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7/22/2019 Bases histoqumica
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Histoqumica
Definicin
La histoqumica es el conjunto de tcnicas que persiguen la:
identificacin
localizacin
cuantificacin
de:
una sustancia
un grupo reactivo
una actividad enzimtica
en clulas y en tejidos que conservan su estructura lo ms
ntegramente posible.
Para ello se aplican reacciones qumicas o fsicas sobre cortes
histolgicos.
Es decir, los cortes histolgicos se tratan para identificar
determinadas propiedades. Dado que la
estructura del tejido se ha preservado y es visible (mediante
tincin), se puede localizar la propiedad
buscada (si ocurre en el interior de determinado tipo celular,
en la luz de un rgano, en los ncleos
celulares, etc.). La propiedad buscada puede ser la presencia de
una sustancia, de un reactivo o de una
actividad enzimtica.
Dependiendo de la tcnica histoqumica, puede ser posible no slo
identificar la localizacin en el tejido,
sino adems cuantificar (cantidad de sustancia, de actividad
enzimtica, etc.).
Las reacciones histoqumicas deben ser:
Especficas: deben detectar la sustancia buscada, evitando
reaccionar con
otras sustancias (falsos positivos).
Sensibles: ya que las sustancias a detectar suelen estar en
concentraciones
bajas.
Reproducibles: siempre que se realice la tcnica, el resultado
debe ser similar.
Cmo aseguramos la especificidad de una reaccin histoqumica?
Utilizando controles. Los controles son preparaciones
histolgicas sobre lasque se realiza la tcnica con modificaciones.
Estas modificaciones aseguran que
la tincin no se produzca (control negativo) o que se produzca
siempre
(control positivo). Sirven para comprobar que se est realizando
correctamente
la tcnica, que no hay problemas con los reactivos, o que no
tenemos falsos
positivos.
Cmo podemos aumentar la sensibilidad de una tcnica
histoqumica?
Se puede aumentar el grosor de los cortes, lo cual incrementa la
cantidad de
sustancia a detectar; especialmente, si la sustancia est
dispersa en el citoplasma
o si forma grnulos, que deben tener cierto tamao.
Cmo aseguraramos la reproducibilidad de una tcnica
histoqumica?
Estandarizando la tcnica. Deben fijarse con precisin las
condiciones de
Condiciones qumicas
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trabajo, los reactivos a utilizar, la temperatura, pH, etc.
Las reacciones histoqumicas deben realizarse sobre preparaciones
en las que:
Se haya respetado la integridad de los tejidos.
Se mantenga la sustancia a detectar en su localizacin
original.
Esto implica que el procesamiento de las muestras (fijacin,
cortes, etc.) debe
realizarse con ciertas restricciones que en el caso de una
preparacin histolgica
rutinaria.
Procesamiento de las muestras para histoqumica
Las muestras deben ser procesadas de manera similar a las
muestras destinadas a tinciones
histolgicas, pero a menudo se producen ciertas
particularidades.
Tcnica histolgica rutinaria Tcnica histoqumica
Toma de muestras Toma de muestras
Fijacin Fijacin (especfica para la tcnica)
Deshidratacin Deshidratacin (no siempre es posible)
Inclusin Inclusin (no siempre es posible)
Corte Corte
Desparafinado Desparafinado (si se ha incluido)
Tincin Tincin o incubacin
Deshidratacin Deshidratacin (no siempre es posible)
Montaje Montaje
En los estudios histolgicos la fijacin se utiliza para evitar
los cambios post-mortem de
rganos, tejidos y clulas, estabilizar las estructuras celulares,
proteger a las clulas de
las distorsiones que pueden originarse durante el proceso de
deshidratacin e
inclusin y mejorar el potencial de tincin de las distintas
estructuras.
Cmo debe comportarse un buen fijador para histoqumica?
Debe mantener las sustancias a detectar en su localizacin
original, sin
destruirlas ni dispersarlas (e.g., no se puede utilizar etanol,
que disuelve
lpidos, cuando se quiere demostrar la presencia de lpidos).
Debe mantener, o modificar lo menos posible, las propiedades
fsico-
qumicas de la sustancia a detectar.
No debe interferir con la tcnica, bien por inhibicin, por
eliminacin
de grupos reactivos o porque el propio fijador aporte la
sustancia a
detectar (e.g., no se puede utilizar lquido de Zenker, que
contiene
mercurio, si se quiere detectar mercurio).
No obstante, en algunos casos los fijadores permiten la
realizacin de la
tcnica. Los fijadores que desnaturalizan protenas pueden
incrementar as los
grupos reactivos que estaran normalmente enmascarados en el
interior de las
protenas globulares.
Condiciones morfolgicas
Particularidades de la fijacin en histoqumica
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Qu fijadores son utilizados en histoqumica?
Aldehdos, especialmente el formaldehdo (e.g. formol-calcio a 4 C
y
pH 7,0-7,2).
