BIBLIOTECA UC

5306015699

UNiVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUíMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

-r5g.4. 2CtA

‘Estudiossobretécnicasdedeteccióndevirusy patógenos

subviralesvegetalesy búsquedaderesistenciaalvirusdel

mosaicodelpepino(CMV) engennoplasinadepimiento’!.

Memoria presentadapor

CARMEN DE BLAS BEORLEGUI

paraoptaralgradode

DOCTORen CIENCIAS BIOLOGICAS

Director: Dr. JAVIER ROMERO CANO

Investigadorprincipal del CIT-INIA

Madrid, 1992

SI. ?s¿

>4 mis viejos compañeros de/laboratorio de Virología Vegetal,

cuando éramos CP/D,4-O6.

>4 mipadre, que ya no estdj y ami madre.

A Gerardo y a nuestros hijos.

¡Oh, Dios, dame una visión sin nubes ylíbrarne de la prisa!Dame el valor de oponerme a toda vanidad yde proseguir, lo mejor que pueda y hasta elfinal, cada una de mis tareas.Dame la voluntad de no aceptar nuncareposo ni homenaje antes de haber podidocomprobar que mis resultados correspondena mis cálculos o de haber podido descubrir yenmendar mis errores.

Sinclair Lewis, 6/doctor Arrowsmn¡th.

AGRADCCIMICNTOS

Muchísimas personas han contribuido a la realización de esta tes/s.

Algunas de forma indirecta, corno los millones de contribuyentes espa¡5oles,

con cuyos impuestos han mantenido mi sustento a lo largo de estos anos. O

el personal del IP/lA, que me concedió un puesto de trabajo hace ya aPios, y

en cuyos laboratorios del Departamento de Protección Vegetal he efectuado

todos los experimentos que aquí describo. O los descubridores de la Coca—

Cola y de la aspirina, sin cuya aportación a la humanidad me habría sidomucho más difícil la escritura de todas estas páginas.

Pero muchos también han intervenido de una forma muy directa,como:

— Los integrantes del laboratorio de Virología Vegetal, que tanto mehan ayudado y ensetiado, por su saber trabajar en equipo, y cuyoentusiasmo me ha hecho más llevadera esta ardua tarea de realizar la

tesis. Por las reuniones de los miércoles, en las que se discutían los

trabajos de todos, aprendiendo tanto sin darnos cuenta. Gracias a todos he

disfrutado muchísimo a lo largo de estos cinco aPios de trabajo. Quiero

expresar especialmente mi agradecimiento a Javier Romero, Fina Castro, y

Gerardo Carazo, que en un viaje a Francia me convencieron de lanzarme a la

aventura y luego me apoyaron eh todo momento incondicionalmente. A

Fernando Ponz por su amplia visión, y sus certeros consejos. A Flora

Sánchez por su experimentada guía en algunos experimentos, por susmaravillosos protocolos y por el virus GFLV purificado. A Maria José Soto,

con la que compartí y sufrí el intenso trabajo de la búsqueda de resistencia

a virosis en qermoplasma de pimiento y además me permitió analizar la

presencia de CMV en sus muestras de pimiento de campo. A David Martínez,

por su paciente ayuda innumerables veces en el ordenador, por susexplicaciones de cuestiones a veces difíciles para mí y por purificar el

plásmido pl/OS portador de un inserto del satélite de CMV. A Jesús Fresno,por ayudarme con las fotos. A Gerardo Carazo, Brígida García, Adela

Redondo, y margarita Calvo, que tantas veces me ayudaron a procesar las

muestras de los EL/SAS. A Paco Sánchez por su colaboración en el cuidado

del invernadero. A Carmen Marcilla, por su infinita paciencia. A Fernando,

Flora, Fina, Vicente, Jesús y Margo por las correcciones al manuscrito de la

tesis, aparte naturalmente de a Javier, mi director. A nuestros convecinos

del Area de Biología Molecular y Virología Vegetal, con los que compartimos

casi todo, y especialmente por los seminarios de los jueves, tan

enriquecedores. Al Dr. Jose Al, Malpica y Vicente Torres, que ayudaron a la

unión de los dos equipos.

- Gustavo Nolasco (U. C. 1. A., Universidad del Algarve, Faro,

Portugal). que pasó tres meses intensisirnos con nosotros diciendo que veníaa aprender, pero me enseñó muchísimo más a mí; por una colaboración

fecunda y por haber podido disfrutar tanto trabajando.

— Nicolás Gonzales, del Centro de Conservación de Recursos

Fito genéticos del 07—IP/lA, que nos suministró las semillas de pimiento y

realizó las autofecundaciones y los cruces en campo. El Dr. Luis Silvela, con

sus pacientes explicaciones para enseñarme a abordar el tratamiento

estadístico de las muestras analizadas por EL ISA. El Dr. A. Schram

(Zaadunie Biotechnology, holanda), que nos cedió el plásmido pZU /234portador de la proteína de la cápsida de CMV. El Dr. 13. D. harrison, por el

plásmido pl 105 portador de un inserto del satélite de CMV.

También quiero agradecer su ayuda en los muestreos de campo a

Carlos Fabregás y Mario Serdá, del Servicio de Protección de los Vegetales

de Amposta (Tarragona); Miguel García Morató, del Servicio de

Transferencia y Tecnología de Moncada (Valencia), y Vicente Félix, del

Servicio de Extensión Agraria de bios (Valencia); Elisa Sáez, del Servicio deProtección de Vegetales de Almería; Fernando Pérez, del Servicio de

Extensión Agraria de San Martín de Valdeiglesios (Madrid); y Rafael Ortiz y

Jose Manuel Barreiro, de 1-lispareco (Badajoz).

Por enviarme diferentes patógenos al Dr. 6. García Arenal (E.T.S.l.A.,

Madrid), por el aislado Fny de C11/1t’; a Ana Cano (CRíA. Murcia) por las

hojas de naranjo infectadas con CTV; a la Dra. Maite Serra (C.l.B., C.S.l.C.,

Madrid) por las hojas de Nicotiana bentham¡ana infectadas con PMMV; a

Cristina Pérez de San Román CC/AlA., Vitoria) por los tubérculos de patotainfectados con PLRV; al Dr. A. Schram (Zoadunie l3iotechnology, holanda) porlas plantas de pimiento infectadas con TSWV; al Dr. Cvvens (U.S.D.A.

T3eltsville, MD, EEUU), por el PSTVd; al Dr. T3arnett (U. de Carolina del Sur,

Clemson, EEUU) por el 74V desecado.

Por cederme fotos: al Dr. Ventura Padilla, de síntomas del CTV; a

Cristina Pérez de San Román, de síntomas del PLRV; al Dr. Jesús Fresno, porla micrografía del CMV purificado; a Ramón Fisac, por el CMV en platanera.

A mi cuñado Tofo, por sus maravillosos mapas.

Al Dr. Julián Perera, Profesor Titular de Biología Molecular y tutorde esta tesis, que siempre me recibió con toda amabilidad.

Y muy especialmente, quiero expresar mi agradecimiento a Gerardo,porque esta tesis nos cambió la vida, y sin embargo, se sup¿ adaptar y

rellenar los huecos que tantas veces dejé en caso. Ya Gerardo II y CarmenII, porque su sola presencia ayuda a poner las cosas en su sitio.

INDICE

O. ABREVIATURAS 1

1. INTRODUCCION 4

• 1. LOS VIRUS VEGETALES 5

2. PATOGENOS SUBVIRALES 10

2.1. Satélites 10

2.2. Viroides 11

3. EL VIRUS DEL MOSAICO DEL PEPINO (CMV). 11

3.1. Características biológicas. 13

3.2 La partícula viral. 15

3.3. Clasificación de cepas. 18

3.4. Propiedadesdel genoma. ID

3.5. Satélitesde CMV.

3.6. CMV en España. 22

4. DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR LOS

VIRUS Y PATOGENOS SUBVIRALES QUE AFECTAN A LAS PLANTAS. 23

4.1. Técnicas serológicas 24

4.2. Análisis de ENAs bicatenarios

4.3. Hibridaciones sobre membrana. 27

4.4. Reacciónen cadena de la polimerasa <PCR).

5. CONTROL DE LOS VIRUS 29

5.1. Plantaslibres de virus. 30

5.2. Plantas resistentesa virus. 30

6.2.1.Protección por RNAs satélites. 31

5.2.2. Protección cruzada. 31

5.2.3. Plantas transgénicas. . 31

5.2.4.Genesde resistencianaturales

5.2.5.Resistenciaa CMV en pimiento 33

II. OBJETIVOS 36

III. MATERIALES Y METODOS 39

1. MATERIALES

1.1. Patógenos 40

1.2. Anticuerpos. 40

1.3. Solucionesy tampones 41

1.4. Medios de cultivo 42

1.5. Estirpes bacterianas. 42

1.6. Productos. 42

1.7. Equipo. 42

2. INOCULACION MECANICA DE LOS VIRUS. 43

3. TECNICAS INMUNOENZ1MATICAS. 43

3.1. La técnicaELISA 43

3.2. Estandarización de la técnica ELISA. 44

4. PURIFICACION DE CMV Y DE LOS RNAs VIRALES. 44

4.1. Purificación de] virus 44

4.2. Extracción del RNA viral. 45

5. ANALISIS DE RNAs BICATENARIOS 45

6. DETECCION DE CMV POR HIBRIDACIONES SOBRE MEMBRANA 46

6.1. Clones de cDNA. 46

6.2. Transferencia tipo “Southern” de DNA a membranas, e6.3. ‘Dot blot” de maceradosvegetalessobre membranas, e6.4. Marcaje de las sondas. 49

6.5. Hibridación con sondasradiactivas. 50

6.6. Hibridación con sondas no radiactivas (digoxigenina). 80

7. DETECCION DE VIRUS Y PATOGENOS SUBVIRALES POR

AMPLIFICACION ENZIMATICA

7.1. Oligonucleotidos cebadores. 51

7.2. RT-PCR a partir de un maceradovegetal. 51

7.3. RT-PCR basadaen captura del virus con anticuerpos específicosen

placas de microtitulación. 83

7.4. RT-PCR realizada sobre placas ensayadaspreviamente con la

técnica ELISA. 54

7.5. RT-PCR basadaen captura del virus por adsorción directa al

poliestireno. 54

7.6. RT-PCR basadaen captura de RNA bicatenano. 85

7.7. Cuantificación del DNA ampUficado por fluorimetría. 55

8. DETECCION DE CMV EN MUESTRAS DE CAMPO. 55

9. BUSQUEDA DE RESISTENCIA A CMV EN GERMOPLASMA DE

PIMIENTO. 66

IV. RESULTADOS. 58

1. PUESTA A PUNTO Y EVALUACION DE LAS TECNICAS DE

DETECCION RUTINARIA DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL PEPINO. 50

1.1. Detecciónde CMV por ELISA 59

1.1.1. Estandarización de la técnica. 59

1.1.1.1.Tiempo idóneo de lectura 50

1.1.1.2.Positivo o negativo . 61

1.1.1.3. Determinación de subgrupo 61

1.1.1.4.Tampón de extracción 62

1.1.2.Limite de deteccióncon un maceradovegetal 62

1.1.3.Límite de deteccióncon virus purificado 66

1.2. Detección de CMV por análisis de los RNAs bicatenarios. 66

1.3. Detecciónde CMV por hibridaciones sobre membrana (‘dot blot”) 68

1.4. Detecciónde CMV por RT-PCR en un maceradovegetal. 68

2. DETECCION DE VIRUS Y PARTíCULAS SUBVIRALES POR RT-PCR

PREVIA CAPTURA EN PLACAS DE MICROTITULACION 71

2.1. Captura del virus con anticuerpos específicos. 71

2.2. Captura inespecifica del virus, 82

2.3. Análisis de resultados por fluorimetria. 82

3. DETECCION DE CMV EN MUESTRAS DE CAMPO

4. BUSQUEDA DE RESISTENCIA A CMV EN GERMOPLASMA DE

PIMIENTO.

V. DISCUSION.

1. TECNICAS DE DETECCION DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL PEPINO

(CMV)

ELISA

Análisis de RNAs bicatenarios

Hibridaciones sobre membrana (dot blot’)

RT-PCR

Limite de detección

2. DETECCION DE VIRUS Y PATOGENOS SUBVIRALES POR RT-PCR

PREVIA CAPTURA EN UNA PLACA DE MICROTITULACION.

3. DETECCION DE CMV EN CAMPO.

4. BUSQUEÚA DE RESISTENCIA EN GERMOPLASMA DE PIMIENTO

VI. CONCLUSIONES

VII. BIBLIOGRAFíA

ANEXO 1

84

87

93

94

94

96

97

98

99

101

105

107

110

114

137

ANEXO II 151

O. ABREVIATURAS

AL: Almería

AMV: alfalfa mosaic virus: virus del mosaicode la alfalfa

ArMV: Arabis mosaic virus: virus del mosaicodel Arabis

ASBVd: viroide de las manchas solaresdel aguacateATOO: American Type Culture Collection

BA: Badajoz

BBWV: broad beanwilt virus: virus del marchitamiento del haba

bc: bicatenario

BCMV: bean common mosaic virus: virus del mosaicocomún de la judía

BPYV: beetpseudo-yellowsvirus: virus del pseudo-amarilleainiento de la remolacha

BYMV: bean yellow mosaic virus: virus del mosaicoamarillo de la judía

BWYV: beetwestern yellows virus: virus del amarilleo occidental de la remolacha

CARNA5Z RNA 5 asociado a CMV

cebador 32 cebador complementario al extremo Y del fragmento que se quiere

amplificarcebador52 cebador homólogoal extremo 5’ del fragmento que sequiere amplificar

CCCVd: viráide del cadangcadangdel cocotero

001ff: Centro de Conservación de RecursosFitogenéticos

cDNA: ácido desoxirribonucleico complementario

CIB: Centro de InvestigacionesBiológicas

CIT-INIA: Centro de Investigación y Tecnología del Instituto Nacional deInvestigación y Tecnología Agraria y Alimentaria

CLRV: Cherry leaf rail virus: virus del enrollado del cerezo

CMV: Cucuinher mosaicvirus : virus del mosaico del pepino

CPMV: cowpeamosaicvirus: virus del mosaicode la carillaORIA: Centro Regional de InvestigacionesAgrarias

eRNA: ácido ribonucleico complementario

OSlO: Consejo Superior de InvestigacionesCientíficasCTV: citrus tristeza virus: virus de la tristeza de los cítricos

dATP: 5’-trifosfato de desoxiadenosina

dCTP: 5’-trifosfato de desoxicitidina

DEPO: pirocarbonato dietffico

dGTP: 5’-trifasfato de desoxiguanosina

1

dig-dUTP: W-trifosfato de desoxiuracilo-il-digoxigenina

dNTP: W-trifosfato de desoxinucleásidodrrP:W-trifosfato de desoxitimidina

DNA: ácido desoxirribonucleicoEDTA: ácido etilendiaminotetraacético; N-(2-(N-N biscarboximetil) aminoetil) -N-

carboximetilglicinaELISA: enzyme-íinked immunosorbent assay

ELISA-DAS: ELISA directo doble sandwichELISA-TAS: ELISA indirecto triple sandwich

GFLV: grapevine fanleafvirus: virus del entrenudo corto de la vid

HLVd: hop latent viraid: viroide latente del lúpulo

HpMV: hop mosaicvirus: virus del mosaicodel lúpulo

HPRI: human placental ribonuclease inhibitor: inhibidor de ribonucleasas de

placenta humana

LE: León

LMV: lettuce mosaic virus: virus del mosaicode la lechuga

LO:Logroño

M: Madridmc: monocatenario

M-MLV-RT: Transcriptasa inversa del virus Moloney de la leucemiamurina.

MU: Murcia

NA: Navarra

nt: nucleátido

O/N: overnight: 12-16h (toda la noche)

ORF: fasede lectura abierta

PA: Palencia

pb: paresde bases

POR: polymerasechain reaction: reacción en cadena de la polimerasaPLRV: potato íeafraíl virus: virus del enrollado de la patata

PMMV: pepper mild mottle virus: virus del moteadosuave del pimiento

PO: Pontevedra

PPV: plum pox virus: virus de la SharkaPSTVd: potato spindle tuber viroid: viroide del tubérculo ahusadode la patataPSV: peanut stunt virus: virus del enanismodel cacahuete

p/’r: peso/volumenPVY: potato virus Y: virus Y de la patata

RF: forma replicativa

2

RNA: ácido ribonucleico

RRSV: raspberry ringspot virus: virus de las manchasen anillo del frambueso

RT: reverse tranacriptase: transcripcióninversa

RT-PCR: reacción de transcripción inversa seguidade la reacción en cadena de la

polimerasa

SBMV: southernbeanmosaicvirus: virus del mosaicode la judía del sur

SOSV: virus del enanismodel trébol subterráneo

SDS: dodecilsulfato sódiico

SIA: Servicio de Investigación Araría

SO: SoriaSPV: Servicio de Protección de los Vegetales.

STNV: satélite del virus de la necrosisdel tabaco

STRSV: satélite del virus de las manchasenanillo del tabaco

T: TarragonaTAV: tomato aspermyvirus: virus de la aspermia del tomate

TBRV: virus de los anillos negrosdel tomate

TBSV: tomatobushy stunt virus: virus del achaparrado peludo del tomate

TEV: tobacco etch virus: virus del grabado del tabacoTMV: tobaccomosaicvirus: virus del mosaicodel tabaco

TNV: tobacco necrosisvirus: virus de la necrosisdel tabaco

ToMV: tomatomosaicvirus: virus del mosaicodel tomate.ToRSV: tomato ringspot virus: virus de las manchasen anillo del tomate.

Tris: trihidroximetilaminoetano; 2-amino-2-hidroximetil- 1,3-propanodiiol.

tENA: ácido ribonucleico de transferencia

TRSV: tobaccoringspotvirus: virus de las manchasen anillo del tabaco

TSWV: tomato spottedwilt virus: virus del bronceado del tomate

U: Universidad

V: Valencia

Z: Zaragoza

ZMV: zucchini mosaic virus: virus del mosaicodel calabacín

3

RNTIDUCCWJH

4

1. INTRODUCCION

1. LOS VIRUS VEGETALES.

Los virus son partículasnucleoproteicasno visualizablesal microscopio

óptico, se multiplican sólo en las células vivas, y puedencausarmultitud de

enfermedades.En general,entrelos patógenosde plantas,los virus son, despuésde

los hongos,los que producenmayorespérdidasen los cultivos agrícolas.Se conocen

alrededorde setecientosvirus vegetales, cuyo ácido nucleico es bien RNA

(monocatenarioen la mayoría de los casos, o bicatenario), o bien DNA

(monocatenarioo bicatenario).El genomase presentarodeadode una cubierta

proteicaconstituidapormoléculasdeproteínaque en la mayoríade los virus sonde

un solo tipo. Algunos de los virus más complejos llevan una envueltaexternade

lipoproteina.La Figura1 muestralavariabilidaden tamañosy formasencontrados

enlos virusvegetales(Matthews,1991).

Los genomasvirales pueden codificar para varias proteínas, tanto

estructuralescomo la proteínade cubierta,como no estructuralescomo proteasas,

proteínasimplicadasen la replicación(las replicasassonRNAs polimerasasRNA-

dependientesque realizancopiasde genomasenteros;las helicasas(Gorbalenyaet

al, 1989) desenrollan el ácido nucleico y están implicadas en replicación,

recombinación,reparacióny expresióndel genomaRNA o DNA), o proteínasde

movimiento.

En los sistemaseucariotasde síntesisde proteínaslos RNA mensajeros

contienenuna sola fase de lectura abierta (ORF), y los ribosomastraducen

solamentelas OREs situadasen el extremo5’. Los virus vegetaleshandesarrollado

básicamentecinco estrategias,ilustradasen la Figura 2, parasintetizarproteínas

a partir de un genomaRNA que contengamásde un gen, y cadagrupo de virus

adoptauna o másdeestasestrategias(Matthews,1991>:

a) ENAs subgenómicos(cucumovirus,closterovirus).La síntesisde uno o más

RNAs subgenómicospermite la traducciónde la ORE situadaen su extremo5’.

b) Genomasdivididos en variossegment¿s(cucumovirus,nepovirus).Se traduceel

gensituadoen el extremo5’ de cadaRNA.

c) Poliproteinas.UnasolaORF setraduceparadar una(enel casode los potyvirus)

o das(en el caso de los comovirus)poliproteinas,que posteriormentese escinden

mediante proteasascodificadas por el propio virus liberando las proteínas

funcionales.

5

TOAnAVIRUS

TOBMvC VIRUS

FCE~EWRJS

PCTEXVIRUS

RNA-mc (4.) sin envuelta

oMaizo Chiorotk Owarf Vfrus ¡LUTEOVAUSfl’MOVIRUST~tuSJSVfltJS

CARMOV RUSIAARAF[VIRUSParsnip Vollow Flock Virus

00

DNA.bc DNA-mc RNA-be

0 0CAULIKCVIRUS GEMINIVIRUS REOVIRIDAS CRVFTOVflJS

CARLAVIRUS

CAPILLOVIRUS

porvvnus

con envuelta

moPO W

000CUCUMOVIRUSAROMOVIRUSILAflVIRUS

QOQoAlfalfa Monje Virus

fl~ 1. Familias y gruposdevirus que infectanalas plantas(Matthews,1991).

Un grupo adicional,el del virus del moteadoamarillo de la comnelina,

formadopor partículasbaciliformescon DNA bicatenario,ffie aprobadopor la

1. 0. T. y. en 1990.

FABAVIRUSNEPO~RJSPs. Enalion Monje VirusDIAMTNOVPIJS

RNA-mc (-1

RNA 000VIRIDAE¶ OOnn,

6

1. RNAs subgenómicos

ORF 15.

RNAsubgcnómíco s’

VAAJ~wAnnnn

2. GenonÁn dividido en varios segmentos

RNA 1genémico 5.L

RNA 2genómico 5’ORE 1

1ORF2 ~

1

3. Poliproteina5.

ORF 1

RNAgenóTnico

Pri,ec,~;,n,jenig, p,oíooiI¡ico postrnducdonala-

vwuwww~jvvvJvw~wAnnnf~rJwvvvvv

4

4. Presenciade un codon de terminacióninterioren ORE1 quepuedeserleído o no

RNAgenómico S’~ ORF 1 ORF 2

1 1~5. Genessolapadosen fasesde lecturadistintas.

RNAgenómico ~

AUG USA

1 ORFí 1

1 LOSE

1

LIgA. Estrategasutilizadaspor los virus vegetalesparapermitir la síntesisdeproteínasen un sistemaencarióticoa partir de un genomaRNA conteniendomás de un gen.

RNAgenómico ORF2

13

1¡ 0HF2

1

4

d) Los tobamovirus y tospoviruscontienenOREs con un codon de terminación

interior que,segúnseleao no, da lugara la formaciónde dosproteínasdistintas.

e) Genessolapadosen fasesde lectura distintas que por un cambioen la fasede

lectura cercadel codon de terminacióndan lugar a una segundaproteína más

larga(luteovirus).

A fin de que los virus puedanaccederal interior de las célulasvegetales

debenpenetrara travésde la cutículay paredde celulosa de éstas,por lo cual la

mayoríade los virus se asocianpara su transmisióncon insectos,nemátodos,u

otros organismosque produzcanlas heridasnecesarias.En la mayoríade los casos

estasasociacionesson altamenteespecificas,con relacionesbien definidasentreel

virus y el vector. Algunos virus son también transmitidosa través del polen y

transferidosa las semillas. La propagaciónvegetativacomerciales una forma de

diseminaciónimportanteen plantasleñosascultivadas.

No todas las plantasreaccionande igual forma al ser inoculadascon un

virus. En los fenómenosde inmunidadtotal, el virus no sereplica, mientrasque en

las llamadas infeccionessubliminales los virus se replican solamenteen las

células inicialmente infectadas.En las reaccionesde hipersensibilidad,el virus

quedarestringidoa unas pocas células que rodeanal punto de entrada,dando

lugar a lesioneslocalizadas.Por último, en los casosde susceptibilidad,los virus

infectan al huéspedsistémicamente,es decir, se esparcendesdeel lugar de la

infección haciaotraspartesde la planta.

Los virus son económicamenteimportantes sólo cuando producen

reduccionessignificativasen la produccióno en la calidadde los productosde las

plantas.Algunos de los síntomasque puedenproducir los virus en el huésped,

revisadospor Bos(1970),Zaitlin (1979)y Goodmanet al (1986),sonreducciónen el

crecimiento,cambiosen el color talescomo mosaicos,amarilleamientos(clorosis) o

apariciónde anillos concéntricos,muertedel tejido (necrosis),y alteracionesen la

forma de crecimientocomo enaciones,filimorfismo o enrollamientode las hojas.

La mayoríade los nombresde los virus incluyen términosquedescribensíntomas

en el huéspeddondese describió por primera vez la enfermedad.La Figura 3

muestralos síntomasinducidospor algunosde los virus utilizados en la presente

tesisdoctoral.

8

2. PATOGENOSSUBVIRALES (SATELITES Y VIROIDES).

2.1. Satélites

Algunos virus de plantaspresentanRNAs asociadosllamadassatélites,

revisadospor Murant y Mayo (1982),y porFrancki (1985),quese caracterizanpor

ser moléculasde RNA monocatenariode pequeñotamaño,no presentarapenas

homologíade secuencianucleotidicacanel genomaviral ni can la planta huésped>

y par serdependientesparasu replicacióndel virus auxiliar (“helper”) al queestán

asociados,generalmentemodificando la expresión de los síntomas de la

enfermedadproducida en la planta huésped. Cucumovirus, nepovirus y

tombusvirus son grupos de virus que presentana menudo RNAs satélites

asociados.

