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M A R T Í N E S P A R I Z - E S P A R I Z @ I B R - C O N I C E T . G O V . A R
B I O T E C N O L O G Í A D E L O S A L I M E N T O S 2 0 1 9
BIOINFORMÁTICA Y ÓMICAS
Las secuencias de aminoácidos de los
polipéptidos relacionados se dan en un código
de una letra.
El sitio de unión al hierro conservado se muestra
en negrita. En particular, el átomo de hierro
está unido por los dos residuos de histidina (H)
conservados.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
ALINEACIÓN DE SECUENCIAS RELACIONADAS
La glicerol-dihidrogenasa de Bacillus está
relacionada con los otros miembros de esta
familia de proteínas, pero ya no usa hierro.
La secuencia de unión al hierro no está más
presente ya que ambas histidinas se han
reemplazado por otros aminoácidos.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
ALINEACIÓN DE SECUENCIAS RELACIONADAS
ALINEACIÓN DE SECUENCIAS RELACIONADAS
Árbol filogenético construido comparando la secuencia
de aminoácidos del citocromo c que se encuentra
codificado en todos los organismos analizados.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
ALINEACIÓN DE SECUENCIAS RELACIONADAS
Cuanto más
cerca están las
ramas, más
similares son las
secuencias. Los
números a lo largo
de las ramas
representan el
número de
diferencias de
aminoácidos.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
La duplicación del gen de la globina ancestral permitió que ambos genes evolucionen independientemente.
El primer gen se convirtió en hemoglobina, que solo se encuentra en los glóbulos rojos. La segunda copia se convirtió en mioglobina, que se encuentra en el tejido muscular.
Ambas proteínas todavía transportan oxígeno, pero tienen especificidad de tejido.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
LA DUPLICACIÓN ES FUENTE DE NUEVOS GENES
ORIGEN DE GENES DE LA FAMILIA GLOBINA.
Durante la evolución,
una variedad de
duplicación de genes y
eventos de
diferenciación dieron
origen a una familia de
las globinas.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
El primer gen de globina ancestral se duplicó dando
hemoglobina y mioglobina. Después de otra duplicación, el
gen de la hemoglobina divergió en los genes de la globina α
ancestral y de la globina β ancestral. La duplicación y la
divergencia continuadas crearon toda la familia de genes de
globina.
ORIGEN DE GENES DE LA FAMILIA GLOBINA.
Los diferentes miembros de
la familia de hemoglobina
están adaptados para
funciones específicas.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
El feto utiliza dos cadenas α y dos cadenas γ para formar su
tetrámero de hemoglobina. Esta forma es capaz de extraer el
oxígeno de la sangre de la madre porque tiene una mayor afinidad por el oxígeno que la forma adulta de la
hemoglobina.
Genes homólogos son genes que se derivan de un gen ancestral encontrado en un organismo ancestral.
Genes parálogos. Si el gen A se duplica dentro del organismo ancestral y una copia evoluciona hacia una nueva función dando el gen B.
Genes ortólogos. El gen A de chimpancés y el gen A de humanos se consideran ortólogos así como y el gen B de chimpancé y el gen B de humanos ya que se originan por un evento de especiación.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
SECUENCIAS PARÁLOGAS Y ORTÓLOGAS
En este árbol evolutivo, se
produjo otra duplicación del
gen B en chimpancés y
humanos. Los genes B 'y B' 'de
chimpancé o humano están
dentro de la especie, y por lo
tanto, estos también son
parálogos.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
SECUENCIAS PARÁLOGAS Y ORTÓLOGAS
CREANDO NUEVOS GENES POR SHUFFLING
La evolución modular de un nuevo gen puede implicar la
fusión de módulos de genes separados o unidades
funcionales. Por ejemplo, el módulo púrpura del gen 1
puede proporcionar una función que complemente al
módulo azul del gen 2. Si estos dos dominios se fusionan,
podrían formar un gen nuevo pero funcional.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
DIFERENTES PROTEÍNAS EVOLUCIONAN A VELOCIDADES MUY DIFERENTES
Durante el curso de la
evolución, algunas
proteínas acumulan más
mutaciones que otras.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
DIFERENTES PROTEÍNAS EVOLUCIONAN A VELOCIDADES MUY DIFERENTES
El gen del citocromo c es muy estable y solo se han producido 50 cambios / 100 aminoácidos en 800 millones de años. Los fibrinopéptidos A y B, por otro lado, han acumulado 50 cambios / 100 aminoácidos en menos de 100 millones de años.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
BASE MOLECULAR DE LA VARIACIÓN: LA MUTACIÓN DEL ADN
RELOJES MOLECULARES PARA SEGUIR LA EVOLUCIÓN
Durante la evolución, las mutaciones en la tercera
posición del codón triplete raramente alteran la
secuencia de aminoácidos de la proteína; por lo
tanto, rara vez son perjudiciales.Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
EL ADN NO CODIFICANTE EVOLUCIONA MÁS RÁPIDO
Las regiones de ADN no codificantes a menudo no tienen una función obvia y muchas mutaciones se acumulan dentro de estas regiones. Las mutaciones en las regiones espaciadoras intragénicas o en los intrones no tienen efecto en la secuencia o función de la proteína.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
ARN RIBOSOMALUN RELOJ QUE AVANZA LENTAMENTE
La comparación de las
secuencias de ARN ribosomal
permité deducir qué tan cerca
están relacionadas las divisiones
principales de los organismos
eucarióticos.
