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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
ESCUELA DE BIOLOGÍA
EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN CON FENOBARBITAL AL DÍA POSNATAL 7 EN LA RATA SOBRE LA MORFOLOGÍA DE NEURONAS EN REGIONES
DEL SISTEMA LÍMBICO Y ACTIVIDAD MOTORA EN LA EDAD PRE-PÚBER Y POS-PÚBER
Tesis que para obtener el grado de BIÓLOGA
PRESENTA: C. Mariela García Aguilar
Dr. Gonzalo Flores Álvarez Director de tesis
Marzo 2015
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Neuropsiquiatría
Del Instituto de Fisiología de la Benemérita Universidad Autónoma de
Puebla bajo la dirección del Dr. Gonzalo Flores Álvarez.
Esta tesis fue parcialmente apoyada por Consejo de
Ciencia y Tecnología del Estado de Puebla (CONCYTEP).
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Gonzalo Flores Álvarez del Laboratorio de Neuropsiquiatría del Instituto de
Fisiología de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, por su confianza, su
paciencia y por permitirme colaborar en este proyecto de investigación.
A los integrantes del comité revisor Dr. Salvador Galicia Isasmendi y al M. C.
Ubaldo Quiroz López por su apoyo, dedicación y sugerencias para evaluar el
presente trabajo de investigación.
A mis múltiples compañeros del laboratorio de Neuropsiquiatría del Instituto de
Fisiología, en especial a los que me guiaron en el desarrollo de mi tesis, omito
escribir nombres por el temor de olvidar escribir alguno de ellos.
iv
DEDICATORIA
A mi mamá, por todas sus enseñanzas, amor incondicional, comprensión; a ti que
me diste todo sin pedir nada y confiar en mí.
Al Dr. J. Rubén Conde Sánchez, por creer en mi esfuerzo, su cariño e insistencia
para alcanzar esta meta.
A mi papá y hermanos.
Con amor a ustedes.
V
RESUMEN
De acuerdo con la organización mundial de la salud, se calcula que una de cada cuatro
familias en el mundo tiene un miembro que presenta algún tipo de trastorno mental.
Esto impacta de manera considerable a adultos jóvenes que son la parte más
productiva de la población; sin embargo, los niños también se ven afectados al
presentar problemas de aprendizaje por déficit de atención e hiperactividad, por lo
tanto, su desempeño escolar es bajo, además, presentan problemas de tipo conductual
y/o emocional, estos síntomas se presentan en el inicio de la edad adulta, debido a
alteraciones en el sistema límbico durante el neurodesarrollo. Por lo cual se pone en
relieve la importancia del presente trabajo, de evaluar el efecto de la administración de
fenobarbital al día posnatal 7 en rata sobre la morfología de neuronas en regiones del
sistema límbico y actividad motora en la edad pre-púber y pos-púber. Se sabe que el
fenobarbital reproduce un amplio esquema de síntomas similares a trastornos
psiquiátricos tales como: ansiedad, angustia, hiperactividad, miedo, tristeza y conducta
agresiva posterior a la pubertad o inicios de edad adulta (Forcelli y cols., 2011). Para
este análisis se realizó una única administración de 75 mg/kg de fenobarbital en el día 7
post natal en la rata Sprague- Dawley, una vez que los animales alcanzaron la etapa
pre púber y pos púber respectivamente, se evaluó la conducta motora mediante la
prueba de actividad motora en campo cerrado ante ambiente novedoso, posteriormente
se analizó la morfología de la arborización dendrítica y la densidad de espinas de las
neuronas de la amígdala basolateral, de igual manera las neuronas piramidales del
hipocampo dorsal CA1 mediante la técnica de tinción de Golgi-Cox. Nuestros resultados
muestran un incremento de conducta motora en los primeros minutos y al avanzar el
tiempo disminuye hasta mantenerse constante, también se muestran diferencias
significativas en la arborización dendrítica, longitud dendrítica y densidad de espinas;
esto nos indica que nuestros resultados apoyan la hipótesis de alteración del
neurodesarrollo, pues sugiere que una alteración en el neurodesarrollo da lugar a la
presencia de trastornos psiquiátricos, los cuales se manifiestan en el periodo posterior a
la adolescencia o bien a la edad adulta.
VI
ÍNDICE
1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 1
1.1 Fenobarbital .................................................................................................................................. 1
1.2 Mecanismo de acción del fenobarbital ......................................................................................... 2
2 MARCO TEÓRICO ................................................................................................................................... 4
2.1 Los trastornos de tipo mental ....................................................................................................... 4
2.2 Epidemiologia ................................................................................................................................ 5
2.3 El sistema límbico .......................................................................................................................... 6
2.4 Neurotransmisores ........................................................................................................................ 9
2.5 Modelos animales ....................................................................................................................... 11
3 ANTECEDENTES ................................................................................................................................... 13
4 JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................................... 15
5 HIPÓTESIS ............................................................................................................................................ 16
6 OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 17
6.1 Objetivo General ......................................................................................................................... 17
6.2 Objetivo Particular ....................................................................................................................... 17
7 DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO ..................................................................................................... 18
8 MATERIAL Y METODOS........................................................................................................................ 19
9 TINCIÓN DE GOLGI-COX ...................................................................................................................... 21
9.1 Composición de la solución de Golgi-Cox ................................................................................... 21
9.2 Extracción de tejido cerebral ....................................................................................................... 21
9.3 Impregnación de cerebros con la solución de golgi-cox ............................................................. 21
10 TRAZO DE NEURONAS. ........................................................................................................................ 23
11 IDENTIFICACIÓN Y LOCALIZACIÓN DE NEURONAS DE INTERÉS A EXAMINAR. ................................... 23
11.1 Hipocampo dorsal. ...................................................................................................................... 23
11.2 Amígdala basolateral ................................................................................................................... 24
12 PROCESO DE REVELADO ...................................................................................................................... 22
13 ANÁLISIS DE SHOLL .............................................................................................................................. 25
14 RESULTADOS........................................................................................................................................ 26
14.1 Actividad motora al día 35 pos natal ........................................................................................... 26
14.2 Actividad motora al día 70 pos natal ........................................................................................... 27
VII
14.3 Morfología neuronal de amígdala basolateral al día 35 post natal ............................................ 28
14.4 Longitud dendrítica total y densidad de espinas en amígdala basolateral al día 35 pos natal. . 29
14.5 Morfología neuronal de amígdala basolateral al día 70 etapa pos púber. ................................. 31
14.6 Longitud dendrítica total y densidad de espinas dendríticas de amígdala basolateral al día 70
post natal ................................................................................................................................................. 32
14.7 Morfología neuronal de hipocampo dorsal a los 35 días post natal etapa pre púber ................ 33
14.8 Longitud dendrítica total y densidad de espinas dendríticas de hipocampo dorsal al 35 pos
natal ................................................................................................................................................... 35
14.9 Morfología neuronal de hipocampo dorsal al día 70 pos natal ................................................. 36
14.10 Longitud dendrítica total y densidad de espinas de hipocampo dorsal al día 70 pos natal ... 37
15 DISCUSIÓN ........................................................................................................................................... 39
16 CONCLUSIONES ................................................................................................................................... 41
