Tema 4: Producci dATP en les fermentacions i a la respiraci

1. Introducci Tipus de fosforilacions del ATP: El ADP es pot fosforilar o sintetitzar de diferents maneres i per aix diferenciem entre:

Fosforilaci oxidativa: Es aquella fosforilaci en el qual el P que sincorpora probe dun Pi i lenergia sobt a partir de lenergia de la transferncia delectrons en un conjunt de reaccions redox, es a dir, que sobte com a producte de la respiraci cellular.

Fosforilaci de substrat: Es aquella fosforilaci en el qual el P que sincorpora al ADP probe duna altre molcula que presenta una G dhidrlisi ms gran que la del ADP i daquesta manera sobte lenergia necessria per fer la transferncia. Sn reaccions tpiques de la gluclisi.

2. Producci dATP en la respiraci

2.1 Fosforilaci oxidativa 1939: Es barrejaven homogenats frescos (tritura un teixit sense purificar resconte tots els enzims) amb intermediaris del cicle de Krebs en un medi ric en oxigen. Despres de realitzar diversos experiments van veure qu:

Els intermediaris que collocaven soxidaven, s a dir, perdien electrons La concentraci de Pi disminua i augmentava la concentraci de glucosa-6-P i

fructosa-6-P. Per tant van concloure que la respiraci estava relacionada amb la oxidaci dels compostos i la formaci dATP 1940: Severo Ochoa. Va ficar nom al fet de que la respiraci crees ATP i la va anomenar fosforilaci oxidativa ja que aquest tipus de sntesi de DNA era diferent a la fosforilaci de substrat que ja es coneixia. Tamb va realitzar estudis quantitatius i per aix va utilitzar un aparell que lhi permetia veure la quantitat de O2 consumit i tamb analitzar la diferent concentraci dintermediaris de reaccions En aquest cal destacar:

KOH: Segrestava el CO2 i evitava que distorsiones els resultats.

El lquid que es trobava en el tubs es movia per acci de laugment o la disminuci de O2 . Al ser un recipient hermtic el nic les reaccions produdes en el homogenat eren les niques que podien fer variar la Po2

Els tubs estaven calibrats i per tant ens permetia saver perfectament la [O2] a partir de lalada.

Aquets experiments van permetre establir una relaci ! ! 3 Avui en dia les mesures de la [O2] es fan amb un oximetre. 1948: Lehninger. Gracies als avenos amb la tcnica dultracentrifugaci es van poder fer fraccionaments cllulars i daquesta manera va poder determinar que:

La respiraci es trobava en els mitocondris. A ms a ms els mitocondris en cllules especialitzades es troben en zones en les quals es necessita una gran quantitat denergia com pot ser les cues dels espermatozoides o les fibres musulars. Per tant hi ha relaci entre energia i mitocondria.

Una altre relaci = 3

2.2 Cadena de transport electrnic

2.2.1 Descobriment de la cadena de transport electronic 1920: Warburg. Descobreix que en els mitocondris existeixen unes protenes que tenen la capacitat de transferir-se els electrons entre elles i finalment transferir-li al oxigen. Aquestes collecci de protenes sels anomena cadena de transport electrnic. Per tant existeixen dos processos que sn la cadena de transport electronic i la fosforilaci oxidativa que es produeixen en presencia dO i en el mitocondri. Per tant es va dir que eren dos processos acoblats

2.2.2 Estudis sobre el estats doxidaci dels mitocondris Es va realitzar el segent experiment en el qual es volia veure quina era la velocitat de consum d[O2] per part dels mitocondris en diferents situacions:

Esta 1: Presenta un pendent petit i per tant vol dir que la velocitat de consum era baixa. Aquesta poca activitat que hi ha es deguda als substrats endgens que presenta el homogenat Malgrat que va ser un experiment molt macroscpic es va poder establir una relaci. Per el seu valor variava depenent de la preparaci fent que o be la velocitat de lestat 3 sigues molt mes gran que la del estat 4 o be les dues velocitats fossin iguals . (3). (4) = 1, o be 10 Es va veure que

Mitocondris intactes: Donava un valor = 10 Mitocondris trencats/rebentats: Donava un valor = 1

Com hem vist entre lestat 3 i lestat 4 lnic que varia es la presencia dADP. Per tant mentre que en lestat 3 existeix tant el transport electronic (hi ha substrats) com la fosforilaci oxidativa (hi ha ATP) per tant hi ha acoblament, en lestat 4 nomes existeix el transport electrnic per tant no hi ha acoblament. En el cas en els que els mitocondris estan trencats la velocitat de lestat 3 es igual a la de lestat 4 i per tant aix vol dir que en aquestes situacions no hi ha acoblament. Per tant podem afirmar que perqu hi aix acoblament es necessari que el mitocondris estiguin intactes tot i que encara no shavien el motiu. Es veur posteriorment.

2.2.3 Procs per la separaci dels diferents parts dels mitocondris Mitjanant processos de ultracentrifugaci consecutius es poden allar les diferents parts dels mitocondris i daquesta manera es poden fer estudis bioqumics en cadascun dells. Daquesta manera es va poder localitza en quines parts dels mitocondris estaven cadascun dels diferents components de la respiraci

2.2.4 Components que formen la cadena de transport electrnic Les diferents components que es poden trobar en la cadena de transport electrnic sn:

Deshidrogenases: Actuen amb el NAD (NADNADH+H) Deshidrogenases (flavoprotenes): Actuen amb el FAD (FADFADH2) Protenes amb nucli ferro sofre: Presenten clsters de ferro sofre que suneixen

a la protena mitjanant els grups tiol de les Cys. (Fe2+Fe3+) Citocroms: Presenten grups hemo (Fe2+Fe3+) Protenes que contenen nuclis de coure (Cu2+Cu+) CoQ o ubiquinona. Es un element transportador o capa de captar electrons

que no esta unit a cap protena.

2.2.5 Experiments realitzats per trobar lordre dels transportadors

2.2.5.1 Trobar el valor de potencial redox estandart El potencial redox estndard ens serveix per veure la tendncia que te una molcula destar en la seva forma reduda o en la seva forma estndard. Daquesta manera com ms gran sigui el seu valor ms tendncia te ha estar redut. Per tant els electrons fluiran des de molcules amb potencials de redox baixos fins a potencials de redox alts. Daquesta manera ens pot servir per determinar el ordre.

