program.
81
Bijlagen
Bijlage I Tabel 28: Overzicht klinische monsters en DNA-extracten AZ Sint-Lucas (Gent) als referentiemateriaal met het resultaat
van zowel AZ Sint-Lucas (Gent) als de nieuwe methode met de beide duplex RT-PCRs van AZ Sint-Jan te Brugge.
ID nummer Soort materiaal Conclusie AZ Sint-
Lucas Conclusie PCR
2293890 Letsel linker lever-lob
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
2462291 Klier
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
2740748 e-swab
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Staal 1
(1609-13005) /
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Staal 2
(1610-08479) /
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
1512-11920 DNA-extract
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
1601-03731 DNA-extract
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
1604-20041 DNA-extract
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
1608-19587 DNA-extract
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
Bartonella positief
Bartonella henselae
positief
82
Tabel 29: Overzicht klinische stalen AZ Sint-Jan (Brugge) met klinische vaststelling en respectievelijke conclusie van de
beide duplex RT-PCRs.
ID
nummer
Soort
materiaal Klinische interpretatie Conclusie RT-PCR
2749731 Punctie
abces oksel
1ste positieve serologie: IgG 1/16000, IgM
1/200. Serologisch duidelijk recente of
actieve Bartonellose. Opnieuw positieve
serologie op moment van unilaterale
cervicale lymfeklier.
Bartonella spp.:
positief
Bartonella henselae:
positief
2732302 Vocht
leverabces
Progressief gunstige evolutie na extractie
van choledocholithiasen en antibiotische
therapie onder vorm van Meropenem. Geen
Bartonella-infectie
Bartonella spp.:
negatief
2504065 Longbiopt
Definitieve diagnose na chirurgische
mediastinoscopie en longbiopsie:
sarcoïd-like niet-necrotiserende
granulomateuze inflammatie in de long
(rechter bovenkwab vermoedelijk secundair
aan B. henselae gezien positieve serologie
1m vroeger maar dit kan eveneens passen
bij doorgemaakte Bartonellose in een ver
verleden, en compatibele kliniek met koorts,
nachtzweten en vermagering). Dit was initiële
besluit van pneumologe.
Maar laattijdige kweek van M. xenopi, die
eveneens een causale rol kan gespeeld
hebben, dus wordt eveneens behandeld.
Bartonella spp.:
negatief
2209798
2273998
2399868
2521239
Serum
Patiënt (idem patiënt 2293890 Tabel 28)
heeft een indrukwekkende
ziektegeschiedenis met chronische
Bartonellose
(nachtzweten, >17kg vermagering, diffuse
klieren en lever-/miltabcessen, geen
bewezen immuundeficiëntie).
Bartonella spp.:
negatief
2663842 Klierweefsel
nodules oksel = folliculair non-Hodgkin
lymfoom. Geen Bartonella infectie, zat in
differentiaal diagnose.
Bartonella spp.:
negatief
2655574 Lymfadenitis
abcesvocht
Suppuratieve lymphadenitis ter hoogte van
de linkerlies op basis van een
kattenkrabziekte. Patiënt kreeg een
voorschrift voor Azitromycine 500 mg/dag
gedurende vijf dagen.
Bartonella spp.:
positief
Bartonella henselae:
positief
83
2532413 Wondvocht Acute kattenkrabziekte, met torenhoge
serum antistofspiegels
Bartonella spp.:
positief
Bartonella henselae:
positief
2740200 Volbloed
Idem patiënt 2749731
Het betrof hier wel een recente/actieve
Bartonellose, maar een B. henselae
serologische, waar je dus geen langdurige
persisterende bacteriemie kan verwachten
(in tegenstelling tot B. quintana)
Bartonella spp.:
negatief
2742003
Lymfeklier
hals/
lymfoom
Grote harde pijnloze halsklier zone I links van
ongeveer 4cm, kleinere zachte adenopathie
anterieur van m. SCM links.
6 weken geleden gebeten door kitten.
Klinische Bartonella infectie, maar bacteriële
lading van B. henselae te laat voor detectie.