17 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................... 43
VIII
FIGURAS
Figura 1 Estructura química del fenobarbital. ............................................................................................... 2
Figura 2 Mecanismo de acción de fenobarbital. ........................................................................................... 3
Figura 3 Administración vía intraperitonal. ................................................................................................. 20
Figura 4 Prueba de actividad locomotora ante ambiente novedoso. ........................................................ 20
Figura 5 Vitratómo motorizado para realizar cortes coronales del tejido cerebral. ................................... 22
Figura 6 Análisis Sholl. ................................................................................................................................. 25
Figura 7 Actividad motora al día 35 pos natal ........................................................................................ 26
Figura 8 Número total de movimientos al día 35 pos natal. ................................................................ 27
Figura 9 Actividad motora al día 70 pos natal. ............................................................................................ 28
Figura 10 Número total de movimientos al día 70 pos natal. ..................................................................... 28
Figura 11 Arborización dendrítica de amígdala basolateral al día 35 post natal. ....................................... 29
Figura 12 Longitud por número de orden al día 35 pos natal. .................................................................... 29
Figura 13 Longitud dendrítica total al día 35 pos natal. .............................................................................. 30
Figura 14 Densidad de espinas dendríticas al día 35 pos natal. .................................................................. 30
Figura 15 Arborización dendrítica al día 70 pos natal. ......................................................................... 31
Figura 16 Longitud por número de orden al día 70 pos natal.............................................................. 32
Figura 17 Longitud dendrítica total al día 70 post natal. ...................................................................... 33
Figura 18 Densidad de espinas dendríticas al día 70 pos natal. ....................................................... 33
Figura 19 Arborización dendrítica al día 35 pos natal. ......................................................................... 34
Figura 20 Longitud por número de orden al día 35 pos natal. ................................................................ 34
Figura 21 Longitud dendrítica total al día 35 post natal........................................................................ 35
Figura 22 Densidad de espinas al día 35 post natal. ............................................................................ 35
IX
Figura 23 Arborización dendrítica al día 70 pos natal. ........................................................................ 36
Figura 24 Longitud por número de orden al día 70 pos natal. ........................................................... 37
Figura 25 Longitud dendrítica total al día 70 pos natal. ........................................................................ 37
Figura 26 Densidad de espinas dendríticas al día 70 pos natal. ........................................................ 38
INTRODUCCIÓN
1
1 INTRODUCCIÓN
1.1 Fenobarbital
El fenobarbital (Figura 1) fue sintetizado por Emil Fischer en 1911, este agente es un
derivado del ácido barbitúrico, químicamente es una diamida cíclica, que produce un
amplio esquema de efectos, pues actúa sobre el sistema nervioso central (SNC), lo cual
trae como consecuencia cambios temporales en la percepción, el ánimo, el estado de
conciencia y el comportamiento. Las propiedades anticonvulsivantes del fenobarbital
fueron descubiertas casualmente por Alfred Hauptmann (1912) que en un principio lo
utilizó como un hipnótico en pacientes con epilepsia (Patrick y cols., 2004). El
fenobarbital es un fármaco de acción rápida con gran eficacia como anticonvulsivo en
neonatos, sin embargo el SNC y el cerebro son inmaduros en esa etapa y son más
susceptibles a manifestar algún tipo de alteración como efecto colateral, lo cual se
asocia con los trastornos psiquiátricos (S. Witting y cols., 2008). Los efectos
secundarios producen depresión respiratoria, disminución de la presión sanguínea y del
ritmo cardiaco. El fenobarbital se ha utilizado para inducir alteraciones en regiones
corticales durante el neurodesarrollo de roedores, pues su efecto produce un aumento
al riesgo de presentar anomalías en las conexiones neuronales del sistema límbico, el
cual esta involucrado en el circuito de recompensa, conducta y el estado de ánimo, por
lo tanto son de nuestro interés para la comprensión de síntomas de trastornos
psiquiátricos tales como: la angustia, ansiedad, hiperactividad, miedo, tristeza y
conducta agresiva; sin embargo, no todas las áreas corticales se han analizado (Forcelli
y cols., 2011).
INTRODUCCIÓN
2
Figura 1. Estructura química del fenobarbital (Patrick y cols., 2004).
1.2 Mecanismo de acción del fenobarbital
El fenobarbital interacciona directamente con el receptor GABA-A, el cual está
conformado por 5 subunidades (α, β, α, β y γ) y cada una tiene subtipos que originan
diversas isoformas con diferentes propiedades, lo cual forman el canal de ión cloro, y
éste al interactuar con el fenobarbital potencia un efecto inhibidor en el sistema nervioso
central (Legido y cols., 2007), también mimetiza la acción de GABA si está ausente, con
ello se facilita la neurotransmisión inhibidora, su mecanismo de acción (Figura 2) se
basa en el aumento de la prolongación de la apertura de los canales del ión cloro,
potenciando así al sistema gabaérgico, independientemente de la frecuencia (Kwan y
cols., 2004), lo cual induce un aumento en la corriente intracelular de cloro (Cl-), que es
mediado por el receptor GABA-A, a su vez reduce la apertura de canales dependientes
de Ca+2, y por lo tanto, la conductancia de iones de sodio (Na+) y potasio (K+), lo cual
lleva a una carga negativa creciente y altera el voltaje en la neurona, este cambio de
voltaje hace que disminuya la excitabilidad neuronal produciendo un efecto depresor en
el sistema nervioso central (Legido y cols., 2007).
INTRODUCCIÓN
3
Figura 2. Mecanismo de acción de fenobarbital (Legido y cols., 2007).
MARCO TEÓRICO
4
2 MARCO TEÓRICO
La presencia de trastornos de tipo mental como: la ansiedad, la angustia, la
hiperactividad, el miedo, la tristeza y la conducta agresiva es una condición que
aparece generalmente entre la adolescencia y la etapa de adulto joven (Flores y cols.,
2001) La pérdida progresiva de las funciones cognitivas no siempre es causada por
algún daño cerebral, sino que también se puede deber a factores genéticos y
bioquímicos que provocan trastornos psiquiátricos, los cuales son catalogados como la
primera causa de deterioro en la productividad de las personas, pues se involucran
diversos aspectos psicológicos tales como: el pensamiento, la percepción, las
emociones o la voluntad, lo cual lleva a la separación del individuo con su vida familiar,
social y laboral (Cardet y cols., 2012). De acuerdo a las estadísticas publicadas por la
Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que una de cada cuatro familias en
el mundo tiene un miembro con algún trastorno mental, el porcentaje es mayor en los
países de ingresos económicos altos (23%) que en los de ingresos bajos y medianos
(11%), esta patología ocupa el quinto lugar en la clasificación de las 10 causas más
importantes de morbilidad a nivel mundial, cabe mencionar que los problemas de tipo
mental son de gran importancia en todos los países, sin que se considere la condición
económica, ya que el pronóstico apunta que la magnitud del problema en los próximos
años tendrá un aumento considerable (Harlem, 2000). Por lo cual, se trata de buscar las
causas, considerando diversos factores como: biológicas, psicosociales, ambientales y
genéticos (Castro y cols., 2013). Sin embargo, todavía se desconoce la etiología de
estas patologías, por lo tanto se tiene un vacío de esta información, por lo que se han
empleado modelos animales para examinar en particular, las diversas hipótesis sobre
los síntomas psiquiátricos (Bhardwaj y cols., 2012).
2.1 Los trastornos de tipo mental
Son una condición psiquiátrica grave, que consiste en una mezcla de signos y síntomas
como: angustia, ansiedad, hiperactividad, miedo, tristeza, conducta agresiva, conducta
obsesivo compulsivo y depresión, las cuales afectan múltiples procesos psicológicos,
MARCO TEÓRICO
5
en los que se comprende el aprendizaje, la percepción, la memoria, los pensamientos,
el lenguaje, la motivación y emoción (Campusano y cols., 2011), sin embargo, no
constituye una entidad clínica bien definida, se considera como un grupo de síntomas
heterogéneos, algunos investigadores prefieren hablar de “síndrome o patrón
comportamental” para resaltar su polimorfismo, pues aún no se conocen las causas, se
cree que dependen de una combinación de factores biológicos, psicológicos y sociales,
como sucesos estresantes, problemas familiares, alteraciones cerebrales o trastornos
genéticos. En la actualidad los estudios se han orientado hacia el aspecto
endocrinológico, pues tratan de descubrir alguna alteración en los neuromoduladores o
péptidos cerebrales que afectan estos dominios comportamentales (Orellana y cols.,
2006).