Hem de tenir en compte per que el potencial redox estandart no es el mateix potencial que podem tenir a les cllules ja que aquest tamb depn de la concentraci de masses actives pe tant no podem donar aquestes dades 100% com a valides. Com ja sabem conixer les concentracions dels diferents formes no es fcil i per tant es impossible conixer el potencial redox real de la cllula = + ln [ ][ ] 2.2.5.2 Allament dels components Lallament va ser un procs difcil ja que tots els components sn protenes de membrana que es troben en la m.i. Per aquest motiu no es van poder allar totes les protenes sin que es van obtenir complexes. Els diferents complexes que van obtenir van ser:

Complex I o NAD deshidrogenasa: Els grups prosttics que presentava sn o FMN o Fe-S

Complex II o Succinat deshidrogenasa: Els grups prosttics que presentava sn o FAD o Fe-S

Complex III o Q citocrom c oxidreductasa: Els grups prosttics que presentava sn

o Hemo bH o Hemo bL o Hemo c1 o Fe-S

Complex IV o Q citocrom c oxidasa: Els grups prosttics que presentava sn o Hemo a o Hemo a3 o CuA i CuB

Tamb van aconseguir allar el citocrom C per separat i de forma molt ms fcil ja que aquest no es trobava en la membrana

Reacci E NAD+ + 2H+ + 2e- NADH+H -0,32 CoQ + 2H+ + 2e- CoQH2 +0,10 2Citboxi + 2e- Citbreduit +0,24 O2 + 2H+ + 2e- H2O +0,83

El que realment fenien per determinar el ordre era era allar cadascun daquets components en un liposoma o reconstruccions parcials de vescules i veure de on a on passaven els electrons.

2.2.5.3 Utilitzaci dinhibidors Existeixen diferents inhibidors que sn capaos dinhibir la cadena de transport electrnic en diferents llocs.

CN-: Inhibeix el complex IV Antimicina: Inhibeix el complex III Rutamicina: Inhibeix el complex I

Per tal de poder aplicar aquets inhibidors com a tcnica per determinar el ordre es necessari que puguem detectar quan un complex esta redut i quan no i per aix es poden utilitzar els espectres dabsorci dels diferents grups prosttics ja que aquets canvien segons el seu estat doxidaci

2.2.5.4 Utilitzaci despectroscpia de diferencia Lespectroscpia de diferencia es realitza amb un aaspectofotometre dalta qualitat que esta format per un feix de llum que es divideix i que va a parar a dos cubetes diferents.

Cubeta que conte una mostra de referencia (blanc) Cubeta que conte una mostra que vull analitzar

Aquest tipus despectrofotmetres van molt be per estudiar la cadena de transport electrnic per dos motius:

Les suspensions, homogenats, o fraccions de mitocondires no son transparents i per tant es difcil fer el blanc

Ens permet fer comparacions. Per poder-les fer correctament collocarem: o Mitocondris completament oxidats en la cubeta de referencia. Per tant

en aquesta cubeta: Es ficar oxigen No es ficar substrat redut

o Mitocondirs completament reduts en la cubeta de la mostra a analitzar. Per tant en aquesta cubeta:

No es ficar oxigen Es ficar substrats reduts.

Com podem veure es va poder determinar que representava cadascun dels pics. Com ms alt fos el pic ms redut volia dir que estava aquest compost. Tots aquets resultats es van combinar amb les tcniques de cintica rapida, en concret amb el sistema stop flow. Aquest sistema permetia barrejar rpidament el oxigen amb una suspensi mitocondrial reduda i llegir els resultats des de el principi de la reacci ja que el sistema es capa daturar el flux i mantenir el medi de reacci en el lloc de lectura. A partir daqu van poder veure quins eren els pics que es veien modificats i amb quina ordre i rapidesa. Hem de tenir en compte que com que els mitocndries estan reduts aquell component que primer reduir el seu pic ser el que directament cedeix els electrons el oxigen i per tant el ltim de la cadena, el penltim de la cadena ser el segon en reduir el seu aspecte i aix successivament.

2.2.6 Ordre de la cadena de transport electrnic El NAD es el gran collector i transportador delectrons per excellncia ja que a diferencia de tots els altres es un transportador soluble.

2.2.7 Disposici a la membrana dels complexos transportadors delectrons Per tal de poder conixer com estaven disposats els diferents complexos a la membrana es van utilitzar dos tcniques per tal de crear liposomes o vescules submitocondrials Daquesta manera es podia conixer la seva disposici sense necessitat de fer estudis cristallogrfics.

La diferencia entre un i laltre dons es que

Detergent: La membrana queda intacte de tal manera que la cara de la matriu mitocondrial queda cap a dintre.

Ultrasons: La membrana queda girada de tal manera que la cara de la matriu mitocondrial queda cap a fora

A partir daqu es van tractar les diferents vescules amb diferents reactius no liposolubles i que per tant no podien travessar la membrana:

Anticossos anti-complexes Reactius que reaccionen amb aa Acceptors i donadors delectrons

Els resultats van ser que tots els components reaccionaven amb les dos vescules i per tant volia dir que estaven exposades per les dues bandes de la membrana interna. A excepci del citocrom c que quasi sempre es perdia ja que aquest esta poc unit a la membrana i rpidament es perd. Es va veure que estava en la cara citoslica.

2.3 Acoblament de la fosforilaci oxidativa i la cadena de transport electrnic

2.3.1 Descobriment de lATP sintasa 1960: Si es feia una microfotografia dels mitocondris amb un microscopi electrnic es podia veure com aquets presentaven units a la membrana interna unes boletes que tenien que ser protenes. Aquestes es van poder allar Mitjanant la creaci de vescules submitocondrials per ultrasons i la centrifugaci. El que es va veure era que:

Partcules submitocondrials: Podien realitzar el transport delectrons i la fosforilaci oxidativa

Vescules soles (sediment): Podien realitzar el transport delectrons Protena lliure (sobrenedant): Podien realitzar la hidrlisi del ATP, es a dir,

tenien activitat ATPasica.