Bartonella spp.:
positief
Bartonella henselae:
onzeker
84
Bijlage II Tabel 30: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op beide Vircell AmpliRun® DNA-controle
in tweevoud.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme Naam Vircell AmpliRun® DNA controle
Bartonella quintana Bartonella henselae
Bartonella
spp.
p715 Bart Fw 31,54 31,75 29,89 29,87
p716 Bart Rv
p718 Bart 16 Fw 31,07 32,35 29,65 29,54
p719 Bart 16 Rv
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw 32,58 32,63 - -
p722 Bq Yop Rv
p724 Bq bqtr Fw 31,99 31,51 - -
p725 Bq bqtr Rv
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw 37,55 39,30 31,64 32,40
p728 Bh pap Rv
p730 Bh glta Fw 41,85 - 31,15 31,18
p731 Bh glta Rv
Tabel 31: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell
AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme Naam Vircell AmpliRun® Bartonella quintana
107 106 105 104 103 102
Bartonella
spp.
p715 Bart Fw 21,13 24,70 28,49 31,20 35,89 39,70
p716 Bart Rv
p718 Bart 16 Fw 21,77 25,13 28,98 31,89 35,15 -
p719 Bart 16 Rv
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw 22,62 26,49 30,61 33,19 37,63 -
p722 Bq Yop Rv
p724 Bq bqtr Fw 21,93 25,32 29,58 31,59 36,30 36,51
p725 Bq bqtr Rv
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw 37,31 39,75 38,82 39,89 36,97 38,15
p728 Bh pap Rv
p730 Bh glta Fw 35,37 36,27 42,58 - - -
p731 Bh glta Rv
85
Tabel 32: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell
AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme Naam Vircell AmpliRun® Bartonella henselae
107 106 105 104 103 102
Bartonella
spp.
p715 Bart Fw 20,11 23,75 27,02 31,05 35,73 38,79
p716 Bart Rv
p718 Bart 16 Fw 20,91 24,09 27,98 31,00 - -
p719 Bart 16 Rv
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw - - - - - -
p722 Bq Yop Rv
p724 Bq bqtr Fw - - - - - -
p725 Bq bqtr Rv
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw 21,66 25,13 28,85 32,12 36,92 39,89
p728 Bh pap Rv
p730 Bh glta Fw 20,92 24,33 27,58 30,50 36,42 -
p731 Bh glta Rv
86
Bijlage III Tabel 33: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op bacteriële
mixen.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme Naam Mix 1 Mix 2 Mix 3
Bartonella
spp.
p715 Bart Fw 18,38 35,59 35,78
p716 Bart Rv
p718 Bart 16 Fw - - 37,94
p719 Bart 16 Rv
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw - - -
p722 Bq Yop Rv
p724 Bq bqtr Fw - - -
p725 Bq bqtr Rv
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw 39,19 - -
p728 Bh pap Rv
p730 Bh glta Fw - - -
p731 Bh glta Rv
87
Bijlage IV Tabel 34: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op de verdunningsreeks
van Vircell AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme Naam Vircell AmpliRun® Bartonella quintana
106 105 104 103 102
Bartonella
spp.
p715 Bart Fw
23,51 27,39 30,16 31,93 31,50 p716 Bart Rv
p717 Bart Pr
p718 Bart 16 Fw
23,30 27,39 31,10 34,12 - p719 Bart 16 Rv
p720 Bart 16 Pr
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw
26,67 32,49 33,77 37,31 - p722 Bq Yop Rv
p723 Bq Yop Pr
p724 Bq bqtr Fw
29,10 - - - - p725 Bq bqtr Rv
p726 Bq bqtr Pr
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw
- - - - - p728 Bh pap Rv
p729 Bh pap Pr
p730 Bh glta Fw
- - - - - p731 Bh glta Rv
p732 Bh glta Pr
88
Tabel 35: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op de verdunningsreeks
van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle en tweemaal op negatieve controle.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme Naam Vircell AmpliRun® Bartonella henselae
106 105 104 103 102 nc1/nc2
Bartonella
spp.
p715 Bart Fw
23,82 27,75 30,76 32,10 34,81 32,25/
37,51 p716 Bart Rv
p717 Bart Pr
p718 Bart 16 Fw
23,59 27,48 31,14 34,58 - -/- p719 Bart 16 Rv
p720 Bart 16 Pr
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw
- - - - - -/- p722 Bq Yop Rv
p723 Bq Yop Pr
p724 Bq bqtr Fw
- - - - - -/- p725 Bq bqtr Rv
p726 Bq bqtr Pr
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw
24,21 28,16 31,96 35,89 - -/- p728 Bh pap Rv
p729 Bh pap Pr
p730 Bh glta Fw
25,39 30,14 - - - -/- p731 Bh glta Rv
p732 Bh glta Pr
89
Bijlage V Tabel 36: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op
bacteriële mixen.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme Naam Mix 1 Mix 2 Mix 3
Bartonella
spp.
