Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira Curie Research Training/14... · 2014-02-18 · Objetivos Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira Objetivos ¾Análisis de

•1

Seminario de Guadalupe, diciembre 2004Seminario de Guadalupe, diciembre 2004Las Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la MeLas Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la Memoriamoria

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS

Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira

Mª del Carmen Portillo GuisadoInstituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla

Consejo Superior de Investigaciones CientíficasSevilla

Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira

Introducción

Objetivos

Materiales y Métodos

Métodos para el estudio microbiológico

Comparaciones de perfiles moleculares

Resultados

Conclusiones

•2

TTéécnicas avanzadas de diagncnicas avanzadas de diagnóóstico. Cesstico. Cesááreo reo SSááiziz

INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGIA, SEVILLA Y RED TEMATICA DEL CSIC DE PATRIMONIO HISTORICO Y CULTURAL

Introducción Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira

La cueva de Altamira se encuentra en Cantabria

Descubierta en 1868 por Modesto Cubillas

Marcelino Sanz de Sautuola en 1879 descubre las pinturas

Introducción




La cueva de Altamira tiene unos 250 m de longitud

Se ha dividido en distintassalas

La sala con mayor concentración de pinturas esla Sala de los Polícromos

El animal más representadoes el bisonte

Entrada Actual

Sala de Polícromos

Cocina

Sala de los Muros

Gran Sala

Sala del Pozo

Cola de Caballo

Sala de la Hoya

10 20mt0 5

•3




La cueva de Altamira posee pinturas paleolíticas de 14000 ± 500 años. La conservación de estaspinturas es muy importante.

Presumiblemente, lasvisitas masivas son el factor desencadenante del deterioro progresivo quesufre este ambientehipogeo.

En la actualidad la cueva se encuentra cerrada al público desde 2002.

Estudio multidisciplinar: arqueología, geología, microclima, hidrogeoquímica, microbiología,




Los microorganismos puedendesarrollarse en cualquier habitat del planeta, natural o artificial.

Las acciones de los microorganismos puedentraducirse en una alteración del sustrato en el que desarrollan quepuede dar lugar su deterioro.

Importancia de conocer los componentes de un ecosistemapara determinar el papel quedesempeña cada uno y el funcionamiento global.

Colonizaciones blancas

•4




EjemplosColonizaciones verdes

Colonizaciones amarillas y grises

“Leopard spots”

“Moonmilk”



Objetivos Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira

Objetivos

Análisis de las comunidades microbianas que se desarrollanen la Cueva de Altamira.

Determinar los microorganismos más representativos en lasprincipales colonizaciones observadas.

Análisis en profundidad de grupos específicos y sudistribución en la cueva.

Análisis global de la diversidad microbiana en la Cueva de Altamira

•5



Materiales y Métodos Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira

Análisis de las comunidadesmicrobianas




Análisis de las comunidadesmicrobianas

Materiales y Métodos

Métodos tradicionales

Basados en cultivo

Métodos moleculares

Basados en ácidos nucleicos(ADN y ARN)

•6




MuestraExtracción

ADN ARNAmplificación PCR o MDA

ADN amplificado ADNc

DGGE ClonaciónSelección

Secuenciación

Búsqueda de homólogos

Perfil de la comunidad e identificación demicroorganismos

Cultivos

Trascripción inversa

microorganismospresentes

microorganismosmetabólicamente

activos

Comparación deperfiles

Estimación deabundancia



Resultados Biodiversidad Microbiana en la Cueva de Altamira

Resultados

1. Determinación de los grupos de microorganismos más representativos en las principales colonizaciones y otras muestras.

2. Detección de grupos de microorganismos que no habían sido detectados en la Cueva de Altamira ni en otras cuevas con pinturas rupestres.

3. Análisis de grupos específicos de microorganismos en la Cueva de Altamira.

4. Determinación de los microorganismos presentes y los que están metabólicamente activos en las muestras analizadas.

5. Análisis global de la diversidad microbiana en la Cueva de Altamira

•7




1. Determinación de los grupos de microorganismos más representativos en las principales colonizaciones y otras muestras

Colonizaciones blancasColonizaciones amarillasColonizaciones grisesDepósitos “moonmilk”




Colonizaciones blancasADN

5967

156

210221

269

364

408425

438493514538556573587

612624638

684740778

720

304

129

315350

378

463

694

664

877891

672

597

11891

176

256

409446

473486511

560574

588614638

739

780

721

327

130

348

465

692664

860891

Cyanobacteria (90%)*

Escherichia (Gamma-Proteobacteria) (98%) *

Actinobacteria (99%) *

Pseudonocardia (Actinobacteria) (92%)

