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Bases moleculares de la pérdida
de expresión
de moléculas
HLA de clase I en tumores
de colon
Carmen M. Cabrera Morales
Servicio de Análisis Clínicos e Inmunología, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada
Incidencia global del cáncer en los países desarrollados y en vías de desarrollo
Miles de nuevos casos diagnosticados en el año 2010
Pulmón
Mama
Colon
Estómago
Hígado
Próstata
Cérvix
Esófago
Vejiga
Linfoma no-hodgkin
Cavidad oral
Leucemia
Páncreas
Paísesdesarrollados
Países en vías dedesarrollo
S Epitelio
T. conjuntivo
(1)
(2)
(3)Epitelio
T. conjuntivo
Modelo de tumorogénesis
S, célula stem epitelial
Intestino normal
Poliposis adenomatosafamilial
APC+/-
Tumores de colonesporádicos
Pólipo adenomatoso Carcinoma
Pérdida de APCen células epiteliales
Transformación maligna
Progresión adenoma-carcinoma:
inactivación
bialelica de APC
NormalAdenomatemprano
Adenomatardío
Carcinoma
APC/b-Catenina COX-2 K-Ras p53 18q LOH
Genes MMR(hMSH2, hMLH1)
TGFbRII, BAX,
IGF-IIR, E2F4,
TCF-4
A
B
APC/b-Catenina
Inestabilidad cromosómica (A) e inestabilidad demicrosatélites (B) en tumores de colon
Inestabilidad genética/ heterogeneidad tumoral
Selección inmune
a) b) c)
Cáncer inmunoediting: generación de variantes
tumorales inmunorresistentes
Antígenotumoral
Proteasoma
Péptidos
RE
TAP
b2m
Aparato deGolgi
Superficiecelular
Complejotrimérico
Ruta biosintética de moléculas HLA de clase I
FENOTIPOS HLA CLASE I EN TUMORES
FENOTIPO HLA CLASE I NORMAL
A2
A29
B44
Cw1
Cw4
FENOTIPO IVPérdida de alelo
A29
Cw1
A2
Cw4
FENOTIPO IIIPérdida de Locus
FENOTIPO IPérdida Total
A2 A29
B44
B8Cw1
Cw4
FENOTIPO IIPérdida de Haplotipo
A29
Cw1
B44
OBJETIVOS Y DISEÑO EXPERIMENTAL
1. Conocer los mecanismos implicados en la pérdida total de moléculas HLA de clase I (Fenotipo I).
95 tumores de colonestudiados por inmunohistología (Abms W6/32, HC10)
Expresión de cadena pesadaHLA de clase I
Estudio de defectos estructuralesy de expresión en b2m
Expresión de genes de la maquinariade procesamiento y presentación
antigénica (TAP1/TAP2, LMP2/LMP7)
14 tumores con pérdida total de expresión de moléculas HLA de clase I
Inestabilidad de microsatélites (MSI)
2. Dada la elevada frecuencia de pérdida selectiva de HLA-B44 (Fenotipo IV) encontrada en tumores de colon por técnicas inmunohistológicas, determinar los mecanismos responsables.