p715 Bart Fw
- 24,93 - p716 Bart Rv
p717 Bart Pr
p718 Bart 16 Fw
23,41 - 19,36 p719 Bart 16 Rv
p720 Bart 16 Pr
Bartonella
quintana
p721 Bq Yop Fw
- - - p722 Bq Yop Rv
p723 Bq Yop Pr
p724 Bq bqtr Fw
- - - p725 Bq bqtr Rv
p726 Bq bqtr Pr
Bartonella
henselae
p727 Bh pap Fw
- - - p728 Bh pap Rv
p729 Bh pap Pr
p730 Bh glta Fw
- - - p731 Bh glta Rv
p732 Bh glta Pr
90
Bijlage VI Tabel 37: CT-waarden voor de efficiëntieberekening van de duplex RT-PCRs.
groen: goed resultaat.
Bartonella-
plasmide
(conc.)
Generische RT-PCR Specifieke RT-PCR
Bartonella spp. SHV Bartonella
quintana
Bartonella
henselae
107 20,76 32,15 20,27 21,26
106 24,42 31,56 23,97 24,88
105 27,56 31,16 27,24 28,11
104 30,66 31,18 30,34 30,90
103 35,37 31,03 33,62 34,38
91
Bijlage VII Tabel 38: Ruwe data (CT-waarden) van de beide duplex RT-PCR voor de bepaling van herhaalbaarheid en
reproduceerbaarheid.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Generische RT-PCR
S0 S1 S2 S3 S4
Bartonella spp.
Interrun
Intrarun
CT 1 27,29 32,60 33,61 35,36 39,17
CT 2 27,39 32,05 33,68 36,57 37,92
CT 3 27,47 31,86 34,36 35,87 40,32
CT 4 27,00 31,85 33,67 36,95 39,54
CT 5 27,57 32,13 34,60 36,81 40,73
SHV
Interrun
Intrarun
CT 1 28,65 29,07 29,93 30,05 30,43
CT 2 28,77 29,55 29,27 29,85 29,61
CT 3 28,93 29,00 29,75 29,33 29,79
CT 4 28,56 29,34 29,94 30,42 30,43
CT 5 28,72 29,20 30,22 30,57 30,95
Specifieke RT-PCR
Bartonella henselae
Interrun
Intrarun
CT 1 28,93 33,36 35,46 37,44 -
CT 2 29,10 33,97 36,24 38,47 -
CT 3 28,99 33,40 35,45 37,59 -
CT 4 28,60 34,15 35,09 38,96 -
CT 5 29,18 33,60 36,06 37,74 -
92
Bijlage VIII Tabel 39: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute waarde van het verschil in
CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische matrixen op de generische RT-PCR. Voor e-swab werden
de gemiddelde CT-waarden genomen van de verschillende inter- en intraruns, idem voor de kliermatrix.
- : geen amplificatie bij de matrix; groen: goed resultaat; oranje: twijfelgeval; rood: slecht resultaat.