Mezlas fijadoras, como el lquido de Bouin (formaldehdo, cido
pcrico en saturacin y cido actico) y el lquido de Carnoy
(etanol
absoluto, cloroformo y cido actico).
Etanol y acetona, de forma limitada y para precipitar protenas
in situ
(uso en fro y tiempos muy cortos).
Qu podemos hacer si la tcnica histoqumica no permite utilizar un
fijador qumico?
En algunos casos, es posible realizar una fijacin muy breve,
realizar la
reaccin histoqumica y posteriormente una post-fijacin.
Cuando no es posible fijar qumicamente, se utiliza la
congelacin. La
congelacin se utiliza sobre todo en histoenzimologa. Debido a la
contraccin
del tejido, a la desecacin y a la formacin de cristales de
hielo, la morfologade la muestra es menos satisfactoria que con la
fijacin qumica. Para
minimizar los artefactos, se realiza una congelacin muy rpida
(nitrgeno
lquido) y se suelen utilizar crioprotectores (alcohol,
isopentano).
No obstante, la congelacin detiene la actividad metablica,
estabiliza los
componentes de la muestra (permitiendo su localizacin) y permite
prescindir
de la inclusin. La muestra congelada puede cortarse directamente
en un
criostato, tras lo cual los cortes se dejan secar a temperatura
ambiente. Las
secciones pueden almacenarse a -20 C, pero la actividad
enzimtica disminuye
con el tiempo.
Despus de la tincin histoqumica, se suele teir la muestra con
una tcnica de rutina, para distinguir las
estructuras y dar contraste a la tincin histoqumica. Lo ms
importante es tener un buen contraste de los
ncleos y del citoplasma, y que la tincin destaque el producto de
la tincin histoqumica.
Si es posible, la preparacin se deshidrata y se monta con resina
sinttica. Si no es posible deshidratar,
debe utilizarse un medio de montaje acuoso (glicerina-gelatina y
otros).
Reaccin histoqumica
Tras procesar la muestra, sta se trata con una solucin, llamada
reactivo histoqumico. Si se desea
determinar reacciones enzimticas, se habla de medios de
incubacin. La solucin, adems de la
sustancia o sustancias que van a reaccionar, suele contener
otras sustancias que ayudan en la
penetracin de los reactivos, y facilitan o permiten la
reaccin.
A veces, no es necesario aplicar ningn reactivo para detectar la
sustancia que se busca (pigmentos,
cidos nucleicos absorben luz UV a 260 nm, vitaminas
fluorescentes, etc.).
En algunos casos, basta con aplicar un reactivo histoqumico para
poner en evidencia la sustancia
buscada (e.g., tcnica de Perls para deteccin de hierro):
Sustancia + Reactivo Producto final identificable
En otras ocasiones, el resultado de la reaccin es un producto no
visible, por lo que se necesita un
segundo paso (e.g., tcnica de PAS para deteccin de glcidos):
Sustancia + Reactivo Producto inicial no identificable
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Producto inicial + Reactivo adicional Producto final
identificable
Estos productos deben ser insolubles y no difundir, para
localizar adecuadamente la sustancia de
inters.
Reacciones histoenzimticas
Con las reacciones histoenzimticas se detecta un tipo de
actividad enzimtica concreta. No se detecta
la enzima en s (que se hara con inmunodeteccin). La
histoenzimtica no slo permite detectar
actividad enzimtica, sino determinados tipos celulares y
orgnulos en los que esa actividad es tpica
(e.g., una actividad ltica indicara presencia de lisosomas).
En este caso, se utiliza un sustrato de la enzima, el cual es
convertido en un producto por la actividad
enzimtica. Como este producto no es visible, en general, se
utiliza un reactivo de captura
(cromgeno), que reacciona con el producto para dar un producto
final visible:
Enzima + Sustrato Producto inicial no identificable
Producto inicial + Reactivo de captura Producto final
identificable
Es importante que la reaccin sea especfica. Si el sustrato puede
ser procesado por
distintas enzimas, habr que inhibir aquellas que no interese
localizar. Tambin debe
asegurase de que el reactivo de captura llegue al lugar de
reaccin a la vez que el
sustrato y que tenga mayor velocidad de penetracin.
Los productos de la reaccin, tanto el identificable como el no
identificable, deben ser
insolubles; el producto inicial debe reaccionar rpidamente con
el reactivo de captura y
el producto final debe ser oscuro y formar precipitados pequeos,
para dar buen
contraste y asegurar la localizacin.
Por qu el reactivo de captura debe acompaar al sustrato, e
incluso penetrar ms
rpidamente que ste?
Si el reactivo de captura no est presente en el lugar de
reaccin, el sustrato
podra difundir, perdindose la localizacin de la actividad
enzimtica. A
menudo se utilizan condiciones sub-ptimas e incluso inhibidores
enzimticos,
para que el producto inicial se produzca lentamente y reaccione
con el reactivo
de captura en la misma localizacin.