Los mayoríade los RNAs satélitessereplican de dos manerasdiferentes

(Piazzolaet al, 1989): a) las que presentanestructurasen los extremos3’ y 5’

similaresa las del virus auxiliar, replicéndosede forma semejantea éstea través

deun moldede sentidonegativo,y utilizando sus replicasas,como en el casode los

satélitesdel virus del mosaicodel pepino(CMV) y del virus de los anillos negrosdel

tomate(TBRV), y b) los quesereplicanmedianteun mecanismode círculo rodante

con FiNAs satélitescircularesy multiméricoscomo intermediosde la replicación,

queseautoprocesanmedianteunaactividadde “ribozima” (ej. el virus del satélite

de las manchasen anillo del tabaco,STRSV). Estaactividadautocataliticade los

RNA satélitescirculares (Bruening et al, 1988) está confinada a una parte

conservaday relativamentecorta de la secuencia,con un modelo estructural

propuestopor Forstery Symons(1987 a y b) de cabezade martillo para las

nucleótidosque contienenel sitio de la ruptura.

Los FiNAs de algunossatélitesllevan información genéticapara la síntesis

de supropiaproteínade cubierta,en cuyo casosuspartículasdifieren de las de los

virus auxiliaresy sedenominanvirus satélites,como el casodel satélitedel virus

de la necrosisdel tabaco(STNV) (Kassanis,1981). En cambio, los RNAs satélites,

que utilizan la proteína de cubierta del virus auxiliar, dan lugar a partículas

morfológica y antigénicamenteindistinguibles de las de éste, aunquepueden

presentarun coeficientede sedimentacióndiferente.

lo

2.2. Viraides

Los viroides, de los que existenrevisionesrecientesde Diener(1987, 1991),

Riesner(1991), y Symons(1991), son un fenómenobiológico extraordinario(que

afectaexclusivamentea las plantas)en el sentidode que un pequeñoRNA escapaz

de producir enfermedadescomo un virus completo. Los viroides son moléculas

circularescovalentementecerradasde RNA monocatenariode bajo pesomolecular

(246-375 nucleotidos),en los que el apareamientointramolecularde secuencias

complementariasdeterminaunaestructurasecundariacaracterísticaformadapor

pequeñasregionesbicatenariasinterrumpidasporbuclesinternosy protuberantes

(Figura 4 1). Al contrariaque los virus, no se encapeidan,y a pesarde su pequeño

tamaño, los viroides se replican autónomamentemedianteun mecanismode

cfrculo rodante(semejanteal del STRSV)(Figura 4 II) a travésde intermediosRNA

oligoméricos,y utilizando lasenzimasdel huésped.Estareplicación,en el casodel

viroide del tubérculoahusadode la patata(PSTVd), selleva a cabo en el núcleo,

acumulándoseposteriormenteen él (Semanciket al, 1976; Takahashiet al, 1982)o,

enel casodel viroide de lasmanchassolaresdel aguacate(ASBVd), o el viroide del

cadang-cadangdel cocotero(CCCVd) en el citoplasma(Randieset al, 1976; Marcos

y Flores, 1990). Hastaahorano se hanencontradoproteínascodificadaspor los

viroides.

Se conocenmás de 15 viroides, de los cualesel más estudiadoesel PSTVd.

Los síntomasde las enfermedadesproducidaspor los viroidesno se distinguende

los producidospor los virus e incluyen enanismo,moteada,distorsianamientoen

las hojas y necrosis.Puedenproducir desdeenfermedadesletales como la del

COCVd (Haseloffet al, 1982) hastainfeccionesasintomáticascomo la del viroide

latentedel lúpulo (HLVd), distribuidopor todo el mundo(Puchtaet al, 1988). Los

viroidesse transmitenen los cultivos principalmentepor propagaciónvegetativao

contaminaciónmecánica,y a través del polen y la semilla, existiendotambién

algunaevidenciade transmisiónporartrópodos(Matthews,1991).

3. EL VIRUS DEL MOSAICO DEL PEPINO (CMV).

El virus del mosaicodel pepino (cucumber mosaic virus o CMV) es el

miembrotipo del grupo de los cucumovirus.Dentro de estegrupo, CMV esel más

distribuido en el mundoy el mejor estudiado;sus propiedadeshan sido revisadas

11

(1)

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21

-3- ~c

EiaA. (1) Secuenciay estructurasecundariapropuestaparae] viroidePSTVd (Grosset al, 1978).(II) Modelo dereplicaciónen círculo rodantepropuestoparalos pequeñosRNAs circularespatogénicos(Branchy Robertson,1984;Hutchins et al, 1985).A la forma infectiva se le asignaarbitrariamentelapolaridadpositiva, mientrasque la polaridadnegativarepresentaa la copiacomplementariade la forma infectiva. (a) Variante simétricaen la cual los RNAsoligoméricos de ambaspolaridadessonprocesadosa formas circularesmonoméricas.(b) Variante asimétricaen la cual sólo los RNAs oligoméricosdepolaridad positiva sonprocesadosa monómeroscirculares.Las flechasindicanlas sitios de corte de los oligómerosproducidosa monómeros.

porFranckiet al (1979),Kapery Waterworth(1981),Edwardsony Ohristie (1991) y

Palukaitiset al (1992)entreotros. Fue descritoporprimeravez como el causantede

unaenfermedadtipo mosaicoenel pepino(Doolittle, 1916;Jagger,1916).

E] grupo de los cucumoviruscontienetres miembros distintos: el virus del

mosaicodel pepino (CMV) mencionado,el virus del enanismodel cacahuete(PSV)

y el virus de la aspermia del tomate (TAV). Todos estos virus muestran

similaridadesen la morfología de la partícula, transmisión por vectores,y

organizacióndel genoma,aunquepuedenser diferenciadosserológicamente,por

su gamade huéspedes,y por los tamañosmolecularesy secuenciasnucleotídicas

desusRNAs virales(Kapery Waterworth,1981).

3.1. Característicasbiológicas.

CMV es probablementeel virus con la gamade huéspedesnaturalesmás

amplia: afectaa másde 775 especiesde 365 génerospertenecientesa 85 familias de

mono y dicotiledóneas(Douine et al, 1979 b), sobretodo de regionestempladas,

principalmente a Crucíferas, Solanáceas,Compuestas,Papilionáceasy

Cucurbitáceas,siendoa nivel mundial el primer causantede pérdidaseconómicas

en hortícolasy ornamentalescultivadasal airelibre (Tomlánson,1987).

Los diversossíntomasproducidospor CMV en diferenteshuéspedeshan sido

revisadosporKapery Waterworth,(1981)y Martelli y Russo(1985).El síntomamás

común inducido por CMV es el mosaico. Sin embargo, la gravedad de la

enfermedadpuedevariar desdeno mostrarsíntomasen algunoscultivos (como por

ejemploen las malashierbasPortulacaoleraceaL. y Stellariamedia L., quejuegan

un importantepap’el epidemiológicocomoreservoriosnaturalesdel virus), hastala

muerte de la planta huésped.Algunos de los síntomasintermedios incluyen

moteadosuave,enanismo,cambioscromáticosen hojas y frutos, filimorfismo,

manchas anulares o lignificación en frutos. Algunas cepas producen

amarilleamientosen las hojas y otras necrosislocalizadaso generalizadas.La

Figura 5 muestraalgunosde los síntomasobservadoscon los aisladosutilizadosen

la presentetesis.

CMV se transmite de forma natural por numerosasespeciesde áfidos.

Fritzscheet al (1972) señalan75 especiesque transmiten CMV, siendo los más

comunesÁphis gossypii y Myzus persicae. Los cucumovirusse transmitenen

general de forma no persistente(Matthews, 1991): los áfldos, al hacerbreves

pruebasen las hojas (normalmenteen menos de 30 segundos),introducen el

estileteen las célulasepidérmicasadquiriendoel virus de una forma no conocida,

dondedebenproducirseinteraccionesentrela proteínade cubiertaviral y el estilete

del áfido (Palukaitiset al, 1992).En sucesivaspruebas,el áfido inyectael virus en

plantassanas,siendoestetiempo de transmisiónmuy corto. Los áfidos retienenel

virus menasde 4 horas,y no setransmitea la progenie.Hay un bajo nivel de

especificidad,ya quevariasespeciesde áfidos puedentransmitir varias cepasde

cucumovirus.La facultaddel CMV de transmitirsea travésde la semillaseha demostrado

en unas 20 especies(Kaper y Waterworth, 1981), lo cual es un factor muy

importante en la epidemiologíadel virus (Tomlinson y Carter, 1970). Los

porcentajesde transmisiónvaríandesdeunastrazasen pepino,a 0,2% en tomate,

7% en calabaza,3-8% enaltramuz(Jones,1988),8% en trebol subterráneo(Jonesy

McKirdy, 1990),4 a28%en carilla(Vigna unguiculata), 6 10-28%enmelón(Sharma(p~

et al, 1984).La transmisiónpor semillade CMV en judía (Phaseolusvulgaris) sedescribiópor primeravez en un aisladoespañol(Bos y Maat, 1974> en un 7%, pero

(1)posteriormentesehanencontradocasoscon hastaun 50%(Davis y Hampton,1986).

CMV también se transmite a través de la semilla de varias malas hierbaso

comunes,comoen el casode algunasespeciesde Cerastium (2%), Spergula(2%),Stellaria (21 a 40%)(Tomlinsony Carter,1970)y Rchinocystis(9 a 95%) (Neergaard,

1977).El mecanismode transmisiónpor semillaapenasse conoce,solamenteha

podido ser localizado en el embrión en el caso de Stellaria media, y en el

endospermoenel casodeEclzinocystislobata (Palukaitiset al, 1992).

CMV no parecequese transmitapor contactode planta a planta ni por

hongos,nemátodos,u otros insectosapartede los áfidos, aunquesí por algunas

especiesde Cuscuta,en lasqueel virus semultiplica (Franckiet al, 1979).

3.2. La partículaviral.

Las partículasde CMV sonisométricascon un diámetro de unos 30 nm.

(Figura6). La cubiertaestáformadapor 180subunidadesproteicasidénticasconun

pesomolecularde aproximadamente24.500 daltons (Francki et al, 1979). Las

partículas contienenun 18% de RNA genómico (Kaper y Re, 1974), que es

monocatenarioy de sentido mensajero O-), compuesto por tres segmentos

denominadosRNA 1, 2, y 3 segúntamañosdecrecientes,quevaríanligeramentede

unascepas a otras (Figura 7). Presentanotro RNA 4, que es un subgenómico

mensajeropara la proteínade cubierta (Pedeny Symons,1973). Solamentese

requierenlos 3 RNAs genómicosparaque el virus seainfectivo. Los RIÑAs 1 y 2 se

encapsidanseparadamente,mientras que los RNAs 3 y 4 se encapsidanen la

:15

mismapartícula(Lot y Kaper, 1976;Doughertyy Hiebert,1985),de forma quehay

tres clasesde partículasde CMV con dimensionesy propiedadesde sedimentación

similares(Figura 8).

3.3. Clasificaciónde cepas.

La variabilidadgenéticay fenotípicade CMV estal que casi todoslos aislados

descritospuedenconsiderarsecepasdiferentes,hastael punto de que Lovisolo y

Conti (1969),basándoseen la gamadehuéspedesy en los síntomas,no encontraron

dos aisladosidénticos entre60 de diferenteslocalidades.SiendoCMV capaz de

soportarla replicaciónde un quinto RNA llamadosatélite,cuya presenciainfluye

en los síntomasque el virus induce en el huésped(Kaper y Waterworth, 1977;

Waterworthet al, 1979),no esdeextrañarestaenormevariabilidad.

Devergney Cardin (1973)dividieron las cepas de CMV en dos grandes

subgrupos,DTL y ToFiS, segúnsu comportamientoen tests de inmunodifusión

(Tabla 1). A vecesseconsideraun tercergrupo, Co, máscercanoa ToES que a DTL

(Devergneet al, 1981).Estaclasificaciónserolégicasecorrelacionacon los gruposO

y B definidosporsusreaccionessobreplantashuésped(Marrouet al, 1975).

Aunque ambos subgrupospuedenconvivir en el campo e incluso en el

mismo individuo (Douineet al, 1979 a; Quiot, 1980), sehadescritoque el serogrupo

ToRS es aparentementemás prevalenteen las regiones templadaspues se

multiplica mal a elevadastemperaturas,mientrasque el serogrupoDTL, más

termorresistente(Marchoux et al, 1976), predominaen las zonas tropicalesy

subtropicales(Haaseetal, 1989),y quelos aisladosdel serogrupoDTL normalmente

producensíntomasmásgravesquelos de ToES(Haacky Richter, 1987).Durantelos

mesesde -veranosepuedeobservarun cambiode predominiode cepasToRS a DTL

(Quiot, 1980),debido a una selecciónde las cepasDTL. Este cambio más parece

debido a posterioresinfeccionesque a mutacioneso a seleccionesde variantes

(Quiot etal, 1979;Devergney Cardin, 1979).Mientras que en Alemaniapredomina

ToES (Haaseet al, 1989), en Franciase han descritoambos(Devergney Cardin,

1978; Quiotet al, 1979),enEEUU Kearneyet al (1990)encuentranprincipalmente

ToRSen pimientos,y DTL en el resto de las especiesen el estadode NuevaYork e

islas Bermudas,en GuadalupepredominaDTL (Migliori et al, 1978>,y en España

seha encontradomayoríade DTL (Luis-Arteagaet al, 1988, Luis-Arteaga, 1989;

Jordáetal, 1992).

Las cepas de CMV se puedendividir también en subgruposdistintos

comparando sus RNAs genómicos. Los serogrupos DTL y ToRS están

18

correlacionadoscon los gruposde hibridaciónWT y 5 respectivamente(Piazzollaet

al, 1979),y con los subgrupos1 y II definidos por Owen y Palukaitis(1988). Los

FiNAs de los miembrosde un subgrupono hibridancon cDNAs del otro grupo en

análisis tipo “dot-blat “ en condicionesrestrictivas de hibridación (Owen y

Palukaitis,1988).

3.4. Propiedadesdel genoma.

Se conocenlas secuenciascompletasde tres cepasde CMV, y las secuencias

parcialesde variasotrascepas(Palukaitis et al, 1992). La secuenciade cepasdelmismo grupo tienen alrededorde un 95% de homología,mientras que las de

distintas grupostienenaproximadamenteun 75% (Quemadaet al, 1989; Rizzo y

Palukaitis,1989).

Los 4 RNAs de CMV tienenvariascaracterísticascomunes:son de polaridad

positiva (+), es decir actúan como RNAs mensajeros,y llevan el extremo 5

bloqueado con 7-metil-guanosina.Los extremos W contienen una región no

traducidaconservadatanto en secuenciacomo en estructurasecundaria(en forma

de tRNA) de unos 200 nt (Gould y Symons,1977) que puedeaminoacilarsepor

tirosina en presenciade aminoacil-tRNA-sintetasas(Kapery Waterworth, 1981).La

conservaciónde estasestructurassecundariasindica una importancia funcional,

probablementeen la replicaciónviral.

El RNA 1 (3357-3389nt segúnlascepas)contieneunaúnicaORFque codifica

paraunaproteínade 111 kDa, denominadaproteínala, quecontieneseis motivos

conservadosencontradosen helicasas(Hodgman, 1988), sugiriendoeste papel

funcional para esta proteína. También hay una región con una considerable

homologíacon un fragmentodel virus Sindbis (virus con unaenvueltalipoproteica

que infecta animalesvertebrados)que codifica parala proteínansPl, necesaria

parainiciar la síntesisdel RNA (-) (Hahnet al, 1989)y que presentaunaactividad

metiltransferasa(Mi et al, 1989).

El RNA 2(3035-3050nt) contieneuna ORF que codifica parauna proteínade

94-97kDa, denominadaproteína2a. Esta contienela secuenciaconservadaGly-

Asp-Aspasociadacon las replicasasvirales(Palukaitiset al, 1992).

Tantolos RNAs 1 y 2 de CMV comolas proteínasla y lb estánimplicadosen

la formacióndel complejode replicaciónviral (Palukaitiset al, 1992).

El RNA 3 contienedosORFs,de las quela situadaenel extremo5’ codifica

paraunaproteínadenominada3a de30 kDa, mientrasquela situadaenel extremo

3’ codificaparala proteínadecubiertade 24 kfla queno setraducea partir del RNA

:19

3, sino a partir del RNA 4 subgenómico,que escolinearcon el extremo3 del RNA 3

(Gould y Symons,1978). La función de la proteína Sa permanecedesconocida,

aunquepor analogíacon otros virus podríaestarimplicadaen el movimiento célula

a céluladel virus (Daviesy Symons,1988). La proteínade cubierta estáimplicada

tanto en la encapsidaciónde los distintosRNAs virales como en el reconocimiento

por el áfido vectorparala transmisióndel CMV (Chény Francki,1990).

3.5. Satélitesde CMV.

Las partículasde CMV a menudacontienenun quinto RNA de pequeño

tamaño(330-390nt) que ha demostradoser un verdaderosatélite(Diaz-Ruiz y

Kaper,1977; Lot etal, 1977;Gould etal, 1978).

Los RNAs satélitesasociadosa CMV estándistribuidospor todo el mundo. El

de mayor importancia económica,el denominadoCARNA 5 (RNA 5 asociadoa

CMV), fue descrito por primera vez en 1972 en Alsacia (Francia) (Kaper y

Waterworth, 1977) produciendouna epidemiadevastadorade necrosisen campos

detomate.Posteriórmentesehaencontradoen otros paísescomoJapón(Yoshidaet

al, 1984),Italia (Kaperet al, 1990)y España(Jordáetal, 1992)(Figura9).

Los FiNAs satélitesseacumulana altos nivelescuandoestánpresentesen

lasplantasinfectadas,a menudoreduciendola síntesisdel genomaviral (Kaper y

Tousignant,1977; Mossopy Francki, 1979; Takanaini,1981; Jacquemondy Leroux,

1982). En la mayoríade los huéspedes,estareducciónde la replicaciónviral se

correlacionacon una atenuaciónde la gravedadde los síntomasinducidospor el

virus. Sin embargo,hay algunos RNAs satélitesque mientras que atenúanlos

síntomasen unos huéspedesacentúanla gravedadde los síntomasen ciertas

Solanáceas,pudiendoproduciruna fuerte clorosis sistémicaen tabacoy pimiento,

mientrasqueinducennecrosissistémicaen tomate.Se sabeque los determinantes

para clorosis y necrosis en tomate están localizadosen diferentesdominios

funcionalesde los RIÑAs satélites(Kurath y Palukaitis, 1989), y que un simple

cambio en un nucleatido distingue RNAs satélites necrogénicosde los nonecrogénicos(Palukaitis, 1988; Sleat y Palukaitis, 1990), pero en definitiva la

modificación de los síntomases el resultadode interaccionescomplejasentreel

RNA satélite,la cepadel virus auxiliar y la especiehuéspedimplicada.

Se han secuenciadomás de 25 aisladosde RNA satélite de CMV, que

presentanuna homologíade secuenciadel 70-99% (Palukaitis et al, 1992), y

mientras las variantesnecrogénicasestánfuertementeconservadas,entre las

variantes no necrogénicashay una mayor variabilidad. Los RIÑAs satélites

presentanunos extremos5’ y 3’ muy similaresa los de los RNAs genómicos(el

extremo 5’ bloqueadocon una guanosinametilada y el extremo 3’ con una

estructuratipo dINA, aunqueno ha podidoseraminoacilado>.Contienende unaa

tres ORFs,que puedensertraducidasitt ultra, aunquelos polipéptidosque codifican

no parecentenerun papelen la patogénesis.El alto gradodeestructurasecundaria

(Gordon y Symons, 1983; García-Arenalet al, 1987) (Figura 10), fuertemente

conservada(Fraile y García-Arenal,1991>, puedeexplicarsu estabilidady sugerir

que estosFiNAs satélitessonRNAs funcionalescuyabiología estaríadeterminada

por su interaccióndirectacon los componentesdel huéspedy/o el virus auxiliar.

Los RIÑAs satélitesprobablementese encapsidancon las partículas que

contienenel RNA 2 o el RNA 3 y también,enpartículasqueno contienenningún

RNA de CMV en un númerovariablede copias(Lot y Kaper, 1976).La cubiertadel

CMV permiteal RNA satélitesertransmitidopor los áfidos quetransmitenal virus

(Mossopy Francki,1977).

3.6. CMV en España.

El CMV se ha encontradoampliamentedistribuido en Españasobremuy

diferentescultivos hortícolas:

- Bos y Maat (1974) identifican un aisladode CMV transmisiblepor semilla en

judías(Phaseolusvulgaris) procedentesde Valencia.

- Peña-Iglesiaset al (1979)describenCMV en platanerasprocedentesde Tenerife,

pertenecienteal subgrupoToESy portadordeun RNAsatélite.

- García-Luqueet al (1983)encuentranaproximadamenteun 30% de cultivos conCMV en una prospecciónrealizadaen diferentesregionesespañolasdurantetres

años(1979-1982),todasellas pertenecientesal subgrupoDTL. Solamenteen dos

muestrasde melón con síntomasde mosaicoy enanismoprocedentesde Valencia

encuentranun satélitetras pasesseriadosen diferentesplantashuésped(García-

Luqueet al, 1984).

- Luis-Arteagaet al (1988)describenunaepidemiade CMV en borrajaenHuescay

Zaragoza,con síntomasde enanismo,reducciónde la hojay mosaico.Estascepas

pertenecíanal subgrupoDTL, y no conteníansatélite. Luis-Arteaga (1989),

estudiandolas virosis queafectana los pimientosenEspaña,encuentraque CMV

esel virus másfrecuenteen Badajoz,Logroño y Zaragoza,y el segundodespuésde

PVY en Murcia y Valencia.Ademásconsigueclasificaruna cepade Murcia como

ToRS,y dos deValenciay BadajozcomoDTL.

22

- Murant et al (1990)realizanuna prospecciónen cultivos hortícolasde la región

valencianay Badajoz,encontrandoaproximadamenteun 50% de plantasinfectadas

por CMV, de las queel 85% son ToRS,y el 33% portadorasdeRNA satélite,aunque

ésteno sedetectóenningunamuestrade Badajoz.Esteno seencuentraenplantas

de pimiento, calabaza,o malashierbas,y si en pepino,melón, sandía, tabaco,

tomatey lechuga.Algunasplantasasintomáticasestabaninfectadascon CMV y

RNA satélite.

- CMV seha encontradoampliamentedistribuido en diferentescultivos hortícolas

deAlmería (Sáez,1991).

- Todas los aisladosdel virus presentesen las muestrasde tomate del áreadel

Mediterráneoanalizadaspor Jardáet al (1992) pertenecíanal subgrupo1 de

hibridación(equivalenteal serogrupoDTL).

La necrosisde tomate fue observadapor primera vez en Españaen la

maresmacatalana(Peña-Iglesiaset al, 1978),en 1986,enel nortede Valencia,y en

1990 afectandoa la mayoría de las zonas de cultivo de tomate del área del

Mediterráneo(Jordáet al, 1992). Se ha encontradotambién en las islas canarias,

pero no en Extremadurao La Rioja, zonasimportantesde cultivo de tomatepara

industria (Murant et al, 1990; Jordáet al, 1992). A diferencia de los casosde

necrosisen tomateencontradosen Francia(Putz et al, 1974) o Italia (Gallitelli,

1988), en la epidemiaespañolasehan encontradotres tipos principalesde RNA

satélite:unosque inducennecrosis,otros queinducenotro síndromede enanismoy

abarquilladode las hojas (muy frecuenteen Valenciadesde1989), y otros que no

modifican los síntomasinducidos por el virus auxiliar. Jordáet al (1992), al

contrarioqueMurant et al (1990),no encuentranRNAs satélitesatenuantes.

4. DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADESPRODUCIDASPOR LOS VIRUS YPATOGENOSSUBVIRALES QUE AFECTAN A LAS PLANTAS.

Las técnicasde detecciónenplantasde virus y patógenossubviralessonmuy

importantesen la patologíavegetalpormuchosmotivos(Chu et al, 1989 b; Hulí y

Al-Hakim, 1988): en estudiosepidemiológicos,parala evaluaciónde resistenciaen

plantas en programasde mejora, para comprobarel estadosanitario de las

semillas y material vegetal en estacionesde cuarentenay certificación, para la

identificacióny diagnósticode nuevospatógenos,etc.

23

Tradicionalmente,el diagnósticode las enfermedadesde plantas se ha

llevado a cabopor el reconocimientode síntomascaracterísticospresentadospor las

plantas enfermas y spbre determinadasplantas huésped tras inoculación

mecánica,injerto o a travésde vectoresdel patógeno.Aunqueno sonmétodosmuy

precisos,hoy en día se siguen utilizando por dar una información importante

(sobretodo enfrutales)e incluso crucial en algunos casos,como en el estudiode

patotipos(Hamiltonetal, 1981;Matthews,1991).

La visualización al microscopio electrónico de partículas virales y/o

estructurasligadasa la patogénesis(Horne,1967), aunqueno seutiliza de forma

rutinaria,es indispensablepara los estudiosestructurales,especialmentecon la

ayudade la inmunoelectromicroscopía(Milne, 1984).

Entrelos métodosmásutilizadosestánlos quedetectanlas proteínasvirales

(técnicasserológicas)y los que-detectanlos ácidos nucleicos virales (análisis de

FiNAs bicatenarios,hibridación con sondasde cDNA o cRNA, y recientementela

técnicade la reacciónen cadenade la polimerasao PCR)

4.1. Técnicasserológicas.

Los primerostestsserológicossebasaronen la observacióndel precipitado

formado cuandolos anticuerpos(preparadosen animalesa los queseinyectabael

virus purificado) seunían en condicionesfavorablesa los antígenosvirales,bien en

medio liquido, bien en geles de agar, formando un agregadoque al hacerse

suficientementegrande, precipita. El ELISA (enzyme-linkedimmunosorbent

assay)es actualmenteel métodomás utilizado para la deteccióne identificación

rutinaria de virus vegetalesen diferentes huéspedes,por ser fiable, rápido,

sensible,y fácilmenteaplicablea gran númerode muestras(Clark y Bar-Joseph,

1984;Torrancey Janes,1981).

Hay muchostipos de ELISA, pero los tres más utilizados son: ELISA-DAS

(daubleantibodysandwich)(Clark y Adama,1977),ELISA indirecto(Rybicki y von

Wechmar,1981; Koenig, 1981)y ELISA indirecto TAS (triple antibodysandwich)

(Bar Josephy Malkinson, 1980; van Regenmortely Burckard, 1980; Barbaray

Clark, 1982).Lasdiferenciasentrelas trestécnicasestánresumidasen la Figura 11.

