ADN EN MEDICINA LEGAL

http://www.biologia.arizona.edu/human/problem_sets/dna_forensics_2/06t.html

Proyecto de biología- Extracción casera de ADN – YouTube http://www.youtube.com/watch?v=v7iVbgjpQ8M

Extracción "casera" de ADN(y comparación con el protocolo normalizado)

http://www.joseacortes.com/practicas/extraccionADN.htm

La presente práctica se puede realizar perfectamente en una cocina normal de una casa. Es más, en un laboratorio de un centro de enseñanza media es frecuente que no se disponga de aparatos o reactivos necesarios para llevarla a cabo y que, por el contrario, siempre hay en una cocina (nevera con congelador, batidora, hielo, etc.)

MATERIAL Y REACTIVOS

Muestra vegetal Agua (destilada o

mineral) Sal de mesa Bicarbonato

sódico Detergente

líquido o champú Alcohol

isoamílico a 0ºC

Batidora Nevera Colador o

centrífuga Vaso Tubo de

ensayo Varilla fina

     FUNDAMENTO

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separado de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico, probablemente el único reactivo de esta práctica que no suele haber en una cocina.

     REALIZACIÓN

1. Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo triturado:

o 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo.

o 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura.o 5 g de bicarbonato sódico.o 5 ml de detergente líquido o champú.

2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber en la cocina (cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.

3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción del detergente.

4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante.

5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón.

6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño

de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su estremo con el aspecto de un copo de algodón mojado.

    RESULTADOS

El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN.

Resulta curioso comparar este método de extracción con el correspondiente protocolo que siguen los laboratorios de análisis: Protocolo QIAGEN de purificación de ADN

Protocolo QIAGEN

1. Pesar 100 mg de la muestra.2. Añadirle 400 µl del tampón AP1, 4 µl de RNasa A (100

mg/ml) y 20 µl de proteinasa K. Mezclar vigorosamente.3. Incubar la mezcla a 65ºC durante 2 horas.4. Añadir 130µl del tamón AP2, mezclar bien e incubar 5

minutos en hielo.5. Centrifugar durante 5 minutos a 13000 rpm.6. Recoger el sobrenadante y pasarlo a un tubo-columna

QIAshredder y centrifugar durante 2 minutos a velocidad máxima.

7. Transferir el líquido que se ha filtrado al tubo de abajo a un tubo eppendorf nuevo, sin arrastrar ningún resto de precipitado (si lo hay).

8. Añadir 1,5 volúmenes de tampón AP3/E y mezclar inmediatamente mediante pipeteo.

9. Recoger 650 µl de esa mezcla, incluyendo cualquier precipitado que pueda haberse formado, a la columna DNeasy mini spin. Centrifugar durante 1 minuto a velocidad mayor a 8000 rpm (10000 rpm) y desechar el líquido filtrado.

10.Repetir el paso anterior con la muestra restante. Desechar el filtrado y el tubo colector.

11.Colocar la columna DNeasy en un tubo nuevo de recogida, añadir 500 µl de tampón AW y centrifugar durante 1 minuto a 10000 rpm. Desechar el filtrado y

reutilizar el tubo para el siguiente paso.12.Añadir 500 µl de tampón AW a la columna DNeasy y

centrifugar durante 2 minutos a 13000 rpm para secar bien la membrana.

13.Transferir la columna DNeasy a un microtubo de 1,5 o de 2 ml y añadirle 100 µl de tampón AE precalentado a 65 ºC directamente en la membrana DNeasy. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 minuto a 10000 rpm.

14.Repetir el paso anterior.15.Guardar la muestra obtenida en congelación.

 

EXTRACCIÓN DE ADN HUMANO.

http://html.rincondelvago.com/extraccion-de-adn-humano.html

OBJETIVOS:

Aislar ADN cromosómico de sangre periférica total de humano

Analizar sobre la importancia del conocimiento de la molécula de la vida en la medicina del futuro.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS:

Todas las células, a excepción de las células anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen ADN en sus núcleos celulares. También podemos encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al núcleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequeña; por este motivo no representa una fuente

conveniente de extracción, aislamiento y purificación, para ser empleado en diferentes estudios de carácter genético, biológico. y/o bioquímico. Muchos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolécula en pequeños fragmentos.

Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material genético y poseer baja actividad de DNAasa.

El tejido linfoide, y en este caso el timo y el bazo representan materiales biológicos que son utilizados con mucha frecuencia como fuente de cantidades considerables de ADN para diferentes estudios.

Después de extraído el ADN suele ser rápidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remoción, aislamiento y purificación con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la célula de la cual proviene. El estrés o tensión mecánica o físico química, que

acompañan los procesos de purificación de las moléculas de ADN deben ser evitadas al máximo y las nucleasas inhibidas.

Factores como los iones Ca2+ y Mg2 son importantes para la actividad del las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extracción y purificación del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta forma, la acción de las enzimas que digieren estas moléculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remoción de las proteínas deben ser llevadas a cabo tan rápido como sea posible y en frío.

Las nucleoproteínas, son proteínas que aparecen asociadas con los ácidos nucleicos de las células eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica pero solubles en soluciones de alta fuerza iónica; propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extracción inicial.

MATERIALES Y REACTIVOS :

Materiales y/o reactivos. Cantidad (por mesa).

Pipetas Pasteur. 3

Baño María -

Centrífuga -

Tubo de ensayo tapa rosca 1

Gradilla 1

Pipetas de 1 y 5ml. 1

Toallas de papel. 2

Porción de papel aluminio -

Solución de SDS al 1% en NaOH 0,2N. 5ml

Etanol absoluto frío. 10ml

Tritón X100 al 1% 10ml

NaCl 0,1M 5ml

Amortiguador salino (NaCl 0,15M; Citrato de Sodio 0,015 M, pH 7). 1ml

Agua destilada 10ml

Sangre Humana extraída con EDTA. 3-5ml

PROCEDIMIENTO:

(Para la ejecución de ésta práctica cada estudiante debe traer tapabocas, gorro quirúrgico y un par de guantes desechables).

Extracción de ADN Humano:

1. Tomar una muestra de 3 a 5ml de sangre en un tubo vacuntainer con EDTA.

2. Centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. Separar la capa de glóbulos blancos que se encuentra en medio del plasma y los glóbulos rojos.

3. Pasarlas a otro tubo de ensayo y agregar 10ml de agua destilada, tapar el tubo e invertirlo tres veces.

4. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm descartar el sobrenadante.

5. Al sedimento (pequeño botón blanco), se le agregan 10ml de tritón X100 al 1%. Tapar el tubo y agitar suavemente de manera constante durante unos minutos hasta resuspender perfectamente el sedimento.

6.Centrifugar 10 minutos a 5000rpm, descartar el sobrenadante.

7. Al sedimento se le agregan 5ml de SDS al 1% (agitar suavemente y resuspender el botón). Pasar el contenido a un tubo de ensayo con tapa y agitar suavemente durante unos minutos más.

8. Agregar 5ml de NaCl 0,1M agitar y dejar reposar por unos minutos.

9. Agregar 10ml de etano frío. Agitar muy suavemente y observar como se precipitan los filamentos de ADN

10. Colectar el ADN con una punta para micropipeta de 10µl a 100µl (punta amarilla) y llevarlo a un tubo que contenga 4ml de amortiguador salino.

11.En caso de que no se pueda colectar el ADN con la punta, se procede a centrifugar 5 minutos a 3000 rpm, se descarta el sobrenadante y al sedimento se le agregan 4ml de amortiguador.