2.2 Epidemiología
Las patologías de tipo mental afectan al 1% de la población a nivel mundial,
generalmente los síntomas inician entre la adolescencia y la etapa de adulto joven, se
considera que se adquieren mediante la carga genética y factores ambientales, cabe
mencionar que las investigaciones en este campo están siendo muy productivas, pues
han alcanzado avances rápidos e importantes, aunque no se ha podido explicar de
manera total su etiología (Saiz y cols., 2010). El reto de atención en este tipo de
pacientes es grande, ya que en México se estima que los trastornos psiquiátricos
ocupan el quinto lugar, y se espera que el índice de pacientes incremente debido a
problemas como la pobreza, la violencia, el aumento en el abuso de drogas y el
envejecimiento de la población, entre otros factores (Medina y cols., 2003). En estas
últimas décadas los investigadores han estudiado las incidencias, teniendo en cuenta la
variable género, los resultados fueron relevantes pues hallaron que el género influye
para adquirir algún tipo patología mental, y que hay una mayor incidencia en hombres
que en mujeres, en hombres inicia entre los 18 a 25 años de edad, pues en algunos
casos presentan mayor abuso de substancias e induce conductas más antisociales y
mayor riesgo de suicidio, contrario a mujeres, inician los síntomas entre los 25 a 35
MARCO TEÓRICO
6
años de edad; con este hallazgo se postula que por una parte, los efectos de los
estrógenos pueden ser los responsables de estas diferencias, ya que estructuralmente
facilitan una maduración temprana durante el neurodesarrollo en mujeres, mientras que
en los hombres, las conexiones neuronales, la mielinización axonal y la lateralización de
las funciones cerebrales son más tardías; funcionalmente, los estrógenos tienen un
efecto modulador sobre el sistema dopaminérgico, serotonérgico y glutamatérgico, esto
puede hacer que el cerebro masculino sea más vulnerable y pueda presentar
alteraciones estructurales durante el neurodesarrollo induciendo algunos síntomas de
tipo metal (Usall y cols., 2003).
2.3 El sistema límbico
El sistema límbico es un conjunto de estructuras cerebrales: Hipocampo, amígdala,
corteza media prefrontal, tálamo medio dorsal, núcleo accumbens, el pálido ventral y el
área ventral tegmenta (Gonzales B. y cols., 2002). Responden a ciertos estímulos
ambientales produciendo respuestas emocionales, por ejemplo: El miedo, la alegría, el
enojo o la tristeza, entre otros, la primera descripción de como el sistema límbico regula
las emociones fue hecha por Paul Broca en 1878; posteriormente, se demostró su
participación en la regulación de conducta agresiva, en el sistema endocrino, y otras
funciones como la integración de la información. El espectro de la conducta humana es
tan amplio que ha representado un tema interés de estudio debido, en primer lugar que
este sistema controla conductas complejas como la motivación, la memoria y el
aprendizaje, y en segundo lugar porque la mayoría de las patologías psiquiátricas son
las más devastadoras, ya que involucran desordenes emocionales (Iñaki y cols., 2009).
El sistema límbico se divide en 2 regiones, que se identifican como:
A) área cortical, la cual incluye el giro parahipocampal, circunvolución del cíngulo y el
hipocampo.
El giro parahipocampal, es una estructura anatómica importante, ya que está
involucrada con el correcto funcionamiento de la memoria episódica, es decir, la
memoria que tiene información sobre las experiencias personales, que ocurren
MARCO TEÓRICO
7
en algún lugar determinado y un momento temporal concreto (White y cols.,
2008).
Circunvolución del cíngulo o giro cingulado, es una estructura que está
involucrada en la formación de las emociones, en el procesamiento de
información referida a la conducta, al aprendizaje y la memoria, recibe
información aferente desde el núcleo anterior del tálamo, y se conecta con áreas
somatosensoriales de la corteza cerebral (González y cols., 2008).
El hipocampo está íntimamente ligado con las emociones, particularmente es
sensible al estrés biológico, tiene la capacidad de participar durante la
neurogénesis neonatal, de procesar información inicial para ser transferida a
otras áreas del cerebro, también realiza la selección de recuerdos y los
almacena en la memoria a largo plazo, realiza funciones por medio de la vía
glutamatérgica, pues modula la actividad de las neuronas piramidales
provenientes de corteza prefrontal y núcleo accumbens.
Para su estudio se divide en CA1, CA2, CA3 Y CA4 considerando el tamaño de sus
neuronas, que son de tipo piramidal, anatómicamente es un conjunto de estructuras
separadas y se subdivide en dos áreas:
a) Hipocampo dorsal que realiza funciones cognitivas, memoria espacial.
b) Hipocampo ventral, que se encarga de regular las emociones y el estrés
(Fanselow y Dong, 2010).
B) la región subcortical incluye: el núcleo septal, el núcleo accumbens, los cuerpos
mamilares, el hipotálamo, el núcleo anterior del tálamo, el mesencéfalo y la amígdala.
El Núcleo septal es un conjunto de estructuras que se encuentran por debajo de
la tribuna del cuerpo calloso, se compone de neuronas de tamaño medio,
presenta conexiones recíprocas con el bulbo olfatorio, el hipocampo, la
amígdala, el hipotálamo, el mesencéfalo, el giro cingulado, y el tálamo; se le ha
relacionado en procesos de recompensa junto con el núcleo accumbens.
El núcleo accumbens está involucrado en los estímulos de recompensa como: El
placer, la adicción y el miedo.
MARCO TEÓRICO
8
Los cuerpos mamilares se componen por dos grupos de núcleos, estos son
pequeños y redondos, estos son los núcleos mediales y los núcleos laterales.
Los cuales actúan como un relevo de impulsos, ya que los estímulos proceden de la
amígdala y del hipocampo por medio del tracto mamillo-talámico, hasta llegar al tálamo,
esta función es importante en la retención de memoria.
El Hipotálamo está formado por varios núcleos y se divide en dos partes:
Hipotálamo medial: concentra la mayor cantidad de núcleos, somas y menor
cantidad de fibras.
Hipotálamo lateral: es pobre en somas neuronales y rico en fibras.
Una de las funciones del hipotálamo, es el manejo de nuestro sistema interno, de la
homeostasis, este control lo hace a través de dos vías: la endocrina y la del sistema
nervioso autónomo (SNA).
El núcleo anterior del tálamo se asocia con funciones de conductas emotivas, y
se relaciona íntimamente con el sistema límbico en la correlación de funciones
autonómicas.
El mesencéfalo o cerebro medio es la parte del tronco del encéfalo que conecta al
cerebro posterior con el prosencéfalo, el cual se compone del tectum y tegmento.
El tectum presenta en la colina superior receptores visuales y en la colina inferior
receptores auditivos, por lo cual su función es la de controles auditivos y
respuestas visuales.
El tegmento controla las funciones de tipo motor, regula la conciencia y la
atención, también algunas funciones autonómicas (Arteaga y cols., 2006).