EL ELISA-DAS es muy sensible, pero necesitala preparaciónde un

conjugadoparacadavirus a testar. Los ELISAs indirectos,en cambio, no utilizan

conjugados específicos del virus, sino anticuerpos obtenidos contra las

inmunoglobulinasdel animal utilizado para la obtención de los anticuerpos

24

ELISA DAS ELISA INDIRECTO ELISA SANDWICH INDIRECTO(TRIPLE SANDWICH)

Tapizadoconelanticuerpoespecificodel virus

Antígenoviral

Anticuerpoconjugadocon unaenzima

Sustratodela enzima

Tapizadoconelantígenoviral

Anticuerpoespecíficodel virus

IgC antiespecieconjugadacon unaenzima

Sustratodela enzima

[—ji]

Tapizadoconelanticuerpoespecíficodelvirus (obtenidoene] animalA)

Antígenoviral

Anticuerpoespecíficodelvirus (obtenidoenel animalB)

lgC antiespecieBconjugadaconunaenzima

uo de la enzimaljfjSustratoou

y Anticuerpoespecíficodel virus (obtenidoenunaespecleanimalA)

• Antígenoviral

~ Anticuerpoespecíficodel virus conjugadoconun enzima

A Anticuerpoespecíficodel virus (obtenidoen unaespecieanimalB)

t lgC antiespecieA conjugadaconun enzima

4E IgC antiespecieB conjugadaconunaenzima

U Sustrato

1.IoZ~I

LrJ

Fig 11. LastrestécnicasELISA masutilizadasenVirología Vegetal.

especificasdel virus, o bien la proteínaA de Staphylococcus<zureas, queposeegran

afinidad por la porciónFc de las IgGs de muchasespeciesanimales.Además,al no

estarconjugadocon unamoléculade enzima,el anticuerpoencuentrafacilitada su

unión al antígeno.El ELISA-TAS presentala desventajade que necesitade dos

anticuerposantivirales obtenidosen animalesdiferentes, y de que el método

requiereun pasoadicional.

Aunquelos anticuerpospoliclonalestodavíase utilizan frecuentemente,la-

utilización de los anticuerposmonoclonales(Rohíer y Milstein, 1975; Halk y De

Boer, 1985)ha supuestoun granavanceenla fiabilidad, especificidady facilidad de

interpretaciónde los resultadosde las técnicasserológicas.

En la interpretaciónde resultadoscon el ensayoELISA es muy importante

determinar qué se consideracomo respuestapositiva y qué como respuesta

negativa,lo quesepuedeabordarde variasmaneras.Unasvecesse consideraun

resultadopositivo cuandoseobtieneunaabsorbanciados o tres vecesla mediade

las absorbanciasobtenidascon las muestrasnegativas,otrascuandoseobtienela

mediamás2 o 3 vecesla desviaciónestándarsi hay disponibleun númeroelevado

de referencias,o incluso otras arbitrariamentecuandopresentauna absorbancia

determinada<Tijsen, 1985). La selección de este criterio es importante para

minimizar las respuestasfalsas. Este valor puedemo-versehacia arriba o hacia

abajopara incurrir más en el error tipo 1 (falsos positivos) o tipo II (falsos

negativos),dependiendoen quéajustetieneconsecuenciasmenosgraves.

4.2. Análisis de RNAs bicatenarios.

La presenciade FiNAs bicatenarios(RNAs-bc) de alto peso molecular,

superiora io~ daltons,en las célulasvegetales,en generalpuedeatribuirsea la

infección de virus RNA, bien a aquelloscuyo genomaestáformado por RNA-bc

(reovirusy criptovirus),o biena la forma replicativa(RF) de los virus cuyo genoma

es RNA monocatenario(RNA-mc) (Dodds et al, 1984). Estos RNAs-bc se han

utilizado paradiagnósticobien por análisis en electroforesis(Dodds et al, 1984;

Dodds,1986),bien por su detecciónmedianteanticuerposque reaccionancon los

RNA-bc(Stollar, 1975;Schwartzy Stollar, 1969).

En principio, cadavirus RNA debepresentarunosRIÑAs bicatenarioscon

unostamañoscaracterísticos,pero a vecescomplica el diagnósticola presenciade

RNAs-bc en determinadasplantassanaso sin inocular, como es el casode una

variedad de Phaseolusvulgaris (Wakarchuky Hamilton, 1985) o del pimiento

(Valverdeet al, 1990).A pesarde estaslimitaciones,estatécnicaseha utilizado coh

éxito paraciertosvirus (Matthews,1991).Coifin y Coutts(1992>obtienenun clon de

cDNA de un virus difícil de purificar, el virus del pseudo-amarilleamientode la

remolacha(BPYV), un posibleclosterovirustransmitidopor moscablanca,a partir

de una extracciónde ENAs bicatenarios.La secuenciaciónde esteclon ha hecho

posibleel poderdiseñarunos cebadoresque permitenla deteccióndel virus, hasta

ahoramuy difícil, por RT-PCR.Además,el estudiode los RNAs-bc puedeayudaren

la clasificaciónde virus desconocidos.

En el casode CMV, diferentesautoreshan detectadoRIÑAs bicatenariosa

partir dediferentesplantasinfectadascon estevirus, detectándosetambiénformas

replicativasde los RIÑAs satélites(Kapery Díaz-Ruiz, 1977;Bar-Josephet al, 1983;

Gabriel, 1986; Stegeret al, 1987; Romeroet al, 1988). García-Luqueet al (1986)

obtuvieron anticuerposmonoclonales con especificidad para una variante

necrogénicade los RIÑAs satélitesde CMV, pero no se utiliza normalmenteELISA

parala deteccióndeestospatógenossubvirales.

4.3. Hibridacionessobremembrana.

La técnica(revisadaporThomas,1983; Andersony Young, 1985; Kingsbury,

1987; Hulí y Al-Hakinx, 1988; Chu et al, 1989 b; Sambrooket al, 1989)sebasaen la

unión del ácidonucleico genómicodel patógeno,previamentefijado a un soporte

sólido (normalmentenitrocelulosao nylon), con moléculascomplementariasque

recibenel nombrede sonda(ya seacUNA donadoo no, oligonucleotidossintéticos,o

cRIÑA obtenido por transcripción in vitro). La unión de las dos moléculas

complementarias(esto es, la hibridación) se detectamarcandola sonda, que

normalmentesesintetiza in vitro utilizando dNTPsmarcadosradiactivamentecono no radiactivamenteconbiotina o digoxigenina(Donovanet al, 1987; Habili et

al, 1987;Saldanhaetal, 1987).

Estatécnicade deteccióne identificaciónfue puestaa punto por primeravez

parala deteccióndel viroide del tubérculoahusadode la patata(PSTVd) (Owensy

Diener,1981)y posteriormenteseha aplicadoa otrosvirus y viroides(Bar-Josephy

Rosner,1984; Varveri et al, 1987; Robinsony Romero, 1991),incluyendo los RNA

satélites(Jordá et al, 1992), aunquesu uso no se ha extendido mucho, debido

principalmentea sermáslaboriosaque el testELISA.

Los limites de detecciónde virus purificados por hibridación con sondas

radiactivasestánen el rangode 1-100pg, superiora ELISA, mientrasquecon tejido

infectadoELISA parecetenerun limite de detecciónmayor(Chu et al, 1989 b). Sin

27

embargo,la utilización de sondasmarcadasradiactivamenteimplica un riesgo y

necesitade instalacionesespeciales.La hibridacióncon sondasno radiactivasestá

descrita como un método menos sensible(Zwadyk y Cooksey, 1987), aunque

Kanematsuet al (1991),y Hopp et al <1991)llegan a unos nivelesde detectabilidad

muy considerablesparavirus y viroidesde patatautilizandosondasmarcadascon

biotina.

El tiempo de preparaciónde las muestrasen el casode ELISA esmenorque

en el delashibridaciones;con la técnicaELISA, y sobretodo cuandose utilizan

anticuerposmonoclonales,existenmenosinterferenciascon los componentesde la

planta, pero en cambio mientras ELISA requiere 100 ¡xl de extracto las

hibridacionesrequierensolamente1-10 pl. Otraventajade las hibridacionesesque

unasondapermitedetectarcualquierpartedel genomadel virus, mientrasque el

ELISA detectanormalmentela proteínade cubierta, que representasólo una

pequeñapartedel genoma.Además,las hibridacionespuedendetectarsatélitesy

viroides,que carecende proteínasestructurales,y por tanto en generalno pueden

seridentificadospor técnicasserológicas.

4.4. Reacciónen cadenade la polimerasa(PCR).

La reacciónen cadenade la polimerasa(PCR) esun método de síntesis itt

uitro de ácidos nucleicos,medianteel cual se puedereplicar específicamenteun

segmentodeterminadode DNA a través de dos oligonucleotidoscebadoresque

flanqueanestefragmento,y ciclos sucesivosde desnaturalizacióntérmicadel DNA,

anillado de los cebadoresa las secuenciascomplementariasy extensiónde los

cebadoresanillados medianteuna DNA polimerasatermoestable.Dado que los

productosde extensiónsona su vezcomplementariosa los cebadores,en cadaciclo

seduplica la cantidadde DNA sintetizadaen el ciclo anterior, de forma que hay

unaamplificaciónexponencialdel fragmento(Innis et al, 1990).El primer gen amplificadopor PCRfue el de la B-globina humana(Saiki et

al, 1985),y desdeentoncesestatécnicase ha utilizado ampliamenteen Biología

Molecular.La tecnologíade la PCRya ha sido aplicadaal estudioy la detecciónde

virus DNA de plantas(Rybicki y Hughes,1990; Pasamonteset al, 1991; Soler et al.

1991). Sin embargo,la mayoría de los virus y patógenossubviralestienen un

genomaRNA (Matthews,1991),y parasu detecciónsehanaplicadovarios métodos

que combinanla transcripcióninversay la PCR(RT-PCR)(Vunshetal, 1990;Jones

et al, 1991;Korschinecket al, 1991; Langeveldet al, 1991; Nicolasy Laliberté, 1991;

Robertsonet al, 1991). En la mayoríade estos casosse han encontradoserios

problemaspara la aplicaciónde la RT-PCR a un diagnósticorutinario de gran

númerode muestraspor un lado, en la extracciónde los ácidosnucleicosa partir

de la plantaenferma,algomáslaboriosaque enel casode ELISA y que requierela

utilización del fenol, compuestoque puedesertóxico y producirquemaduras,y por

otro lado en la deteccióne identificación de los productosamplificados,que se

realizanormalmentea travésdeuna electroforesis.

Paraevitar las extraccionesde los ácidosnucleicos,Wetzel et al (1991), y

Boija y Ponz(1992) llevaron a cabola RT-PCRdirectamentea partir de macerado

vegetal de plantas.En el caso del virus de la hepatitisA, Jansenet al (1990)

purificaron los ácidos nucleicos mediante la adsorción del virus a tubos de

polipropilenotapizadoscon anticuerposespecíficos(de forma semejanteal ELISA),

seguidode una ruptura térmicadel virión. Un ensayosemejantesé ha descrito

recientementeparala detecciónde un virus de plantas,el virus de la Sharka(PPV)

(Wetzelet al, 1992). En ambos casosselleva a caboun tratamientotérmico para

desensamblarel virión, previo a la transcripcióninversa.

La alta sensibilidad(normalmentevarios órdenesde magnitudmayoresque

la técnica ELISA) de esta técnica le da un gran potencial sobre todo en el

diagnósticade patógenosque se presentanen bajasconcentraciones,como puede

seren la certificaciónde semillas,detecciónde virus y viroides en plantasleñosas,

virus limitados al floema que seencuentranen bajo titulo en las plantas,etc. (Chu

et al, 1989b).

5. CONTROLDE LOS VIRUS.

Dado que todavíano se disponede métodosdirectosde control tales como

“viricidas”, los esfuerzossuelenir encaminadosa reducir las fuentesde infección

dentroo fueradel cultivo, limitar la dispersiónde los vectoresy minimizar el efecto

de la infecciónen la producción.En general,estasmedidasno ofrecenuna solución

permanenteal problemaproducidopor un virus en unaareadeterminada,salvo en

el caso de encontraruna fuente de resistenciaa un virus en particular en

cultivares agronómicamenteimportantes,y aun así, la protecciónpuedeno ser

permanentesi aparecennuevascepasdel virus capacesde infectarel cultivar antes

resistente(Matthews,1991).

5.1. Plantaslibres devirus.

Los intentosde eliminar los reservoriosnaturalesde un virus en un area

determinadatendránéxito si la gamade huéspedesesrestringida,peroparavirus

como CMV o el bronceadodel tomate(TSWV) con una ampliagamade huéspedes

puedeserprácticamenteimposible.Reservoriosnaturalesde los virus puedenser:

las malashierbasperennes,o aquellasanualesen lasque el virus se transmitepor

semilla; plantas ornamentalesperennesque a menudo son portadoras de

infecciones suaves;las semillas portadorasde virus; infecciones crónicas en

plantaspropagadasvegetativamente,etc.(Matthews,1991).

Es de gran importancia la certificación de semillas para garantizarla

ausenciadevirus o un porcentajede infecciónmuybajo. ¡Cimble et al (1975)indican

que incluso con un 0,1% de transmisiónpor semilla del potyvirus mosaicode la

lechuga(LMV) no seobtieneun buencontrol de la enfermedad,recomendandoun

porcentaje<0,003%.Janesy Proudiove(1991)en el casode CMV transmisiblepor

semillaenel altramuz(Lupinas angustifohus),de gran importanciaen Australia

como planta forrajera, recomiendanno sembrarsemilla con más de 0,5% de

infección,y observanque cuandola semillasesiembraa 8 y 11 cm de profundidad,

envez de los 5 cm normales,disminuye la incidenciade plantasinfectadasen un

15%y 50%,respectivamente.

Se puedenobtenerplantaslibresde virus mediantetermoterapia.CMV ha

sido eliminado de varias plantaspor esteprocedimiento(Nylan y Goheen,1969;

Walkey y Freeman,1977).

5.2. Plantasresistentesa virus.

Una de las mejoresformasde lucharcontralos virus esla introducciónde

genesde resistenciaen cultivaresde importanciaagronómica.Ponz y Bruening

(1986),Everetty Harnett(1987),Fraser(1986,1987, 1990),Frasery Gerwitz (1991)

han realizadorevisionessobrela resistenciade lasplantasa lasvirosis.

A pesarde estarmuy extendidala utilización de cultivaresresistentes,no se

conocebien aún la basemolecularde la resistencia.El casomás reveladorhasta

ahora fue el estudiadopor Ponz et al (1988), que encontraronque un gen de

resistenciapresenteen Vigna unguiculata cv. Arlington frenteal virus del mosaico

de la carilla (CPMV) codifica para un inhibidor de la proteasaviral encargadadel

procesamientode la poliproteinadel virus enproteínasindividuales.

33

5.2.1. Protecciónpor RNAs satélites.

Como se ha explicadoanteriormente,en el caso del CMV la reducción o

ausenciade síntomasviralespuedeestarasociadacon la presenciade un pequeño

RNA extragenómico(RNA satélite)enel inóculo viral (Mossopy Francki,1979).Por

ej, en China, plantasde pimiento inoculadascon una cepade CMV que contenía

RNA satéliteprodujeronunosrendimientossignificativamentemayoresque los de

plantas adyacentesno inoculadas,que sufrieron infección natural por CMV

(Baulcombe,1989). Tambiénsehan llevado a cabocon éxito ensayosde campocon

plantasde tomateen Italia (Gallitelli et al, 1991).Francki (1985a y b) y Tien et al

(1987)realizaronunarevisióndel control de las enfermedadesproducidaspor CMV

utilizandoel RNA satéliteasociadoa estevirus.

5.2.2. Proteccióncruzada.

En esteprocedimientolas plantasseinoculancon unacepasuavedel virus,

lo cualprotegea la plantahuéspedcontrala infecciónporcepasmás virulentas.En

todos los casosenqueseha demostrado,parecequela presenciade la proteínade la

cubiertade la cepasuavedel virus en la plantainmunizadaimpide la expresióndel

gen de la proteína de cubierta de la cepa más virulenta, evítándoseasí la

acumulaciónde virus y expresiónde los síntomas(Palukaitis y Zaitlin, 1984;

Fulton, 1986;Bryant, 1988).

Dodds(1982),medianteproteccióncruzadacon doscepasde CMV entomate,

observaque hay una inhibición de la acumulaciónsistémicade virus, ademásde

ausenciade síntomas,aunqueel virus seacumulaen lashojasinoculadas.En este

casola proteccióncruzadano es dependientedel huésped,no seproducecontraun

virus no relacionadocomo el del mosaicodel tabaco(TMV) y se detectaprotección

tanto en las hojas inoculadascon la segundacepa como en las hojas formadas

posteriormente(Doddset al, 1985).

5.2.3. Plantastransgénicas.

A fin de imitar el fenómenode la proteccióncruzada se ha intentado

transformarplantascon secuenciasvirales. El gen de la proteínade cubiertade

TMV fue e] primeroen serexpresadoen tabacotransgénicopor Bevanet al (1985).

Powell Abel et al (1986)tambiéntransformarontabacocon el gen de la proteínade

cubiertade TMV y encontraronque las plantasdesarrollabanmenos síntomas

31

frente a la infección por TMV. Posteriormentese han realizadoexperimentos

semejantescon el virus del mosaicode la alfalfa (AMV) (Tumeret al, 1987; Loesch-

Fileset al, 1987; Van Dun et al, 1987) y otros muchosvirus. La resistenciaa virus

enplantastrasgénicashasido revisadaporBaulcombe(1989)y Beachyetal (1990).

En el casode CMV, sehaobservadoque haytrestiposdiferentesdegenesque

confierentoleranciaa los virus en plantas:unosque codifican parala proteínade la

cubiertaviral, queson los quehastaahorahandesarrolladouna mayor resistencia

a virus (Cuozzoet al, 1988; Slightom et al, 1990; Quemadaet al, 1991),otros que

codifican para RNA contrasentido(gen de la proteína de cubierta de sentido

negativo),en cuyo casolas plantasse protegensólo a concentracionesde inóculo

bajas(Cuozzoet al, 1988), y otros que correspondena diferentesformasdel RNA

satélite(Baulcombeet al, 1986; Harrisonet al, 1987;Jacquemondetal, 1988).

5.2.4. Genesderesistencianaturales

Las plantasposeenun sistemade defensamuy eficientecontrala mayoríade

los agresores,la denominadaresistenciano huésped(Heath,1981). Sólo unospocos

agentesbióticos soncapacesde inhibir las defensasde una especieen particular.

Sin embargo,CMV esun patógenomuy comúny efectivo,capazde infectarmuchas

especiessilvestresy cultivadasy sonmuy escasaso inexistenteslas resistencias

mayores en especiescultivadas de gran importancia económicacomo melón,

calabacín,tomateo pimiento(Pochardy Daubéze,1989).

Se ha encontradouna resistenciaparcial a CMV en el pepino cv. China

(Kyoto), cuyosprotaplastosaisladostambiénsonresistentes.Estaresistenciaestá

bajo el control de tres genesque son de naturalezarecesivay afectan a la

replicación viral (Maule et al, 1980). Otra de las resistenciasa CMV mejor

estudiadasfue la descubiertapor Walkey y Pínk (1984)en calabacíncv Cinderella,

dondeel virus escapazde replicarseen las hojas inoculadas,pero no da lugar a

una infección sistémica.Esta resistenciaes heredablebajo un control genéticorelativamentecomplejo,y resultamás efectivaa altasintensidadesde luz y a altas

temperaturas(Pink y Walkey, 1985; Pink, 1987>. También se ha descritouna

resistenciaa CMV enmelón “P1-161-375’ (Risseret al, 1977),queconsisteen una

resistenciaal vectorAphisgossypii (Lecoqet al, 1979). Asimismo,sehanobservado

resistenciasa CMV, de las que sesabepocoen general,en Vigna unguiculata,que

presentauna reacciónde hipersensibilidadal virus (deZeeuwy Crum, 1963), en

lechuga(Provvidenti et al, 1980), y espinaca,todas ellas controladaspor genes

únicos (Poundy Cheo,1952; Sinclair y Walker, 1955; Provvidentiet al, 1980).Otras

resistenciasen Phaseo¿usaureus y Phaseolus limensis se sabe que están

determinadaspor un gen único dominante y por dos genes dominantes

complementarios,respectivamente(Edwardsony Christie, 1991>.

5.2.5. Resistenciaa CMV enpimiento.

El pimiento (Capsicum spp.) es una planta semileñosadioica (2n=24),

parcialmenteautoalógamay cuyo fruto constituye un alimento frecuente en

nuestra dieta. Pertenecientea la familia de las Solanáceas,proviene de

sudamérica,de la regióndel sur de Perúy Bolivia y todavíapuedeencontrarseC.

annuum creciendosilvestre desdeel sur de EstadosUnidos hastael centro de

Argentina.Estegénerofue introducidoenEuropaa travésde los españolesen 1493

(Villalón, 1981).

Se conocenalrededorde 18 diferentesespeciesde pimiento,de lascuales5 se

han domesticado,y dentrode éstashay una enormevariedaden tamaño,forma,

color, aromay sabordel fruto (Villalón, 1981>.La especiedepimientocultivadamás

importanteen el hemisferionortees O. annuum.Otra especiecultivadaen EEUU,

Méjico y centroaméricaesO. frutescens,a la queperteneceel tabasco.

El pimiento, como la mayoría de las plantashortícolas,es susceptibleal

ataque de numerosasenfermedades,entre las que destacan los hongos(principalmenteFusariumy VerticiUium) y los virus. A nivel mundial seconocen

alrededorde 30 virus que afectanal pimiento, a los que hay que añadir otras

enfermedadesde supuestao probadaetiologíaviral en lasque el virus implicado no

estácompletamentecaracterizadoe identificado (Villalón, 1981; Conti y Marte,

1983). Por otro lado, los mayoresdañosson producidospor un número de virus

relativamentebajo: CMV, el virus Y de la patata(PVY), el virus del mosaicodel

tabaco(TMV), el virus del rabadadel tabaco(TEV), el virus de las manchasen

anillo del tabaco(TRSV), y últimamenteel virus del bronceadodel tomate(TSWV).

El pimientoes uno de los cultivos hortícolasmás importantesen España,

dondesu importanciaquedareflejadapor las 23.900Ha. de superficiededicadaal

mismoduranteel año1990, de las que un 25% correspondena cultivo protegido(de

Miguel, 1991). En general,CMV y PVY, que se transmitenambospor áñdosde

forma no persistente,son los másprevalentesy los queproducendañoseconómicos

másimportantes(Luis-Arteaga,1989), a los que seañadedesde1988 el TSWV, que

constituyeactualmenteel principal problemadel cultivo del pimiento al aire libre.

En invernaderodestacanel virus del moteadosuavedel pimiento(PMMV), el virus

del mosaicodel tomate(ToMV) y PVY (Soto y Ponz, 1991; García-Arenal,1992; Gil -

33

Ortegay Luis-Arteaga,1992). Entrelos diversossíntomasque produceCMV en

pimiento destacanla reducciónen el crecimiento,mosaico,filimorfismo y aspecto

mate en las hojas, manchasnecróticaso en forma de anillo en los frutos, y

reduccióndel cuajadoy <Ial tamañode los frutos(Luis-Arteaga,1989)

Hastaahorano sehan conseguidoplantasde pimientotransgénicas,ya que

Capsicum annuum es una especiemuy difícil de regenerarin vitro. Sólo se ha

conseguidoregenerara partir de diferentesexplantoscomo hipocótilo y cotiledón

(Fari y Czako, 1981;Phillips y Hubstenberger,1985; Arroyo y Revilla, 1991),y a

partir decallo solamenteenel casodeutilizar protoplastos(Saxenaet al, 1981; Díaz

et al, 1988>.Tambiénseha observadoqueO. annuumpuedesersusceptiblea cepas

silvestresde Agrobacterium(Liu et al, 1990), lo que hacepensarque seráposible

una transformacióngenéticadel pimientoen el futuro.

La Mejora Genéticapara Resistencia(introducir genes de resistenciao

inmunidada patógenosen cultivaresde importanciaeconómica)esla soluciónmás

factible actualmentepara controlar las enfermedadesde virus en pimiento. Sin

embargo,hastaahorano se conoceningún mecanismode resistenciaeficiente a

CMV en las especiesde Capsicumy especialmenteen C. annuum. Hay descritas

algunasresistenciasparciales,porej. Pochardy Daubéze(1989)describenal menos

cinco componentesde resistenciaparcial a CMV en varias especiesdel género

Capsicum:

- Resistenciaa instalacióndel virus. Lecoqet al (1982) encontrarontres fuentesde

estaresistencia:en uno de los casos,en C. annuumvar. minimum “Rama”, existe

un gen dominantemayor (Pochard, 1982), pero en los otros das la herenciaes

poligénicay recesiva.

- Resistenciaa la migracióndel virus en la planta.Fue descubiertaen C. baccatum

(“Pendulum3-4”> y O. annuum “Milord” y “Vania”, en las que el virus queda

restringido a las hojas inoculadas.(Pochardy Chambonnet,1971; Pochard,1977;

Nono-Womdimet al, 1992). Parecequela resistenciaresultade unainhibición enla

translocacióndel virus haciao desdeel sistemavascular,impidiendo el transporte

del virus a largasdistancias(Dufour et al, 1989). Estaresistenciapoligénicaseha

mejorado a través de una selección recurrente,se ha introducido en nuevas

variedadesde pimiento(Pochardy Daubéze,1989)y ha sido efectivaen campo,aun

encasode fuertesinfestaciones(Marchouxet al, 1986;Nono-Womdimet al, 1992>.

- Resistenciaa multiplicación.viral. Presenteen la línea “Perennial” (Singh y

Thakur,1977),suherenciaespoligénica(Pochard,1985).