Escherichia (Gamma-Proteobacteria) (98%)*

Sphingomonas (Alpha-Proteobacteria) (94%)

Actinobacteria (89%) *

Chondromyces (Delta-Proteobacteria) (92%)

Chondromyces (Delta-Proteobacteria) (97%) *Rhodothermus (Bacteroidetes) (92%) *

Microbacterium (Actinobacteria) (91%)

Chondromyces (Delta-Proteobacteria) (97%) *Firmicutes (99%) *

Planctomycetes (91%)*

Planctomycetes (93%)*Rhodobacter (Alpha-Proteobacteria) (90%)*

Planctomycetes (97%)

Plactomycetes (93%) Pseudonocardia (Actinobacteria) (98%)

Plactomycetes (91%)

Cyanobacteria (89%) *

Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (99%)*

Rhodothermus (Bacteroidetes) (92%)*

Sphingomonas (Alpha-Proteobacteria) (94%)*

Methylocaldus (Gamma-Proteobacteria) (92%) Pseudonocardia (Actinobacteria) (92%)

Escherichia (Gamma-Proteobacteria) (97%)

Beta-Proteobacteria (94%)

Gordonia (Actinobacteria) (97%)

Actinobacteria (98%)

Acidobacteria (99%) *

Methylobacterium (Alpha-Proteobacteria) (93%) *


ARN

•8



A

B

Alpha-ProteobacteriaBeta-ProteobacteriaGamma-ProteobacteriaDelta-ProteobacteriaActinobacteriaFirmicutesPlanctomycetesAcidobacteriaVerrucomicrobiaBacteroidetesCyanobacteriaCloroplastosChloroflexiSPAM


Colonizaciones blancas

ADN

ARN



6887

320308

231257

348375

408425456

491518

553 568596 609

632650682706737756

779784803

877

935

286

129

ARN

386

470504

813

6885

155

206232258

335375406424459491519543555570

576 598611633648 683695708 740

759776

787807833865

935

284

Lysobacter (Gamma-Proteobacteria) (92%) * Delta-Proteobacteria (90%) *

Ectothiorhodospiraceae (Gamma-Proteobacteria) (91%) *

Gamma-Proteobacteria (98%) *Acidobacteria (94%) *

Desulfovibrio (Delta-Proteobacteria) (90%) *Actinobacteria (98%)*

Gamma-Proteobacteria (98%)*

Acidobacteria (98%) * Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (100%)

Gamma-Proteobacteria (98%) *

Delta-Proteobacteria (98%) *

Gamma-Proteobacteria (93%) *


Beta-Proteobacteria (93-95%)

Delta-Proteobacteria (98%)*

Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (100%) Microbacterium (Actinobacteria) (92%)

Acidobacteria (97%)

Nitrospirae (97%) *

Sphyngomonas (Alpha-Proteobacteria) (100%) *Hyphomicrobiaceae (Alpha-Proteobacteria) (94%)*

Gamma-Proteobacteria (94%)

Delta-Proteobacteria (90%)Nostocoida (Actinobacteria) (97%)


Actinobispora (Actinobacteria) (94%)*

Acidobacteria (91%)*

Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (98%) *

Beta-Proteobacteria (97%)* Streptococcus (Firmicutes) (99%) *

Actinobacteria (95%)

ADN


Colonizaciones amarillas

•9




Colonizaciones amarillas

Alpha-ProteobacteriaBeta-ProteobacteriaGamma-ProteobacteriaDelta-PproteobacteriaActinobacteriaFirmicutesAcidobacteriaNitrospiraeGemmatimonadetes

ARN



ARN

127

295

347

461492

570

612

744733

756

235

281

384

937

653633

409

586

322

445

522

686

761780

838860

824

307

874

123

207185

264

321

349

436

461490

570544

606

747732

770

251

151

299

384

939

665635

407

105

586

332

450

56

511527

6688

673

798808

953

850883

833824

Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (99%)


Enterobacteraceae (Gamma-Proteobacteria) (99%)

Enterobacteraceae (Gamma-Proteobacteria) (98%)