La amígdala es una estructura en forma de almendra que se ubica cerca del lóbulo
temporal, fue identificada por primera vez en el siglo XIX por Burdach, que
originalmente la describe como un grupo de células, posteriormente se le conoce como
complejo basolateral, pues presenta un gran número de estructuras que la rodean, con
ello se constituye lo que actualmente se le conoce como el complejo amigdalino; debido
a esto, la amígdala y el complejo amigdalino son términos que se refieren regiones
MARCO TEÓRICO
9
altamente diferenciadas, dicha estructura se ha identificado en muchas especies; el
interés en su estudio continúa debido a su papel central en el procesamiento emocional,
sin embargo puede actuar como refuerzo de contenidos de memoria en otras zonas
corticales, el hipocampo y la amígdala participan simultáneamente, tanto en los estados
iniciales de la formación de la memoria como en la recuperación (Almaguer y cols.,
2002).
Tradicionalmente las emociones se habían considerado exclusivamente humanas, y de
distinto aspecto a funciones cerebrales de tipo cognitivo y de percepción sensorial; cabe
mencionar que la palabra emoción es un concepto difícil que describe las experiencias
y sentimientos, así como aspectos de comportamiento interno y externo de los
individuos, puesto que las emociones pueden tener un gran impacto en diferentes
aspectos de tipo mental (Sah y cols., 2003). La amígdala presenta proyecciones
gabaérgicas, que contribuyen a la regulación autonómica de la respuesta a estrés
(Gonzales y cols., 2002).
2.4 Neurotransmisores
Se ha postulado que la existencia de trastornos bioquímicos como responsables de
patologías de tipo psiquiátrico. Los neurotransmisores son: dopamina, acido gamma-
amino butírico (GABA), serotonina y noradrenalina, los cuales son más implicados en
este tipo de alteraciones (Obiols y cols., 1998).
Dopamina
Es un neurotransmisor asociado a la sensación de placer, su función es la de regular
diversas funciones como la conducta motora, la emotividad y la afectividad así como en
la comunicación neuroendocrino, sus receptores se encuentran ampliamente
distribuidos en diversas áreas del SNC, de los cuales se han identificado 5 tipos y se
divididos en dos familias.
Los receptores de la familia D1 y sus subtipos D1 y D5
Los subtipos pertenecientes a la familia D2 y sus subtipos D2, D3 y D4
MARCO TEÓRICO
10
Se ha demostrado que una exceso de dopamina a nivel pre-sináptico en la vía
mesolímbica es la responsable de los síntomas como delirios y alucinaciones (Guerrero
y cols., 2001).
Acido gamma-amino butírico (GABA)
Es considerado el neurotransmisor inhibitorio por excelencia en el SNC, es sintetizado a
partir de la descarboxilación del glutamato, mediada por la enzima glutamato
descarboxilasa (GAD), posteriormente GABA es introducido en vesículas para salir de
la neurona presináptica, una vez liberada llega hasta la neurona postsináptica, en
donde es reconocido por los receptores (GABA-A y GABA-B). El GABA presenta 3 tipos
de receptores, los cuales son:
Receptor Ionotrópico GABA-A: es una glucoproteina, se cree que las 8
subunidades (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, π, θ, y ρ1-3) constituyen este receptor, el
cual está situado en la membrana plasmática del terminal post sináptica, abren
los canales de cloro y son inhibidores de la conducción del impulso nervioso
Receptores de tipo metabotrópico: son GABA-B y GABA-C, están ubicados en la
membrana plasmática de los terminales pre y post sinápticos, los receptores
GABA-B permiten un aumento a la salida de potasio e inhiben la entrada de
calcio (Luján y cols., 2005).
Las neuronas gabaérgicas se localizadan en la corteza, el hipocampo y en las
estructuras límbicas, estos haces son conocidos como los cuerpos neuronales que se
encuentran en el estriado y envían sus fibras hacia la substancia nigra, y los cuerpos
neuronales de las células de Purkinje que se encuentran en la corteza cerebelosa,
emiten proyecciones a núcleos intercerebelares interpósito, fastigial y al núcleo dorsal.
El GABA actúa como un relajante natural, ya que regula las funciones que por estrés u
otras circunstancias puedan encontrarse sobrecargadas produciendo hiperactividad,
insomnio, problemas de concentración y de conducta, es decir, funciones motoras y
cognitivas; este neurotransmisor fue identificado como constituyente químico único del
MARCO TEÓRICO
11
encéfalo y considerado como transmisor inhibidor desde 1950 (Castro y cols., 2007). El
GABA se ha asociado a la génesis de la esquizofrenia, hay evidencias de que una
disfunción gabaérgica produce la disminución del RNAm, el cual es responsable de la
síntesis de la enzima GAD en la corteza cerebral, Además, se ha encontrado un
aumento en el número de receptores GABAA y una disminución en la liberación de
GABA en sinaptosomas, en respuesta a los agonistas glutamatérgicos, por otro lado se
ha observado una disminución en la recaptura de GABA en la amígdala, el hipocampo y
corteza temporal en los pacientes con esquizofrenia (Guerrero y cols., 2001).
Serotonina
La serotonina (5-hidroxitriptamina o 5-HT) se encuentran en varias regiones del sistema
nervioso central, se encarga de regular el apetito mediante la saciedad, los ciclos de
sueño y vigilia, de equilibrar el deseo sexual, del control de la temperatura corporal, de
la actividad motora y de las funciones perceptivas y cognitivas (Saiz y cols., 2010).
Cabe mencionar que es difícil considerar la acción de la dopamina sin tomar en cuenta
su interacción con la serotonina (5-HT), la cual es a través de sus receptores 5HT2A,
estudios en humanos han mostrado que existe una alta correlación entre la
concentración de catabólicos de dopamina y serotonina en líquido cefalorraquídeo
(LCR), ya que la serotonina inhibe la liberación de dopamina mediante la
hiperpolarización de los somas dopaminérgicos en la sustancia nigra (SN), en el
estriado y corteza prefrontal, con ello se explica que los síntomas negativos de la
esquizofrenia se deban a una reducción en la transmisión dopaminérgica en la corteza
prefrontal, y que al utilizar antagonistas serotoninérgicos facilita la liberación prefrontal
de dopamina, lo cual hace que disminuyan los síntomas negativos de esta patología
(Guerrero y cols., 2001).
2.5 Modelos animales
Los modelos animales son un instrumento de gran importancia en el laboratorio, ya que
facultan el desarrollo de investigaciones en el área de la salud, la característica principal
de un modelo animal es que pertenece al orden más alto de fidelidad “validez de
MARCO TEÓRICO
12
constructo” con ello se logra la reconstrucción de patologías, con lo cual poder
acercarse a su etiología.
Un modelo animal puede representar signos en tres diferentes niveles:
Puede reproducir un factor de inducción como algún defecto genético y/o
patológico posterior a los procesos que subyacen a la enfermedad.
Se puede imitar una fenomenología, es decir una serie de sígnos de tipo mental,
tales como los de una esquizofrenia.
Permite que se pueda predecir la respuesta patológica y el uso de tratamientos
que se encuentren disponibles, como algunos fármacos o antipsicóticos.
Con estas bases se logró modelar la neurobiología de la esquizofrenia en animales,
pues se crean nuevos diseños para adentrarse en la búsqueda de su etiología (Lipska y
cols., 2000).
ANTECEDENTES
13
3 ANTECEDENTES
Los investigadores se centran en crear y analizar fenómenos similares a síntomas de
trastorno mental, inicialmente fueron diseños y realizados mediante perturbaciones
directas en los sistemas de neurotransmisión, con el fin de imitar una gama amplia de
los síntomas de tipo conductual, con ello se abrieron nuevas líneas de investigación
para el desarrollo de nuevas estrategias de la búsqueda de su etiología (Kuei y cols.,
2009). Los primeros experimentos fueron realizados por Hebb, pues realizó estudios
basándose en el análisis del comportamiento motriz en rata, con ello se centró la idea
de caracterizar la conducta motora.