Tumores de colon con ausencia de expresión
de HLA-B44 (Abms 116-5-28, 66HA)
13 tumores con pérdida de
HLA-B44
Estudio de pérdida
de heterozigosidad
en 6p21.3
Expresión y defectos
estructurales en
HLA-B
3. Determinar la frecuencia de pérdida de haplotipo HLA-I
MICRODISECCIÓN DE SECCIONES DE COLONCRIOPRESERVADAS
Extracción de DNA y mRNA
Microdisección manual
Pipeta Aguja
A
B
Patrones inmunohistológicos en tumores de colon con Fenotipo I
Proteína RNAm
Tumor HC/b2m b2m HC HLA b2m
CO5 - - - + +
CO6 - - - + +
CO14 - - - + +
CO18 - - - + +
CO19 - - - + +
CO22 - - - + +
CO26 - - - + +
CO85 - - - + +
CO86 - - + + -
CO108 - - - + +
CO117 - - + + -
CO128 - - - + +
CO132 - - + + -
CO135 - - + + -
HC, cadena pesada HLA de clase I
SECUENCIA LÍDER EXÓN 2
5‘-ATG CTCTCTCT
37 44
CCCCC TAA-3‘AAAAAAAAAA
200 204 272 276 281 285 360
Mutaciones de b2m encontradas en secuencias de repetición de mononucleótidos en tumores gastrointestinales
con fenotipo mutador
Inserciones y deleciones
Mutaciones missense
Análisis de inestabilidad de microsatélitesen tumores HLA de clase I negativos
Patrón de inestabilidad de BAT26y TGFbRII
Tumor BAT
26
BAT
40
BAT-
RII
BAX TNM Grado
histológico
*CO86 + + - - T4N2M1 MD
*CO117 + ND ND + ND ND
*CO132 + + + + T4N3M0 MD
CO135 + + + - T4N2M0 PD
Presencia (+) o ausencia (-) de MMP; MD, moderadamente diferenciado; PD, pobremente diferenciado; ND, no
determinado; *Tumores HNPCC (Criterios de Amsterdam)
Mutaciones de b2m en tumores de colon MSI (inestabilidadde microsatélites) positivos
*Deleción no descrita en la literatura.
Tumor ExonHomocigoto/
heterocigotoMutación
Posición del
codon stop
CO86
CO117
CO132
CO135
Exon 2
Exon 2
Exon 2
Exon 2
Secuencia líder
Secuencia líder
Heterocigoto
Heterocigoto
Heterocigoto
Heterocigoto
Homocigoto
Homocigoto
*deleción CA, codón 25
deleción A, codón 67
deleción C, codón 91
*deleción CCGTG,
codones 101-102
deleción CT, codones 13-
15
deleción CT, codones
13-15
56
102
102
114
56
56
CO86 CO132
CT
A
Estroma
Tumor
Estroma
Tumor
Del. A (A5)Del. CT (CT4)
Cromosoma 15
15q21
D15S126
15qter
D15S209
Centrómero
Telómero
b2m
15pter-15qter 15q21(próximoa b2m)
Pérdida de heterozigosidad (LOH) en b2m (15q.22)
Tumor D15S126 D15S209
CO5
CO6
CO14
CO18
CO19
CO22
CO26
CO85
CO86
CO108
CO117
CO128
CO132
CO135
LOH
MSI
MSI
ROH
H
ROH
H
ROH
MSI
ROH
MSI
ROH
MSI
MSI
ROH
MSI
MSI
ROH
LOH
ROH
H
H
ROH
ROH
MSI
ROH
MSI
MSI
LOH, pérdida de heterozigosidad;
ROH, retenciónde heterozigosidad;
H, homocigoto;
MSI, inestabilidad de microsatélites.
Análisis de la expresión de genes APM en tumores de colon microdisectados MSI negativos
β2m
HLA
TAP1
TAP2
LMP2
LMP7
LMP2M*
- 424 pb
- 308 pb
- 273 pb
- 298 pb
- 449 pb
- 542 pb
PM 5 6 14 18 19 22 26 85 108 128 C+ C-
LMP7M*
- 614 pb
- 449 pb
- 542 pb
Actina
Fenotipo I;
15%
Pérdida de
B44; 14%
Resto de
tumores; 71%
PÉRDIDAS HLA DE CLASE I
EN TUMORES DE COLON
0
5
10
15
20
25
30
35
B7 B15 B27 B38 B41 B50 B56 B60
B44 (24%)
Frecuencia de HLA-B44 en la población caucásica
6p21.3
Centrómero
Telómero
Cromosoma 6
Clase II III Clase I
TAP1 TAP2 HLA-B HLA-C HLA-A
D6S291 D6S273 D6S265C125C12C D6S276D6S105
Microsatélites
PÉRDIDA DE HETEROZIGOSIDAD EN 6p21.3
Tumor Tipaje HLA STR Haplotipo
perdido