- Algunoscultivaresbrasileñospresentanuna resistenciaparciala la transmisión

del CMV poráfidos (Cohen,1982).

34

- Más recientementeseha descubiertoun quinto tipo de resistenciaen una línea

procedentede China: una tendenciaa recuperarsetras una infección sistémica,

probablementeasociadaa un bajo nivel de multiplicación viral en las hojasjóvenes

(Pochardy Daubéze,1989).

Villalón tambiénha encontradociertaresistenciaa CMV en C. annuum,C.

chinense,C. frutescens,y algunospimientos silvestresy primitivos de Texas y

Méjico, y los ha introducido en programasde Mejora. Webb y Smith (1969)

encuentranresistenciaa infección sistémicaen C. frutescens.Barrios et al (1971)

tambiénencuentranuna resistenciaen C. frutescens,al parecerproducidapor un

genrecesivo.

En España,Gil-Ortega y Luis-Arteaga (1982, 1988> han estudiadoel

comportamientoen la inoculación artificial con cepasespañolasdel CMV de

variedadesde pimiento autóctonasy extranjerascon cierta resistenciaal virus, y

concluyenque la variedad“Perennial’ es la que presentamayor toleranciade todas

las estudiadas.

85

VOS

36

II. OBJETiVOS

El laboratoriode Virología Vegetaldel Departamentode ProtecciónVegetal

del CIT-INIA tradicionalmente ha dedicado un considerable esfuerzo al

diagnósticode virus vegetalescon importanciaeconómicaen España,tratandode

desarrollartécnicasespecificas,rápidasy sensibles,siendouna de sus finalidades

la transferenciade estatecnologíaa los laboratoriosde SanidadVegetaly Servicios

de Protecciónde los Vegetalesde las diferentesComunidadesAutónomas.Otra

línea de investigaciónllevadaa caboen nuestro laboratorioestudialas relaciones

huésped-parásito,entrelas queseencuentranlas resistenciasa virosis presentes

en algunoscultivos.

Dentro de estemarcode trabajo,los objetivos concretosde la presentetesis

han sido:

- Estudio y comparaciónde diferentesmétodosde diagnósticorutinario

aplicablesa un número elevado de muestraspara un virus ampliamente

distribuido enEspañae inductorde importantesenfermedadescomo esel virus del

mosaicodel pepino (CMV). Estos métodosson tanto aquellosque detectanlas

proteínasvirales(ELISA) como aquellosque detectanlos ácidosnucleicosvirales

(análisiselectroforéticode RNAs bicatenarios,hibridacionessobremembranascon

clones de cUNA y amplificación enzimáticaprevia transcripción inversa de

fragmentosdel genomaviral).

- Desarrollode técnicasde detecciónmedianteamplificación enzimáticade

partedel genomadel patógeno(PCR), caracterizadapor su alta sensibilidad,y

hastaahorade unaaplicabilidadlimitada, para su utilización en un diagnóstico

rutinario, aplicablesa virus morfológicamentemuy diferentesy a patógenos

subviralescomosatélitesy viroides.

- Aplicación de algunas de estas técnicásde detección a un estudio

epidemiológico para la determinaciónde la presenciadel CMV en campo, e

identificacióndel subgrupoal que pertenecen.

~37

- Búsquedaderesistenciaa CMV en diferenteslineasdeun germoplasmade

pimientoprocedentesde la zonaoriginaria de estecultivo, Centroy Sudamérica,y

recogidoen su mayoríacreciendode forma silvestre,lo cual constituyeun material

genéticamentemuy variab]e,e idóneoparabuscarresistencias.

38

IY2IkTEIRIkLES y TOIDDS

III. MATERIALES Y METODOS

1. MATERIALES

1.1. Patógenos.

Se utilizaron los siguientespatógenosinfectandolas siguientesplantas: un

aisladode CMV procedentede unaplataneracanaria<Peña-Iglesiaset al, 1979)y

un segundoaisladodenominadoFny (Owen y Palukaitis, 1988> se mantuvieron

infectandoplantasde Nicotiana tabacum L. cv Xanthi nc, N. glutinosa L., y

pimiento (CapsicumannuumL.) “Yola Wonder”; el cucumovirusde la aspermia

del tomate(TAV) se inoculó en N. tabacum cv Xanthi nc; el potyvirus mosaico

amarillo de la judía (BYMV) (Castroet al, 1992)seinoculó enhojasde haba (Vicia

faba L.); el nepovirusentrenudocorto infecciosode la vid (GFLV) infectandovid

(Vitis vinifera L.) (Fresno,1992); el luteovirus enrolladode la patata(PLRV) en

patatas(Solanum tuberosumL.>; el tospovirus bronceadodel tomate (TSWV>

infectandopimiento; el viroide PSTVd en plantasde crisantemo(Chrysanthemum

morifolium 11am). Todasestasplantasse conservaronen invernadero. Hojas de

naranjo(Citrus sinensisOsbeck)infectadascon el closterovirusde la tristezade los

cítricas(CTV) semantuvierona 40C. Hojasde Nicotiana benthamianaL. infectadas

con el tobamovirusmoteadosuave del pimiento <PMMV) (Alonso et al, 1991) y

varetasdenogal(Juglansregia L.) infectadascon el nepovirusenrolladodel cerezo

(CLRV) (Borja, 1991)semantuvieroncongeladasa -200C.

1.2. Anticuerpos.

Para la detección de CMV se utilizaron: a) anticuerpos policlonales

polivalentesde la casaSanofi (Francia)que detectanlos serotiposDTL, ToES y Co,

b) anticuerpospoliclonalesde Agdia Inc. (USA) que detectanCMV-cr, y c) un kit

compuestopor tres anticuerposmonoclonalesde Sanofi: polivalentes,específicos

del subgrupoToRS y específicosdel subgrupoDTL.

Parael resto de los patógenosse utilizaron: anticuerpospoliclonalespara

GFLV, PLRV y CLRV de Bioreba,Boehringery donadopor el Dr. Rowhani (U.Davis, California, EEUU), respectivamente;anticuerposmonoclonalesde Ingenasa

y Agdia en el casode CTV y BYMV (anti-PTY) respectivamente;anticuerpos

40

policlonalesde suerosbrutossin purificar cedidospor el Dr. Gonsalves(U. Cornelí,

NY, EEUU) y la Dra. Serra(CSIC, Madrid> en el caso de TSWV y PMMV,

respectivamente;liquido ascíticoconteniendoanticuerposmonoclonalesespecíficos

deRNAs-bcfue donadopore] Dr. Pawel] (U. Florida, FA, EEUU).

1.3. Solucionesy tampones

- PBS:fosfato20 mMpH 7,4, NaCí150 mM, KCI 3 mM, NaN33 mM.

- PBS-Tween:PBSconteniendoTween-20al 0,05%.

- TAMPON DE EXTRACCION DE MUESTRAS INFECTADAS CON CMV: citrato0,5 M pH 6,5 conteniendoTriton X-100 al 0,1%y ácidomercaptoacéticoal 0,1%.

- TAMPON DE EXTRACCION GENERAL: Tris-HCl 0,5 M pH 8,2, PVP-40 al 2%,PEG-6000al 1%,NaCí 140 mM, Tween-20al 0,05%,azidasódica3 mM.

- TAMPON SUSTRATO PARA FOSFATASA ALCALINA: dietanolaminapH 9,8, conteniendoazidasódica3 mM.

al 9,7%

- STE:NaCí 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0.

- TAE: Ths-acetato40 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0.

- TBE: Tris-borato89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0.

- TAMPON DE LISIS: glucosa5OmM, Tris-HOl 25mM pH 8,0, EDTA lOmM, 4mg/ml lisozima.

- TE: Tris-ROl 10 mM pH8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0.

- SSC20 X: NaCí 3 M, citratosódico0,3 M, pH 7,0.

- TNE :Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, NaCI100 mM, pH 7,4.

- Soluciónde Denhardt50 X: Ficolí 400al 1%, PVP-40al 1%,seroalbúminabovinaal1%(p/v).

41

1.4. Medios de cultivo.

- Medio LB (Luria-Bertani> liquido tamponado:Bacto-triptonaal 1%, extractode

levaduraal 0,5%.NaCí al 1%, pH 7,5.

1.5. Estirpesbacterianas.

Los genotiposde las estirpesbacterianasutilizadasson:

- Escherichiacoli NM522: recAe(supE,thi, Mlac-proAB),hsd5,[F, proAB, lacIQ,

IacZAM1S]

- Escherichi.acoli XL1-blue: rect (recAí, lar, endAl,gyrA96, thi, hsdRl7,supE4.4,

retAl, [F,proAB, tacIQ, lacZAMlS, TulO].

1.6. Productos.

- Endonucleasasde restricción: se emplearonendonucleasasde restricción de

BoehringerMannheimy Amersham,utilizadasgeneralmentecon los tamponesy

condicionessugeridosen los catálogosde los proveedores.

- Otras enzimas:DNA polimerasatermoestable(Pyrostasa)de Boehringer, M-

MLV-RT (transcriptasainversadel MMLV) de GibcoBRL.

- Material radiactivo: a—32P-dCTPde Amersham.

- Productosquímicos:en generalse utilizaron reactivos procedentesde Merck,

Sigma,Panreac,Pharmacia,Prolaboy Carlo Erba.

- Otros: kit “Multiprime labelling system” (Amersham>,kit ‘DNA labeling and

detection nonradioactive” (Boeliringer), liquido de centelleo (Ready Value~,

Beckman), inhibidor de ribonucleasas(HPRI, Amersham), placas ELISA de

poliestireno(Nunc),marcadorde pesosmoleculares1 Kb ladder(Gibco BRL). El

marcadorDNA del fago lambda cortado con la enzima de restricción PstI fue

preparadoen el laboratoriopor los métodosestándarde Sambrooket al (1989>. Los

cebadoresfueron sintetizadosmedianteencargopor Biosynthesis5. L.

1.7. Equipo

- UltracentrifugaBeckmanL8-55M y BeckmanTL-100.

- EspectrofotómetroZeissPMQ3.

- EspectrofotómetroparaplacasTitertekMultiskan PlusMK II.

- Contadordecentelleo(BeckmanLS 1801).

42

- Horno con movimiento rotatorio (Hybaid mini hybridisationoven>.

- Termocicladorde tubos: Intelligent HeatingBlock IHB 2024 (Cambio> y Perkin

Elmer CetusgeneampPCRsystem9600. Termocicladorde placas:TechnePHC-3,

con un adaptadorparaplacas.

- FluorímetroTKO 100(Hoefer)

2. INOCULACION MECáNICA DE LOS VIRUS

Hojas de muestrasinfectadasse trituraronen un morteroen presenciade

tampónfosfato 0,01 M pH 7,0. Las plantasa inocular sepulverizaronpreviamente

con el abrasivocarborundo600 mesh,capazde originar microheridasque facilitan

la entradadel virus al interior de la célula vegetal.A continuaciónel macerado

vegetalse frotó sobrelas hojas y las plantas se conservaronen condicionesde

invernaderoo en cámarasde cultivo.

3. TECNICAS INMUNOENZIMATICAS

3.1. La técnicaELISA.

Con los antisuerospoliclonales de CMV (Sanofi, Agdia) se realizaron

ensayosELISA-DAS en placasde poliestireno,queserealizanbásicamentesegún

Clark y Adams(1977)sólo quelos volúmenesutilizadosfueron 0,1 ml. Se utilizaron

las diluciones sugeridaspor las casas comercialespara los anticuerpos y

conjugados.El tampónde extracciónde lasmuestrasen la proporción1./lO (p/v) fue

citrato0,5 M pH 6,5 conteniendoTriton X-100 0,1% y ácidomercaptoacético0,1%.

Las muestrasse procesaronen mortero, o en el caso de las hojas, en bolsa de

plásticocon la ayudade un tubo de vidrio. En los ensayoscon los anticuerposde

Sanofi, conjugados con fosfatasa alcalina, el sustrato utilizado fue p-

nitrofenilfosfato y las lecturas espectrofotométricasse realizaron a 405 nm,

mientrasque con los anticuerposde Agdia, conjugadoscon peroxidasa,el sustrato

utilizado fue o-fenilendiaminay las lecturasse hicieron a 490 nm. Las placasse

dejaron a temperatura ambiente en oscuridad, y se realizaron lecturas

espectrofotométricasa distintostiempos.

43

Parala identificaciónde los subgruposde CMV se utilizaron anticuerpos

monoclonalesespecíficos(Sanofi) en ensayosde ELISA-TAS realizadossegúnlas

instruccionesde la casacomercial.

3.2. Estandarizaciónde la técnicaELISA.

Con el objeto de determinarel tiempo idóneo para realizar las lecturas

espectrofotométricas,que es aquél que presentamayor diferencia entre la

absorbanciade la muestrainfectaday la de la sana(Sánchez-Vizcafnoy Cambra,

1981), se hizo un análisisde las absorbanciasobtenidasa distintos tiempos con

variasmuestrasen distintoshuéspedestanto paralos anticuerpospoliclonalesde

Sanofl como paralos deAgdia.

Paraestandarizarel ensayode detecciónde subgrupoal que perteneceel

viras se siguió el procedimientode Kearney et al (1990) realizandoun ensayo

ELISA-TAS con anticuerposde los dossubgruposutilizando muestrasde serogrupo

conocidomantenidasen invernadero(CMV de la plataneracanaria,perteneciente

al grupoToRS, y CMV-Fny pertenecienteal DTL), enel quesegenerandasvalores

deA405 que representadosen un gráfico danlugar a dos zonaslimitadas por dos

rectas,queenglobana los dossubgrupos.

Otro factor a estandarizarfue el de los tamponesutilizados en la

homogeneizaciónde las muestras.Se estudiaronvarios tampones:el recomendado

por la casacomercialde Sanofi y los utilizados por otros autores(Clark y Bar -

Joseph,1984; Fresno,1992) a fin de elegir el que diera mejor resoluciónentrela

plantasanay la plantaenferma.

4. PURIFICACIONDE CMV Y DE LOS FiNAS VIRALES

4.1. Purificacióndel virus

Parala purificacióndel virus seutilizaron hojasde N. tabacum cv Xanthi

inoculadascon un aisladode CMV, y sesiguió el protocolodescritopor Lot et al

<1972)queutiliza como tampóndeextraccióncitrato0,5 M pH 6,5 conteniendoácido

mercaptoacético0,1%, y clarifica con cloroformo. El virus se concentra por

precipitacióncon polietilenglicol, seguidode dosciclos de centrifugacionesa bajay

altavelocidad,y una centrifugaciónen gradientede sacarosa5-30%. El virus se

44

cuantificópor lecturaespectrofotométricaconsiderandoque ( IOmrn > a 260 nm: 5,A280/A28o=1,7(Franckiet al, 1979).

4.2. Extraccióndel RNA viral.

El virus suspendidoen tampón fosfato 20 mM pH 7,0 se fenolizó con fenol

saturadocon aguaconteniendoSDSal 0,1%. Los ácidosnucleicospresentesen la

fase acuosase precipitaron con 2,5 volúmenesde etanol absolutoa -700C en

presenciade acetatosédico 0,3 M pH 5,2. Tras centrifugar, el precipitadose

resuspendióen aguaestéril, y semantuvoa -700C hastasu utilización. El RNA se

cuantificópor lecturaespectrofotométricadonde( lOmm) a260 nm: 25.

5. ANALISIS DE RNAS BICATENARIOS

Se utilizó el método descrito por Morris y Dodds (1979) con pequeñas

modificacionescomoseha descritopreviamente(Romeroet al, 1988). Se extrajeron

los ácidosnucleicostotalesen2 m]/g (v/p) de STE 2X, 1,5 mL/g de fenolsaturadoen

agua,1,5 ml/g de cloroformo-alcoholisoamilico (24:1), 0,1 ml/g de SDS 10%, 101jJ/g

de 2-mercaptoetanoly bentonitacomo abrasivo.El conjuntose agitó en tubos de

centrífugadurante10 mm a temperaturaambientey secentrifugóa 7500g durante

20 mm. A la faseacuosasele añadióetanolhastaunaconcentraciónfinal del 15%,

y la muestrase cromatografióa travésde una columnade 3 ml de volumen de

celulosaCF 11 (Whatman>preequilibradacon STEconteniendo15%etanol.En estas

condicioneslos RNAs-bc quedanespecíficamenteretenidosen la celulosa, y

posteriormenteseeluyencon tampónSTE sin etanol.

Los RNAs-bc seprecipitaroncon etanolen presenciade 0,3 M acetatosódicoy

se analizaronpor electroforesisen geles de agarosaal 1% en tampón TAE o

poliacrilamida al 5% en tampónTBE. Los gelessetiñeron con bromurode etidia 1

~ig/ml y el DNA se visualizó en un transiluminadorde luz ultravioleta. Algunos

gelesde poliacrilamidafueron teñidosposteriormentecon nitrato de plata segúnel

métododeSammonset al (1981)descritopor Igloi (1983).

45

6. DETECCIONDE CMV PORHIBRIDACIONES SOBREMEMBRANA.

6.1. Clonesde cDNA.

Se utilizaron tres clonesparaprepararlas sondas(Figura 12):

a) 45080,obtenidode la AmericanType Culture Collection (ATCC), portadorde un

insertode cDNA de422 nt del extremo3’ del RNA 2 (residuos2479-2900)de la cepa

CMV-Q pertenecienteal grupo ToFiS y donado en el fago Ml3mp7. Para su

multiplicación seincubóEscherichiacali NM522 a 370C en medioLB y setransfectó

con esteclon. Se hizo unapreparaciónde las formasreplicativassegúnSambrook

et al (1989>, y se purificaron segúnMorelle (1988), mediante lisis alcalina del

cultivo, concentraciónde ácidos nucleicos por isopropanol y purificación por

centrifugaciónen gradientede CsCl.

El inserto se liberó por escisióncon la enzimade restricción Eco Rl, y se

purificó a partir de un gel de agarosaal 1,5%con tiras de papelde cambiade iones

DEAE Trans~BlotTM(Bio-Rad). El DNA se extrajo de éste por incubacióna 700C

durante unahora con tampón de extracción(arginina O,01M, NaCí 1MX con una

posterior fenolización y concentracióndel inserto por precipitación con etanol

absoluto.Unavezresuspendidoen TE pudo serutilizado enposterioresensayos.

b> pZU12SA, donadoporel Dr. A. Schram,de ZaadunieBiotechnology (Holanda).

Esteclon es portadorde un insertode cDNA de 659 nt del gen de la proteínade

cubiertadeun aisladode CMV-T2 y donadoenpBin 19. Unacolonia deE. coli XL1 -

blue portadoradel plésmidocon el insertosecreció en medio LB con 50 gg/ml de

kanamicina,y los plásmidosse purificaron segúnel método de Morelle (1988),

seguido de una centrifugación en CsCl. Para obtenerla sondase amplificó un

fragmentode 496 pb del insertoutilizandolos cebadoresB y D (Figura 13)segúnel

protocolode PCR(ver apartado7.2).

c) pT 105, cedidoporel Dr. B. Harrison(SCRI, Dundee,GranBretaña),portadorde

un inserto conteniendodossecuenciascompletasy otra parcial de un satélitede

CMV-I 17N enunvectordeexpresiónbasadoen el sistemaplásmidoTi (Bau.lcombe

et al, 1986). El plásmidosepurificósegúnel métododeMorelle(1988)y paraliberar

el inserto se realizó una doble digestión con las enzimasde restricciónEcoRí y

BamHI (Sambrook et al, 1989). El inserto se purificó como se ha explicado

previamenteen el apartadoa) de estasección.

46

.0ca

45080

oo

—1 extremo2 RNA

a)CLON 45080enMl3mp7, portadordeun cDNA de422 ntdelextremo 8’ (residuos2479-2900)delRNA 2 de la cepaCMV-Q.

pZU123A —4wJ.

genproteínacápsida

b) CLON pZU12SA, enpBin 19, portadordeunproteínade la cápsidade CMV-T2.

Em

pTlOS

CDNA de 659nt de la

oo

TE W 5~satéliteW 5’satélite3’

c) CLON pTlO5 enpásmidoTi portadordecDNA desatélitedeCMV.TE= 108 nt de la posición227-335de lasecuenciadel satélite.A continuaciónhaydosunidadesdél satélitecompletas(Baulcombeet al, 1986).

500 nL

‘II

EitlZ. ClonesdeCMV utilizadoscomosondasen las hibridaciones.

CACUUUCCUCC0UACJUA . OUAUAUAOAWJUOUOACUCUCUACAOAAIUACUAUAICUAUACACUCCOICU

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Ligia. CebadoresdiseñadosparadetectarCMV por RT-PCR(SecuenciasdeQuemadaet al, 1989).

62. Transferenciatipo Southernde DNA a membranas.

Los DNAs se sometierona una electroforesisen gel de agarosaal 1% en

tampónTAE y se transfirieron a membranasde nylon (Hybond Nt Amersham,

Incj mediantetransferenciaalcalina con NaOH 0,4 M durante toda la noche

(Sambrooket al, 1989). Despuésde la transferencia,lasmembranasseenjuagaron

en una solución SSO 2X y se guardaronenvueltasen plástico a 400 hastael

momentode la hibridación.

&3. “Dot-blot’ de maceradosvegetalessobre membranas.

El maceradovegetal de las muestrasse extrajo de forma análoga a los

ensayosELISA con el mismo tampón de extracción,realizando en ocasionesdilucionesseriadasde las muestras.

Membranasde nylon (HybondN~, Amersham)o nitrocelulosa(HybondC de

Amershaino Schleicher& Schuell RA-SS) cortadasal tamañoadecuadoselavaron

en primerlugar en aguadestiladaparaserposteriormentesaturadasen SSC20X

(nitrocelulosa>o 5X (nylon). De cadamuestrapreviamentedesnaturalizadaa 650C 5

mm sepipetearon10 ~l en un punto (“dot”) y sedejaronsecar.Los ácidosnucleicos

se fijaron a la membranapor tratamiento térmico (8000 2 h en el caso de

nitrocelulosa)o por tratamientoalcalino(NaOH 50 mM durante5 minutosen el

casode HybondNt), seguidode breve inmersión en SSO 2X con agitación. Las

membranasse guardaron envueltas en plástico a temperatura ambiente

(nitrocelulosa>o a 400 (nylon> hastael momentode la hibridación.

6.4.Marcajede lassondas.

Los insertospurificadoso los fragmentosamplificadospor PCRsemarcaron

radiactivamentepor síntesiscon oligonucleótidosal azar y a—32P—dCTP enpresenciadel fragmentoKlenowde la DNA polimerasa1 «<it ‘Multiprime labelling

system”>. Los nucleotidosmarcadosno incorporadosse eliminaron mediantecromatografíaen una columna de SephadexG-50 según el método descritoporSambrooket al (1989),y semidió la incorporaciónde radiactividaden un contadorde centelleoconlíquido de centelleo.

El marcajeno radiactivose llevó a cabo con digoxigeninamedianteel kit‘DNA labeling anddetectionnonradioactive’.DNA desnaturalizado10 mm a 9500semezclóen un tubo eppendorfcon hexanucleótidosal azar,dINTPs(dATP 0,1 mM

49

+ dCTP0,1 mM + dGTP0,1 mM + dTTP 65 ¡iM + dig-dUTP35 j.tM), y 2 unidadesdel

fragmentoKlenow de la DNA polimerasa1 <volumenfinal de 20 ¡¿1), y seincubó 1 h

a 370C. Sedetuvola reaccióncon 2 ¡il deEDTA 0,2 M pH 8,0, y el DNA seprecipitó

con 2,5~ de LiCI 4 M y tres volúmenesde etanol frío. Trasdejara -700C 30 mm se

centrifugóy resuspendióenTE.

6.5-Hibridación con sondasradiactivas.

Lasmembranascon las muestrasa analizarseprehibridarona 6500 en un

hornocon movimiento rotatorio duranteal menosunahora en 50 id/cm2 de tampón

SSO 5X, solución deDenhardt5X, SDS al 0,5%, conteniendo20 ~xg/mlde DNA de

espermade salmón desnaturalizadomediantecalor (10000 durante 5 mm)

(Sambrooketal, 1989>.La hibridaciónserealizódurantetodala nochea 6500 en el

mismohornoy con la mismasoluciónde prehibridacióna la queseañadióla sonda

marcadapreviamentedesnaturalizadaa 10000durante5 minutos.Despuésde la

hibridación,las membranasselavarontres vecesdurante15 mm en SSO 2X, SDS

0,1%a 6500, unavezdurante10 mm enSSC2X, SDS0,1%a 650C,y unavezdurante

5 mm enSSO 2X, SDS 0,1%a temperaturaambiente.Una vezsecaslas membranas

seexpusieroncon pantallaintensificadoraa unapelículade rayosX (KodakXAR 5>

y semantuvierona -700C hastael momentodel revelado.

6.6. Hibridacióncon sondasno radiactivas(digoxigenina>.

La prehibridaciónde las membranasse realizó en 200 pA/cm2 de una

soluciónSSC5X conteniendoagentedebloqueoal 5% (plv),sarkosilal 0,1%,y SDS al

0,02% durante al menos 1 h. en horno con movimiento rotatorio a 6500. La

hibridación se realizó durantetoda la noche a 65~C con la misma solución de

prehibridaciéna la queseañadióla sondamarcaday desnaturalizadadurante5

mm a 1000C.Despuésde la hibridación,las membranasselavaroncuatrovecesen

SSC2X, SDS0,1%a 6500 (condicionesde hibridaciónrestrictivas).La digoxigenina

se detectómedianteanticuerposanti-digoxigenina(fragmentosFab) conjugados

con fosfatasaalcalinaque enpresenciadeNBT (nitratoazulde tetrazolio)y solución

X-fosfato(5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfatode toluidinio> revelansuposiciónpor una

reaccióncolorimétrica.