CT-waarde Vergelijkende CT-waarde
(absolute waarde)
Matrix Verdunning
Doelwitgen
16S rRNA
gene SHV
16S rRNA
gene SHV
1x TE-buffer
(referentie)
S0 27,30 28,78
S1 30,65 28,90
S2 32,74 28,72
S3 33,98 28,89
S4 36,89 29,10
e-swab
S0 27,34 28,73 0,04 0,03
S1 32,10 29,23 1,45 0,34
S2 33,98 29,82 1,24 1,10
S3 36,31 30,04 2,33 1,16
S4 39,54 30,24 2,64 1,14
LV
S0 27,74 28,99 0,44 0,23
S1 30,99 28,92 0,34 0,02
S2 33,45 28,80 0,71 0,08
S3 35,00 28,83 1,02 0,06
S4 38,50 28,95 1,61 0,15
pus1
S0 29,72 32,01 2,42 3,25
S1 32,94 32,12 2,29 3,22
S2 34,69 32,34 1,95 3,61
S3 - 32,53 - 3,65
S4 - 32,54 - 3,44
pus2
S0 28,59 31,22 1,30 2,46
S1 33,05 31,52 2,39 2,63
S2 33,92 31,81 1,18 3,08
S3 39,39 31,51 5,41 2,62
S4 - 31,88 - 2,78
93
pus3
S0 30,49 32,56 3,19 3,80
S1 34,12 32,56 3,46 3,67
S2 39,61 33,56 6,87 4,83
S3 - 33,76 - 4,87
S4 - 32,86 - 3,76
VB1
S0 28,89 31,16 1,59 2,40
S1 32,59 30,97 1,93 2,08
S2 34,51 31,29 1,77 2,57
S3 35,67 31,15 1,69 2,26
S4 - 30,73 - 1,63
VB0,2
S0 28,92 29,80 1,62 1,04
S1 31,48 29,54 0,83 0,64
S2 33,18 29,76 0,43 1,03
S3 35,53 29,81 1,55 0,92
S4 - 29,92 - 0,83
GV1
S0 29,25 31,13 1,95 2,37
S1 32,45 31,45 1,80 2,56
S2 34,57 31,44 1,83 2,72
S3 - 31,26 - 2,38
S4 - 31,70 - 2,60
GV2
S0 27,36 29,15 0,06 0,39
S1 31,52 29,44 0,87 0,55
S2 32,70 29,30 0,04 0,57
S3 35,27 29,47 1,29 0,58
S4 - 29,31 - 0,21
kl106
S0 27,22 28,54 0,07 0,22
S1 29,96 28,93 0,70 0,03
S2 32,26 28,51 0,48 0,21
S3 35,50 28,87 1,52 0,02
S4 38,16 28,88 1,26 0,22
kl105
S0 26,84 28,59 0,46 0,17
S1 30,24 28,79 0,42 0,10
S2 31,85 28,80 0,89 0,08
S3 33,42 28,74 0,56 0,14
S4 38,65 28,74 1,76 0,35
94
Tabel 40: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute waarde van het verschil in
CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische matrixen op de species-specifieke RT-PCR. Voor e-swab
werden de gemiddelde CT-waarden genomen van de verschillende inter- en intraruns, idem voor de kliermatrix.
- : geen amplificatie bij de matrix; groen: goed resultaat; oranje: twijfelgeval; rood: slecht resultaat.
CT-waarde Vergelijkende CT-waarde
(absolute waarde)
Matrix Verdunning Doelwitgen
pap31 pap31
1x TE-buffer
(referentie)
S0 28,87
S1 32,06
S2 34,49
S3 36,00
S4 -
e-swab
S0 28,96 0,09
S1 33,70 1,63
S2 35,66 1,17
S3 38,04 2,04
S4 - -
LV
S0 28,94 0,06
S1 32,95 0,89
S2 - -
S3 - -
S4 - -
pus1
S0 - -
S1 - -
S2 - -
S3 - -
S4 - -
pus2
S0 35,60 6,72
S1 - -
S2 - -
S3 - -
S4 - -
95
pus3
S0 - -
S1 - -
S2 - -
S3 - -
S4 - -
VB1
S0 32,09 3,22
S1 - -
S2 - -
S3 - -
S4 - -
VB0,2
S0 30,94 2,07
S1 - -
S2 - -
S3 - -
S4 - -
GV1
S0 31,45 2,58
S1 - -
S2 - -
S3 - -
S4 - -
GV2
S0 29,49 0,61
S1 35,48 3,41
S2 - -
S3 - -
S4 - -
kl106
S0 30,15 1,28
S1 34,05 1,99
S2 36,66 2,17
S3 - -
S4 - -
kl105
S0 29,61 0,74
S1 33,43 1,36
S2 35,30 0,82
S3 - -
S4 - -
96
Bijlage IX Tabel 41: Ruwe data (CT-waarden) specificiteitscontrole van de beide duplex RT-PCRs met TaqMan® Fast Virus 1-Step
Mastermix op organismen aanwezig in klinische stalen en de bacteriële mixen.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme
Generische RT-PCR Specifieke RT-PCR
Bartonella
spp. SHV
Bartonella
quintana
Bartonella
henselae
Adenoviridae 41,95 - - -
A. vaginae - - - -
CMV - - - -
Enterovirus - - - -
EBV - - - -
G. vaginalis - - - -
H. influenzae - - - -
HHV-1 - - - -
HHV-2 - - - -
HHV-6 38,20 - 36,78 -
L. crispatus - - - -
L. iners - - - -
RSV - - - -
Rhinovirus - - - -
S. pneumoniae - - - -
Toxoplasma - - - -
VZV - - - -
Mix 1 42,67 29,38 - -
Mix 2 - 29,69 - -
Mix 3 - 29,19 - -
97
Tabel 42: Verder onderzoek voor de interferentiestudie op de bacteriële mixen, de bacteriële culturen apart en het Human
herpesvirus 6 (HHV-6).