Gamma-Proteobacteria (98%)*

Alpha-Proteobacteria (98%)* Thauera (Beta-Proteobacteria) (96%)*

Myxococcus (Delta-Proteobacteria) (98%)* Delta-Proteobacteria (100%) *

Acidobacteria (93%) *Acidobacteria (97%)*

Pseudonocardia (Actinobacteria) (94%)Acidobacteria (97%) *



Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (98%)*

Delta-Proteobacteria (90%) *Gamma-Proteobacteria (98%) *

Enterobacteaceae (Gamma-Proteobacteria) (99%)

Acidobacteria (94%) *


Alpha-Proteobacteria (95%)

ADN


Colonizaciones grises

•10



A

B

Alpha-ProteobacteriaBeta-ProteobacteriaGamma-ProteobacteriaDelta-ProteobacteriaActinobacteriaAcidobacteria

β

A


Colonizaciones grises

ADN

ARN



127

237

323347

385

539

757744

800

409

587

636665676

718696

790

821

854

Methylobacterium (Alpha-Proteobacteria) (94%)


Hyphomicrobium (Alpha-Proteobacteria) (90%)

Bdellovibrio (Delta-Proteobacteria) (98%)

Methylobacterium (Alpha-Proteobacteria) (98%)

Taxeobacter (Bacteroidetes) (87%)

Hydrogenophaga (Beta-Proteobacteria) (93%)

Pseudomonas (Gamma-Proteobacteria) (97%)

Verrucomicrobia (97%)

Hydrogenophilus (Beta-Proteobacteria) (98-99%)

Herbaspirillum (Beta-Proteobacteria) (97%)

Propionibacterium (Actinobacteria) (99%)

Moraxella (Gamma-Proteobacteria) (99%)

Acinetobacter (Alpha-Proteobacteria) (99%)

Synechocystis (Cyanobacteria) (99%)

Staphylococcus (Firmicutes) (99%)

Tsukamurella (Actinobacteria) (99%)

Streptococcus (Firmicutes) (98%))

Enterococcus (Firmicutes) (96%)

Propionibacterium (Actinobacteria) (99%)

Aquabacterium (Beta-Proteobacteria) (98%)



Moraxella (Gamma-Proteobacteria) (99%)


Depósitos de “moonmilk”

•11



A

B

αβγδAFPAVBCCSTTO

Alpha-ProteobacteriaBeta-Proteobacteria

Delta-ProteobacteriaGamma-Proteobacteria

ActinobacteriaFirmicutesPlanctomycetesAcidobacteria

BacteroidetesVerrucomicrobia

ChloroflexiSPAMTM8

Cloroplastos

OP1TM6


Depósitos de “moonmilk”

ADN

ARN




2. Detección de grupos de microorganismos que no habían sido detectados en la Cueva de Altamira ni en otras cuevas con pinturas rupestres.

CrenarchaeotaFusobacteriaNitrospiraeVerrucomicrobiaGemmatimonadetes

•12




Grupos bacterianos detectados

Acidobacteria: sólo tres especies descritas , aunque muchas subdivisiones determinadas por secuencias consegudas de muestras ambientales.

Actinobacteria (Propionibacterium y Pseudonocardia): formación de esporasen suelos participan en la descomposición de materia orgánica, algunos pueden fijar N2 atmosférico y otros producen metabolitos secundarios que han servido para la producción de antibióticos.

Bacteroidetes (Flavobacterium): aeróbico y heterótrofo en ambientes terrestres o acuáticos

Chloroflexi: frecuentes componentes de “films” microbianos y ambientes acuáticos. Algunos fototrofos y poseen morfología filamentosa y pigmentos (bacterioclorofila d)

Firmicutes (Bacillus, Clostridium y Paenibacillus): formación de esporas




Grupos bacterianos detectados

Nitrospirae: quimioorganotrofos aerobios, oxidan nitrito a nitrato.

Planctomycetes: la mayoría conocidos a través de secuencias, carecen de pared de Peptidoglicano, reproducción por gemación e implicados en el ciclo del Nitrógeno (oxidación anaeróbica del amonio).

Proteobacteria: todos los tipos de metabolismos (Pseudomonas y Escherichia) normalmente aerobios y heterótrofos, aunque Escherichia puede ser anaerobio facultativo.

Verrucomicrobia: aerobios estrictos, heterótrofos y anaerobios o endosimbiontesde nematodos.

Otros grupos detectados: microorganismos fototrofos (cianobacterias y microalgasunicelulares) y euciarotas heterótrofos (hongos).