50

7. DETECCIONDE VIRUS Y PATOGENOSSUBVIRALES PORAMPLIFICACION

ENZIMATICA

7.1. Oligonucleotidoscebadores.

A fin de diseñarunoscebadoresparala detecciónde CMV se compararon

las secuenciaspublicadasdel RNA 3 pertenecientesa las cepasde los dos

subgrupos(Quemadaet al, 1989>, buscandozonas conservadasy evitando el

extremo W con estructurasecundariaen forma de tENA. Se eligió un primer

cebadorA (19 mer> homólogoal fragmentode la región intergénicano codificante

situadoentrelos nt 114 y 132 (numeracióndeestosautores),y un segundocebadorC

(21 mer) complementarioal fragmentositSadoentrelos residuos633 y 653 del gen

de la proteína de cubierta,de maneraque la zonaamplificadatiene un tamaño

esperadode 540 nt (Tabla 2). Con el objetode amplificarpartedel gen dela proteína

de cubiertaseutilizaron otros doscebadoresB y D que amplificanun fragmentode

497 pbentrelos residuos398 y 894 (Figura13).

En el caso de PLRV y CLRV se utilizaron los cebadoresdescritospor

Robertsonet al (1991)y Boda y Ponz (1992), respectivamente.Los cebadorespara

TSWV fueron donadospor el Dr. A. Schraxn(ZaadunieBiotechnology,Holanda>.El

resto de los cebadoresfueron diseñadossegúnlas secuenciaspublicadasde los

patógenosy recogidasen la Tabla 2, utilizándoseen algunos casosel programa

informático OLIGOTM (Oligo software). En esta tabla están especificadaslas

secuenciasde todos los cebadoresutilizados, así como las regiones que se

amplifican.

72. RT-PCRa partir deun maceradovegetal.

El ensayoserealizó básicamentesegúnBoda y Ponz (1992> con pequeñas

modificacionesen las concentracionesde los reactivos. Una primera reacciónde

transcripcióninversa(RT), se llevó a cabo en tubos eppendorf(1,5 mí) en un

volumenfinal de20 jil, en la queal maceradovegetalde la plantaextraídoen Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, Tween-20al 0,05%,gelatinaal 0,01%,KCI 50

mM (concentracionesfinales), se le añadieron20 pmolesde cebador3¾1 mM

dNTPs,25 unidadesde inhibidor de ribonucleasas,y 200 unidadesde transcriptasa

inversa.Se incubéa 370C duranteunahora, a fm de sintetizarel cDNA de cadena

sencilla.

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La segundacadenadel cDNA y la amplificación se llevó a cabo en un

volumende 100 gí, añadiendoa la soluciónde RT 20 pmolesde cebador6’ y tampón

Pyrostasa1OX (suministradocon la enzima>, de forma que las concentracionesfinales de la solución de amplificaciónfueron Tris-HCl 60 mM pH 9,0, MgCl2 2,1

mM, (NH4)2S0420 mM, albúminadesuerode bovino al 0,005%,dNTPs0,2 mM y

0,2 pM de cadacebador.La solución se cubrió con 100 pl de aceitemineral para

prevenir evaporaciones.Sedesnaturalizóa 920C 2 mm, se añadieron2 u de DNA

polimerasatermoestable(Pyrostasa)a 720C, y sesometieronlas solucionesa 35

ciclos de desnaturalizacióna 94t 1 mm, anillamientoa 540C 1 mm, y extensióna

720C 1 mm enun termociclador.El tiempode extensiónsealargóen el último ciclo

a 7 mm paracompletarla síntesisdeDNA en todaslascadenas.

Despuésde la amplificación, en algunasocasionesse concentréel DNA

añadiendo150 pl de cloroformo,y recuperandola faseacuosa.El DNA seprecipitóa

-700C durante30 mm con 10 pl de acetatosódico3M pH 5,2, y 250 pl de etanol

absoluto,y secentrifugóa40C durante15 mm. El DNA seresuspendióen TE pH 8,0

y unaalícuotasesometióa electroforesistal comosedescribeen el apartado5.

7.3. RT-PCR basadaen capturadel virus con anticuerposespecíficosen

placasde microtitulación.

Se tapizaronplacasde microtitulaciónde fondo cóncavocon 50 pl de una

suspensiónde los anticuerposcorrespondientesen tampóncarbonatopH 9,6 a la

dilución habitualutilizadaparaELISA o en el casode los antisuerosbrutosa 1/500.

La temperaturay periodode incubaciónfue igual que paraELISA. Los tejidos de

plantaseprocesaronen 1/10 (p/v> de tampónde extraccióngeneral,y seañadieron

50 pl por pocillo tras lavartres vecescon PBS-TweenpH 7,4. Despuésde incubar

toda la noche a 4W se lavaron los pocillos con extremo cuidado para evitar

contaminacionesy se procedióa la amplificación.

En un principio, a fin de permitir la aperturade los viriones inmovilizados

en la placasellevó a cabo un tratamientotérmico: las placasvacíassecongelarona.-700C duranteal menosunahora,seañadieron50 pl de aguatratadacon DEPC a

cadapocillo, y, tras incubar durante20 mm a 65W, se recogieron 10 pl para

realizar la transcripción inversa. Más adelante,este paso se omitió y sintratamientoprevio 20 pl de premezcíade transcripcióninversa(Tris-HCl 50 mM pH

8,3, KCl 75 mM, MgCl~ 3mM, 1 mM de cadadNTP,cebador3 1 pM, y 200 unidades

de transcriptasainversaseañadierondirectamentea cadapocillo, la placasetapó

53

cuidadosamentey se incubó 1 hora a 37W con agitación,a fin de recuperarla

máximacantidadde virus.

La amplificaciónsellevó a cabobienentuboseppendorf(enla mayoríade los

casosduranteel desarrollodel método)o bien en los mismospocillos de la placa

dondese realizó la transcripcióninversa(en este caso se utilizaron placas de

policarbonatoTechne),a fin de comprobarque podíarealizarseel ensayocompleto

en la mismaplaca. En estoscasosseutilizó un termocicladoradaptadoa placas.En

cualquier caso, se realizó la amplificación añadiendo80 pl de mezcla de

amplificacióny seañadió100 pl de aceiteminerala fin de evitar evaporaciones.Las

concentracionesfinales(volumenfinal de ¡00 pl) de los reactivosftie: Tris-HOl 60

mM pH 9, KCl 15 mM, MgCl~ 2,1 mM, (NH4)2S0420 mM, 0,2 mM de cadadNTP,

0,2 gM de cadacebadory albúminadesuerode bovino al 0,005%. Despuésde una

desnaturalizacióninicial de 2 mm a 940C, se llevó la temperaturaa 720C y se

añadieron 1,6 unidadesde DNA polimerasatermoestable(Pyrostasa)y la

amplificacióntuvo lugar a travésde 30 ciclos (ó 35 en el casode PLRV y PSTVd).

Cadaciclo consistíaenuna fasedeanillamientode 1 mm a 520C (410C en el casode

PLRV o 4500 para PSTVd>, una fasede elongaciónde 1 mm a 720C y una fase de

desnaturalizaciónde 30 s a 9300. Un ciclo final con una fasede elongaciónde 5 min

terminabael proceso.La detecciónde los productosde PCEnormalmenteserealizó

porelectroforesisde 1/3 del volumen de la mezclade reacción,tinción por bromuro

de etidio 1 pg/ml y visualizacióncon luz UV. Alternativamente,el DNA amplificado

secuantificópor fluorimetría,segúnseexplicaen el apartado7.7.

7.4. RT-PCR realizadasobreplacasensayadaspreviamentecon la técnica

ELISA.

Tras terminar un ensayocon la técnicaELISA, la soluciónpresenteen el

pocillo se eliminó lavandouna vez con PBS-TweenpH 7,4, se añadierona los

pocillos 20 jil de la mezcla de transcripcióninversa, y se continuó como se ha

descritoenel apanado7.3.

7.5. RT-PCR basadaen captura del virus por adsorción directa al

poliestireno.

Seadsorbierondirectamentea la placa50 jil de extractosde planta1/10 (p/v)

en tampóncarbonato0,05 M pH 9,6, conteniendoPVP al 1%. Tras incubartoda la

nochea 4W y lavar, las placasseprocesaroncomosehadescritoen e] apartado7.3.

54

7.6. RT-PCRbasadaen capturade RNA bicatenario.

Se tapizaronlos pocillos con 50 pl de líquido ascitico conteniendoanticuerpos

monoclonalesespecíficosde RNA-bc, diluido 1/100 en tampón carbonato0,05 M pH

9,6. Seañadieronalos pocillos 50pl deextractosdeplanta1/10 (p/v) en el tampónde

extraccióngeneral,seincubarontodala nochey la placaselavó tres vecesconPBS-

Tween pH 7,4. A cadapocillo se añadieron20 pl de agua tratada con DEPC

conteniendocebador3 1 gM, se incubé durante 5 mm a 900C y se enfrié

rapidamente.Serecogióun volumen de 12,5 pl y setransfirió a un tubo eppendorf,

añadiendoel resto de los componentesde la transcripción inversa descritos

anteriormentehastacompletarel volumen de 20 ití. Los siguientespasosfueron

como sehadescritoenel apartado7.3.

Las hojas infectadascon PSTVd, por replicarsey acumularseesteviroide

dentrode los núcleos(ver Introducción),fueron tratadasa fin de romperéstos.Las

hojas de crisantemoinfectadasse pulverizaron en mortero en presenciade

nitrógenolíquido, y sehomogeneizaroncon el tampónde extracciónmencionadoal

queseañadióTriton X-100 al 0,1%y NonidetP-40al 0,1 %. Seagitó durante5 mm a

40C, 50 pl de estos extractos se añadierona los pocillos y se continuó el

procedimientocomo sehadescritoenel apartado7.3.

7.7. Cuantificacióndel DNA amplificadopor fluorimetría.

En algunosexperimentosse cuantificaronlos productosde amplificaciónpor

fluorimetria. Paraello se diluyó 1/3 del volumen de la reacciónen 2 ml de TNE

conteniendo1 pg/ml de fluorocromoHoechst33258. La mezclaseexcité a 353 nm y

la fluorescenciaemitida seleyó en un fluorímetroa 453 nm.

8. DETECCIONDE CMV EN MUESTRAS DE CAMPO.

Durante las campañaagrícolasde los años 1990 y 1991 se recogieronen

diferentesregionesespañolasmuestrasde campo,en su mayoríahortícolas,con

síntomasde virosis, en algunos casossin síntomasy también algunas malas

hierbas.A fin de evitar contaminaciones,se recogieronen bolsasseparadamente

(directamentea travésde labolsao conguantes>,y seintrodujeron inmediatamente

55

enunaneveraportátil con hielo hastasu conservacióna 4W, -200C o desecacióncon

gel de sílice. La descripciónde estematerialseencuentraen el anexo1.

Las muestras fueron ensayadaspor ELISA-DAS con anticuerpos

policlonalesparadeterminarsuposibleinfección con CMV. En los ensayosde 1991,

las muestraspositivasfueron ensayadascon anticuerposmonoclonalesespecíficos

de grupoparadeterminarsu serotipo(técnicasdescritasen 3.2>.

9. BUSQUEDADE RESISTENCIAA CMV EN GERMOPLASMA DEPIMIENTO.

El Centrode Conservaciónde RecursosFitogenéticos(CCRF)del CIT-INIA

(Centrode Investigacióny TecnologíaAgrariay Alimentaria del Instituto Nacional

de InvestigacionesAgrarias),ubicadoen la Fincade El Encín (Alcalá de Henares,

Madrid), disponede una ampliacolecciónde líneasde pimiento. Muchasde éstas

provienende la zona originariade la especieCapsicum,en Centroy Sudamérica,

cedidasporel BancodeGermoplasmade la UniversidaddeLa Molina (Lima, Perú)

y del Banco de Germoplasmade C.A.T.I.E. <CostaRica).En los últimos años,estas

lineas están siendo caracterizadasmorfológicamenteen el propio Centro por

Nicolás Gonzales.Para ello ha realizadoun seguimientode la segregaciónde

caracteresmorfológicosdurantetres años:en 1988de cadalínea sembró10 semillas

(NG-080-1,NG-080-2,etc.;deéstasen1989sembró5 decadauna(NG-080-1-1,080-1-

2, etc); y deéstasen 1990sembrótressemillas(NG-080-1-1-1,etc>.

Con el objeto de buscar resistenciasa CMV se analizaron semillas de

diferentesespeciesdel géneroCapsicum (C.annuum,C. baccatum,C. chinense,

C. frutescens,C. pubescens,C. spp.)de esta colección, y cuya descripciónse

encuentraenel anexoII.

Las semillas se trataron con fungicida (materia activa Mancozeb>y se

pusieron a germinar sobre papelde filtro humedecidoen aguaestéril dentro de

placasPetri en una cámaraoscuraa 300C. Una vez germinadas,una media de 9

semillasde cadalínea se trasplantarona bandejasde plástico(64 pocillos/bandeja>

con vermiculita (Termita,Asfaltex, 5. A.> inmersasen lg/l de solución nutritiva

(abonofoliar Hakaphosazul 15.11.15.0,8,BasO. En cadabandejase pusieron al

menosdos controlesde la variedadsusceptible‘Yolo Wonder”. Las bandejasse

mantuvieronen una cámarade cultivo de plantasa 24 ±10Cde temperatura

máxima, 14 ±1Wde temperaturamínima, con un fotoperiodode 16h luz y 8 de

oscuridad,y una iluminación de 110-100jiEm~1r2. Al alcanzarun estadiode 4-6

56

hojas expandidasseprocedióa su inoculaciónsegúnseha descritoen el apartado

2. Como inóculo se utilizó un extracto1/5 (p/v) de hojas de tabacoinfectadascon

CMV en tampónfosfato 0,01 M pH 7,0. Generalmenteseinoculé con el aisladoFny

(Oweny Palukaitis,1988), quesecaracterizaporproducirsíntomasgraves,aunque

en algunoscasosenqueésteno seencontrabaen óptimascondicionesse utilizó el

aisladode la plataneracanariao muestrasde Almería pertenecientesal grupo

DTL.Al cabode un mesaproximadamenteseprocedióa un primer análisis visual

de las plantas. Las líneas que presentaronsíntomasde infección (mosaico,

deformaciónde las hojas y/o retraso en el crecimiento> fueron consideradas

sensiblesal virus, y las líneasasintomáticasfueron analizadascon el testELISA

con anticuerpospoliclonales(Sanofi) polivalentes.Las que resultaronser ELISA

negativasfueron trasplantadasa tierra y fueron reinoculadas.Las que a pesarde

la reinoculaciónseguíansiendonegativassellevaron a campoo se mantuvieronen

invernaderocon el objeto de obtenerdescendenciapor autofecundacióna fin de

continuar el estudio de la resistencia.En algunoscasosademásse realizaron

cruzamientosgenéticoscon otras lineas.

57

EESULTkDOS

58

IV. RESULTADOS

1. PUESTAA PUNTO Y EVALUACION DE LAS TECNICAS DE DETECCION

RUTINARIA DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL PEPINO(CMV).

Se han puestoa punto varias técnicasde detecciónde CMV a fin de

evaluarsu aplicabilidada un diagnósticorutinario de un número elevadode

muestras.Estastécnicasson tanto aquellasquedetectanlas proteínasvirales

(ELISA> como las que detectan los ácidos nucleicos virales (análisis

electroforéticode ENAs bicatenarios,hibridación sobremembranascon clones

de cDNA y amplificaciónenzimáticapreviatranscripcióninversade fragmentos

del genomaviral).

1.1. DETECCIONDECMV PORELISA.

1.1.1. Estandarizaciónde la técnica.

1.1.1.1.Tiempoidóneode lectura.

Las absorbanciasobtenidascon variasmuestrasen distintoshuéspedesy

en diferentesplacasde poliestirenomedianteun ensayoELISA-DAS realizado

con los anticuerpospoliclonalesde Sanofl o de Agdia permitieronencontrarcuál

es el tiempo idóneopara realizarlas lecturasespectrofotométricas.En la Figura

14 (A) seapreciaclaramenteuna mayordiferenciaentre las A405 de muestras

sanase infectadasobtenidasa las 3 h o tras toda la noche frente a lecturas

anteriores.Como con las lecturas OJN el fondo subíabastante,se utilizó la

lectura de las 3 h preferentemente.Sin embargo>cuandose utilizaron los

anticuerposde Agdia conjugadoscon peroxidasa(Figura 14 B), seobservóque es

preferible realizar la lectura a la 1/2 ó 1 h. En general,y utilizando estos

resultados como gula, para cada placa se estudió la evolución de las

absorbanciasa lo largo del tiempo y seeligió la lecturamás alta en la que los

fondosno hubieransubidodemasiado(A405<0,15).

Se utilizaron varios lotes de anticuerposde Sanofi a lo largo de este

estudio, no observándosediferenciassignificativas de comportamientoentre

50

Sanof 1

—u———Planta sana

—.——— Planta CMV

0/N

ti em PO

Agdla

—u———Planta sana

—•-—— Planta CMV

tiempo

EiaJA. Mediasde lasabsorbanciasobtenidasconmúltiplesmuestrasadiferentestiemposen un ensayoELISA-DAS con: (A) anticuerpospoliclonalespolivalentesanti-CMV de Sanoficonjugadosconfosfatasaalcalina.(B)anticuerpospoliclonalesanti-CMV-cr deAgdia conjugadosconperoxidasa.

(A) 2

oy

cItn

3-

2-

1oJI

T O

3Ornin I-2h 3h

(B) 0,14 -

0,12 -

0,10 -

0,06 -

0,06 -

0,04-

0.02

0,00 U30 mm Ib

• U

3h 0/N

unos y otros, aunqueElisa Sáez (SPV, Almería, comunicación personal)

encontróalgún lote que presentabaproblemasparadetectarvirus en pepino.Sólo

seutilizó un lote de anticuerposAgdia.

1.1.1.2.Positivoo negativo.

A fin de elaborarun criterio paradeterminarqué se considerabacomo

respuestapositiva y qué como respuestanegativa,sehizo un estudioestadístico

de los valores de absorbanciaobtenidos para las plantassanasde diferentes

huéspedescon los anticuerpospoliclonalesde Sanofi,obteniéndoseunos valores

mediosa las 3 h de 0,07, 0,09, y 0,005 para pimiento, tabacoy judía sana

respectivamente,aunquecon unas desviacionesestándarmuy elevadasen

pimientoy tabaco,de0,17 y 0,19 , respectivamente.Aunquela casacomercialde

Sanofi recomiendaestablecercomoresultadopositivocuandose obtengan2 veces

la absorbanciade la mediade las plantassanas,seobservóqueplantasde judía

consideradascomo positivas según este criterio al ser ensayadaspor otros

métodos (por ej. PCE) resultaronnegativas.En cambio, algunasplantas

consideradascomo positivaso dudosassegúnestecriterio inoculadasa plantas

huéspedprovocaronposteriormenteen éstasunaclarainfecciónviral, o algunas

plantasconsideradascomo negativascon los anticuerpospoliclonalesresultaron

positivas con los monoclonales.Debido a que la franja de dudosos era

relativamenteamplia, establecimosarbitrariamentepara los muestreosel

positivo en tres vecesla media de las absorbanciasobtenidascon las plantas

sanas,prefiriendoincurrir másen el error tipo II (falsosnegativos).

Utilizando los anticuerpos de Agdia conjugadoscon peroxidasalas

absorbanciasobtenidasparalas plantasinfectadassonmásbajas(Figura 14 B), conunamediade A490=0,037paralasplantassanas,y con una desviaciónestándarde

0,023, por lo que en estecasose estableciócomo respuestapositiva aquellaque

presentabadosvecesla mediade lasA490de lasplantassanas.

En todos los ensayosse utilizaron como controlestampón de extraccióny

plantasana,que dieronen generalresultadosparecidos.Se hicieron generalmente

dos repeticionespor muestra.

1.1.1.3. Determinacióndel subgrupo.

Paraestandarizarel ensayode detecciónde subgrupoal que perteneceel

virus se realizó un ensayo ELISA-TAS con los anticuerpos monoclonales

61

correspondientesa partir de muestrasde subgrupo conocido mantenidasen

invernadero.Al utilizar dosmonoclonalessegenerarondos valoresde A4o5 quese

representaronen unagráfica(Figura is5, en la que sepuedentrazardos rectasde

pendiente2 y 0,5 respectivamente,quelimitan doszonasque englobana la mayoría

de las muestras.Por tanto, se utilizó como criterio para incluir una muestradeCMV en un subgrupoel quepresentaraun valor de A405 dos vecesmayor con el

anticuerpoespecíficoparadicho grupoque parael contrario.

1.1.1.4. Tampón de extracción.

Otro factor quehubo queestandarizarfueron los tamponesutilizados en la

homogeneizaciónde las muestras,puestoquesobretodo en el casode pimiento, se

observaronunosvaloresde absorbanciaalgo elevadosparala planta sana.En la

Tabla 3 seobservauna fuertevariaciónsegúnel tampónqueseutiice, obteniéndose

los mejoresresultadoscon los tamponesn0 4 y n2 2. Aunque el tampón n2 4

distinguealgo mejorla muestrainfectadade la sana,seutilizó el tampónn9 2 para

los muestreosde CMV en generalpor sermássencillo de preparar,y el tampónti2

4 solamentecuandoserealizaronextraccionesparaserensayadascon anticuerpos

quedetectanotros virus ademásde CMV.

1.1.2. Límite de detecciónen un maceradovegetal.

Para estudiarel límite de deteccióno detectabilidaddel ensayo con los

anticuerpospoliclonalespolivalentes(Sanofi) en diferenteshuéspedes,empleamos

muestrasque presentabanniveles de infección semejantes(aproximadamenteA

4o5=3 para la dilución 1/10). Se realizarondiferentes diluciones de macerado

vegetalconel tampónde extraccióny seanalizai,onen ELISA-DAS. Segúnnuestro

criterio de considerarcomo positivas aquellasmuestrasque dieron una lectura

espectrofotométricade al menostres vecesel valor de la plantasana,seobservóen

la Figura 16 que el límite de detectabilidaden ordendecrecienteparalos distintos

huéspedesera(p/v>: tomate>1/80.000,tabaco1/70.000,y pimientoy pepino1/10.000.

Puestoqueen cadapocillo hay un volumen de 100 pl de muestra,estosnivelesde

detecciónsonde<1,25 pg, 1,42 pg y 5 pgde tejido infectado,respectivamente.

El limite de dilución del ensayoELISA-TAS se analizó con los anticuerpos

monoclonalespolivalentesde Sanofi conjugadoscon fosfatasaalcalinaen tabaco.La

Figura 17 muestraqueel límite dedetecciónes1/20.000,equivalentea 5 pg de tejido

infectado/pocillo.

U)

oHEcU)o

ocnL.oci,-o4

3,0

2,0

1>0

0,0

Absorbancia a 405 nrn (IJTL)

Eig..lfi. Absorbanciasobtenidasenun ensayoELISA-TAS conlos anticuerposmonoclonalesdeSanoflespecíficosparalos subgruposDII y ToRSde CMV.

TAMPON PLANTA •T!W 1 h ir ~i~W O/N1 P.sano 0 0 0 0 0

P. CMV 0,15 0,30 0,61 0,92 2,232 P. sano 0,03 0,06 0,14 0,20 0,65

P. CMV 0,46 0,83 1,60 2,31 3,143 P. sano 0,01 0,01 0,03 0,04 0,18

P. CMV 0,24 0,42 0,89 1,33 2,774 P. sano 0,03 0,08 0,19 0,28 0,78

P. CMV 0,59 1,13 2,58 3,47 3,415 P. sano 0,01 0,02 0,03 0,06 0,12

P. CMV 0,13 0,24 0,52 0,80 2,31

TAMPON 1: PBS-Tween+2%PVP

TAMPON 2: Citrato sódico0,5M pH 6,5, 0,1%ácidomercaptoacético

TAMPON 3: Citrato sódico0,5M pH 6,5, 0,1%ácidomercaptoacético,0.1%TritonX-100.

TAMPON 4: Tris-HCl 0,5 M (pH 8,2),2% PVP, 1% PEG6000,0,8%NaCí, 0,05%Tween20, 0,2%NaN3.

TAMPON 5: fosfato0,03MpH 7,2, 0,2%dietilditiocarbamato

Tabla 3. Absorbanciasobtenidas(a 405 mr> con los diferentestamponesutilizadosparaextraerel maceradovegetaldehojas de pimiento en un ensayoELISA-DAS con anticuerpospoliclonalesde Sanoflconjugadoscon fosfatasaalcalina.

o 2 3

Extractobruto detomate

O • • O •~~I • O • 1 ¡o o o o o o o o o o o o— o o o o o o o o o o o

— o o o o o o o o o o— 1j’ 0 0 0 0 0 0 0 0— ej e., y t, o r. O

A405

3,0

2,0

LO

0,0

Extractobruto detabaco

1/DILUCIONES 1/DILUCIONES

A405 Extractobrutode pimiento

3,0

2,0

1,0

0,0

A405

3,0

2,0

1,0

0,0

Extractobruto depepino

1/DILUCIONES 1/DILUCIONES

~jg.J,fi Límites dedetecciónobtenidosenensayosELISA-DAS conanticuerpospoliclonalespolivalentes(Sanofl)apartir demaceradovegetaldehojasdediferenteshuéspedesinfectadosconCMV.

A405:3

2-

o

—9-—— Tomate CMV—4——— Tomate sano

0-4—•-”

28§8§§§88888— ti, o o o o o 0 0 o

— V ti, O t- O

£8— o

—

O O O O O O O O 0 888— o o o o o o o o— o 0 0 0 0 0 0 0 0 0

— u, O o o o o o o o— ej ‘.9 y u, .0 t~ O

u u0 0 0 0o o o O— o O O

— u, o

.JldlJtJIJr

00o o0088ej y o ‘O e>

u

o

1/DILUCIONES

T sanoT CMV

£iaJLl. Limite de dilución obtenidoen un ensayoELISA-TAS conlosanticuerposmonoclonalespolivalentesdeSanofia lastreshorasde.añadirel sustratoapartir dedilucionesdeun maceradovegetaldehojasde tabacoinfectadasconCMV.

o’ o~ o, O, o’ ac a a a a ooc — aU)— o Eun 1-

concentraciónvirus

Ligia. Límite de dilución obtenidoenun ensayoELISA DAS paraladeteccióndeCMV realizadoconanticuerpospoliclonalesconjugadosconfosfatasaalcalina.Se utilizó virus purificadoa unaconcentraciónde 12,8mg/ml sindiluir. Comocontrol seempleótampónPBS-Tween.