(SSO)D6S311 D6S291 D6S273 C12C C125 D6S265 D6S105 D6S276
CO32 A29, -; B44, 62 N L H L L H H L ND
CO67 A2, 29; B44, 51 L L H L L H L H A29/B44
CO69 A24, -;B44, 35 L L L L L H H L A24/B44
CO101 A2, 29; B44, 7 L L L L L L H L A29/B44
STR, microsatélite; N, normal; L, LOH; H, homocigoto; ND, no determinado
Tumores con tinción inmunohistológica negativa de B44 y
pérdida de haplotipo HLA-I
Tumor Tinción con los Abms
116-5-28/66-HA
Tipaje HLA-B
(SBT)
CO46
CO49
CO53
CO57
CO61
CO74
CO81
CO99
CO100
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B*4402/51011
B*4403/1402
B*4403/0702
B*4403/4005
B*4403/3534
B*4403/4501
B*4402/40011
B*4403/4501
B*4405/4501
Tumores de colon con expresión negativa de HLA-B44
SBT (Sequence Based Typing),secuenciación en alta resolución
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
B*4402 B*4403 B*4405
Tumor
Control
Frecuencia de los diferentes subtipos de HLA-B44 en los tumores de
estudio y en la población control
p <0.05
EX1 EX2 EX3 EX4 EX5 6 7 8
Región 3‘ no traducida
HLA-5UT BSACG3
EF4 BNSA HLA-3UTB
(1388 pb)
Estrategia de secuenciación del locus HLA-B
cDNA
Asp114Asp114
Imagen especular de HLA-B4402/4403/4405
Péptidosubóptimo
Calnexina
BiP
HC
ERp57 b2m
Crt
Complejo de carga peptídico
Tpn
TAP1 TAP2
Péptido óptimo
RE
Citosol
Proteina ubiquitinada Proteasoma
ATP ATP
HC, cadena pesada HLA de clase I
Crt, calreticulina; Tpn, tapasina
Tapasina y el complejo de carga peptídicoHLA de clase I
- 424 pb
- 281 pb
- 281 pb
b2m
Tapasina
Tapasina*
46 49 53 57 61 74 81 99 100 C+ C-
TAP1
TAP2
- 273 pb
- 298 pb
Expresión de tapasina, TAP1/TAP2 en tumores de coloncon ausencia de expresión en superficie de B44
Tapasina*, expresión en mucosa autóloga
Tumores de colon HLA-B44 positivos
C- C+ VE10 CL87 CL86 CL54
- 424 pb
- 281 pb
b2m
Tapasina
B
- 281 pbTapasina
A
62 67 94 101 106 C+ C-
Pérdida de haplotipo HLA-I asociado apérdida de heterozigosidad en 6p21.3
D6S105D6S265C.1.2.5C.1.2.CD6S273Ds291
Estroma
Tumor
Tumor CO15
Electroferogramas de microsatélites que mapean 6p21.3
Fenotipo I; 14%
Pérdida
selectiva de
B44; 15%
Fenotipo II;
40%
Tumores sin
alteración
HLA-I; 31%
FI
FIV
FII
Resto
69% de los tumores de colon presentan alteración HLA-I
1. Fenotipo I MSI positivos
- Inactivación bialelica de b2m (4casos).
MSI negativos
-Alteración del componente del proteasomaLMP7; y defecto de expresión de TAP2 (4 casos).
- En un único caso no se ha podido determinar el mecanismo responsable (CO5).
2. Expresión negativa en superficie de B44
- Tumores con pérdida de haplotipo B44 (4 casos).
-Tumores con defecto de expresión en la chaperona tapasina, componente del complejo de carga peptídico de clase I (9 casos).
3. Pérdida dehaplotipoHLA-I
-El 40% de los tumores de colon presentanLOH en la región 6p21.3
Alteraciones HLA-I en los tumores de colon presentados
Estadio
Dukes TNM Numérico DescripciónPatológica
Tasa de supervivencia a los
5 años (%)
A T1N0M0 I Cáncer limitado a la mucosa y submucosa
>90
B1 T2N0M0 II Cáncer extendido en lamuscular
85
B2 T3N0M0 II Cáncer extendido en laserosa
70-80
C TxN1M0 III Invasión de los ganglios linfáticos regionales
35-65
D TxNxM1 IV Metástasis distantes (hígado, pulmón, etc)
5
Estadios y pronóstico en el cáncer
de colon