Tamb es va veure que si es tornaven a reconstruir les vescules amb les protenes aquetes vescules tornaven a permetre la fosforilaci oxidativa i el transport delectrons Per tant es va determinar que les protenes que formaven les boletes si be eren capaces de per si soles hidrolitzar lATP en presncia dun transport delectrons sn

ADP + PiATP + H2O

capaces de permetre la sntesi dATP i per tant tenien activitat ATPsintasa i eren les que permetien la fosforilaci oxidativa. Aquesta protena en un principi era coneguda com a factor F1 per actualment es coneix com a ATPsintasa F1

2.3.2 Hipotesis de lacoblament El problema del acoblament es que no existia cap transportador delectrons que presentes un centre actiu en el qual shi pogus unir el ATP es a dir, cap transportador presentava activitat ATPasica. Per tant fsicament la cadena de transport i la fosforilaci oxidativa estaven separades. Per aquest motiu es parla dacoblament i no duni

2.3.2.1 Hiptesi de lacoblament qumic Es una teoria que es basa en el fet de que el transport delectrons es capa de generar un intermediari ric en energia qumica(G dhidrolisi gran) que no era lATP. Aquesta energia qumica era utilitzada per la sntesi del ATP. Per tant com podem veure era una sntesi dATP semblant a la fosforilaci per substrat. El problema va ser que ning va trobar quin era aquest intermediari

2.3.2.2 Hiptesi de lacoblament conformacional Es una teoria que es basa en el fet de que el transport delectrons es capa de generar un canvi de conformaci en una protena de tal manera que passa a un estat conformacional tens. Aquesta energia fsica era utilitzada per la sntesi del ATP. Malgrat que no es va poder demostrar aquesta hiptesi si que algunes de les seves idees van ser aplicades en el model actual tal i com veurem ms endavant

2.3.2.3 Hiptesi de lacoblament quimiosmotic Es una teoria que es basa en el fet de que el transport delectrons es capa de generar un transport de protons que genera gradient de protons entre la matriu i lespai intermembrana del mitocondri. Aquesta energia electroqumica era utilitzada per la sntesi del ATP. Els punts principals en els quals es basava aquesta hiptesi

La reacci de sntesi dATP era una reacci vectorial es a dir era una reacci que necessitava tenir una direcci fixa en el espai. Aquest fet trencava amb les idees clssiques del metabolisme ja que totes les reaccions que es coneixen eren isotrpiques, s a dir, que no necessitaven tenir una direcci.

Caracterstiques especifiques de la membrana: Just al mateix temps es va descriure la teoria de les membranes biolgiques basada en el mosaic fluid en el qual es descriuen les membranes com una barrera de permeabilitat generada per una diluci bidimensional de lpids orientats. Aquesta teoria de la estructura de la membrana comportava que les membranes fossin

o Asimetriques: Permet que les reaccions siguin vectorials. o Impermeables: Permet que es pugui generar el gradient.

Les dades experimentals que van permetre sustentar aquesta teoria i per tant donar-la com a valida varen ser:

Com ja hem vist anteriorment els mitocondris trencats presentaven un desacoblament. Aquest fet es podia explicar amb aquesta teoria ja que la destrucci dels mitocondris implicava que es destruir el gradient de protons

Experiment en el qual es mesurava el pH de la part citoslica i es va veure que en presencia de O2 aquest rapidament augementava fruit del transport de protons i poc a poc anava disminint fruit de la sntesi del ATP. Es va tornar a repetir el experiment per aquesta vegada es va afegir 2-4 dinitrofenol que es conexia que era un agent qumic desacoblant i tamb es coneixia que era liposoluble i que podia unir-se a H. Daquesta manera es va raonar que el seva capacitat de desacoblar era deguda a que destrua el gradient.

2.4 Gradient de protons: Diferencial electroqumic Parts: La diferencia de potencial total es pot dividir en:

Diferencies de potencial qumic: Actua sobre les concentracions dels protons. s a dir, es el gradient generat per lespcie en concret

Diferencia de potencial elctric: Actua sobre la distribuci de les carregues. s a dir, es el gradient generat per les carregues independentment de lespcie.

Diferencial electroqumic: Aquesta equaci es pot simplificar si treballem a partir de la diferencia de potencial qumic

Fora prot motriu: La fora prot motriu i la diferencia de potencial electroqumic sutilitzen bastant indistintament depenen de si ens interessa donar la energia en V o en J/mol. El nom de fora prot motriu deriva de la similitud daquesta fora generada pels protons en el mitocondri, a la fora que exerceixen les piles en un circuit elctric. Ja que els dos permeten generar una diferencia de potencial elctric que es poden expressar en V que servir per crear un treball til, ja sigui encendre una bombeta (energia fotnica) o generar ATP (energia qumica). A ms a ms els dos poden ser cortocircuitats i com a resultat generar energia calorfica (en el mitocondri saconsegueix trencant les membranes)

2.4.1 Mtodes de mesura de pH i Mesura de : Per tal de poder-la mesurar utilitzarem cations i anions lipofilics. Aquets cations es caracteritzen per tenir una gran quantitat danells aromtics que lhi permeten repartir la carrega i tamb guanyar un carcter hidrofbic. Aquets dos fets permeten que els cations puguin travessar la membrana. Cal destacar que a ms a ms els anaells aromtics ens serviran per poder calcular les concentracions Els dos compostos que sutilitzen ms sn:

Metiltrifenilfosfat Metiltetrafenilborat

Al utilitzar aquets lipfils aconseguim dues coses:

Eliminar el pH: No utilitzen protons per tant el diferencial qumic no es pot convertir en pH

Arribar al equilibri: Com que els ions poden travessar la membrana al final podran arribar a una condici dequilibri on la suma dels potencials elctrics i qumics ser igual a 0

Per tant per acabar de calcular en el equilibri nomes haurem de conixer quines sn les concentracions en el equilibri del ionfor utilitzat en lequilibri. Per poder-ho calcular aprofitarem la capacitat dabsorci dels anells aromtics. Per discernir ente les concentracions de dins i de fora farem una centrifugaci de la fracci cellular que conte els mitocondris i daquesta manera:

Sobrenedant: Sabsorbeix [fora] Sediment: Conte els mitocondris. Es fa una lisi i sabsorbeix[dins]

Mesura del pH: Per tal de poder-la mesurar utilitzarem cids dbils ja que aquets sempre presenten una fracci no ionitzada (estan en equilibri entre la o ionitzada i la ionitzada) Per tant per calcular pH podem utilitzar diferents mtodes dels que destaquem:

Relaci entre les Keq: Com ja hem dit el cid feble sempre presentar una porci de part ionitzada i una de o ionitzada. En aquest cas la no ionitzada tindr la capacitat de travessar la membrana i daquesta manera al final arribarem a unes condicions dequilibri on [AH]dins=[AH]fora i consequentment la Keqdins =Keqfora . Al igualar les concentracions podrem relacionar la relaci de concentracions de [A-] de dins i fora amb les de [H+] tamb dins i fora. Per conixer quines son les concentracions de [A-] podrem utilitzar el mateix mtode de centrifugaci que abans.

Utilitzaci de PO4H2: s un cid deble que presenta dues peculiaritats: o Presenta un pK=6,8. Aquest pK est molt a prop del pH fisiolgic i per

tant s molt susceptible a canvis dequilibri. o El seu aspecte de ressonncia magntica nuclear vaia en funci del pH

per tant observant com varia lrea dels pics i el lloc podem conixer quin s el seu pH.