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Organisme
Generische RT-PCR Specifieke RT-PCR
Bartonella
spp. SHV
Bartonella
quintana
Bartonella
henselae
Mix 1 - 29,03 - -
Mix 1 - 28,52 - -
Mix 1 - 28,98 - -
Mix 2 - 29,60 - -
Mix 2 - 29,43 - -
Mix 2 - 29,31 - -
Mix 3 - 28,44 - -
Mix 3 - 28,77 - -
Mix 3 - 29,14 - -
Acinetobacter - 28,93 - -
E. coli - 29,66 - -
E. faecalis - 29,20 - -
P. aeruginosa - 29,76 - -
S. agalactiae - 29,11 - -
S. aureus - 29,59 - -
S. dysgalactiae - 29,49 - -
Herpes-6 staal 1 - 29,35 - -
Herpes-6 staal 2 - 29,26 - -
Herpes-6 staal 3 - 29,17 - -
Herpes-6 staal 4 - 29,08 - -
HHV-6 - - 38,63 -
HHV-6 - - - -
HHV-6 - - - -
HHV-6 - - - -
HHV-6 - - - -
98
Bijlage X Tabel 43: Resultaten CT-waarden onderzoek van de meest voorkomende bewaarcondities van de staalflow binnen het
AZ Sint-Jan te Brugge.
- : niet gedetecteerd; groen: goed resultaat; rood: slecht resultaat.
Staal-
nummer
Generische RT-PCR Specifieke RT-PCR
Bartonella
spp. SHV
Bartonella
quintana
Bartonella
henselae
1 26,95 28,39 - 28,77
2 27,34 28,78 - 28,92
3 27,47 28,86 - 29,11
4 29,74 29,70 - 31,35
5 27,45 28,48 - 29,30
6 26,89 28,32 - 28,74
7 27,35 28,82 - 28,98
8 27,31 28,84 - 29,06
9 27,36 29,18 - 28,85
10 27,29 28,65 - 29,09
99
Bijlage XI
Figuur 27: Resultaat deel van het piekenpatroon van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle na uitvoering
op het softwareprogramma SeqMan Pro (DNAstar).
Kleurencode: blauw = cytosine; zwart = guanine; groen = adenine; roze = thymine.