En 1970, Greenough y sus colegas iniciaron una investigación multidisciplinaria, que
consistió en observar a grupos de animales en fase de crecimiento, a un grupo lo
colocaron en un ambientes enriquecido, es decir diversos objetos para jugar y
ejercitarse, y el otro grupo de animales fue colocado en un ambiente limitado,
posteriormente realizó el análisis morfológico de las neuronas de ambos grupos por
medio de microscopia electrónica, los resultados indican la existencia de cambios
neuronales, tanto en la estructura dendrítica, como en el aumento en el número de
sinapsis en el grupo de animales que se desarrollaron ante ambiente enriquecido, este
dato es importante ya que al haber cambios de conectividad indica la posibilidad de
inferir algún tipo de conducta mental.
Estudios han demostraron que existe una relación directa entre la geometría dendrítica
y la sinapsis (Kolb y cols., 1998). Actualmente se recrean la simulación de síntomas de
trastorno mental tales como: ansiedad, hiperactividad, angustia, tristeza, miedo y
conducta agresiva, mediante la exposición de fenobarbital, ya que su presencia es un
índice de anomalías en la edad adulta (Varona y cols., 2001). En la siguiente
investigación administraron fenobarbital a crías de rata, su efecto interrumpe la
evolución normal del neurodesarrollo, reportaron la presencia de síntomas similares a
trastornos mentales en edad adulta (Herranz y cols., 2007). Las investigaciones
continúan con la búsqueda de la etiología de patologías psiquiátricas, actualmente
involucran la acción de los neurotransmisores (Patricia y cols., 2007).
ANTECEDENTES
14
En esta investigación hicieron una examinación de estructuras límbicas (giro cíngulado,
hipocampo, fornix y amígdala) las alteraciones encontradas se asocian a la presencia
de síntomas mentales; realizaron análisis postmortem y de neuroimágen, para
comparar estas estructuras en niños, adolescentes y adultos, entre pacientes con
esquizofrenia y personas que no la presentaban, reportaron que en los niños y
adolescentes con la patología, se presentan más aberraciones en regiones del sistema
límbico, y son más evidentes que en los adultos, lo cual produce que se interrumpa la
transmisión neuronal, sin embargo, existen anormalidades que no solo se limitan en el
sistema límbico, pues hay regiones del cerebro que también presentan daños
generando síntomas psiquiátricas; estos resultado enriquecen la comprensión de la
presencia de anomalías durante el desarrollo neurológico (White y cols. 2008).
El uso del fenobarbital para inducir síntomas similares de trastornos psiquiátricos ya se
ha venido documentado, sin embargo continúan las investigaciones para encontrar un
mayor acercamiento en la búsqueda la etiología, en el trabajo de Forcelli (2011) se
indujo alteración neuronal en diversas regiones del cerebro, mediante una dosis de
fenobarbital, en rata con 7 días de edad, los hallazgos demostraron la presencia de
muerte celular pronunciada en varias regiones importantes del sistema límbico, esto se
ha asociado a condiciones anormales de tipo emocional, de comportamiento motor y
psiquiátrico.
Varias regiones del sistema límbico aún no se han incluido para ser estudiadas
mediante estos análisis, y continúan las investigaciones, pues exponen a ratas
neonatas con una administración de fenobarbital, con el fin de aumentar el riesgo de
presentar alteraciones en aéreas del cerebro, con ello reproducir un comportamiento
similar a patológicas psiquiátricas; una vez que los animales llegaron a la edad adulta,
fueron evaluados, los resultados confirman que mediante el fenobarbital se induce una
alteración a conexiones sinápticas durante la neurogenesis, lo cual Indica la presencia
de anormalidades en el comportamiento que son similares a trastornos mentales, por lo
tanto se pone en relieve el estudio en modelos animales para acercarse más a la
etiología de patologías psiquiátricas (Bhardwaj y cols.,2011).
JUSTIFICACIÓN
15
4 JUSTIFICACIÓN
La prevalencia de trastornos mentales impacta de manera considerable a los adultos
jóvenes que son la parte más productiva de la población; sin embargo, los niños
también se ven afectados al presentan problemas de aprendizaje por déficit de atención
e hiperactividad, por lo tanto su desempeño escolar es bajo, además de presentan
problemas de tipo conductual y/o emocional, se sabe que estos síntomas se presentan
en el inicio de la edad adulta, debido a alteraciones en el sistema límbico durante el
neurodesarrollo. Mediante la administración de fenobarbital en ratas neonatas se
reproducen algunos síntomas similares a trastornos psiquiátricos. Debido a que aún no
existen reportes de los efectos de fenobarbital sobre hipocampo dorsal CA1 y amígdala
basolateral, decidimos realizar la administración única de fenobarbital en ratas de 7 días
de edad y analizar en edad pre púber y pos púber las posibles alteraciones de la
morfología de la arborización dendrítica de estas áreas, y por otra parte evaluar la
conducta motora.
HIPÓTESIS
16
5 HIPÓTESIS
Las ratas administradas con fenobarbital al día 7 pos-natal presentarán alteraciones en
la conducta motora y en la morfología neuronal de la amígdala basolateral e hipocampo
dorsal CA1.
OBJETIVOS
17
6 OBJETIVOS
6.1 Objetivo General
Evaluar la conducta motora y la morfología de las neuronas de amígdala
basolateral e hipocampo dorsal CA1 en ratas Sprague-Dawley en etapa pre-
púber y pos-púber, que fueron administradas con fenobarbital en el día 7 post
natal.
6.2 Objetivo Particular
Conducta
Evaluar la conducta motora en campo cerrado ante ambiente novedoso, a los 35
y 70 días post natal.
Morfología neuronal
Analizar la morfología de arborización dendrítica, y la densidad de espinas de las
neuronas a los 35 y 70 días post natal, mediante la tinción de Golgi-Cox.
Neuronas de amígdala basolateral.
Neuronas piramidales del hipocampo dorsal CA1.
DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO
18
7 DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO
MATERIAL Y METODOS
19
8 MATERIAL Y METODOS
Se obtuvieron 40 ratas macho cepa Sprague-Dowley de 7 días de edad, del bioterio
Claude Bernard de esta universidad, todos los procedimientos descritos en este estudio
cumplen con la Norma Oficial Mexicana 062-ZOO-1999 y han sido aprobadas por el
comité de cuidado de dicho bioterio. A los 7 días de edad, a 20 animales se les
administro una dosis de 75 mg/kg de peso de fenobarbital vía intraperitoneal (Ip),
mientras que a las 20 ratas restantes se les administró una dosis de solución salina
isotónica por vía intraperitoneal (1 ml/kg de peso) como se observa en la (Figura 3).
Una vez que los animales alcanzaron la edad pre-púber (35 días de edad, 10 controles
y 10 experimentales) y las de edad post-púber (70 días de edad, 10 controles y 10
experimentales), fueron evaluados conductualmente mediante la prueba de actividad
motora ante ambiente novedoso, la cual nos permite estudiar los niveles de la actividad
motora (respuesta al estrés) al encontrarse ante un nuevo ambiente (Marinelli y cols.,
2005) La actividad motora espontanea es regulada por neurotransmisores y estructuras
del sistema límbico, una de ellas es la amígdala basolateral, la cual esta implicada en
reacciones emocionales, memorias, en la agresión, celos, miedo; modula la respuesta
al estrés mediante las conexiones con el hipotálamo, así mismo la actividad autonómica
y endocrina; si la zona es lesionada induce docilidad (White y cols., 2008). El
hipocampo dorsal CA1 está implicado en procesos cognitivos, aprendizaje espacial y la
memoria, está asociado con la amígdala (Bannerman y cols., 2004). Para esta prueba
las ratas se colocaron en cajas de acrílico negro de 44cm de largo, 22cm de ancho y
22cm de altura, las cuales cuentan con 8 pares de fotodiodos de luz infrarroja en los
costados, cada movimiento de la rata interrumpe el haz de luz (Figura 4); la contabilidad
de los movimientos se registró por medio de un contador electrónico en doce periodos
sucesivos de diez minutos cada uno, con un registro total de dos horas (Flores., 1996).