Resultats: A partir daquets experiments sha pogut calcular que: pH=0,5 Aix indica un excs cid a fora =170mV Aix indica un excs de protons a fora

Conseqentment el P= 200mV

2.5 Probes a favor de la teoria quimiosmotica

2.5.1 Generaci dATP amb pH artificial La teoria es basa en que la cadena de transport electrnic a grosso modo serveix per crear un gradient de protons que genera un diferencial electroqumic que es utilitzat per generar el ATP. Per tant si som capaos de crear un gradient de protons artificial, la teoria diu que es tindria que generar ATP amb absncia de substrats reduts que fessin moure la cadena de transport electrnic. Per crear el gradient de protons artificial realitzo els segent experiment: En una suspensi mitocondrial faig augmentar el pH fins que la suspensi arribi al equilibri, es a dir fins que a dins i fora dels mitocondris tinguem el mateix pH. A continuaci i de forma el mes rpid possible fem baixar el pH de la suspensi. Durant els moments en els quals no es trobem en el equilibri el pH del interior del mitocondri ser ms alt que no pas al del exterior, s a dir, que hi hauran ms protons al exterior. Aquest fet crear que durant uns moments tinguem un pH i un increment de carregues artificial que ser capa de generar ATP. Per tant podem confirmar que el gradient de protons s la base de la producci dATP.

2.5.2 Generaci dATP amb nomes un dels potencials Com hem vist el potencial electroqumic presenta dues parts. Cadascuna daquestes parts s independent i en teoria t que tenir la capacitat de generar lATP per ell sol tot i que unes quantitats ms baixes. Per tal de poder eliminar el potencial qumic o elctric utilitzarem els ionfors. Recordem que el potencial qumic depenia de lespcie nicament i el potencial elctric depenia de la carrega independentment de lespcie. Ionfors: Sn molcules solubles que tenen la capacitat de transportar ions entre membranes a favor de gradient. Els dos ionfors que ms shan utilitzat sn:

Valinomicina: lutilitzarem per destruir el potencial elctric Nigericina: Lutilitzarem per destruir el potencial qumic o pH

2.5.2.1 Valinomicina Definici: s un pptid petit sintetitzat per estreptomicines que sutilitza com antibitic. Estructura: T una estructura circular que s hidrofbica per fora i a dintre presenta uns grups carbonils que tenen la capacitat dinteraccionar amb cations K Que transporta: Cations de potassi Destrucci del potencial elctric: Com ja hem pogut calcular en el citosol tenim una excedent de carregues positives en comparaci amb el interior, i per tant tenint en compte aix i el fet de que en el interior del mitocondri la concentraci de potassi es molt baixa la valinomicina te la capacitat de transportar els potassi desde el citosol fins al mitocondri. Com a resultat de lequilibri dels potassis es destruir el potencial elctric ja que les carregues en els dos cantons seran les mateixes, per en canvi el potencial qumic quedar intacte ja que els protons no es toquen. Resultat: Nomes amb el potencial qumic es pot realitzar la fosforilaci oxidativa.

2.5.2.2 Nigericina Definici: Es una molcula orgnica sinttica Estructura: Te una estructura lineal per en presencia de un medi hidrofbic te la capacitat de plegar-se en forma circular que t la part hidrofbica per fora i un la part interior polar amb la capacitat de interaccionar cations com poden ser el potassi i els protons Que transporta: Protons i potassi Destrucci del potencial qumic: La nigerina te la capacitat de transportar un proto en una direcci i un potassi en laltre direcci. La doncs agafar un prot del exterior i el transportar fins al interior i agafar un potassi del interior i portar fins el exterior. Daquesta manera podem veure com el pH es veu afectat ja que el gradient de protons es va destruint, per la diferencia de potencial elctric no ja que per cada carrega positiva que perdem amb un prot la guanyem amb un potassi. Resultat: Nomes amb el potencial elctric es pot realitzar la fosforilaci oxidativa.

Bioenergtica Francesca Soler

3

Per la membrana passen electrons i bombegen protons. Si apliquem una soluci de 2,4-dinitrofenol, com que s un cid dbil es descompon en la forma ionitzada no ionitzada. Si a fora hi ha protons, el 2,4-dinitrofenol nota que hi ha protons i lequilibri queda afectat.

Si no t crrega pot passar a laltre costat. Si lexperiment es fa afegint una gran dosi de dinitrofenol (enverinar), el dinitrofenol agafa protons i els transporta a laltre costat i sanulla el gradient de protons. El dinitrofenol actua com a desacoblant no hi ha fosforilaci (per s transport electrnic).

Altres mtodes Agafar una suspensi de mitocondris i sotmetrels a un xoc amb una dissoluci de pH molt elevat. Els mitocondris sn impermeables als ions, per en aquesta magnitud. Acaba entrant aquest pH a dins.

Se centrifuga, es torna a resuspendre, i el pH es porta a valors baixos. Durant una estona, el pH dins els mitocondris s alt i el pH fora s baix. Hem creat un gradient de pH artificial durant un temps. Durant aquests primers moments, sense que no hi hagi ni substrats oxidables ni oxigen, es produeix fosforilaci. El gradient de pH s causa suficient per generar fosforilaci.

Experiments amb ionfors Sn transportadors de ions. Nhi ha que son antibitics naturals i nhi ha de sinttics.

x Valinomicina petit pptid que sintetitza un streptomices. T moltes modificacions qumiques.. s covalentment circular. Una vegada es plega, li queda fora una zona hidrofbica i a dins li queden carbonils que serveixen per quelar potassi. El potassi queda amagat dins aquest cercle hidrofbic.

Membrana amb [H+]fora>[H+]dins. Si hi ha valinomicina, allibera aigua i agafa i potassi. Com que fora no t crrega, es fica dins la membrana.

Bioenergtica Francesca Soler

4

Com que hi ha una diferncia de potencial elctric, el potassi s una crrega i si hi ha un excs de crregues positives fora, el potassi no hi est b. Com que s hidrofbic i petit, dissol dins la membrana. Ionfor mbil. Transporta les crregues positives dins la membrana. Fa que la diferncia de potencial elctric sanulli. No ha transportat protons

(resta encara un gradient de pH). Si els mitocndries sels sotmet a lacci de la

valinomicina segueixen produint fosforilaci.

De la frmula , que t dues parts, si ten carregues una ( ) encara fa fosforilaci (funciona).

x Nigericina molcula orgnica sinttica lineal. Es plega formant un cercle i s hidrofbica per fora. Tamb s mbil a la membrana.