Por qu los productos finales de las reacciones histoqumicas, en
general, deben serinsolubles en agua y lpidos?
De esta manera, forman precipitados que mantienen la localizacin
inicial, y no
se disuelven en procesos adicionales.
Las tinciones histoenzimticas son afectadas por la temperatura,
pH, inhibidores de la actividad
enzimtica y cofactores (sustancias como iones metlicos o
coenzimas, que son necesarias para la
actividad enzimtica). Variando estos factores se puede optimizar
la reaccin y producir la localizacin
deseada. Hay que tener en cuenta que disitintas enzimas pueden
funcionar en condiciones muy
diferentes.
Ejemplos de tcnicas histoqumicas
Deteccin de polisacridos
Caractersticas de los sustratos y productos en
histoenzimtica
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Reaccin del P.A.S. (periodic acid-Schiff):
Esta tincin da una coloracin fucsia caracterstica en presencia
de carbohidratos (polisacridos
simples, polisacridos complejos neutros y polisacridos cidos
sulfatados). La mezcla de cido
perydico y reactivo de Schiff (derivado incoloro de la fucsina
cida) produce una reaccin doble:
1) R-CHOH-CHOH-R + IO4- R-CHO + R-CHO + IO3 + H2O
(grupos vic-glicol) (perydico) (aldehdos)
2) R-CHO + Reactivo de Schiff Azometina (producto coloreado)
Azul alcin:
Da una coloracin azul en presencia de mucopolisacridos cidos. Es
un compuesto bsico que
reacciona con los mucopolisacridos a pH bajo.
Qu haramos para detectar la presencia de polisacridos complejos
neutros y cidos
simultneamente?
Las tinciones P.A.S. y azul alcin se pueden combinar,
permitiendo la
deteccin de distintos tipos de mucopolisacridos. Mira las
microfotografas
siguientes.
Microfotografas de glndulas endocervicales teidas con azul alcin
y P.A.S. El azul alcin tie las
mucinas cidas, mientras que el P.A.S. domina en las glndulas que
producen mucinas bsicas. (a)
muestra una glndula normal, mientras que (b), y (d) muestran
glndulas hiperplsicas, y (c) muestra
clulas de adenocarcinoma (con coloracin mixta, al contener
mucinas cidas y bsicas). El P.A.S. y el
Deteccin de polisacridos
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azul alcin estn tiendo grnulos de mucina producidos por las
clulas y almacenados en el citoplasma.
Fuente: Modern Pathology (2005) 18, 11991210,
doi:10.1038/modpathol.3800403.
Deteccin de lpidos
Los lpidos se pueden detectar con colorantes del grupo de los
Sudanes o con Rojo 0 al aceite. Estas
sustancias son lisocromos: se disuelven en lpidos y los
colorean. Se suelen preparar en saturacin en
etanol al 50% o 70%.
Tras teir con lisocromos, las muestras no se deshidratan, y se
montan directamente
con glicerina-gelatina.
Por qu se realiza un montaje sin deshidratar y con
glicerina-gelatina?
Tal como vimos anteriormente, hay preparaciones histoqumicas que
no se
pueden deshidratar. Recuerda que la deshidratacin se realiza con
una
secuencia de alcoholes, que arrastraran los lisocromos. Debido a
la ausencia
de deshidratacin, hay que montarlos con medio acuoso, la
glicerina-gelatina.
Tincin con Rojo 0 al aceite, mostrando glbulos de grasa en el
interior de arteriolas pulmonares. Estos
glbulos acaban en el torrente sanguneo tras una contusin
traumtica con f ractura sea. Fuente:
http://library.med.utah.edu/WebPath/FORHTML/FOR002.html
Deteccin de hierro
Reaccin de Perls
Se utiliza para detectar grnulos de hemosiderina (compuestos por
ferritina, la protena almacenadora de
hierro). Se aplica HCl diluido para liberar iones frricos, y
estos iones reaccionan con ferrocianuro de
potasio para formar ferrocianuro frrico (azul de Prusia), que
precipita y tiene color azul verdoso.
Montaje de muestras teidas con lisocromos
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Corte de hgado. La tincin de Perls muestra los grnulos de
hemosiderina en el tejido (acmulos con
funcin de almacenamiento de hierro), debido a una situacin de
exceso de este mineral (hemosiderosis
o hemocromatosis). Fuente: The University of Utah Eccles Health
Sciences Library.
Bibliografa
StainsFile
Galera de imgenes en IHCWorld
Special Stains in Histology
Special stains (surgical pathology)
MARTINEZ, R. y GRAGERA, R.R. 2008. Fundamentos tericos y
prcticos de la Histoqumica. Consejo
Superior de Investigaciones Cientficas.
PEARSE A.G.E.1980. Histochemistry: Theoretical and Applied. Vol.
1. Preparative and Optical
Technology. Edinburgh: Churchill Livingstone.
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