•13




3. Análisis de grupos específicos de microorganismos en la Cueva de Altamira

Bacterias Reductoras de Sulfato (SRB)Crenarchaeota de baja temperatura

• Ninguno ha sido detectado en estudios previos

• SRB y Crenarchaeota suelen ser abundantes en suelos

• SRB pueden ser originar efectos negativos en las pinturas

• De las Crenarchaeota no se conoce su metabolismo




Bacterias Reductoras de Sulfato (SRB)

Anaerobias estrictasMetabolismo: Reducción de sulfatos produciendo sulfurosUtilizan una amplia gama de sustratos orgánicos de bajo peso molecularSulfatos son abundantes en suelosPosibles efectos negativos de las SRB:

- Alcalinización- Sulfuros metálicos- Precipitación de carbonatos

Importancia de su metabolismo, ecología, actividad corrosiva y producción de H2S.

•14




A BDesulfovibrio vulgaris (98%)

Desulfomicrobium (90%)

Desulfomicrobium hypogeium (97%)

Desulfovibrio (99%)Desulfomicrobium hypogeium (97%)Desulfovibrio (96%)Desulfovibrio desulfuricans (99%)Desulfovibrio desulfuricans (96%)Desulfomicrobium (98%)Desulfomicrobium hypogeium (99%)Desulfomicrobium hypogeium (93%)Desulfomicrobium hypogeium (98%)Anaeromyxobacter (98%)

Desulfomicrobium (99%)Desulfomicrobium escanbiense (98%)Desulfovibrio vulgaris (98%)Desulfovibrio (92%)Desulfovibrio vulgaris (97%)Desulfovibrio vulgaris (94%)Desulfovibrio vulgaris (98%)Desulfovibrio vulgaris (98%)Desulfovibrio vulgaris (98%)

Desulfovibrio vulgaris (98%)Desulfovibrio vulgaris (98%)Desulfovibrio vulgaris (98%)

Desulfomicrobium hypogeium (98%)

Desulfovibrio vulgaris (98%)1 3

2003 2004 2003 2004

2 1 32

Identificación de las bandas que se han asignado a bacteriasreductoras de sulfato en perfiles moleculares de muestras de suelo




AY960257, clon 875, cueva de AltamiraOTU1, cueva de Altamira

OTU2, cueva de Altamira AJ853587, clon GZKB93, Residuo urbano sólido

AY328748, clon DSSD50, agua potableAF175636, clon WJGRT-118, acuífero contaminado

EF188717, cueva de Altamira EF188720, cueva de Altamira

EF188751, cueva de Altamira


AF132738, Desulfomicrobium hypogeium cepa CN-AAJ277896, Desulfomicrobium baculatum cepa DSM1742U64865, Desulfomicrobium apsheronum cepa DSM5918AJ237604, Desulfobacterium macestii cepa DSM4194

DQ069214, clon MAB1, ambiente subterráneoAF280859, clon mle1-31, agua residual

EF188721, cueva de Altamira


EF188478, cueva de Altamira DQ093951, clon ga89, suelo

DQ092636, Desulfovibrio desulfuricans cepa F28-1

U42221, Desulfovibrio fairfieldensis cepa FH 26001/95AJ295680, Desulfovibrio intestinalis cepa JG-G12

EF188749, cueva de Altamira EF188470, cueva de Altamira EF188736, cueva de Altamira

DQ122124, Desulfovibrio vulgaris subsp. oxamicus cepa DSM 1925

X87409, Desulfovibrio termitidis cepa HI1

EF188746, cueva de AltamiraEF188745, cueva de Altamira

AE017319, Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris cepa Hildenborough

DQ173816, clon F4P35, marisma saladaAY960231, cueva de Altamira

AY651813, clon 3ML-89, agua subterráneaAY491577, clon oc34, pozo petrolíferoAJ306780, clon SHA-100, suelo

AY960234, cueva de AltamiraAY960226, cueva de Altamira

AY960239, cueva de AltamiraAY960232, cueva de Altamira

AY960225, cueva de AltamiraM34407, Desulfosarcina variabilis cepa DSM 2060EF188779, cueva de Altamira

AJ421896, clon Alt9-K55, cueva de AltamiraAJ421200, clon C3-K4, cueva de Tito BustilloAJ421892, clon Alt9-K47, cueva de Altamira

DQ022161, clon HKT 546, agua residualAF097803, clon 1959, agua residual

AY592087, clon Kazan-1B-10/BC19-1B-10, fango de volcánDQ123792, clon PAH-Feed-72, sueloAJ504432, Anaeromyxobacter subgroup (O. Myxococcales), cepa FAc12