La nigericina allibera un potassi i agafa un prot. Semporta una crrega positiva dun

prot per deixa un potassi. La diferncia de potencial elctric no queda alterada (pot existir). Els mitocondris fan fosforilaci. Ara els hi hem anullat la possibilita de tenir gradient de pH per encara tenen potencial de membrana.

Quan sapliquen els dos ionfors alhora? No fosforilaci.

Problemes estequiomtrics de la hiptesi quimiosmtica Quina solvncia t el plantejament de la hiptesi quimiosmtica. Es raonable el transport de protons que va plantejar Mitchell?

2.5.2 Desacoblament Com ja hem reiterat segons la teoria, el gradient de protons es el encarregat de poder donar lenergia per poder sintetitzar ATP. Per tant si destrum per complert aquest gradient en teoria no es pot generar ATP. Per destruir aquest gradient puc utilitzar ionfors especfics per protons com pot ser el 2,4 dinitrofenol. Aquets ionfors doncs nomes transportaran protons desde el exterior fins al interior i per tant destruiran el gradient electroqumic. I com a resultat no es podr generar ATP. A nivell natural tamb existeix el desacoblament amb la presencia de la termogenina, aquesta s una protena es capa de generar un porus pel qual hi poden passar els protons. Es una protena que es troba principalment en el teixit adips bru en els nadons i en tots aquells animals que hibernen. Aquesta localitzaci es deguda a que el desacoblament es igual al curtcircuit del sistema i com ja hem dit abans aquest fet genera energia trmica com a resultat.

2.6 Clculs estequiomtrics

2.6.1 Protons-electrons En la poca que Mitchell va fer la hiptesis ja es coneixia que per cada atom doxigen o per cada 2 electrons que sutilitzaven es podien produir 3 fosforilacions. Despres de la hiptesis el que es vol conixer es la relaci entre el oxigen i el electrons per el hidrogen, es a dir quants protons sm capaos de transportar amb un oxigen o amb 2 electrons. Experiments de Mitchell: Va calcular el pH i per tant la [H] que es generava en el exterior del mitocondri com a conseqncia dafegir una quantitat coneguda de oxigen. Un dels problemes del experiment s que mentres es crear el gradient de protons, aquest ja esta sent utilitzat i per tant el pic de pH o de [H] que es gener no es tant alt com realment ho seria. Per aquest motiu van fer clculs terics en els quals es va calcular quina era la concentraci de protons mxima que es generava si no tenem en compte leliminaci durant la producci. El resultat va ser que ! !2! = 6 Clculs actuals: Aquestes extrapolacions matemtiques que es van fer no eren gaire bones ja que no tenien en compte que la eliminaci del gradient de protons es feia per la bomba de protons per existeixen altres transportadors que utilitzaven aquest gradient com podien ser:

Antitransport de Na: Surt un Na del interior en contra de gradient i entre un prot a favor de gradient.

Transport de Pi: El Pi sl no pot entrar en el interior del mitocondri que s on realment fa falta. Per transportar-se sajunta amb un proto. Daquesta manera entra un altre prot en el interior

Permeabilitat intrnseca: Les membranes mitocondrials no son barreres 100% efectives i per tant hi han protons que poden travessar per si sols la membrana sense necessitat de cap transportador

Bioenergtica Francesca Soler

5

Es van fer experiments primerencs que pretenien quantificar el nombre de protons que es necessiten:

P/O=3 (Ochoa, anys 40)

P/2e-=3

H+/2e-=?

Es pretenia veure quants protons per un tom dO2. H/O=?

Per on entren els protons? Han dentrar pq han de fer ATP. El tema

s captar quants en surten en el primer moment.

Es pot fer fent una extrapolaci que ens donaria el valor mxim de protons extruts. Mitchell va trobar H+/2e-=H+/O6.

La hiptesis patina (el I transporta 2 protons). A ms, el transportador electroneutre de Pi el van inhibir amb NEM. Inhibint aquest transportador, el n de protons extruts s uns 8x10. Sembla que hi ha un transport de protons major del que es podia explicar amb Mitchell.

CoQ Primera consideraci: tenir en compte que tamb existeix el CoQ (un dels intermediaris). Pot sofrir reaccions redox, no est lligada a cap protena i s liposoluble. A ms, la concentraci de CoQ s exageradament elevada en comparaci als complexes I, III, IV i CitC.

El CoQ t 3 estats possibles:

Cicle Q Mecanisme:

Bioenergtica Francesca Soler

5

Es van fer experiments primerencs que pretenien quantificar el nombre de protons que es necessiten:

P/O=3 (Ochoa, anys 40)

P/2e-=3

H+/2e-=?

Es pretenia veure quants protons per un tom dO2. H/O=?

Per on entren els protons? Han dentrar pq han de fer ATP. El tema

s captar quants en surten en el primer moment.

Es pot fer fent una extrapolaci que ens donaria el valor mxim de protons extruts. Mitchell va trobar H+/2e-=H+/O6.

La hiptesis patina (el I transporta 2 protons). A ms, el transportador electroneutre de Pi el van inhibir amb NEM. Inhibint aquest transportador, el n de protons extruts s uns 8x10. Sembla que hi ha un transport de protons major del que es podia explicar amb Mitchell.

CoQ Primera consideraci: tenir en compte que tamb existeix el CoQ (un dels intermediaris). Pot sofrir reaccions redox, no est lligada a cap protena i s liposoluble. A ms, la concentraci de CoQ s exageradament elevada en comparaci als complexes I, III, IV i CitC.

El CoQ t 3 estats possibles:

Cicle Q Mecanisme:

Utilitzant inhibidors dels transportador de Pi i diferents calcules es va poder calcular que ! !2! = 8 10 Per tant per cada 2 electrons o un oxigen es transporten entre 8 i 10 protons des de el interior del mitocondri fins al exterior.

2.6.2 Protons-ATP Per trobar la relaci entre quants protons es necessiten per crear un ATP, en primer llco hem de calcular quina es la energia associada a la cadena de transport electrnic i en el transport de protons. Aix es pot calcular de la segent manera: Tenint en compte que per generar un ATP necessiten 14kcal/mol podem veure com es necessiten mes o menys uns 3 protons per crear un ATP. Tenint en compte que es creen 3 ATP , necessitar 9 protons.

2.7 Justificaci del nombre de protons Els protons poden ser transportats de tres maneres

Cicle Q o pool de quinones Deshidrogenaci del NADH+H Canvis conformacions provocats pel transport delectrons. Formaci de porus

que deixen passar els protons.

2.8 Ordre de la cadena de transport electrnic

Cicle Q:

Bioenergtica Francesca Soler

6

Mitchell va proposar: CoQ transportador mbil de protons. Grcies al cicle Q hi ha 4 protons que venen de dins cap a fora. Les reaccions de transferncia electrnica els donen E per anar contra gradient.