MATERIAL Y METODOS
20
Figura 3 Administración vía intraperitonal.
Figura 4 Prueba de actividad locomotora ante ambiente novedoso.
Posterior a la actividad locomotora se realizó el protocolo de tinción de Golgi-Cox.
TINCIÓN DE GOLGI-COX
21
9 TINCIÓN DE GOLGI-COX
La técnica fue Ideada por Camilo Golgi, es uno de los métodos de impregnación de
células nerviosas que actualmente mantiene un sitio de honor dentro del campo de la
descripción morfo funcional del sistema nervioso, este método permite la tinción de las
células nerviosas y sus prolongaciones; con la reacción de nitrato de plata y el
dicromato de potasio o de sodio (Alvarado., 1994). Es considerado como un genérico,
para un grupo de tinciones que consisten en la preparación de tejido neuronal con
dicromato, seguido de una exposición de iones de metales pesados (Scheible., 1978).
La modificación de la tinción de Golgi- Cox que se usó en este trabajo es la que realizó
(Golgi y cols.,1981) en donde es sustituida la plata por el mercurio.
9.1 Composición de la solución de Golgi-Cox
Dicromato de potasio (K2Cr270) 170 mM.
Cloruro de Mercurio (HgCl2) 200 mM.
Cromato de potasio (K2Cr04) 200 mM.
Este se almacenó en un recipiente de vidrio ámbar por 5 días y se filtró para retirar el
precipitado que se haya formado.
9.2 Extracción de tejido cerebral
Posterior a la prueba de actividad locomotora, los animales fueron administrados con
una dosis de anestésico pentobarbital sódico, vía intraperitoneal, después se realizó
una perfusión intracardiaca con solución salina al 0.9% en el ventrículo del corazón,
luego se hizo un corte a la arteria aorta descendiente, con la finalidad de retirar la
sangre del cerebro, finalmente se removió el cerebro para ser extraído y colocado en
solución de Golgi-Cox (técnica de tinción).
9.3 Impregnación de cerebros con la solución de golgi-cox
Los cerebros se almacenaron en total oscuridad por 28 días, posterior a este tiempo la
solución fue remplazada por una solución de sacarosa al 30%, estos nuevamente
TINCIÓN DE GOLGI-COX
22
fueron almacenados en total oscuridad por 5 días, con la finalidad de conferirle al tejido
una flexibilidad, evitar su deshidratación y por tanto que se fracturen al ser seccionados;
cumplido el tiempo requerido cada cerebro fue retirado de dicha solución para que por
medio de un vibratómo motorizado (Figura 5) realizar las secciones del tejido cerebral;
el cerebro fue colocado en la platina, el cual se sumergirá en una solución de sacarosa
al 6% hasta que sea totalmente cubierto para así realizar los cortes coronales, siendo
este a partir del área más ventral hasta la más dorsal con un espesor de 200 micras.
Figura 5 Vitratomo motorizado para realizar cortes coronales del tejido cerebral.
Los tejidos seccionados fueron fijaron en laminillas previamente gelatinizadas al 2%,
haciéndoles presión para evitar desprendimiento del mismo durante el proceso de
revelado, dichas laminillas se mantendrán en una cámara húmeda con el objetivo de
evitar la deshidratación del tejido, posteriormente se realizó el proceso de revelado de
la tinción Golgi-Cox, el cual fue en total obscuridad de la siguiente manera (Gibb y Kolb,
1998).
9.4 Proceso de revelado
1. Las laminillas se enjuagaron con agua destilada, por 1 minuto.
2. Con hidróxido de amonio, por 30 minutos.
3. Un enjuague con agua destilada, por 1 minuto.
4. Con fijador rápido de Kodak al 50%, por 30 minutos.
TINCIÓN DE GOLGI-COX
23
5. Un enjuague con agua destilada, por 1 minuto.
6. La deshidratación del tejido será con concentraciones crecientes de etanol 75, 90
y 100 %, 10 minutos por cada uno, finalmente 30 minutos de alcohol absoluto.
7. Luego 30 minutos en xileno.
8. El tejido se cubrieron con resina sintética (al 60 % en xilol, marca Hycel) y se
guardaran en absoluta oscuridad para el secado.
9.5 Trazo de neuronas
Para iniciar la reproducción bidimensional de las neuronas, Kolb (1998) propone los
siguientes criterios para elección de las mismas.
1.- Que la neurona se encuentre en la región a analizar.
2.- Que se encuentre bien teñida.
3.- Que no esté fragmentada.
4.- Que se encuentre lo suficientemente aislada de tal manera que se puedan distinguir
las dendritas de la neurona elegida.
Se hizo una selección de 5 neuronas por cada hemisferio cerebral para su dibujo, para
lo cual se utilizó un microscopio leica, DMSL, con una cámara lucida adaptada que
proyecta una imagen especular por los lentes ópticos.
9.6 Identificación y localización de neuronas de interés a examinar
9.6.1 Hipocampo dorsal
Las neuronas piramidales del hipocampo dorsal región CA1 (Paxinos y Watson, 1998),
presentan un soma que se caracteriza por tener una forma triangular (20µm de
diámetro). Del ápice del soma emerge el árbol dendrítico apical, y de la base del soma
de 5 a 10 dendritas basolaterales (Figura 7) (Campaña y cols., 2008).
TINCIÓN DE GOLGI-COX
24
Figura 7 a) Fotográfica de 1 neurona de hipocampo dorsal región CA1 (Paxinos y Watson 1998) y b)
microfotografía Campaña y cols., 2008).
9.6.2 Amígdala basolateral
a) Amígdala basolateral o complejo amigdalino, es una estructura subcortical,
presenta neuronas e interneuronas, b) Núcleos amigdalinos agrupados a partir
de Bregma -1.80 a -3.60mm (Figura 8); (modificado de Feber y cols., 2013; Mc
Donald, 2003).
Figura 8) Neurona de amígdala basolateral (Bringas y cols., 2012). Y Núcleos amigdalinos
Modificado de (Feber y cols., 2013)
ANÁLISIS DE SHOLL
25
10 ANÁLISIS DE SHOLL
Una vez que se dibujaron las dendritas de las neuronas de interés, se realizó el análisis
de Sholl (Sholl; 1953)
1.- Se observó el árbol dendrítico tridimensional
2.- Mediante el uso de una cámara lucida se hizo una reconstrucción del árbol
dendrítico en un plano bidimensional
3.- Con un acetato con anillos concéntricos equidistantes de 10 µm, se colocó de
manera centrada sobre los trazos del árbol dendrítico, el número de intersecciones del
anillo se utilizó para estimar la longitud dendrítica total (TDL) y la estimación del número
total de ramificaciones dendríticas (ramificación indicada por cada bifurcación), las
cuales se cuentan en cada orden de distancia desde el cuerpo de la célula o el eje
dendrítico (Figura 6) y de igual forma se calcula la densidad de espinas (modificado de
Bringas y cols., 2013).
Figura 6 Análisis Sholl (Modificado de Bringas et al. 2013).
Una vez que se obtuvieron los resultados del análisis de Sholl, se realizó el análisis
estadístico.
RESULTADOS
26
11 RESULTADOS
Posterior a la administración de fenobarbital, al día 35 y 70 pos natal los animales
fueron evaluados mediante la prueba de actividad motora ante ambiente novedoso.