EaU)o~ 2,0-1,

oa-oot IDO-

0,0o

u

4

3

Eauno<o<ooa<o-ooa,-o4

2

o09 0~ O~ o, a’= D D C CO O — 00O — 00- un -

1.1.3. Límite dedeteccióncon virus purificado.

Paraestudiarel límite de detectabilidaddel ensayo ELISA-DAS con los

anticuerpospoliclonalespolivalentes(Sanofi)a partir devirus purificado, serealizó

una purificaciónprevia de éste,paralo cual seinocularonplantasde N. tabacum

‘Xanthi” con la muestrade CMV BA-39 (ver apartado3), a los seis días se

recogieronlas hojas y se purificó el virus, con un rendimientode 8,5 mg de virus

porcada100g de hojade tabaco,y una concentraciónde 12,8 mg/mí, y se utilizó

inmediatamentedebido a la inestabilidaddel CMV. Se realizarondiluciones del

virus con tampónPBS-Tweendesde100 p.g hasta1 pg. En la Figura 18 semuestra

que se pudo detectarhasta 1 ng de virus purificado, utilizando el criterio de

considerar como positivas aquellas muestras que dieron una lectura

espectrofotométricade al menos tres vecesel tampón, que correspondea una

concentraciónde 10 ng/ml.

1.2. Detecciónde CMV poranálisisde los RNAs bicatenarios.

Se puededetectarCMV medianteextracciónde los ácidos nucleicos virales

bicatenarios(RNAs-bc), más estables y fáciles de extraer que los RNAs

monocatenarios,que requierenunapurificación previadel virus. A fin de estudiar

la mínimacantidadde material vegetalque puedeutilizarse con estemétodo, se

inocularon plantas de tabaco con CMV (aisladode la plataneracanaria)y se

extrajeronlos RNAs-bc a partir de distintas cantidadespreparandomuestras

homogéneas.En este ensayo se pudo detectar la presenciade las formas

replicativasen0,1 g de hojainfectada,comopodemosver en la Figura 19 (A).

Con estatécnicatambiénfue posibledetectarla presenciade RNA satélites

en muestrasde campo,como se observaen el análisis de los ácidos nucleicos

bicatenariosde una muestrade tomate de Valencia con fuertes síntomasde

necrosisen el año 1990 (ver síntomasen Figura 9), y otra muestrade pimiento

procedentede Badajozdel mismoaño, sin presenciade satélite(Figura 19 B). En

estamuestrade pimiento se observala presenciade RNAs-bc específicosde la

plantahuésped,similaresa los descritosporValverdeet al (1990).

1.3. Detecciónde CMV porhibridacionessobremembrana(“dot blot”).

Esteensayofue realizadocon lasmismasdilucionesde la muestradehoja de

tabacoinfectadocon CMV (aisladode la plataneracanaria)que seutilizaron parael

ensayoELISA (1.1.2). Se prepararonmembranasde nylon (Hybond N ~) en las que

se colocaron10 g por cadadilución. Utili~ando la sonda45080de CMV marcada

radiactivamentecon unaactividadespecíficade aproximadamente15 x íO~ cpm4ig

sellegó a detectarladilución 1/500(equivalentea detectarvirus en20~igde tejido de

hoja) cuandola autorradiograflaseexpusodurante7 días(Figura 20 A).

En el caso del marcaje no radiactivo, se ha conseguidodetectarhasta

diluciones de 1/8 (1,25 mg de tejido) en hibridacionescon la sondapZU123A

marcadacon digoxigenina,aunqueno sehadeterminadoel límite dedetectabilidad

con estemarcaje(Figura 20 B). En el casode las plantassanasno se observaba

reaccióncon la digoxigenina.

En ensayosde hibridacionescon marcajeradiactivo, las membranasde

nitrocelulosamostraronuna mayorsensibilidad. En la Figura 21 se observauna

mayorseñalde hibridación en idénticasmuestrasde campoinfectadascon CMV

en membranasde nitrocelulosa(Schleicherand Schuell) que en las de nylon

(HybondN~> con la sondapZU123A marcadaradiactivamentecon una actividad

específicade aproximadamente3 x ío~ cpm4¡ga los 12 díasde exposición.

1.4. Detecciónde CMV por RT-PCRen un maceradovegetal.

Estemétodosehaensayadoconéxito con los cebadoresA y C (verMateriales

y Métodos,Figura. 13) en plantasinfectadascon CMV de los dos subgruposy en

varios huéspedescomo tabaco,tomate y pepino. Sin embargo,no fue posible la

deteccióncuandoel huéspedutilizado fue pimiento.En los primerosexperimentos

ocasionalmenteseobservaronbandasdel tamañoesperadoen algunasplantasno

inoculadas,hecho que dejó de producirse al poner un extremo cuidadoen la

recogidade las muestras(hacerloa travésde unabolsade plásticoo lavándoselas

manosminuciosamentedespuésde tocar unamuestrainfectaday antesde recoger

otra). Se consideróuna muestracomo positiva cuandoel tamaño del producto

amplificado erade 540 paresde bases,y negativacuandono estabapresenteun

productode estetamaño.

A fin de optimizar la concentraciónde iones magnesioen el tampón de

reacciónde la RT-PCR, se realizó un ensayocon concentracionescrecientesde

MgCl2 en el medio, tanto en la transcripcióninversa,como en la amplificación

posterior.En la Figura22 (A) seobservaque concentracionesde 2,5 ó 3 mM rinden

mayor cantidadde producto sin que se observenbandasinespecíficasen los

controlessanos.

El límite de detecciónobtenidocon un maceradovegetalesmásalto quelos

obtenidoscon otrastécnicas,llegándosea detectaruna dilución de 1O~ (Figura 22,

B), que equivalea aproximadamente1 ng de tejido infectado, ya que el ensayo

requiereunos 10 pI.

Paraestudiar la detectabilidadcon virus purificado, se utilizó el CMV

obtenidoenel apartado1.1.3 y los RNAs viralesextraídos,a unaconcentraciónde

12,8 ng/pI, sediluyeron con el tampónde la transcripcióninversa.El análisisde los

productosde la amplificaciónpor electroforesisnos permitió detectarhasta100 fg

deRNA viral (Figura22 C). Ya que los virionescontienenun 18% de RNA (Francki

et al, 1979)estacantidadequivalea 55 pg departículasviralesml-1. Siendoel peso

molecularde la panículade CMV de 5,8-6,7x 106 D (Franckiet al, 1979), sehan

detectadounas50.000partículasdevirus.

Paraprobarque los productos amplificadospor PCR eran específicosdel

CMV, serealizóuna transferenciatipo “Southern’ del DNA a membranasdenylon

y sehibridó con la sondapZU123A marcadacon digoxigenina.En la Figura 23 se

puedeapreciarque la sondade CMV hibridabacon el DNA cuyamovilidad eradel

tamañoesperado,y no habíaseñal con las plantassanasni con el cucumovirus

TAV.

2. DETECCIONDE VIRUS Y PARTíCULAS SUBVIRALES POR RT-PCR PREVIA

CAPTURA EN PLACAS DE MICROTITULACION

En un intentode resolverel problemaquepresentabael maceradovegetalde

determinadoshuéspedesen la inhibición de las reaccionesde la RT-PCR,y a la vez

facilitar un diagnósticorutinario, se puso a punto la detecciónde CMV y otros

patógenosmedianteRT-PCRen unaplacaELISA, lo cual facilita el análisisde un

númeroelevadode muestras.

2.1. Capturadel virus con anticuerposespecíficos.

El método descrito en Materiales y Métodos fue diseñado en nuestro

laboratoriopor GustavoNolasco (UCTA, Universidaddel Algarve, Faro, Portugal)

71

para ser aplicado a la detecciónde GFLV en tejidos de plantas de vid.

Consecuentemente,las temperaturas utilizadas en un principio para

desensamblarel virión y liberar el RNA reflejabanpropiedadesde estabilidad

térmica descritaspara este virus por Quacqarelliet al (1976). Al ástudiarel

comportamiento de la técnica con otros virus, observamosque el mismo

tratamientotérmico dabaresultadocon virus RNA vegetalestan diferentescomo

BYMV (flexuoso filamentoso)o TSWV (con envueltasexternasa la cubierta

proteica).Experimentosposterioresrealizadossin estetratamientotérmico dieron

lugar a un método, esquematizadoen la Figura 24, que ha resultadoválido para

todas los virus ensayadoshastaahoray paraun satéliteasociadoa CMV (Tabla 4).

Los pasosprincipales del método son: inmunocaptura de las formas virales

utilizando placasde microtitulación (poliestirenoo policarbonato)tapizadascon

anticuerposespecíficos,BLEC&..de un fragmento del genomadel patógeno,y

d~t~n~¡áade los productosamplificados.Todos los pasospuedenllevarse a caboenla misma placa.La puestaa punto de estatécnicaha llevado a presentaruna

solicitud de patenteen el Registrode la PropiedadIndustrial de Españacon el n2

P9201232<fecha12/6/92).

En la Figura 25 se observa que los fragmentosamplificados fueron del

tamaño esperadopara todos los virus. En algunos experimentosse pudieron

observaralgunasbandastenuesademásdel fragmentoesperado;estasbandas

parecíanserespecificasdel virus, ya que no se observabanen los controlessanos.

En el casodel PMMV un segundofragmentode alrededorde 350 pb sedetectaba

siempreen las muestrasinfectadas.Un análisis más detalladode la secuencia

revelóqueel cebadorW presentabaun 62% dehomologíacon la región comprendida

entrelos nt 1062 y 1082. Un anillado inespecíficodurantela transcripción inversa

daría lugar a un cDNA que se extenderíahasta el nt 735, amplificándose

posteriormenteun productode 347 pb.

En el casodel RNA satéliteseobservaronocasionalmentebandasadicionales

de 190 pb y 140 pb (Figuras25, 30, y 31>, probablementetambiénproducidaspor

anillados inespecíficos.Incluso se observóque era posible amplificar el RNA

satélitecon un único cebador(Figura 26, carril D). Un estudio detalladode la

secuenciaen el ordenadorcon ayuda del programa OLIGO TM, reveló que

probablementea 370C y en las condicionesde la transcripcióninversa,el cebadorW,

parcialmentecomplementarioal extremo3% se va a unir al RNA satélite de la

siguienteforma:

74

4

4

~1~

Adsorcióndelanticuerpoa lafasesólida

IncubaciónLavadoAdición demuestras

IncubaciónLavadoReactivosdeRTIncubación

ReactivosPORDNA polimerasaIncubaciónen termociclador

4,CUANTIFICACIONy/o DETECCION

£ig.Zt Métododedeteccióndevirus y patógenossubviralesmedianteRT-PCRconunapurificaciónpreviapor capturaaunafasesólidamedianteanticuerposespecificas.

o<.2

8-.

<.24>

Eu-oo4..u4>4..

4>4>w4>o.

•1-.~

u2

~ti

4>

It

r 1~~~;; oa•1

Co1- M

pb.4

517--— 506

— 396 -—344

298

220201-A ‘

-si -ti-~~

£i~2L Análisis por electroforesisen geldepoliacrilaznidaal 5%de productosdeRT-PCRgeneradosapartir demuestrasinfectadasconvirus y RNA satéliteamplificadospreviacapturapor un anticuerpoespecíficoenunaplacadepoliestireno.M: marcadordepesosmoleculares(DNA 1 Kb ladder,Gibco, BEL).

CA B D¡ ¡

Eig.26. Análisis porelectroforesisengel de agarosaal 1%deproductosdeRT-PCRapartir deRNA satéliteamplificadocon: A, cebador3’ enla transcripcióninversa,añadiendoel cebador5’ enlaPCR. B, cebador5 en la RT, añadiendoel cebador8’ enla PCR.C, cebadorWenla RT. D, cebadorW en laRT.

5’ 335 3’

UCC UCUGCAGGACCC RNA satélite

I¡¡IIII 1 ¡cebador 5 GGGAGACGC~IIAA~qQ

5.

y mediantela acciónde la transcriptasainversapuedeformarun cDNA de tamaño335+6nt. En el primerciclo de amplificación,el cebador5’ seuniráa los nt 10-30delcDNA, de los queescomplementario,dandolugaraotra cadenade 332 nt, en la que

los últimos 21 nt son ahora complementariosal cebador5’. Esto explicaría la

amplificaciónocurridacon un único cebador.

La especificidadde la amplificaciónse confirmó en el caso de CMV por unahibridacióntipo Southernde los productosdePCRconunasondade cDNA, como seobservaen la Figura 23, en la que sepuedeapreciarqueseobtieneunabandamás

nítida con este método que cuandose amplifica a partir de maceradovegetal.Tambiénseobservóespecificidadde la bandaamplificadaen el casodel satélitealhibridar con la sondapTlO5 (resultadosno mostrados).

El limite de deteccióndel método sedeterminócon dilucionesseriadasde lasmuestrasinfectadas,viendo que era al menos 10-6 para CMV (semejantealobtenidocon maceradovegetal),y iO~ para CTV, un closterovirus de bajo titulolimitado al floema (Figura 27). En comparacióncon ELISA en experimentos

paralelos(Tabla5) estemétodoresultóseral menos10 vecesmássensibleenel casode CMV y mil vecesmássensibleenel casode CTV.

Otra aplicacióndel método fue en aquellasplacasde ELISA en las que seoriginabanvaloresdudosos:traseliminarel sustratoenzimáticoy susproductosde

hidrólisis de la placa, fue posible detectarun productoclaro de PCRa partir deamplificacióndel RNA viral retenidotodavíaen el pocillo depoliestireno(resultadosno mostrados).

Paraexplicar la accesibilidaddel RNA viral a la acciónde la transcriptasainversa sin necesidadde un tratamiento térmico o químico, se pensó que losanticuerposinmovilizadospodríanestaratrapandoen vez de viriones algunosRNAs parcialmenteencapsidados.Parainvestigar estaposibilidadse ensayóelmétodo con virus GFLV purificado, cuya integridad había sido chequeadapor

tinción negativaal microscopioelectrónico,realizandoun ensayoparalelo con untratamientotérmicoprevio a la transcripcióninversa,y sin éste. En la Figura28 seobservaquela amplificación de la parte esperadadel genomaviral ocurría en

78

Diluciónde muestrasinfectadase>

CTVELISAt Fluorimetría

10-1

io-~

io-~

i0-~

10-6

2,101

0,185

0,109

0,105

0,092

1185410

Control sano10-1 0,134

(*) Estasdiluciones

(t) A405•correspondenalas dela flg 27.

Tabkñ. Absorbanciasobtenidascondilucionesde maceradovegetalde muestrasinfectadaspor 0W, y datospreliminaresde

cuantificaciónrelativa por fluorimetría de DNA amplificadoen la detecciónde CTV.

amboscasosy que no habíadiferenciasnotorias entreambos experimentos.Es

decir,una desnaturalizacióntérmicaprevia,para la cualestevirus en particular

esmuy sensible(Quacquarelliet al, 1976), no mejoraapreciablementela capacidad

de amplificar el fragmentogenómico(compararcarrilesA y B).

2.2. Capturainespecíficadel virus.

Con el objetodepoderaplicarestemétodoen aquelloscasosdondeno hubiera

disponibleun anticuerpoespecificoy paralos viroidesque no disponende cubierta

proteica,seensayóla adsorcióndirectade los viriones al poliestireno.Estemétodo

alternativodió resultadocon CMV, pero no con GFLV o BYMV (Figura29).

Otra alternativa fue utilizar anticuerposespecíficosde RNAs-bc para

capturar las formas replicativas del patógeno.De esta manera se obtuvo

amplificacióndel tamañoesperadocon varios virus, como BYMV, CMV, GFLV, y

CLRV ademásdel RNA satélite asociadoa CMV (Figura 30). Este método fue

igualmenteaplicadocon éxito a la amplificaciónde un virus con envuelta,el TSWV

(resultadosno mostrados).Cuandosecomparanestosresultadoscon los obtenidos

con anticuerposespecíficos(Figura 24>, no seobservandiferenciassignificativas.

Para amplificar el viroide PSTVd fue necesarioañadir Triton X- 100 y

NonidetP-40al tampónde extraccióna fin de romperlos núcleos,en cuyo interior

sereplicay acumulael viroide. De esta forma se consiguióuna amplificación de

una bandadel doble del tamañoesperado,aunqueno se observaronbandasdel

tamañoesperado(Figura 31). Un análisis más detalladode las secuenciasreveló

una alta complementaridadde los cebadoresquepodríandar lugar a la formación

de dimeros. También se observaronvarios fragmentosmenores de 80 nt,

probablementeformados al no poder penetrar la polimerasa en la compacta

estructurasecundariadel viroide.

2.3. Análisis de resultadospor fluorimetria.

Para evaluar la posibilidad de evitar la electroforesiscomo método de

análisis de los resultados,en algunos ensayosparte del DNA amplificado se

cuantificó por fluorimetria. La Tabla5 muestralos datosobtenidosen la detección

de CTV, un closterovirusde bajo título limitado al floema, utilizando el método

descritoy comparadocon los resultadosobtenidospor ELISA. Aunque el número

reducidode ensayosy muestrasno permitió fijar un criterio claro paradistinguir el

negativodel positivo,la diferenciaentremuestrasanae infectadapareceestarbien

r > > >>- r -J ~~ LL -JCD <j

‘o

It

fipb

1018

SI?506

396344298

220201

154134

Eig2fl. Análisis porelectroforesisengel de poliacrilarnidaal 5%deproductosdeRT-PCRapartir demuestrasinfectadasconvirus y RNA satélitede CMV previacapturaconanticuerposespecíficosdeRNAs-bc.M: marcadordepesosmoleculares(DNA 1 Kbladder,Gibeo, BEL). 8: tabacosano.

1 541 34

EÍgA. Electroforesisengel depoliacrilamidaal 5% deproductosamplificadosapartir deRNA satélitedeCMV y delviroidePSTVdmediantecapturaconanticuerposespecíficosdeRNA-bc. M~ marcadordepesosmoleculares(DNA1 Kb ladder,Gibco,BEL>

1, PSTVÚpb

396344

22020 1

75

marcaday los limites de detecciónobtenidospor fluorimetría sondel mismo orden

demagnitudquelos obtenidospor electroforesis.

3. DETECCIONDE CMV EN MUESTRASDE CAMPO

Durantela campañaagrícolade los años1990 y 1991 se recogieronen 18

provinciasespañolas,sobretodoen las zonashortícolasdel mediterráneo,Valle del

Ebro,Extremaduray Galicia,muestrasde plantascon síntomasde infecciónviral(en general mosaicosmás o menos severos,deformacionesde hojas o frutos,

enanismo,amarilleamientos,etc.). Se hizo unaespecialincidenciaen el cultivo del

pimiento. Los síntomasde algunasplantasque resultaronestarinfectadaspor

CMV sereflejanen la Figura 32.

Las muestras fueron analizadas por ELISA-DAS con anticuerpos

policlonalesde Sanofi(años1990 y 1991)y deAgdia (año 1990),y las que resultaron

positivas en el año 1991 fueron analizadascon anticuerposmonoclonalesen

ensayosELISA-TAS para identificar el subgrupo.Como criterio para reflejar los

resultados(ver 3.1.1.>se eligió:

+: D.O.> tres veces el fondo

++: D.O.> diez veces el fondo

anticuerpospoliclonales

SanoS<lecturaalas3 It>

4.: D.O.> das veces el fondo

++: D.O.> diez veces el fondo

anticuerpospoliclonales

Agdia <lecturaa la 1 h)

Se observóque las muestras,ya fueran- guardadasa 40C o ~20oC,que no

fueron procesadaspronto,perdíanlos epitoposrápidamentey los anticuerpostanto

policlonales polivalentes como monoclonales para subgrupo dejaban dereconocerlos.

El anexo 1 presentalas muestrasrecogidasordenadaspor provincias, el

cultivo, los síntomasque presentaban,la fecha de recolección,el lugar y elresultadodel análisis.Al lado del númerode la muestraseponeen algunoscasos

idéntica letra a las muestrasque fueron recogidasen la mismaparcela.También

seconsignanlos casosde infeccionesmixtas cuandoseencontraronotros virus en

estasmuestrasal seranalizadasen nuestrolaboratorio. -

En el año1990(Figura33) seobservóunaincidenciade CMV del 28,32%eneltotal de las plantasmuestreadas.Destacaun 44,18%de incidencia en Madrid

84

cultivo Total I!rIco1+12

GU LO M NA IT IVZ1+12Acelga

Apio O/l — ............ — i0fl—

Berenjena Oíl44.17

0/1

calabacín 5.j8 1+11COL 0/1 0/1Garbanzo 0/9 .0/9Judía 6.115 5./IBLechuga 0/3 0/1 0/2Mala hierba 0/3 .0/2 .0/1Melón 6.19 3+14 2+/2 1.13Patata 0/2

00/1 0/1

Pepino 2.]! 2./4 0/1Pimiento 22.194 1.12 7./35 5./lO 4+134 1+11 1,/4 4,/ESandIa 0/2 0/1 OIlTomate 6./14 1+12 1+11 1./3 0/4 3.14Yeros 0/4 0/4TOTAL 49.1173 2.14 1./lO 0/4 7./35 19./43 4./34 4.114 7+/lB 5./11

Fig...aa.Incidenciade CMV en diferentescultivos y provinciasespañolesen lacampañaagrícolade 1990.

PROVINCIAS TESTADAS

~ n: plantas infectadas cont: plantas analizadas

INCIDENCIA TOTAL DE CMV:28.32%

(zonas de Aranjuez y Villa del Prado)>principalmenteen pimiento, judía verde,

calabacíny pepino.Por cultivos, en pimiento sedetectóun 24,46% de CMV, un

66,66%enmelón,un 42,85%en tomate,y un 40% en pepino.No sedetectóinfección

en ninguno de estos cultivos: apio, berenjena,col, garbanzo,lechuga, malas

hierbas,patata,sandíao yeros.

Los anticuerpospoliclonalespolivalentesde Sanofi estáncomercializados

comocapacesde detectartodaslas cepasde CMV, pertenecientesa los subgrupos

DTL, ToES y Co, peroseencontraron8 muestrasCBA-4, LO-29, M-7, M-9, M-18, NA-

9, V-6, V-10) que los anticuerposde Sanofi no reconocieron,mientrasque los de

Agdia, que sólo reconocenun tipo (inclasificado), reconocía.Estas muestras

suponenun 16,3% del total de lasmuestrasrecolectadasen el año 1990y positivas

para CMV.

En el año 1991 (Figura 34> sedetectéun 28,63%de plantasinfectadaspor

CMV. Destacaun 92,3% de incidenciaen tomatesde Almería, un 50% de las 6

malashierbasmuestreadas(N. alba,bledoy Datura sp.),y un 31,16%en pimientos

a nivel general.No se detectéinfección en ninguno de estos cultivos: alfalfa,

Brassica sp, haba,maíz, o pepino.

En cuantoa los subgrupos,sedetectaron57 muestrasinfectadascon DTL

(76%)y 15 con ToRS (20%), asícomo 3 muestrascon una infección mixta (4%), al

parecerdivididosporzonas(Figura 35). ToRSsedetectéen La Rioja (tantoen abril

como en octubre)y Pontevedra(septiembre>,y DTL enNavarra,Zaragoza,Madrid,

y zonadel Mediterráneo.Sólo en Badajozse detectaronlos dos subgrupos,con la

presenciade unamuestrade ToESy 3 con infecciónmixta.

4. BUSQUEDADE RESISTENCIAA CMV EN GERMOPLASMA DE PIMIENTO.

Se hananalizado160 lIneascorrespondientesa las siguientesespecies:

N2 delineasanalizadas Especie Procedencia22 C. annuum Perúy CostaRica4 C. baccagum Perúy CostaRica82 0. chinense Perú32 C. frutescens Perú2 0. pubescens CostaRica18 C.spp. PerúyCostaRica

Algunas de estas160 líneasprocedíande los mismosgenitores,pero por no

serlíneashomogéneasseanalizaronpor separado.

87

cultive Total ¡AL0/1

BA aa—~—j castilla L.6n ION MU NA ¡PO 8EV ZAlfalfa 0/1Borraja 1./6

E—0/2

—1./6

Eraesicas 0/2Gorbanzo 1./IB O/lS 1,/3Maba 0/1 OIlJudía 5./84 1444 3447 1./33Maíz oíí OIlMala hierba 3./6 2,14 0/1 1./1Melón 2.12 1,/1 1,11Pepino 0/2 0/2Pimiento 14./306 6+116 12+139 0/3 2.12 0/2 5,/20 3./6 26,161 25+179 10+120 4+130 2./30Tomate 26+137 24+126 0/6 0/1 2./4Total 35+1468 35./53 12+/46 0/3 2,/2 3,/SO 6+126 4./7 26./61 25.119 13./61 1./3 4./SO 4./32

Eig..34. Incidenciade CMV en diferentescultivos y provinciasespañolesen lacampañaagrícolade 1991.

PROVINCIAS TESTADAS

n: plantas infectadas cont: plantas analizadas

INCIDENCIA TOTAL DE CMV:28,63%

~io,

1—

—

SI—<o

eq.-.cq

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1.4‘-ao>eo>‘fi0ocU04‘o0‘o4)

‘a‘ua,o>‘~uo>O>‘ecao0

.

-ou,u,

e‘e—O

b0~

cu

0‘~

‘4

.21

En el anexo2 seconsignanlos datosdeestetrabajo,mostrandolas especies

analizadas,la clave paracadalínea, su procedencia,fechade germinación,n2 de

plantas trasplantadas,n~ de bandejaa la que se trasplantaron,n2 de plantas

inoculadas,plantasque mostraronsíntomas,resultadodel ELISA, plantasque

fueron posteriormentetrasplantadasa tierra, reinoculaciónde éstasy ELISA de las

plantasreinoculadas.