Falten protons encara.

Podem calcular quanta G hi ha associada a la cadena de transport electrnic i en el transport de protons? S pq sn processos redox.

En transport electrnic

En transport de H+

Qu es vol fer amb els protons? Produir ATP.

Per cada ATP que es produeix en condicions cellulars . Per cada prot tinc disponibles unes 5Kcal/mol i en necessito 15. Necessito multiplicar per 3 el 4,6Kcal/molH+ necessito 3H+ transportats per cada ATP. Tamb necessito 3ATP/O=3ATP/2e-, de manera que necessito uns 9H+/3ATP. Els 9 protons no els veig a la cadena de transport electrnic.

Hi ha reaccions conformacionals degudes a canvis de conformaci dels transportadors durant el transport delectrons.

Aquestes tres coses ban resoldre els problemes estequiomtrics de la hiptesi quimiosmtica.

Transferncia delectrons entre transportadors Hi ha unes dades fetes amb tcniques de Photobleaching que permeten veure si les protenes estan quietes o es mouen a les membranes.

Photobleaching marcar protenes amb un reactiu fluorescent, mirar els mitocondris en el microscopi de fluorescncia, i si al Complex I li hem posat un fluorfor verd, veurem verd per tot arreu. Si a un determinat mitocondri li enviem un raig lser, all on toco desapareix el color pq el lser ha provocat una fotodegradaci i hi ha un forat de color. Mirant al llarg del temps, el photobleaching va reapareixent

mica en mica la coloraci original i al final ho veus tot igual. Com que es poden obtenir imatges cada ms, es poden fer cintiques de la desaparici del photobleaching. Permet calcular la velocitat de difusi lateral dels diferents complexes de la cadena.

Els complexes que tenen color, al llarg del tems es van movent en totes direccions i acaben omplint lespai on no hi havia color. Difusi lateral, pq les membranes sn bidimensionals i per mantenir la vectoralitat shan de moure lateralment, per no poden invertir la seva orientaci.

Aproximadament aquests complexes difonen 40nm/5ms. En 5ms es mouen tan com 10 vegades el seu dimetre.

Bioenergtica Francesca Soler

6

Mitchell va proposar: CoQ transportador mbil de protons. Grcies al cicle Q hi ha 4 protons que venen de dins cap a fora. Les reaccions de transferncia electrnica els donen E per anar contra gradient.

Falten protons encara.

Podem calcular quanta G hi ha associada a la cadena de transport electrnic i en el transport de protons? S pq sn processos redox.

En transport electrnic

En transport de H+

Qu es vol fer amb els protons? Produir ATP.

Per cada ATP que es produeix en condicions cellulars . Per cada prot tinc disponibles unes 5Kcal/mol i en necessito 15. Necessito multiplicar per 3 el 4,6Kcal/molH+ necessito 3H+ transportats per cada ATP. Tamb necessito 3ATP/O=3ATP/2e-, de manera que necessito uns 9H+/3ATP. Els 9 protons no els veig a la cadena de transport electrnic.

Hi ha reaccions conformacionals degudes a canvis de conformaci dels transportadors durant el transport delectrons.

Aquestes tres coses ban resoldre els problemes estequiomtrics de la hiptesi quimiosmtica.

Transferncia delectrons entre transportadors Hi ha unes dades fetes amb tcniques de Photobleaching que permeten veure si les protenes estan quietes o es mouen a les membranes.

Photobleaching marcar protenes amb un reactiu fluorescent, mirar els mitocondris en el microscopi de fluorescncia, i si al Complex I li hem posat un fluorfor verd, veurem verd per tot arreu. Si a un determinat mitocondri li enviem un raig lser, all on toco desapareix el color pq el lser ha provocat una fotodegradaci i hi ha un forat de color. Mirant al llarg del temps, el photobleaching va reapareixent

mica en mica la coloraci original i al final ho veus tot igual. Com que es poden obtenir imatges cada ms, es poden fer cintiques de la desaparici del photobleaching. Permet calcular la velocitat de difusi lateral dels diferents complexes de la cadena.

Els complexes que tenen color, al llarg del tems es van movent en totes direccions i acaben omplint lespai on no hi havia color. Difusi lateral, pq les membranes sn bidimensionals i per mantenir la vectoralitat shan de moure lateralment, per no poden invertir la seva orientaci.

Aproximadament aquests complexes difonen 40nm/5ms. En 5ms es mouen tan com 10 vegades el seu dimetre.

2.9 Organitzaci supramolecular dels complexes respiratoris Models: Existeixen dos models de organitzacions supramoleculars dels complexos respiratoris

Model destat fluid: Es aquell en el qual cadascun dels complexos de la cadena respiratria es troben per separat i difonen lliurament per la membrana. La transferncia delectrons entre els diferents complexos es fa mitjanant xocs aleatoris.

Model destat slid: Es aquell en el qual cadascun dels complexos de la cadena respiratria es troben tots junts gracies formant un macrocomplex conegut com ha respirosoma.

Probes a favor del estat fluid: Fotoblanqueig: Es el fenomen en el qual es produeix la destrucci fotoqumica

dun fotopigment. Aquest sistema sha utilitzat per demostrar la difusi dels complexos i la seva velocitat de difusi. Per aix es marcava algun del complex amb un fluorofor i es collocava a la membrana dun mitocondri. En un inici tot el mitocondri estava illuminat i posteriorment amb un lser provocarem un fotoblanqueig duna zona del mitocondri i conseqentment aquesta es va quedar tota fosca. Al cap dun temps la taca fosca va desaparixer i el color es va tornar a repartir homogniament i aix nomes es pot explicar si els complexos es mouen. Aquest sistema tamb ens serveix per calcular la velocitat de difusi i aquesta s duns 40nm/5ms (cada 5ms es mouen 10 vegades el seu dimetre). Cal destacar que CoQ i CitC encar es mouen ms rpidament.

Stopped Flow: Amb estudis de cintica rapida han demostrat que la transferncia dels electrons des de el NADH fins al O2 tarden uns 10ms. Aquest temps es viable amb el model de xocs aleatoris

Cintiques de segon ordre: Daquesta manera podem demostrar que es necessiten el xoc de dos complexos perqu es produiexi la transferncia. Per aix es necessari fer estudis de cintiques de reaccions i calcular la velocitat de reacci a diferents concentracions de cadascun dels complexos. Per variar la

concentraci el que es fa es diluir els complexos a partir de fusionar vescules lipdiques despullades de protenes al mitocondri. Es va veure que tant disminuint la concentraci dun complex com dun altre la velocitat disminua i per tant aix volia dir que era una cintica que segon ordre.