11.1 Actividad motora al día 35 post natal
En actividad motora a los 35 DP muestra una diferencia significativa en los número de
movimientos durante los primeros 10 minutos de la prueba en el curso temporal, entre
el grupo tratado con fenobarbital con respecto al grupo control, y al avanzar el tiempo
esta disminuye (Figura 7). Se realizó una ANOVA de 2 vías posteriormente una post-
hoc de Bonferroni **p<0.01; (n=100 neuronas/grupo).
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Figura 7 Actividad motora al día 35 post natal
En el número total de movimientos al día 35 post natal, no se encontraron diferencias
significativas entre el grupo tratado con fenobarbital con respecto al grupo control
(Figura 9). Se realizó una t de Student; (n=100 neuronas/grupo).
RESULTADOS
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Figura 8 Número total de movimientos al día 35 post natal.
11.2 Actividad motora al día 70 post natal
A los 70 DP, muestra una diferencia significativa en el número de movimientos durante
los primeros 10 minutos de la prueba en el curso temporal, entre el grupo tratado con
fenobarbital con respecto al grupo control y al avanzar el tiempo va disminuyendo
(Figura 9). Se realizó ANOVA de 2 vías posteriormente una post-hoc de Bonferroni
***p<0.001; (n=100 neuronas/grupo).
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0
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RESULTADOS
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Figura 9 Actividad motora al día 70 post natal.
En el número total de movimientos se muestra una diferencia significativa entre el grupo
tratado con fenobarbital con respecto a su grupo control (Figura 10). Se realizó la
prueba t de student ***p<0.0001; (n=100 neuronas/grupo).
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Figura 10 Número total de movimientos al día 70 post natal.
11.3 Morfología neuronal de amígdala basolateral al día 35 post natal
Se realizó el análisis de Sholl para evaluar el grado de conectividad neuronal en
amígdala basolateral, se muestra la arborización dendrítica de las neuronas de
amígdala basolateral a los 35 días post natal, una diferencia significativa a nivel de los
círculos 6, 7, 8 y 9 (Figura 11). En la longitud por número de orden existe diferencia
significativa a nivel del tercer orden dendrítico en el grupo tratado con fenobarbital con
respecto al grupo control (Figura 12). Se realizó una ANOVA de dos vías,
posteriormente una post hoc de Bonferroni *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; (n=100
neuronas/grupo).
RESULTADOS
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Figura 11 Arborización dendrítica de amígdala basolateral al día 35 post natal.
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Figura 12 Longitud por número de orden al día 35 post natal.
11.4 Longitud dendrítica total y densidad de espinas en amígdala basolateral al
día 35 post natal.
En longitud dendrítica total de neuronas de amígdala basolateral al día 35 post natal, se
observa una disminución significativamente menor ( Figura 13) y en la densidad de
espinas una diferencia significativa menor (Figura 14) en el grupo tratado con
RESULTADOS
30
fenobarbital con respecto al grupo control. Se realizó una t de student *p<0.05,
***P<0.05; (n=100 neuronas/grupo).
Figura 13 Longitud dendrítica total al día 35 post natal.
Figura 14 Densidad de espinas dendríticas al día 35 post natal.
RESULTADOS
31
11.5 Morfología neuronal de amígdala basolateral al día 70 etapa pos púber.
Se realizó el análisis de Sholl para evaluar el grado de conectividad neuronal en la
amígdala basolateral, nos muestra la arborización de neuronas al día 70 pos natal, se
observa una diferencia significativa menor al nivel de los círculos del 10 al 20 en el
grupo tratado con fenobarbital con respecto al grupo control (Figura 15). En la longitud
por número de orden se muestra en el primer, tercer, cuarto y quinto (1er, 3er, 4to y 5to)
orden dendrítico una diferencia significativa menor entre el grupo tratado con
fenobarbital con respecto al grupo control. Se realizó una ANOVA de dos vías,
posteriormente una post hoc de Bonferroni *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001 (n=100
neuronas/grupo).
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Figura 15 Arborización dendrítica al día 70 post natal.
RESULTADOS
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Figura 16 Longitud por número de orden al día 70 post natal.
11.6 Longitud dendrítica total y densidad de espinas dendríticas de amígdala
basolateral al día 70 post natal
En la longitud dendrítica total de neuronas de amígdala basolateral al día 70 post natal,
se muestra una diferencia significativa menor ( Figura 17). En la densidad de espinas
dendríticas no se muestran diferencias del grupo tratado con fenobarbital con respecto
al grupo control (Figura 18). Se realizó una t de student ****p<0.0001; (n=100
neuronas/grupo).
RESULTADOS
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Figura 17 Longitud dendrítica total al día 70 post natal.
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Figura 18 Densidad de espinas dendríticas al día 70 post natal.
11.7 Morfología neuronal de hipocampo dorsal a los 35 días post natal (etapa
pre púber)
Se realizó el análisis de Sholl para evaluar el grado de conectividad neuronal en
hipocampo dorsal, nos muestra la arborización de las neuronas al día 35 post natal, no
se observan diferencias en el grupo tratado con fenobarbital con respecto al grupo
control (Figura 19). En la longitud por número de orden se muestra en el quinto orden
dendrítico una diferencia significativa en el grupo tratado con fenobarbital con respecto
RESULTADOS
34
a su grupo control (Figura 20). Se realizó una ANOVA de dos vías, posteriormente una
post hoc de Bonferroni *P<0.05; (n=100 neuronas/grupo).
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Figura 19 Arborización dendrítica al día 35 post natal.
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Figura 20 Longitud por número de orden al día 35 post natal.
RESULTADOS
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11.8 Longitud dendrítica total y densidad de espinas dendríticas de hipocampo
dorsal al 35 post natal
En la longitud dendrítica total de neuronas de hipocampo dorsal al día 35 post natal no
se muestran diferencias significativas (Figura 21). En la densidad de espinas
dendríticas se muestra una tendencia a disminuir entre el grupo tratado con fenobarbital
con respecto al grupo control (Figura 22). Se realizó una t de Student ***P<0.001;
(n=100 neuronas/grupo).
Figura 21 Longitud dendrítica total al día 35 post natal.
Figura 22 Densidad de espinas al día 35 post natal.
RESULTADOS
36
11.9 Morfología neuronal de hipocampo dorsal al día 70 pos natal
Se realizó el análisis de Sholl para evaluar el grado de conectividad neuronal en
hipocampo dorsal, nos muestra la arborización de las neuronas al día 70 post natal una
diferencia significativa menor a nivel de los círculos 11 al 20, en el grupo tratado con
fenobarbital con respecto al grupo control (Figura 23). En la longitud por número de
orden se muestra una en el tercer, cuarto y quinto (3er, 4to y 5to) orden dendrítico una
diferencia significativa en el grupo tratado con fenobarbital con respecto a su grupo
control (Figura 24). Se realizó una ANOVA de dos vías, posteriormente una post hoc de
Bonferroni **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0001; (n=100 neuronas/grupo).
A r b o r i z a c i ó n D e n d r í t i c a
H i p o c a m p o D o r s a l 7 0 D P
C í r c u l o s c o n c é n t r i c o s
No
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0 2 4 6 81
01
21
41
61
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02
22
42
62
83
0
0
5
1 0
1 5
2 0 C o n t r o l
F e n o b a r b i t a l
* ** * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * ** *
Figura 23 Arborización dendrítica al día 70 post natal.
RESULTADOS
37
N o . d e o r d e n d e n d r í t i c o
H i p o c a m p o D o r s a l 7 0 D P
O r d e n D e n d r í t i c o
Lo
ng
itu
d (
m)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
1 5 0
3 0 0
4 5 0
6 0 0
7 5 0
9 0 0
C o n t r o l
F e n o b a r b i t a l
* *
* *
* *
Figura 24 Longitud por número de orden al día 70 post natal.