De todaslas líneasanalizadas,las siguienteshan mostradoalgún tipo de

resistenciao tolerancia(Figura36):

a) N~D25~Z (complejo de C. annuum + C. frutescens+ C. chinense, con

predominanciade O. annuum).En un primerensayoseinocularon5 plantasquQ

resultaronasintomáticas,mientras que el resto de las lineas de la bandeja

mostrabanun mosaicopronunciadoy retrasoen el crecimiento.No se realizó

ELISA por no disponerentoncesde antisuerospara CMV. De estas5 plantasse

obtuvo semillaporautofecundación,queal seranalizada,de 39 plantasinoculadas,

9 resultaronpositivasen un ensayoELISA (23,07%de infección). Al ser cruzada

con CAP1 (O. annuumvar comercial “Botijillo’», sensibleal CMV, sólo se pudo

inocularunaplanta, queno mostrósíntomas.

Seanalizóla líneaparentalNG-025-5,obtenidael añoanterior,y de 5 plantas

inoculadas,todasresultaronasintomáticas.Al realizarcrucescon la línea NG-047-

8 (complejode C. annuum+ O. frutescens + O. chinense,con predominanciade C.

chinense>,y también sensibleal CMV, se inocularon 5 plantas. En ninguna de

estasplantasinoculadassepudo detectarvirus porELISA. En cambio, otraslíneas

emparentadasanalizadas(NG-025-1-2y NG-025-1-4)resultaronsensibles.

Estosdatosparecenindicarque setrata de una resistenciadeterminadapor

un solo gendominante(ver Discusión).

b) NGD44~á (complejo de O. annuum + O. frutescens + O. chinense, con

predominanciade O. fruteacena).En un primer ensayoseinocularon5 plantascon

CMV, de las que cuatro resultaroncon fuertes síntomasy una permaneció

asintomáticay muy vigorosa.Comola línea eraheterogénea,sedecidió seleccionar

estaplantaasintomática.De la descendenciaobtenidapor autofecundacióndeesta

planta, seinocularon87 plantas,de las que 4-4 resultaroncon síntomas(50,57%de

infección). De estos datos sólo se puedededucir que esta resistenciano está

codificadapor un solo gen, y que al menosuno de los genesque intervienenes

dominante.Otraslineascercanasanalizadas(NG.044-1-1,NG-044-1-2,NG-044~1-3,

NG-044-1-5,NG-044-5-1,NG-044-5-2,y NG-044-5-3)resultaronsensibles.

c) NG21&&4 (O.chinense).Estalíneaseanalizópor tresveces.La primeravez, en

febrero de 1991, las plantasse mantuvieronen cámaraclimatizadaa 25-280C,y

90

o04o>04a>oe.,dCCoEo>-eene.>o,4

,CA)

Coo,

ta)e>oen3.44

,en-c4)o4,4>

-

O>re02ena>

1

--

.~t”t

-

resultaronen un 100% infectadaspor ELISA, aunque las plantas resultaron

asintomáticas.Se pusootro lote enjulio de 1991, estavez en invernadero,dondese

alcanzantemperaturasdehasta350C en estaépoca,y seobtuvo estavez un 25% de

plantascon síntomas.En un terceranálisisrealizadoen marzode 1992,otravezen

invernadero,pero en estaépocacon temperaturasmáscontroladasde alrededorde

18-230C,seobtuvootravezun 100%deplantasasintomáticasdeuntotal de 23 quese

analizaron.

Estosdatosparecenindicar que se trata de una toleranciadependientede la

temperatura.

Nflfi~Q (C.pubeacen.s).En un primer ensayoal inocular dosplantasresultaron

las 2 negativasen el ensayoELISA. Repitiendocon 6 plantas,las 6 resultaron

negativas.En un tercerensayo,de un total de cuatroplantas inoculadas,dos

resultaroninfectadas.Es posible,queestalínea, por presentaruna hoja rugosay

muy dura, resultemásdificil de serinfectadapor inoculaciónmecánica.

e) En unafasemáspreliminarestánlas lineasNfl.1~441(C. annuum),de la que 8

plantasinoculadasfueron ELISA negativas,y la NLkB5AAJC.annuum),de la que

en 13 plantasinoculadassólo unaresultéinfectadapor ELISA.

92

IDISCUSROW

g3

V. DISCTJSION

1. TECNICAS DE DETECCIONDEL VIRUS DEL MOSAICO DEL PEPINO

(CMV).

Siendo la detecciónde virus muy importantepor múltiples razones(ver

Introducción),se decidió estudiary compararvarias técnicasparaun diagnóstico

rutinario de un elevadonúmerode muestras,aplicándolasa la detecciónde un

virus de gran importanciaeconómica,presenteen numerososcultivos hortícolasy

distribuido por todo el mundo,como es el CMV. Estastécnicasfueron: ELISA con

anticuerpospoliclonalesy monoclonalescomerciales,análisis electroforéticode

RNAs bicatenarios, hibridacionessobre membrana (“dot blot”) con sondas

especificas,y amplificación enzimáticade una parte del genomaviral por la

reacciónen cadenade la polimerasa(RT-PCR>.

ELISA

La técnica inmunoenzimáticaELISA (Clark y Adams, 1977) ha sido

utilizadaparadetectarantígenosvirales en extractosde maceradovegetal de un

amplio número de plantasinfectadas.Aunque es la técnica de diagnósticomás

utilizada, se ha descritoque no da buenosresultadosen la detecciónde virus

inestablescomo el CMV (Morris et al, 1983).probablementeporpresentarCMV una

baja capacidadinmunogénica(Francki et al, 1979), siendo por tanto difícil

conseguirantisueroscon un titulo alto si no se estabilizanpreviamentelas

partículas(Portaet al, 1989>. En nuestrosexperimentosresultó la técnicamás

sencilla y rápida de las ensayadas,y aunqueno se ha utilizado un sistema

automatizado,salvo en la lectura espectrofotométricade las placas,el nivel de

simplificaciónconseguidoesmuy alto. Además,el ensayoELISA con anticuerpos

policlonalesha mostradoser de una elevadasensibilidad para detectarCMV

(Figuras 16 y 18>. El mayor problemaque encontramoscon esta técnicaes la

presenciade numerososcasosdudososque no se sabesi correspondena valores

negativos(plantasno infectadas)altos o a valorespositivos (plantasinfectadas)

débiles:a) por un lado en un estudioestadísticode las absorbanciasobtenidascon

numerosasplantassanas,se obtuvo unamediade 0,08 para pimientoy tabaco,

aunquecon una desviación estándarde 0,18; ésto suponeque con el criterio

94

recomendadopor la casacomercial de considerarcomo positiva aquellasmuestras

quepresentendosvecesla absorbanciade la media de las plantassanas,se está

incurriendo en numerososerrores de tipo 1 (falsos positivas), y b) al analizar

plantascon absorbanciasentre dosy tres vecesla media de las sanaspor otras

técnicas(PCR o inoculacióna plantashuésped)seobtuvieronen unoscasosvalores

positivos y en otros valores negativos.Se puedefijar un criterio más o menos

restrictivo paradeterminarlas respuestaspositivasen 2 ó 3 vecesla absorbancia

obtenidacon las muestrassanas(Tijssen, 1985>,pero en cualquiercasoseincurrirá

en un númeromayor o menorde falsospositivos o falsosnegativos.Una forma de

resolver los resultadosdudososseria por análisis de las muestrascon otras

técnicas.

Los anticuerpospoliclonalespolivalentesde la casa comercial Sanofl no

reconocieronel 16,3% de las muestraspositivas,que sí reconocieronlos de Agdia.

Esteresultadoindica que o bien hay epitoposen algunosaisladosde CMV que los

anticuerposde Sanoil no reconocen,lo cual no seríade extrañarpor la enorme

variabilidad serológicaque presentaCMV (Palukaitis et al, 1992) o bien los

anticuerposde Agdia presentanreaccionescruzadascon algún otro virus

relacionado,y que los anticuerposde Sanofi no presentan,o una combinaciónde

ambos.El problemade los anticuerposcomerciales,que son los utilizados en los

Laboratoriosde Diagnósticode los Serviciosde Protecciónde los Vegetalesy en los

ServiciosdeSanidadVegetala nivel nacional,que requierenuna estandarización

de las técnicas,esquenormalmentesecomercializansin la información adecuada:

si se utiliza el mismo aisladopara obtenerlos diferenteslotes, si se inmuniza

siempreel mismo animal, si se utiliza siemprela misma planta huéspedpara

purificar el virus, si presentanreaccionescruzadascon otros virus, el título de los

anticuerpos,etc.Es por tantoimportanteevaluarlos antisueroscomerciales,que a

estasdesventajasafiadenel estarpreparadosen su mayoría contra aisladosde

otros países,y sedesconocesu comportamientocon los aisladosnacionales.Según

estosresultados,se podríapensarquepuedehaberalgúnaisladode CMV que no

hayanreconocidoningunode los dosanticuerpos.

Los anticuerpospoliclonales, en general, comprenden un número de

diferentesanticuerposquehan sido producidoscontralos epitopospresentesen el

antígenoinyectadoa la especieanimal inmunizada.Por tanto, son capacesde

reaccionarcon una amplia gamade cepaso variantesdel - virus que compartan

epítoposcomunes.En cambio, los anticuerposmonoclonalesson específicosde un

solo epítopo,y reaccionansólo con aquellascepasdel virus que lleven eseepítopo.

Los anticuerposmonoclonalestienenpor tanto un mayorpotencialparadiferenciar

cepas,aunquese puedeprepararuna mezclade anticuerposmonoclonalespara

obteneruno polivalente,que pareceserel casode los comercializadospor Sanofi. El

problemaactualmentede estosanticuerposen generales su coste,y que haymuy

pocoscomercializados,peropermitiríanunamayorestandarizaciónde la técnicay

unamás fácil interpretaciónde los resultados.

En nuestrosresultadosse ha conseguidouna mayor detectabilidadcon

anticuerpospoliclonalesque con los monoclonales(Figuras16 y 17), probablemente

por unadiferenciaen el título, quelas casascomercialesno indican.

Otrode los factoresimportantesa estandarizarpara conseguiruna buena

interpretaciónde los resultadosesel tampóndeextracciónque seutilice, puescomo

se presentaen la Tabla 3, con un tampón tris o citrato se consigueuna mayor

diferenciaentrelas absorbanciasde las plantasinfectadasy las de las sanasque

cuandose utiliza un tampón fosfato. El tampón fosfato, de uso muy extendido

probablementeporserel másutilizadoparatejidos animales,en los que seempezó

aplicandoel ELISA, no pareceserel másadecuadoparalos tejidos vegetales,cuyos

extractosson en generalmás ácidos,segúnlos resultadosobtenidostambiénpor

otros autores(Walteretal, 1983;Fresno,1992).

Análisis de RNAs hicatenarios

El análisis de los RNAs bicatenarios,utilizado para el diagnóstico de

enfermedadesvirales (Matthews, 1991), tiene una aplicación limitada para un

diagnósticorutinario de un númeroelevadode muestras,por la complejidaddel

procedimientoy la utilización de componentesorgánicosnocivos (Morris et al,

1983>. Además,el limite de dilución obtenidopor análisis electroforéticode los

RNAs-bc de CMV no es comparablecon el obtenidocon los demásmétodos.La

principal utilidad de estatécnicaessu capacidadde detectarRNAs satélites,virus

crípticos,enaquelloscasosen los queno sedisponede ningunainformación previa

del virus en los que puedeaportardatos parasaberal menos el grupo al que

pertenece,o paraaquellosvirus de los que no se dispongani de antisueros,ni de

sondas,ni datosde secuenciaque permitanrealizaruna RT-PCR(Coifin y Coutts,

1992).En estatesissehanobservadoRNAs satélitesen unamuestrade tomatecon

síntomasde necrosisy ausenciade ellos en otra muestrade pimiento(Figuras9 y

19 B), lo que concuerdacon observacionespreviasde la presenciade éstosencampo

(Murantet al, 1990;Jordáetal, 1992).

96

Hibridacionessobremembrana(“dot blot”

)

Otra técnicaalternativaa la detecciónrutinaria de maceradovegetalde

plantasinfectadasesla hibridación sobremembranas(“dot blot”) utilIzando una

sonda marcada radiactivamente.Aunque se inició como una técnica muy

prometedora,no se ha extendidosu uso, principalmenteporque no resultan

análisismás sensiblesy sí máslaboriososque el ELISA.

Comosondasparaestatécnicasehanutilizado dosdonesde cDNA de CMV.

La sondapZU123A que contiene el cDNA del gen d6 la proteína de cubierta,

presentala ventajade hibridar con el RNA 3 y conel RNA 4, por contenerambos

dicho gen (Gould y Symons,1978), aumentandola señal de hibridación. Con la

sonda45080, portadoradel extremo 3 del RNA 2, por estaresta región muy

conservadaen los 4 RNAs (Gould y Symons,1977, 1978), tambiénpresentaría

hibridación parcialcon éstos.

La amplificacióndel cDNA del clon 45080sellevó a cabopor métodosclásicos

(Sambrooket al, 1989),pero el clon pZU123A se amplificó por POR con cebadores

específicosdel gende la proteínade cubierta,lo cual supusoun importanteahorro

de esfuerzoy tiempo. Se probaron dos tipos de membranaspara evaluar su

comportamientocon un maceradovegetal. En las condicionesutilizadas, la

nitrocelulosapermitía una mayor sensibilidadque el nylon (Figura 20), lo que

coincidecon los resultadosobtenidospor otrosautores(Borja y Ponz,1992).

Se podría haber mejorado la sensibilidad de las hibridaciones con

membranasde nitrocelulosao sondasRNA (Robinsony Romero, 1991>,pero las

- membranasde nitrocelulosasonmás frágilesy las sondasde cRNA presentanel

inconvenientede que el RNA se degradafácilmentepor acción de las RNasas,

presentesen las manos, el material no estéril, y el propio macerado,lo que

dificultarla su utilización como sondaparaun númeroelevadode muestras.

Paraun diagnósticorutinario es aconsejablela utilización de marcaje no

radiactivoa fin de evitar los riesgosque implica la utilización de radiactividad.La

hibridaciónconsondasno radiactivasestádescritacomo un métodomenossensible

(Zwadyk y Cooksey, 1987), aunqueKanematsuet al (1991), y Hopp et al (1991>

alcanzanunosnivelesde detectabilidadmuy considerablesparavirus y viroides de

patatautilizandosondasmarcadascon biotina(ver Tabla 6).

97

El hechodequeel ensayode transcripcióninversaseguidade la reacciónen

cadenade la polimerasa(RT-PCR> sea muy sensible,no radiactivo, rápido y

necesitepocasmoléculasde RNA molde haceque seaunabuenaalternativaa los

ELISAs convencionalesy a la hibridación sobremembranaspara la detección

rápida de virus. El diseño de los cebadorespara detectarCMV, basadoen la

comparaciónde secuenciasconocidasdel gen de la proteínade cubiertade los dos

subgrupos,y en el queseeligieron regionesconservadasen el RNA 3, da lugar a

ensayosde amplio espectrorespectoa CMV, ya quese pudierondetectartodos los

aisladoscon que se comprobó,pertenecientesa diferentessubgruposy distintas

zonas de origen. Sería posible igualmentediseñarcebadoresespecíficospara

diferenciarlos dossubgrupos,ya que entreambossólo hay un 75% de homología,

frenteal 95% existenteentrecepaspertenecientesal mismo subgrupo(Quemadaet

al, 1989; Rizzo y Palukaitis, 1989>. Recientementese ha publicado quese pueden

diferenciarlos subgruposde CMV medianteRT-PCR utilizando cebadorespara

amplificar la proteínade cubierta,y posterioranálisiscon enzimasde restricción

(Rizoset al, 1992).

Unade las mayoresventajasde la PCR, su sensibilidad,puedeconvertirse

en uno de sus mayoresproblemas.En un principio se obtuvieronen algunos

ensayosamplificacionesen plantas no inoculadas,debido probablementea

contaminacionesen el momento de la recogida de las muestras. Esto puede

dificultar el diagnósticorutinario cuandoesel propio agricultor el que recogelas

muestraspor posiblescontaminacionesde muestrasnegativascon otras positivas

recogidasanteriormentecon las manoso herramientas,por lo quedeberíarecibir

instruccionesal respecto.Estatécnicarequiere,por tanto, unacuidadosarecogida

de las muestras,así como la utilización de materialestéril y desechable,mientras

que conELISA no esestrictamentenecesario,

Otro problemaquepresentaactualmenteestatécnicaesel elevadopreciode

los reactivos,aunqueésteva disminuyendonotablemente.Es de esperar,queal ir

aumentandola demandade éstos,los costesdisminuyan.

Perouna ventajaimportanteesquemientrasELISA requierela utilización

de anticuerpos,y para la mayoría de los virus hay un númeromuy limitado de

anticuerposen el mercado,o paralas hibridacioneshacefalta obteneruna sonda,

los reactivosnecesariospara la RT-PCR son comercialesde uso corriente,y sólo

necesitacebadoresespecíficos,tambiéncomerciales.Sólo es necesariotener datos

96

de la secuenciaviral, pero actualmentese conocela secuenciade un buennúmero

devirus de casitodos los gruposconocidos.

Un resultadosorprendentefue encontrar que no se pueden utilizar

maceradosvegetalesmuy concentrados,pues a la dilución 1/10 no se obtiene

amplificación (Figura 22 B) debido probablementea que los componentesde la

planta o un excesode molde inhiben la transcripcióninversa.Este fenómenoes

frecuentetambiénen las hibridaciones(Maule et al, 1983; Owensy Diener, 1981;

Borja y Poaz, 1992). También se encuentranproblemas con determinados

huéspedescomo el pimiento,en el que no fue posibledetectarpor estatécnicaen

ningún caso el virus en un maceradode esta planta, sabiendoque estaba

fuertementeinfectada.

Límite de detección

En este trabajo se ha utilizado el concepto de limite de deteccióno

detectabilidadcomola cantidadmáspequeñacapazde serdetectadaen un ensayo.

Las detectabilidadesobtenidascon las diferentestécnicaspor otros autorescon éste

y otrosvirus seencuentranen la Tabla 6, en la que tambiénsehan incluido los

resultadosobtenidosenestatesis.Como sepuedeobservarenestatabla,el límite de

detecciónobtenido tanto con virus purificado como con extractos de tejidos

infectadossonequivalentesa los obtenidosporotrosautores.

Es d.itTcil compararunastécnicascon otras,por detectarcadauna diferentes

partesdel virus, ya que ELISA, como método inmunológico, detectaproteínas

virales (que puedenir asociadasa RNA o no>, y PCR e hibridacioneslos ácidos

nucleicos,que puedenestar en forma monocatenaria(formas encapsidadas)o

bicatenaria(formas replicativas),etc. Con la técnicaELISA se detectó 1 ng de

partículas virales de CMV, y teniendo en cuenta que éstas contienen

aproximadamenteun 18% de RNA, estacantidadequivaldríaa unos 180 pg de

RNA. Porelectroforesisen gel de productosamplificadosporRT-PCRsedetectaron

0,1 pg (unas50.000 partículasvirales), lo que suponeuna cantidad1.800 veces

menor,esdecir, ennuestrascondicionesde ensayoRT-PCRtiene unasensibilidad

tres órdenes mayor que ELISA para detectar partículas virales de CMV

purificadas.

Cuandose utiliza tejido infectado,en nuestrascondicionesELISA es más

sensibleque las hibridaciones,ya que requirió 1,4 ~xgde tejido infectado en un

VIRUS Y

VIROIDES

VIRUS PURIFICADO REFERENCIA

ELIsA HIBRIDACIONES PCR ELISA HIBRIDACIONES PCR

Clsrk y Adam-.. 1917

RRSV <lOng/oil

¡‘PV <1 ng/ml 1/100000

HpMV <10 ng/oil 1/50000

BWYV 100 pg ~fr3~5~ jons .t al, 1991

BWYV Hewinaa y IYArcy. 1984

BYDV 30.60 mi Liste, y Rochov, 1979

BVMV 600ng 300pg(32P) 1/125 1/2000(t) Vunshetsl,1990

CLRV 6.24 ng/ml 1/5000 Edwsrd. y Cooper, 1985

CLRV 4Ong 1/160 1/640 (32¡>) 2,51104(t) Borja y Pon. 1992

<200 ng/mI)

CMV 0,01.0,1 ng 1/10000 Cera .4 .1. 1978

PLRV 1.6 ng-64 pg(~P> 1/25.1/625 <32P> Rohinson y Romero, 1991

Potyvirus - - Langeveld etal, 1991

~ g Spg<32P) 1/2000 1/625(32P) Varverietatí98í-

¡‘PV 10 fg WeÚel st .1. 1991

PPV 1/5200 1/12000 1/12000(t) Korachineck st .2, 1991

1/50000(Biot)

PSTVd 0.2.20 pg (Biot) 1/1250 (B¡ot) Konen,atsu et .1. 1991

200 ng (Digoz) 1/2~0 (Digoz)

PVX 4,Sng sopg32P> Baulcombo et al, 1984

(2 1.Eng/ml)

505V 400 g lpgÓ32P) 1/625 1/125(32P) Chuetal,1989

TMV 5.IOng ~ <32p> Selsetal. 1964

TMV 2ng(~P) Kc*~ etal. 1988

ToR5V 40 ng/mI ¡/4000 Converse, 1918

T5WV 1 1/10000 1/50000 deflaanetsl. 1991

CMV lis los, mi) 0,1 ít4.í04 1/500<22P) 10’ (t) ESTATESIS

0): detección de producto. amplificados por electroforesis. ¡¡lot:sondes marcada radiactivan,ente

sondas marcadas con biotina. Digox: sondas marcadas con digoxigenina. (32¡’>.

IahiaA. Límitesdedeteccióndevirusy viroidespurificados,asícomodejugo bruto demuestrasinfectadas,observadospordiferentesautorescon trestécnicasdistintas.En estatablaseincluyenlos resultadosobtenidosenla presentetesis

ensayocon anticuerpospoliclonales,mientrasque las hibridacionesnecesitaron20

gg. Este resultadocoincide con lo descritopor Chu et al (1989b). RT-PCR sigue

siendola técnicamás sensible,puesllegó a detectar1 ng de tejido infectado.Por

tanto, en lascondicionesensayadas,RT-PCRresulta1.400 vecesmás sensibleque

ELISA con anticuerpospoliclonales(equivalentea la diferenciade detectabilidad

obtenida con virus purificado) y ELISA unas 10 veces más sensibleque las

hibridacionescon sondasmarcadasradiactivamente.

2. DETECCIONDE VIRUS Y PATOGENOSSUIBVIRALES PORRT-PCR PREVIA

CAPTURA EN UNA PLACA DE MICROTITULACION.

Con el fin de resolverlos problemasquepresentabael maceradovegetalde

determinadoshuéspedesinhibiendo las reaccionesde RT-PCR y parafacilitar el

diagnósticorutinario de un n2 elevadode muestras,seha desarrolladoun método

muy sensiblede diagnósticoviral queincluyeun pasoprevio de purificación parcial

de las partículasviralesmediantela unión a anticuerposinmovilizadosen una fase

sólida, seguido de amplificación de parte del genomaviral por RT-PCR. Una

importantecaracterísticade estemétodoes que la preparaciónde las muestras

requiereexactamenteel mismo trabajoqueparala técnicaELISA y no necesitade

laboriosasextraccionescon fenol. La posibilidadde llevar a cabotodo el procesoen

una placa de microtitulación utilizando termocicladoresadaptadosa la placa, y

fluorímetroslectoresde placaspermitiríaunaautomatizaciónexactamenteigual a

la queseconsiguecon la técnicaELISA, y llevadaa cabopor personalcon un grado

técnicode preparaciónsimilar.

El limite de detecciónconseguidocon estemétodoessemejanteal obtenido

con RT-PCR realizadadirectamentecon maceradovegetal, y éste de orden de

magnitud normalmentesuperior al descritopara otros virus RNA de plantas

realizandopurificacionespreviasdel RNA (verTabla6). Esto ocurreprobablemente

porquea] ir diluyendoel maceradovegetalse consigueprácticamenteeliminar los

posiblesinhibidoresde las reaccionesenzimáticas.

Unade las característicasmásimportantesdel métodoesel hechode que el

cDNA pueda ser sintetizadodirectamentea partir de las partículas virales

retenidasen el pocillo medianteun anticuerpo.Esto implica que o bien es algún

intermediarioen el ciclo de la replicaciónparcialmenteasociadocon la proteínade

cubierta el que expone, al menos parcialmente,el RNA a la acción de la

101

transcriptasainversa, o bien que los viriones se distorsionanen el procesode

inmunocapturalo suficiente como para permitir el accesode la enzimaal RNA

normalmenteoculto. Nuestra evidenciaexperimentalactual no permite todavía

distinguir entre estas posibilidades,y probablementeambaspuedenocurrir

simultáneamenteen unamuestrade maceradovegetal. Los experimentosen los

que se inmunocapturóGFLV purificado y tuvo lugar una amplificaciónpor PCR

(Figura 28> demuestranque la segundahipótesises posible.Resultadosde otros

autoresindican que los anticuerposunidos a una fase sólida pueden producir

cambiosconformacionalesen las partículasvirales: Dekker et al (1989), realizando

estudioscon diferentesanticuerposmonoclonalespreparadoscontrala proteínade

cubiertade TMV, observaronque algunosde estosanticuerposno reaccionancon

los antígenosen una fase líquida, mientras que son capacesde unirse a ellos

cuandoestán unidos a una fase sólida. Jaegleet al (1988> observaron que

anticuerposformadoscontraun péptidosintéticode la regiónamino-terminalde la

proteínade cubiertadel tombusvirusdel achaparradopelud¿del tomate(TBSV)

reaccionaroncon el virus completoen ensayosELISA. Dadoqueestaregión amino-

terminal estáen el interior de una cubierta muy compacta,esteresultadodebe

significar que la estructuradel virus se abre lo suficiente sobre la placa de

microtitulación como parapermitir a los anticuerposreaccionarcon esta región

normalmente escondida (Matthews, 1991>. Resultados similares obtienen

MacKenziey Tremaine(1986) con el virus del mosaicode la judía del sur (SBMV>.