2.10 Deslocalitzaci del gradient de protons Models: Existeixen dos models possibles del comportament dels protons una vegada han estat transportats

Deslocalitzaci: El gradient es reparteix uniformement per tota la superfcie Localitzaci: El gradient no es reparteix i es queda just en el lloc on ha sigut

transportat Probes a favor de la deslocaclitzaci: Mitchell creia que el gradient estava deslocalitzat i per aquest motiu va fer un experiment per demostrar-ho en el qual utilitzava la gramicidina. Aquesta protena es un ionfor que insereix a la membrana i forma un porus per no es pot difondre (es queda fixe en un lloc de la membrana). Va collocar una concentraci de gramicidina i de mitocondris igual de tal manera que hi hagus una sola gramicidina per cada mitocondri i el que va veure era que en aquets mitocondris no h havia producci dATP i que per tant hi havia un desacoblament. Com que la gramicidina no es pot moure si el gradient no estigues deslocalitzat seria impossible un desacoblament.

3.1 Descobriment de lATP sintasa 1960: Si es feia una microfotografia dels mitocondris amb un microscopi electrnic es podia veure com aquets presentaven units a la membrana interna unes boletes que tenien que ser protenes. Aquestes es van poder allar Mitjanant la creaci de vescules submitocondrials per ultrasons i la centrifugaci. El que es va veure era que:

Partcules submitocondrials: Podien realitzar el transport delectrons i la fosforilaci oxidativa

Vescules soles (sediment): Podien realitzar el transport delectrons Protena lliure (sobrenedant): Podien realitzar la hidrlisi del ATP, es a dir,

tenien activitat ATPasica.

Tamb es va veure que si es tornaven a reconstruir les vescules amb les protenes aquetes vescules tornaven a permetre la fosforilaci oxidativa i el transport delectrons Per tant es va determinar que les protenes que formaven les boletes si be eren capaces de per si soles hidrolitzar lATP en presncia dun transport delectrons sn capaces de permetre la sntesi dATP i per tant tenien activitat ATPsintasa i eren les

ADP + PiATP + H2O

que permetien la fosforilaci oxidativa. Aquesta protena en un principi era coneguda com a factor F1 per actualment es coneix com a ATPsintasa F1 Un altre experiment que va confirmar que aquesta ATPasa era realment lATPsintasa es basava en crear vescules que continguessin nomes aquesta ATPsintasa i observar quina relaci hi havia entre els protons i el ATP. Per crear les vescules van barrejar ATPsintasa purificada, fosfolpids i detergent, posteriorment varen fer una dilisi per tal deliminar el detergent i com a resultat es van crear unes vescules que nomes contenien els fosfolpids i lATPsintasa. Hem de tenir en compte per que aquesta ATPsintasa est collocada al reves de com ho esta en el mitocondri. Aquestes vescules les van collocar en un suspensi i van calcular com variava el pH exterior amb un pH metre desprs dafegir-hi ATP Com podem veure el que passava era que en presencia dATP la concentraci de protons al exterior disminua. Aquesta disminuci nomes podia ser deguda a que lATPsintasa gastava el ATP per transportar el prot cap al interior de la vescula. Tenint en compte que la ATPsintasa estava al reves de com est realment en el mitocondri es va crear la hiptesis de que en la cllula passava al reves, es a dir que el transport dels protons era el que donava la energia per sintetitzar un ATP a partir dADP i Pi. Hiptesi de Mitchell: Amb tot aquesta informaci Mitchell va fer una hiptesi sobre el funcionament de lATPsintasa. Es basava en que el prot entrava en el transportador i atacava a un radical de O del Pi. Com a conseqncia el P del Pi podia ser atacat pel radical O del P de ADP. Daquesta manera es forma ATP + H2O

3.2 Model actual de lATPsintasa Per arribar al model actual es van fer molt experiments i fins lany 1997 no es va confirmar la hiptesi de lATP sintasa. Els principals experiments que van permetre arribar aquest model varen ser:

Skow: Va descobrir la bomba de Na-K que era una ATPassa que podia transportar els dos ions en contra de gradient.

Boyer: Va establir el mecanisme de sntesi del ATP a partir destudis fisicoqumics. El mecanisme el va anomenar binding change mecanism

Walker: Van poder resoldre lestructura tridimensional de la subunitat F1 mitjanant cristallografia de raigs X i daquesta manera va poder confirmar moltes de les hiptesis generades per Skow i Boyer.

Bioenergtica Francesca Soler

8

hidrofliques per dins. Deixar passar H+, K+, Na+... ionfor que fa porus que deixen passar protons. Sanomena ionfor formador de canals.

Van fer un experiment amb diferents concentracions de gramicidina i mitocondris. Posaven tan

poca gramicidina que tocava una gramicidina per mitocondri:

.

Van veure que tamb hi havia desacoblament. Comparat amb la superfcie del mitocondri s suficient per fer que el gradient de pH desapareixi. Si el gradient no fos tan qumic com se limaginava Mitchell, aix no passaria.

Collegues de Mitchell pensaven que quan els protons sortien quedaven localitzats (gradients locals de protons) per tornar a entrar per lATPasa. Mitchell tenia ra.

ATP sintasa (ATPasa F1-Fo) Van trobar una part de la protena ancorada a la membrana: la Fo i la que es veia al microscopi es deia F1.

Una vegada purificada es van fer estudis de reconstrucci parcial: agafaven lATPasa F1-Fo purificada + fosfolpids de membrana + detergents. Feien una dilisi que mica en mica anava traient el detergent i aconseguien vescules artificials que contenien la bicapa lipdica i la protena de membrana. En les condicions que sutilitzaven quedava invertida.

Vescules reconstitudes

Les protuberncies sn la protena unida (moltes cpies)

Van afegir ATP a les vescules i mesuraven qu passava si representaven concentraci de protons respecte el temps. A lafegir lATP es produa una

davallada de la concentraci de protons i desprs hi havia un retorn al valor original. Van interpretar que passava al revs que en la respiraci: entren protons degut a que lATP experimenta una

hidrlisi, la qual provoca el transport de protons.