11.10 Longitud dendrítica total y densidad de espinas de hipocampo dorsal al
día 70 post natal
En la longitud dendrítica total de neuronas de hipocampo dorsal al día 70 post natal,
muestra una diferencia significativa ( Figura 25). En la densidad de espinas dendríticas
no se muestran diferencias entre el grupo tratado con fenobarbital con respecto al grupo
control (Figura 26). Se realizó una t de Student **p<0.01 (n=100 neuronas/grupo).
Figura 25 Longitud dendrítica total al día 70 post natal.
RESULTADOS
38
Figura 26 Densidad de espinas dendríticas al día 70 post natal.
CONCLUSIONES
39
12 DISCUSIÓN
El presente trabajo de investigación propuesto evaluar el efecto de la administración de
fenobarbital sobre la morfología dendrítica y la actividad motora ante un ambiente
novedoso, La actividad motora espontanea es regulada por neurotransmisores y
estructuras del sistema límbico, una de ellas es la amígdala basolateral, esta implicada
en reacciones emocionales, memorias, en la agresión, celos, miedo; modula la
respuesta al estrés mediante las conexiones con el hipotálamo, así mismo la actividad
autonómica y endocrina; si la zona es lesionada induce docilidad (White y cols., 2008).
El hipocampo dorsal CA1 está implicado en procesos cognitivos, aprendizaje espacial y
la memoria, está asociado con la amígdala (Bannerman y cols., 2004). Nuestros
resultados concuerdan con otros estudios en los que han utilizado el fenobarbital, pues
reportan que la exposición aguda del fármaco en neonatos induce alteraciones en áreas
del sistema límbico, lo cual indica que se reproducen síntomas similar a los trastornos
de tipo metal en etapa pos-púber (Verona y cols., 2001; Herranz y cols., 2007; A.
Forcelli y cols., 2011; Bhardwaj y cols., 2012). En nuestra investigación realizamos la
reproducción de síntomas similares a trastornos de tipo mental tales como: Ansiedad,
angustia, hiperactividad, miedo, tristeza y conducta agresiva, lo cual fue mediante una
administración de 75 mg/kg de fenobarbital en ratas de 7 días de edad, ya que es el
periodo más sensible durante el neurodesarrollo y aumenta el riesgo de presentar
alteraciones en la conectividad neuronal, nuestros resultados concuerdan con (Orellana
y cols., 2006) al reportar que las alteraciones de las interconexiones neuronales
explican un amplio espectro de patologías psiquiátricas generadas por trastorno de
conectividad anatómica.
En la prueba de actividad motora del curso temporal al día 35 y 70 post natal, nuestros
resultados indican una diferencia significativa en el número de movimientos en los
primeros 10 minutos, lo cual indica que en este tiempo se presentó un incremento de
conducta motora y al avanzar el tiempo esta disminuye hasta mantenerse constante,
entre el grupo tratado con fenobarbital con respecto al grupo control, y en el número
total de movimientos al día 35 post natal no se encontraron diferencias significativas
entre el grupo tratado con fenobarbital con respecto al grupo control, Sin embargo al día
70 post natal muestra una diferencia significativa en el número de movimientos totales
CONCLUSIONES
40
entre el grupo tratado con fenobarbital con respecto a su grupo control. Nuestros
resultados concuerdan con lo reportado por Forcelli y cols., (2011) donde indica que la
exposición ratas neonatas al fenobarbital induce incremento de actividad motora en
edad post púber.
En cuanto a la morfología de arborización dendrítica de amígdala basolateral al día 35
post natal, nuestros resultados muestran una diferencia significativa a nivel de los
círculos 6, 7, 8 y 9. De igual manera se observa la longitud por número de orden resalta
en el tercer (3er) orden, por otro lado en la longitud dendrítica total y en la densidad de
espinas se observa una diferencia significativa entre grupos tratados con fenobarbital
con respecto a su grupo control. Nuestros resultados indican que existe una alteración
neuronal y por ende la presencia de problemas de tipo conductual y/o emocional, estos
hallazgos concuerdan con (Forcelli y cols., 2012). Sin embargo varias regiones
cerebrales aún no han sido examinadas.
Respecto a la morfología de arborización dendrítica de amígdala basolateral al día 70
post natal, se observa una diferencia significativa en la arborización de dendritas a nivel
de los círculos 10 al 20. Se observa la longitud por número de orden una diferencia
significativa en el primer, tercer, cuarto y quinto orden, por otra parte se muestra una
diferencia menor en la longitud dendrítica total, sin embargo en la densidad de espinas
no se muestran diferencias, esto es entre grupos tratados con fenobarbital con respecto
a su grupo control. Nuestros resultados concuerdan con otro estudio pues indica que
mediante el uso temprano de fenobarbital se inducen cambios de desarrollo en la
corteza, lo cual se asocia a trastornos psiquiátricos (Lipska y cols., 2000).
Respecto a la morfología de arborización dendrítica y a la longitud dendrítica total del
hipocampo dorsal al día 35 post natal, no encontramos diferencias sin embargo en la
longitud por número de orden se muestra más en el quinto (5to) orden una diferencia
significativa, y en la densidad de espinas dendríticas se observa una tendencia a
disminuir entre grupos tratados con fenobarbital con respecto a su grupo control. El
resultado de un estudio indica que la presencia de alteraciones en sistema límbico
CONCLUSIONES
41
induce anomalías en redes neuronales y desencadena trastornos psiquiátricos (M. T.
Ledo y cols., 2007).
Nuestros resultados de la morfología de arborización dendrítica del hipocampo dorsal al
día 70 post natal, muestran una diferencia significativa menor a nivel de los círculos 11
al 20, sin embargo en la longitud por número de orden se observa que en el tercero,
cuarto y quinto orden una diferencia significativa mayor y en la longitud dendrítica total;
Mientras que en la densidad de espinas no se muestran diferencias entre grupos
tratados con fenobarbital con respecto a su grupo control. Se ha reportado que los
cambios en áreas del sistema límbico, indica la presencia de una desregulación las vías
de neurotransmisión gabaérgica, dopaminérgica y de glutamato, pues el hipocampo
presenta conexiones con casi todas las partes del sistema límbico (G. Flores y cols.,
2001).
Los resultados del presente trabajo de investigación apoyan la hipótesis de alteración
del neurodesarrollo, pues sugiere que una alteración en el neurodesarrollo da lugar a la
presencia de trastornos psiquiátricos que se manifiestan posteriores a la adolescencia o
edad adulta (Garcia y cols., 2005). La administración de fenobarbital en ratas de 7 días
de edad, induce síntomas similares a trastornos psiquiátricos al alcanzar la etapa pre
púber y pos púber. Nuestros resultados indican que alcanzamos lo objetivos
planteados.
13 CONCLUSIONES
La administración de fenobarbital al día 7 post natal induce síntomas similares a
trastornos psiquiátricos al alcanzar la etapa pre púber y pos púber.
El efecto del fenobarbital incrementa la actividad motora al alcanzar la etapa pre-
púber y pos-púber, esto se observó en los primeros minutos de la prueba de
actividad motora ante ambiente novedoso.
CONCLUSIONES
42
El efecto del fenobarbital sobre la morfología de arborización dendrítica de la
amigadla basolateral presentó diferencias de cambio en el día 35 y 70 post natal.
El efecto del fenobarbital sobre la morfología de arborización dendrítica del
hipocampo dorsal CA1 al día 35 DP no se observaron cambios, sin embargo al
día 70 DP fueron más notorios.
Los resultados del presente trabajo apoyan la hipótesis del neurodesarrollo, por
lo cual se alcanzaron los objetivos planteados.
BIBLIOGRAFÍA
43
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