AF382400, Anaeromyxobacter dehalogenans cepa 2CP-3 OTU17, cueva de Altamira

AY374745, clon PI_r120_c2, marisma salada

88 5773

98

88

7892

52

65

9791

52

708090

67

70

62

8161

72

887983

8653

72 10%

69

71

51

Árbol filogenético de bacterias reductoras de

sulfato

•15




Crenarchaeota de baja temperatura

• Miembros del dominio Archaea

• Presentes también en ambientes moderados, como los suelos

• Hasta muy recientemente, ningúnmiembro perteneciente a Crenarchaeotade baja temperatura había sido cultivado.

• En 2005 ha sido propuesta la primeraespecie cultivada de Crenarchaeota de baja temperatura: “Nitrosopumulus maritimus”quimiolitotrofa y oxidadora de amonio)




Perfil de la comunidad de Archaea pertenecientes a una muestra

Crenarchaeota de baja temperatura

RNA

•16




Cre

narc

haeo

ta c

ultiv

adas

de a

lta te

mpe

ratu

ra

AY972865, cueva de Altamira, 935-E, AY972865

AY972857, cueva de Altamira, 914

U62814, suelo, SCA1154, AY972860, cueva de Altamira, 858

AF418934, agua continental, HTA-D6AY972855, cueva de Altamira, 855AY972856, cueva de Altamira, 905



AF418938, agua continental, HTA-G6

U62816, suelo, SCA1166U62820, suelo, SCA11

AJ535120, subsuelo, Gitt-GR-39

D85505, Acidianus infernus

96

9166

88

67

99

81

79

80 97

96Acidianus brierleyi, U38359

AY247901, Sulfolobus islandicusX03235, Sulfolobus solfataricus

X14835, Thermofilum pendensM35966, Thermoproteus tenax

M21087, Pyrodictium occultum

M366474, Desulfurococcus mobilis

95

8951

54

77

10%

100

Cre

narc

haeo

ta d

e ba

ja te

mpe

ratu

ra

AY972858, cueva de Altamira, 856AY972859, cueva de Altamira, 939

AB050241, agua continental, SAGMA-11 U87518, sedimento de agua continental, LMA137 AF201367, sedimentos de estuario, DOURO13

AJ294881, sedimentos marinos, 19a-27

AJ715802, agua marina, ECS4A-09 AY820231, piedra, CCSD_RK1930_A9 AF316803, agua continental, CL500-AR1 U87519, sedimentos de agua continental, LMA229

AB113625, agua subterránea, HAuD-MA13

AJ567622, sedimentos marinos, MBAA16 AF083071, Candidatus Cenarchaeum symbiosum

DQ085099, Nitrosopumilus maritimus

67

86

90

54

99

87

70

80

86

95

72

100

Árbol filogenético de Archaea




A

B

Actinobacterias

Acidobacterias

Firmicutes

Planctomycetes

Verrucomicrobia

Bacteroidetes

Cloroplasto

OtrosOtros

Cloroplastos

Delta-Proteobacteria

Gamma-Proteobacteria

Beta-Proteobacteria

Alpha-Proteobacteria

4. Determinación de los microorganismos presentes y los que están metabólicamente activos en las muestras analizadas.

Proporción de los distintos grupos bacterianos

encontrados en la Cueva de Altamira a partir de

ADN (A) y ARN (B)

•17




0

5

10

15

20

25

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

Número de clones

Div

isio

nes

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

Número de clones

OTU

s

B

A

Representación de los clones analizados frente a los grupos bacterianos encontrados (A) yfrente a las especies diferentes

encontradas (B)

5. Análisis global de la diversidad microbiana en la Cueva de Altamira




ConclusionesLas comunidades microbianas pueden ser caracterizadas porperfiles moleculares que permiten su comparación y la cuantificación de los grupos principales.Se han determinado los microorganismos más característicos de las principales colonizaciones y muestras en base al ADN y al ARN. El principal grupo microbiano detectado tanto en base del ADN como en base del ARN es Proteobacteria.Se han detectado grupos microbianos que no se habíandetectado previamente.Se ha estimado que la diversidad total de los microorganismosde la Cueva de Altamira es mucho mayor a la observada y obtenida en este estudio.

•18

Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (CSIC)

http://www.irnase.csic.es/

MC Portillo([email protected])

RED TEMATICA DE PATRIMONIO HISTORICO Y CULTURAL

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