Els tres investigadors varen rebre el premi Nobel. Com desprs veurem posteriorment hi va haver un ltim experiment que va acabar de confirmar la hiptesi. Estructura: Gracies a estudis cristallogrfics avui en dia es coneix la estructura daquesta ATPsintasa. Principalment esta formada per dos subunitats:

F0: Es la subunitat que es troba al interior de la membrana. Es un canal especfic de protons. Esta formada per protenes insolubles que tenen la capacitat de transportar els protons per no de sintetitzar ATP. Est formada per tres cadenes diferents:

o Cadena C: Hi han com entre 10 i 14 copies i formen un anell inserit a la membrana

o Cadena a: Hi ha nomes una copia i suneix a la perifria del anell i a la columna formada per b

o Subunitat b: Hi ha dos copies i formen una columne soluble que conexta les subunitats F0 i F1

F1: Es la subunitat que es troba fora de la membrana. Estan formades per protenes solubles que tenen la capacitat de sintetitzar o utilitzar el ATP segons si es troben units o no a la subunitat F0. Esta formada per quatre cadenes diferents:

o 3 3: Es un complex format per 3 heterodimers de cadenes i que es disposen de forma alternada i creant un anell hexmer. Els dos tenen la capacitat dunir nucletids per la subunitat s la que participa en la catlisi.

o : Sencarrega de connectar el anell de cadenes c a la cadena o : Es una cadena allargada que esta connectada amb i que sinsereix al

interior del anell hexameric format per i . Esta formada per dos hlix paralleles i una tercera que presenta una orientaci una mica diferent a les altres dues

o : Sencarrega dunir la cadena b a lanell hexameric Forma una estructura duns 450.000 Da

Funcionament: La sntesi del ATP es produeix en el anell hexameric format per les cadenes i . Cadascun dels tres heterodimers pot estar en tres conformacions:

L (loose): Conformaci relaxada Te la capacitat dunir ADP i Pi T (Tignt): Conformaci tensa Te la capacitat de convertir el ADP i el Pi en ATP O (Open): Conformaci oberta Te la capacitat dalliberar el nucletid

Els tres heterodimers mai estaran en la mateixa conformaci. El canvi de conformaci es podr fer gracies a la subunitat , ja que aquesta subunitat es la que esta unida a la subunitat F0 i te la capacitat de girar. A ms a ms aquesta cadena no es del tot asimtrica i per tant a mesura que va girant es capa de produir diferents interaccions

Complex ATP sintasa

Espai intermembrana

Matriu mitocondrial

amb cadascun dels heterodimers i daquesta manera provocar que aquets canvin de conformaci. Les interaccions que es donen entre i son del tipus hidrofbic ja que sn interaccions que sn fcils de trencar i que per tant no frenen el gir. Per tant la sntesi del ATP en lATP sintasa esta formada per tres passos:

Uni ATP+ Pi Sntesi dATP Alliberaci dATP

De tots aquets el que suposa la barrera energtica ms gran s lalliberaci del ATP. Aquesta barrera energtica s tant gran que mentre que la uni i la formaci del ATP es poden realitzar de forma espontnia, lalliberaci necessita denergia. Aix es podia veure amb estudis de bescanvi dO18 entre P i H2O ja que es marcaven els O del P i el que es mirava era si laigua estava o no marcada (si esta marcada hi ha hagut producci dATP). Aquesta energia s la proporcionada pel gradient electroqumic. Per tant podem dir que en presencia dagents desacoblats hi pot haver-si sntesi del ATP per no es podr produir alliberaci, que ha fi de comptes representa que no hi ha producci dATP. Com hem vist fins ara la formaci del ATP necessita de canvis de conformaci que venen generats per la rotaci de . Aquesta rotaci requereix denergia que agafem del gradient electroqumic. La subunitat F0 es la especialitzada en convertir la energia electroqumica del gradient en energia rotacional. Per aquest motiu el funcionament de lATP sintasa es coneix com a catlisi rotacional Experiment de catlisi rotacional: Desprs de conixer les estructures de la subunitat F0 van predir el model de la catlisi rotacional, per aquest no es va confirmar fins al cap duns anys. La primera proba de que la catlisi hauria de ser rotacional i que aquesta rotaci es podia produir nicament amb els protons va ser quan es va descobr que els flagels bacterians tenien la capacitat de girar a partir de nomes un gradient de protons. A partir daqu es va fer un experiment de single molecule i que estava basat en una ATPsintasa amb dos modificacions:

Presencia de cua de His en les cadenes i : Daquesta manera podien unir la protena a una superfcie que presentes algun metall quelant com podria ser el Ni.

ATP sintasa

Centre actiu amb 3 possibles conformacionsSeqncia de canvis conformacionals: O LTO LTO

O : -empty or open, very-loose-binding; L : -ADP or loose-binding; T : binds ATP tightly.

El pas limitant s lalliberament del producte (ATP) de la superfcie de F1

Catlisi rotacional

Estudis unint una molcula dactina marcada amb una sonda fluorescent

Presencia de streptovidina a una de les cadenes c. Aquesta avidina es pot unir a un filament dactina que presenta un marcatge fluorescent.

A continuaci varen collocar la protena a sobre una placa que presentava Ni, daquesta manera la podien fixar en una posici en concret i la van sotmetre a unes condicions en les quals hi havia o no ATP. Gracies al filament dactina van poder veure que sense presencia dATP el filament dactina no es movia per que en presencia dATP aquest filament si que es movia i ho feina en sentit antihorari. Les condicions que es van fer aquest experiment lATPsintasa degradava el ATP, per tant es creu que a nivell fisiolgic el moviment s en sentit horari.

4. Rendiment i reversibilitat de la producci dATP Tipus denergia utilitzades: El ATP s una energia qumica per per tal de poder aconseguir-la shan utilitzats molts passos i molts tipus denergia diferents. En ordre les energies sn:

1. Energia qumica 2. Energia elctrica 3. Energia electroqumica 4. Energia mecnica 5. Energia qumica

Motiu: Per tant podem veure com el organisme es complica molt per tal de produir energia a partir de substrats energtics. Aquesta complicaci es deguda a que daquesta manera al realitzar tantes reaccions apropem la reacci en un procs reversible. Com ja sabem els processos reversibles tenen un rendiment molt ms gran que no pas els rendiments irreversibles. El organisme no es pot permetre el luxe de perdre energia i lhem daprofitar al mxim. Proba daix es que si comparem la energia qumica inicial i final que tenim podem veure com

NADH + H NAD+ + 2e- + 2H+ G=51kcal/mol 3x (ADP + Pi ATP + H2O) G=42kcal/mol

Per tant podem veure com quasibe saprofita la totalitat de lenergia que tenim en un principi. Proves de la reversibilitat: Sha observat que si utilitzen un bloquejant del complex III com es lantimicina en una cadena de transport electronic que es troba en un medi que presenta ATP el gradient de protons i el transport electronic van al reves. Aquest fet nomes pot passar si les passes estan molt a prop entre elles, es a dir si el procs esta molt a prop de ser reversible.