En cambio, Dubs et al (1991), trabajandocon TMV atrapadopor anticuerpos

inmovilizadosen una matriz de dextrano(soporteflexible, no rígido), llegaron a la

conclusiónopuesta,es decir que las partículasvirales manteníansu integridad

conformacional,debidoprobablementea utilizar una fasesólidadistinta a la. de los

anterioresautores.

Aparte de estasevidenciasexperimentalesde otros autores,fue revelador

nuestroexperimentoen el queno seutilizaron anticuerpossino queseadsorbieron

directamentelos virus al poliestireno,siendobienconocidoquela adsorcióndirecta

de antígenosa la superficie del poliestirenoa menudoproduce cambios en la

conformacióny antigenicidadde lasproteínasvirales (Al Moudallal et al, 1985;Mc

Culloughet al, 1985;Smithy Wilson, 1986;Jordany Hainmond,1991).En estecaso

sólo seamplificó CMV (Figura29), lo que podríaserdebidoa queenestevirus las

subunidadesproteicasse empaquetanmuy laxas en la cápsidadejandohuecos

(Jacrotet al, 1977)(Figura 6), de forma quelas ribonucleasaspuedenpenetraren

las cápsidasintactas y degradarel RNA encapsidado(Francki, 1968; Habili y

Francki, 1974). De la misma forma podría quedaraccesiblea la transcriptasa

102

inversa. El fracasoen la amplificaciónenzimáticadel resto de los virus parece

indicar que el desensamblajedel virión no estáproducidopor factoresquímicos,

como cambiosen el pH o concentracionesde los componentesdel tampón de la

transcriptasainversa.

Por tanto, estosdatosindican que en nuestrométodola desencapsidación,al

menos parcial, del RNA, podría estarmediadapor su unión a los anticuerpos

inmovilizados en la fase sólida, y dependiendode la naturalezade ésta.Estos

anticuerposunidos a la fasesólida produciríancambios conformacionalesen las

proteínasde cubiertay haríanque el RNA viral quedaraexpuestoa la acciónde la

transcriptasainversa.

Estemétodoparecetenerunavalidezgeneral,ya queha dadoresultadocon

todos los virus y huéspedesensayados:BYMV, CLRV, CMV, CTV, GFLV, PLRV,

PMMV, y TSWV, ademásde RNA satélitede CMV y el viroidePSTVd (Tabla4), en

huéspedestan distintos como tabaco, pimiento, haba,vid, patata, crisantemo,

naranjo,o nogal.

En un dignóstícorutinario, la especificidadrequeridavaría dependiendode

los casosparticulares,desdela necesidadde identificar una cepaviral particulara

la convenienciade detectarcualquiermiembro de un grupo particularde virus, o

incluso cualquiervirus presenteen la muestra.La especificidaddel método de la

inmunocaptura-RT-PCRresidetanto en la interacciónvirus-anticuerpocomo en la

del cebador-RNAmolde. Las opcionesparacontrolar la primera estánlimitadas a

la disponibilidadde anticuerposcomercialescon diferentesgradosde especificidad.

La secuenciade los cebadoresy las condicionesde amplificación (entre otros la

concentraciónde ionesMg++, el númerodeciclos y las temperaturasde anillado)

puedensermanipuladasparaespecificidad.Con algunospatógenosseobtuvieron

siemprefragmentosamplificadosadicionalesa los esperados(casosdel PMMV y

RNA satéliteasociadoal CMV), probablementeproducidospor hibridacionesde los

cebadores con secuenciasparcialmentecomplementarias(señaladasya enresultados)que no setuvieron en cuentaenel momentode diseñarlos cebadores,

bien por carecerde la secuenciacompletaen esemomento,bien por no utilizar

programasinformáticos que abarcarantoda la secuenciadel patógeno.En esta

tesis, en un principio se diseñaronlos cebadoresbasándoseen las secuencias

publicadasde los diferentespatógenosy siguiendolas directrices de Innis et al

(1990),y posteriormenteseutilizó el programaOLIGOTM que permite una mayor

estandarizacióny utilizar secuenciasde un banco de datos. Los cebadoresse

puedendiseñarpara detectargrupos -enteros de virus, como es el caso de los

potyvirus (Langeveidet al, 1991)o luteovirus (Robsrtsonet al, 1991), mediante

103

cebadoresen parte degeneradosdirigidos contra la proteína de cubierta, muy

conservadaenestosgrupos.Porotro lado, a fin deevitar amplificacionesen la PCR

distintas de la esperada,nuestrosensayoshan sido realizadoscomenzandolos

ciclos de amplificacióncon unadesnaturalizacióna 940C del DNA junto con el resto

de los reactivos,exceptola DNA polimerasa,lo que permiteque sedeshagantodas

las posibleshibridacionesde los cebadorescon secuenciasno deseadasy quepueden

darsecuandosehanmezcladotodos los reactivos,en los instantesprecedentesa la

PCR. Hayun mayorproblemade especificidadcon la transcripcióninversa,quese

realizaa 370C, y por tanto a estatemperaturalos cebadorespuedenunirsea zonas

parcialmentecomplementarias,y dar lugara la formaciónde cDNAs no deseados.

Actualmente se están empezandoa comercializar transcriptasas inversas

termoestables,que posiblementeayudarána resolveresteproblema.

Haydescritosvarios métodosde detecciónde los productosamplificados.El

más clásico es la electroforesisen gel de agarosao poliacrilamida seguidade

tinción con bromurode etidio. Se puedeaumentarla sensibilidado comprobarla

especificidaddel productoamplificado mediantehibridacióncon sondasmarcadas

(Sailci et al, 1988;Innis, 1990>.Otros formatosensayados,hastaahorageneralmente

sólo con virus animales,han sido: ensayo“sandwich” enel queel DNA amplificado

con nucleótidosconteniendobiotinasecapturaa una fasesólida,y posteriormente

se detectacon estreptavidina-avidina(Keller et al, 1991; Korschinecket al, 1991);

unavarianteen que el DNA amplificadose inmoviliza en placasELISA, se hibrida

con una sondamarcadacon biotina, y éstapor ¡3-galactosidasasconjugadascon

estreptavidina(Inouye y Hondo, 1990>; por fluorescencia(Dahlén et al, 1991;

Landgrafet al, 1991>; o porquemilumiiscencia(Scbnxidt, 1991).

Paranuestroformatode ensayoen placasde microtitulación, la utilización

de la fluorescenciacomo forma de deteccióny cuantificaciónde los resultados

parecióla forma más sencillade evitar la electroforesis,no adecuadapara un n2

elevadode muestras,y los resultadosobtenidosparecenprometedores.La presencia

de cebadoresy nucleótidosremanentesno incorporadosno pareceaumentarel

fondo, permitiendouna cuantificacióndirectadel DNA amplificado sin tenerque

eliminar estoscebadoresno incorporados.Además,es un método más rápido y

barato que la utilización de cebadoresmarcadospor biotina y compuestos

fluorescentesdescritospor Landgraf et al (1991>. Aunque se pierde alguna

información a causa de que la cuantificación fluorimétrica no permite una

identificación del producto de amplificación, la utilización de anticuerpos

específicosen la inmunocapturaproveeun grado adicional de especificidadpara

104

evitar los falsos positivos. Además en aquellos casos que se considerara

conveniente,sepodría analizarunaalícuotaporelectroforesis.

Hastaahora los RNAs satéliteshabíansido detectadospor hibridaciones

(Rosneret al, 1983; White y Kaper, 1987;Gállitelli et al, 1988;Jordáet al, 1992),por

análisiselectroforéticode los RNAs bicatenarios(Kapery Díaz-Ruiz,1977; Valverde

y Dodds, 1986; Romeroet al, 1988) o incluso por detecciónserológica de éstos

(García-Luqueetal, 1986>.En estatesissehan detectado,ademásde por análisisde

los RNAs-bc, por amplificaciónpor RT-PCR con cebadoresespecíficosde las cepas

necróticas,y por hibridaciónde los productosamplificadoscon sondasespecíficas.

Los cebadoresestándiseñadospara detectarsecuenciasconservadasen las

poblacionesnecróticas,aunquedebido a una alta homologíacon las variantesno

necróticas,esde esperarquedetecteunagran mayoríade éstas.Pareceque la RT-

PCRpreviacapturacon anticuerposespecíficosparaRNAs bicatenariosseríamuy

indicada en el análisis rutinario de RNAs satélites,frente a la complejidad del

procedimientode las hibridacioneso del análisis de los RNAs bicatenarios.No

pareceque sehayaextendidoel usode los anticuerposparasudetección.

3. DETECCIONDE CMV EN CAMPO.

CMV ha sido descritocomo un virus importanteen los cultivos hortícolasen

España,tanto sólo como asociadoa RNAs satélites(Peña-Iglesiaset al, 1979;

García-Luqueet al, 1983; García-Luqueet al, 1984; Luis-Arteagaet al, 1988; Luis-

Arteaga,1989; Murant et al, 1990; Jordáet al, 1992>. A la vez que se recogieron

muestras- paraestudiarcon ellaslas técnicasde detecciónde CMV, se estudióla

dispersióndel virus en el campo,e identificaron los subgrupospresentesen las

diferenteszonashortícolas.

Los porcentajesde infeccióndel 28,32%encontradosen 1990(Figura 32> y de

un28,63%en 1991 (Figura33>, aunqueel númerode muestrasanalizadasde cada

cultivo sea limitado y por tanto la incidencia de CMV no tenga significado

estadístico,indican unaalta y constantepresenciadel virus en campo,así como un

porcentajede infecciónsorprendentementesemejanteentresi y al encontradopor

García-Luqueet al (1983>del 30% en unaprospecciónrealizadaen variasregiones

españolasdurante3 años(1979-1982),y analizandolasmuestraspor síntomassobre

plantasindicadoras,microscopiaelectrónicay ensayosserológicos.El criterio que

seha utilizado para considerarunamuestracomo positiva por ELISA esbastante

105

restrictivo, y parecemuy posible que los anticuerposutilizados no hayan sido

capacesde reconocertodos los aisladosdel virus por presentaréste una gran

variabilidadserológica,por lo quees posibleque el porcentajede infecciónseaaún

ligeramentemás alto.

Se hanencontradolos dos subgruposen España,distribuidosal parecerpor

zonasy porépocasdel año(Figura34).Es lógico quepredomineel subgrupoDTL, ya

que las cepasde ToRS son termosensiblespor multiplicarse mal a temperaturas

elevadas(Marchouxet al, 1976; Douineet al, 1979 a),y Españaesun paísen el que

en veranosealcanzantemperaturasmuy elevadasen general.Ahora bien, en este

resultadoparecehaberinfluido notablementela épocaen que se recogieronlas

muestras,ya queMurant et al (1990)ensusprospeccionespor la zonade Levantey

Badajozencuentranun 85% de cepastipo ToRS, pero estasmuestrasserecogieron

a principios dejunio en una épocamuy tempranade la campañaagrícola,y Quiot

et al (1980)ya observaronenel surdeFranciaque enlos mesesde veranocambiael

predominiode cepasToRS a DTL, por selecciónde lascepasmás termorresistentes,

lo queha sido comprobadoencondicionesde invernadero(Douine et al, 1979 a). En

cambio,la mayoríade los análisisserealizancon muestrasprocedentesde cultivos

que estánmás avanzados,y los síntomasde virosis son más evidentes,lo que

explicarlaun mayorpredominioen estaépocade CMV tipo DTL. En Galicia, con

veranosmás suaves,sólo seha encontradoToRS. En La Rioja se ha encontrado

ToRS tanto en una borraja recogidaen abril como en pimientos recogidos en

octubre,lo que pareceindicar que es un subgrupoconstanteen la zona.Aunque

estaregión essemejantea la de Navarra, en la que se identificó exclusivamente

DTL en la mismaépoca,esposibleque la proximidaddel río Ebro a la zonaenque

se recogieron las muestras cree un microclima especial. En Badajoz se

encontrarontanto muestrasinfectadascon CMV-DTL, como una con ToRS, así

como tres que parecíaninfectadascon ambos. Estos resultadosparecenestar

relacionadoscon la épocaen queserecogieronlas muestras,en el mes de julio, y

comparandocon lasobservacionesdeQuiot et al (1980)y Douineet al (1979 a> parece

queseríala épocade transiciónde cepastermosensiblesa termorresistentes.Estos

datosde los subgruposestánen concordanciacon la existenciade un gradienteen

el que aumentala presenciade DTL segúnaumentala cercaníaal ecuador:en

Alemania, Inglaterra y Hungría se ha encontradoToRS, en Francia, España,

Argelia y Etiopía (clima mediterráneoo subtropical>se han encontradolas dos

poblaciones,mientras que en Guadalupe,con un clima tropical, sólo se ha

encontradoDTL (Quiot et al, 1979a).

106

En nuestrosexperimentoshemosobservadoque el análisis de las muestras

por ELISA-TAS debehacerserápidamente,en casocontrario los epítopospropios

del subgrupose pierden,aunquela muestraes reconocidapor los anticuerpos

policlonales.Haaseet al (1989> observanque la diferenciaciónde los serotiposestá

basadaen neatapos,solamentepresentesen la partícula viral intacta, y en

maceradovegetallas partículas virales, especialmentelas del grupo DTL, se

degradanrápidamente.

4. BUSQUEDADE RESISTENCIAEN GERMOPLASMA DE PIMIENTO.

La mejoragenéticapara resistenciaes un procesolargo y laborioso,pera la

ampliadistribución del CMV y las grandespérdidaseconómicasque ocasionaen

plantashortícolaslo justifican. Otra forma de conseguirresistencias,como es laobtenciónde plantastrasgénicas,tambiénimplica un procesolargo y laborioso,y en

el casodel pimiento aún estáen una fase muy preliminar, puesaunquese ha

conseguidoregenerarexplantos,todavía no se ha obtenido ningún pimiento

transgénico(ver introducción).

En la presentetesissehanbuscadonuevasfuentesderesistenciaa CMV en

una colección de líneas de pimiento del CCRF, que resulta un material muy

interesanteparaestepropósitoporvariasrazones:a) procederde la zonaoriginaria

delgéneroCapsicum,en Centroy Sudamérica;b) habersido recogidasLa mayada

de las plantascreciendosilvestres;e) estarconstituidopor variasespeciesdistintas,

algunasde ellas sin clasificar (C. spp.) d) muchasde las lineasno ser especies

homogéneas,sino mezclade C. annuum,C. chinense,y C. fratescens,ya que en el

pimiento, al ser ligeramentealógamo, son muy frecuenteslos cruzamientos

interespecíficos.Estas característicashacen que estas líneas presentenuna

considerablevariabilidadgenéticaque constituyeunabuenafuentedondebuscar

resistencias.

En el análisisde estaslíneaspor inoculaciónmecánicadel virus y posterior

observaciónde las síntomasy a vecesELISA, sehanencontradaen estudiasmáso

menospreliminaresvarias resistencias,resultadoque puedeserde gran interés

pueshastaahorano seconoceningún mecanismode resistenciaeficiente a CMV

enlas especiesde Capsicum.

Los resultadosde la segregaciónobtenida al autofecundarplantas

resistentesde la línea NG-025-5-2apuntanfuertementea queestaresistenciaestá

107

codificadapor un salo gen que se camportacomadominante.Si la plantaque se

autofecundótenía un genotipo Rr (resistente)se obtendríauna descendenciapor

autafecundaciónIRE 2Rr: lrr, quecoincidiría con el 23,07%de plantassensibles

(genotiporr) obtenido.En los cruzamientospruebacon plantassensibles(Rr x rr)

darlauna segregación1 Rr: 1 rr. En un cruce quese realizó sólo se obtuvo una

planta,que resu.ltóresistente.

El análisisde plantasprocedentesde semillasde genitoresde esteindividuo

sonconsistentescon estahipótesis.Las resultadosobtenidosconplantasde la línea

NG-025-5 parecenindicarque fueradegenotipoRR, puestodasfueranresistentes,y

al cruzarcon unaplantasusceptibleseobtuvo un 100%de plantasresistentesen un

total de 5 plantas,que corresponderíanal genotipoRr. En cambio, las líneasNG-

025-1-2y NG-025-1-4,que resultaronsensibles,corresponderíana un genotipo a.

Antes de estar segurosacercadel control genéticode esta resistencia,será

necesarioestudiarmás generaciones.

Esta línea, aunquees una mezcla de C. annuum, C. chinense, y C.

frutescenstiene predominanciade C. annuum,lo cualesunaventajapor serésta

la especiemás cultivadaa nivel mundial, y facilitaríala introducciónde estegen en

variedadescomercialesmediantemejoragenética.

No son frecuenteslas resistenciasen pimiento controladaspor genes

dominantes.Pochard(1982)encontréun gen mv mayordominantede resistenciaa

instalacióndel virus, tambiénen unapoblaciónsilvestrede C. annuum,aunquela

mayoríade las resistenciasa CMV encontradasson poligénicas(Lecaqet al, 1982;

Pochard,1977; Pochard,1985; Pochardy Daubéze,1989).Se conoceunaresistenciaa

CMV controladaparun gen dominantesimple en Phaseolusaureus(Sittiyos et al,

1979).

Estudiandolos orígenesde estalínea,pareceprocederde una zona costera

llanadel Perú,dondesecultiva extensivamenteel algodón,y siendoAphis gossypii

un pulgón muy frecuenteen este cultivo, ademásde uno de los más comunes

transmisoresde CMV (Palukaitiset al, 1992), es posible que hubierauna presión

selectivapositivaen las plantasa adquirirresistenciaa estepulgón.Se ha descrito

un casode resistenciaa Aphis gossypii en el melón PI-161-375resistentea CMV

(Lecoqet al, 1979).

En la líneaNG-044-5-4parecehaberuna resistenciaque no estácodificada

por un salo gen, y siendodominanteal menosuno de los genesque intervienen.

Estaresistenciaparecemáscercanaa laspoligénicasobtenidasporPochard(1985>.

Estacaracterísticatiene la ventaja de que, en general,cuanto más compleja o

108

multidimensionalesuna resistencia,parecequees más difícil de servencidapor

patotiposnuevosdel patógeno.

Un casocuriosode toleranciaseobservacon la línea NG-218-8-4,queparece

ser de] tipo termosensible:el virus se replica al ser inoculado, pero sólo hay

aparicióndesíntomasa altastemperaturas.Hay numerosasresistenciasdescritas

dependientesde la temperatura,por ej. la presenteen la línea de Vigna

unguiculataChinesered x Iron al CPMV (Ponzy Bruening, 1986), que muestra

unaresistenciade hipersensibilidadal virus a 2600, mientrasque sufre infección

sistémicaa 3400. Tambiénse ha descritoque el tabaco SamsunNN se infecta

sistémicamentecon TM’V a temperaturaspor encimade 280C (van Loon, 1975).Al

contrario,Pink y Walkey(1985)encuentranel cultivar Cinderellade calabacínmás

resistentea CMV a altastemperaturas.

Lasotras tresposiblesresistenciasencontradasen las líneasNG-15644(C.

annuum),NG-15~1 (C. annuum),y NG-8990(U pubescens)estánen una fasemás

preliminar de estudio. Se va a obtenerdescendenciapor autofecundacióny

cruzamientospruebacon lineas sensiblesparaanalizarla descendenciade cada

plantaindividualmente.

Estaslineashabrándeseranalizadastambiénfrentea otrascepasdel virus,

ya que el problemade los genesde resistenciaa CMV es que normalmente son

“débiles” y devida corta,debidoal menosen parte,a lasmuchascepasde CMV que

existenen el campo(Matthews, 1991). En estoscasoses importanteconocerla

distribución de cepasen las diferentesregionesespañolas.Por ej., en aquellas

zonas donde sólo esté presenteel subgrupo ToRS que no se replica a altas

temperaturas,se podrán utilizar estas plantastolerantesque sólo muestran

síntomasa elevadastemperaturas,ya que en este casono habríasíntomasde

infecciónviral. El problemade estasplantases actuarcomo reservoriosparaotras

plantassensibles,pero podríanser una alternativainteresante,en caso de no

disponerde otrasplantasresistentes.Tambiénhabránde seranalizadasfrente a

inoculacióncon pulgones,queesla vía de transmisiónnaturalen campo.

109

‘lo

VI. CONCLUSIONES

En la presentetesis se ha abordadoel estudioy comparaciónde cuatro

técnicaspara la deteccióndel virus del mosaico del pepino (CMV) de gran

importancia económica en España y a nivel mundial, encaminadasa un

diagnóstico rutinario. La técnica ELISA es la más rápida y sencilla de las

ensayadas,y presentauna alta detectabilidad.El mayor problema que se ha

encontradocon estatécnicaes la evaluaciónde numerososcasosdudososque se

presentan,que podrían explicarse por la inestabilidad del virus y por su

complejidadserológica,quesehan de resolverpor análisiscon otras técnicas.Las

anticuerpospoliclonalespolivalentesde Sanofi (Francia)no reconocieronel 16% de

las muestrasqueen cambio sí reconocieronlos anticuerpospoliclonalesanti-CMV-

cr de Agdia. Seconsiguieronmejoresresultadoscon tamponesde extraccióncitrato

o tris quecon tamponesfosfato. El análisiselectroforéticode RNAs bicatenariosy la

hibridaciónsobremembranascon sondasde cDNA viral marcadasradiactivay no

radiactivamente tienen una aplicación limitada, por la complejidad del

procedimiento. Las membranas de nitrocelulosa permitieron una mayor

sensibilidadque lasdenylon. La amplificaciónenzimáticade partedel cUNA viral

obtenidopreviatranscripcióninversarealizadadirectamenteen un maceradode

muestrasinfectadas,mostró un límite de detecciónpara CMV tres órdenes

superior a la técnicaELISA, resultandoun método rápido, pero que requiere

dilucioneselevadasdel extracto,trabajaren condicionesque eviten todaposibilidad

de contaminaciones,y con determinadoshuéspedes,como el pimiento, seproducen

inhibicionesde la reacción.

En un diagnósticorutinario de virus paraun númeroelevadode muestras,

sepiensaqueactualmenteel métodomásadecuadoesELISA, resolviendolos casos

dudosospor RT-PCR.Esteúltimo métodoseríael másadecuadoen aquelloscasos

en que la concentracióndel patógenoseabaja, como por ejemplo en el estudio de

transmisiónde virus por semilla.

Se ha desarrolladoun métodopara el diagnósticode virus y patógenos

subviralesquecombinala inmunocapturade los patógenosmedianteanticuerpos

inmovilizadosen placasde micratitulación,con unaamplificación de unapartedel

genomaprevia transcripcióninversa (RT-PCR), sin necesidadde llevar a cabo

ningún tratamiento térmico o químico para desencapsidarel virión. Datos

111

preliminaresde la deteccióndel productoamplificadopor fluorescenciaindican que

sepuedellevar a cabotodo el procesoen unaplacade microtitulación,dandolugar

a un gradode automatizaciónequivalenteal de la técnicaELISA. Estemétodoha

demostradotener una validez general,ya que ha dado resultadocon todos los

patógenosviralesy subviralesy huéspedesensayados:BYMV, CLRV, CMV, CTV,

GFLV, PLRV, PMMV, y TSWV, asícomo RNA satélitede CMV y el viroide PSTVd.

En esteprocedimientosepuedensustituir los anticuerposespecíficosdel virus por

anticuerposmonoclonalesespecíficosde RNAs bicatenarios,ofreciendo así la

posibilidadde diagnósticoen aquelloscasosen queno se dispongade anticuerpos

específicos,o dondelos métodosinmunológicosseandifíciles de utilizar, como esel

casode los patógenossubvirales,RNAs satélitesy viroides. El método descrito

presentala sensibilidadtípicade los ensayosbasadosen la reacciónen cadenade la

polimerasa,y con un grado de dificultad semejanteal de la técnicaELISA. La

especificidaddel ensayoparecedependeren gran manerade que los cebadores

utilizadoshayansido diseñadoscorrectamente.Sobreestemétodoseha presentado

unasolicitudde patenteen el Registrode la PropiedadIndustrialdeEspaña.

En prospeccionesrealizadasen diferentesregionesespañolasy en diferentes

cultivos durantelos años1990 y 1991, sehan encontradoinfeccionesde CMV del

28%en amboscasos.El virus estápresenteen altosporcentajesen las principales

hortícolasespañolas:melón, pimiento, tomate,calabacín,judía, y pepino.También

seha detectadoun alto porcentajede infección en las malashierbasmuestreadas.

Se han identificadolos dossubgruposde CMV, DTL y ToRS, distribuidosal parecer

segúnzonasy épocade recolección,encontrándosealgunasplantasinfectadascon

ambos.Estosdatossecorrelacionancon las propiedadesde termosensibilidadde los

dossubgrupos.El subgrupotermosensibleToRSapareceen épocastempranasde la

estacióny en zonasque no parecenalcanzarelevadastemperaturas,mientrasque

el grupo termorresistenteDTL se ha encontradotanto en la región mediterránea,

como en el interior de la Península.En la provincia de Badajoz se encontraron

ambos subgrupos,e incluso plantas con infeccionesmixtas, en la época de

transiciónde primaveraa verano.

Se hanbuscadoresistenciasal CMV en lineasde germoplasma

pertenecientesa diferentesespeciesdel géneroCapsicum,medianteinoculación

mecánicadel virus y posteriorobservacióndesíntomas.UnalíneaNG-025-5-2

pertenecientea C. annuumha mostradounaresistenciaasociadaa una falta de

síntomasy ausenciade presenciaviral segúnun análisisELISA, carácterque

112

parecedeterminadopor un genmonogénicodominante,segúnel estudiode la

descendenciaobtenidapor la autofecundaciónde un individuo resistenteal virus.

Otra líneaNG-044-5-4de C. frutescenspresentóunaresistenciaque no pareceestar

codificadapor un únicogen> y en la queal menosuno de los genesque intervienen

esdominante.Unaterceralínea de C. chinense,la NG-218-8-4,parecepresentar

unatoleranciaal virus de tipo termosensible,esdecir,el virus sereplicaal ser

inoculado,perosólo hay apariciónde síntomasa temperaturaselevadas.El restode

las lineasseencuentranen un estudiomáspreliminar.

113

“4

VII. BIBLIOGRAFTA

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