100
Bijlage XII
Resultaat BLAST: Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle
Bartonella henselae strain Houston-1 16S ribosomal RNA gene, complete sequence
Sequence ID: NR_074335.1Length: 1492Number of Matches: 1
Related Information
Range 1: 55 to 719GenBankGraphics Next Match Previous Match First Match
Alignment statistics for match #1
Score Expect Identities Gaps Strand Frame
1229 bits(665) 0.0() 665/665(100%) 0/665(0%) Plus/Plus
Features: Query 1 ACATGCAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTGGGA 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 55 ACATGCAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTGGGA 114
Query 61 ATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATACGTCCTTA 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 115 ATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATACGTCCTTA 174
Query 121 GGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 175 GGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA 234
Query 181 CGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 235 CGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACT 294
Query 241 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAA 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 295 GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAA 354
Query 301 CCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACC 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 355 CCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACC 414
Query 361 GGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGC 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 415 GGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGC 474
Query 421 GGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCATGTAGGCGG 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 475 GGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCATGTAGGCGG 534
Query 481 ATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGT 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 535 ATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGGGT 594
Query 541 ATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAATTCGTAGATATT 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 595 ATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAATTCGTAGATATT 654
Query 601 CGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAA 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 655 CGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAA 714
Query 661 GCGTG 665
|||||
Sbjct 715 GCGTG 719
101
Resultaat BLAST: Staal 1 - 2749731
Bartonella henselae strain Houston-1 16S ribosomal RNA gene, complete sequence
Sequence ID: NR_074335.1Length: 1492Number of Matches: 1
Related Information
Range 1: 43 to 757GenBankGraphics Next Match Previous Match First Match
Alignment statistics for match #1
Score Expect Identities Gaps Strand Frame
1310 bits(709) 0.0() 714/716(99%) 1/716(0%) Plus/Plus
Features:
Query 1 GGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 43 GGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGTGAG 102
Query 61 TAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCG 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 103 TAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCG 162
Query 121 TATACGTCCTTAGGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAG 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 163 TATACGTCCTTAGGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAG 222
Query 181 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGC 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 223 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGC 282
Query 241 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGA 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 283 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGA 342
Query 301 CAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAA 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 343 CAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAA 402
Query 361 AGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGT 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 403 AGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGT 462
Query 421 GCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGC 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 463 GCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGC 522
Query 481 GCATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCT 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 523 GCATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCT 582
Query 541 TTGATACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAA 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 583 TTGATACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAA 642
Query 601 TTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGC 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 643 TTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGC 702
Query 661 TGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGGAAGTCCACGCC 716
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||||||||
Sbjct 703 TGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA-GTCCACGCC 757
102
Resultaat BLAST: Staal 3 - 2740748
Bartonella henselae strain Houston-1 16S ribosomal RNA gene, complete sequence
Sequence ID: NR_074335.1Length: 1492Number of Matches: 1
Related Information
Range 1: 107 to 757GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match
Alignment statistics for match #1
Score Expect Identities Gaps Strand Frame
1194 bits(646) 0.0() 649/651(99%) 0/651(0%) Plus/Plus
Features: Query 1 GCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATA 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 107 GCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATA 166
Query 61 CGTCCTTAGGGAGAAAGATTTATSGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGG 120
||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 167 CGTCCTTAGGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGG 226
Query 121 TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 227 TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACA 286
Query 181 CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 287 CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAAT 346
Query 241 GGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCT 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 347 GGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCT 406
Query 301 CTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCA 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 407 CTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCA 466
Query 361 GCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCAT 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 467 GCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCAT 526
Query 421 GTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGA 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 527 GTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGA 586
Query 481 TACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAATTCG 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 587 TACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTAAAATTCG 646
Query 541 TAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAG 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 647 TAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAG 706
Query 601 GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGAAGTCCACGCC 651
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||
Sbjct 707 GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC 757
103
Resultaat BLAST: Staal 4 - 2655574
Bartonella henselae strain Houston-1 16S ribosomal RNA gene, complete sequence
Sequence ID: NR_074335.1Length: 1492Number of Matches: 1
Related Information
Range 1: 43 to 712GenBankGraphics Next Match Previous Match First Match
Alignment statistics for match #1
Score Expect Identities Gaps Strand Frame
1205 bits(652) 0.0() 667/674(99%) 4/674(0%) Plus/Plus
Features:
Query 1 GGCAGGGYTTAAACACATGCAAAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGT 60
|||| || || ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 43 GGCA-GGCTT-AACACATGC-AAGTCGAGCGCACTCTTTTAGAGTGAGCGGCAAACGGGT 99
Query 61 GAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATA 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 100 GAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAATAACACAGAGAAATTTGTGCTAATA 159
Query 121 CCGTATACGTCCTATTTGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAG 180
||||||||||||| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 160 CCGTATACGTCCT-TAGGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAG 218
Query 181 CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGAT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 219 CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGAT 278
Query 241 CAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 279 CAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT 338
Query 301 TGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTT 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 339 TGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTT 398
Query 361 GTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACT 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 399 GTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACT 458
Query 421 TCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTA 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 459 TCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTA 518
Query 481 AAGCGCATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACT 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 519 AAGCGCATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACT 578
Query 541 GCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGT 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 579 GCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTGTGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGT 638
Query 601 AAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTG 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 639 AAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTG 698
Query 661 ACGCTGAGGTGCGA 674
||||||||||||||
Sbjct 699 ACGCTGAGGTGCGA 712