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
Se observa que Los hongos están más
estrechamente relacionados con los animales
que con las plantas. La rama que lleva a las
plantas superiores incluye varios grupos de
algas, incluida la roja, como se muestra aquí.
LOS TRES DOMINIOS DE LA VIDA
Todos los organismos de hoy pertenecen a una de las tres divisiones principales basadas en las relaciones entre el ARN ribosomal: las Eubacterias, las Arqueas (o Arquebacterias) y los Eucariotas. Las mitocondrias y los cloroplastos tienen un ARNr que se parece mucho al de las Eubacteria
Chapter 26 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
BIOINFORMÁTICA Y ANÁLISIS INFORMÁTICO
Crecimiento del
contenido del par de
bases y registros de
secuencia en la base de
datos GenBank DNA.
Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak,
and Cheryl L. Patten. — 4th ed.
Capítulo 5 (p146-172)
El campo de la bioinformática se ocupa del análisis
computarizado de grandes cantidades de datos de
secuencias genéticas.
Chapter 9 • Molecular
Evolution * Clark, D.P.
Tenga en cuenta que los ejes y
son escalas logarítmicas.
BIOINFORMÁTICA Y ANÁLISIS INFORMÁTICO
Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak,
and Cheryl L. Patten. — 4th ed.
Capítulo 5 (p146-172)
Chapter 9 • Molecular
Evolution * Clark, D.P.
Tanto en la biología molecular
como en otras áreas, se
acumulan grandes cantidades de
información en los bancos de
datos informáticos.
OMICAS.
Genómica: Área de investigación
que genera, analiza y gestiona las
montañas de información sobre
las secuencias del genoma y
todos los genes que se transcriben
en varios tipos de células y tejidos.
Proteómica: Los estudios de las
poblaciones de proteínas
completas de diversos tipos de
células y tejidos y las numerosas
interacciones proteína-proteína.
Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak,
and Cheryl L. Patten. — 4th ed.
Capítulo 5 (p146-172)
OMICAS.
A medida que se implementaron nuevos métodos y se enfocaron
más los objetivos de la investigación, surgieron otras "ómicas",
como la metagenómica, la genómica funcional
(transcriptómica) y la metabolómica.
En general, el sufijo "omics" implica la experimentación a gran
escala del genoma completo, con el análisis de muchas
muestras al mismo tiempo.
Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak,
and Cheryl L. Patten. — 4th ed.
Capítulo 5 (p146-172)
BIOINFORMÁTICA Y ANÁLISIS INFORMÁTICO
Existe una gran dependencia de las computadoras y los programas informáticos para ensamblar, analizar, archivar y distribuir datos genómicos.
Se han desarrollado diversos recursos informáticos para manejar los diversos tipos de información genómica.
Una variedad de sitios web ahora están disponibles para la búsqueda en línea y la manipulación de secuencias
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak,
and Cheryl L. Patten. — 4th ed.
Capítulo 5 (p146-172)
BIOINFORMÁTICA Y ANÁLISIS INFORMÁTICO
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
La minería de datos es el uso de programas informáticos para encontrar
información útil mediante el filtrado o la selección de los datos.
Algunos ejemplos simples de análisis en secuencias de ADN o proteínas:
• Búsqueda de secuencias relacionadas.
Cualquier secuencia de ADN/Aminoácidos puede compararse con otras
secuencias disponibles en los bancos de datos.
Si se encuentra otra proteína con una secuencia relacionada, esto puede
dar una idea de la función de la proteína bajo investigación.
¡Por supuesto, esto supone que la función de la proteína carnada ya se ha
descifrado!
BIOINFORMÁTICA Y ANÁLISIS INFORMÁTICO
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
Algunos ejemplos simples de análisis en secuencias de ADN o
proteínas:
• Búsqueda de secuencias relacionadas.
Cualquier secuencia de ADN/Aminoácidos puede compararse con
otras secuencias disponibles en los bancos de datos.
Otro uso importante de las comparaciones de secuencias es rastrear
la evolución tanto de los genes individuales como de los organismos
que los portan.
BIOINFORMÁTICA Y ANÁLISIS INFORMÁTICO
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
Algunos ejemplos simples de análisis en secuencias de ADN o
proteínas:
• El análisis de sesgo de codón puede ubicar las regiones de
codificación.
Debido a la redundancia de la tercera base y al uso preferencial de
algunos codones sobre otros (en las regiones de codificación pero no
en el ADN intergénico aleatorio), existen diferencias en la frecuencia
de codones entre el ADN codificante y el no codificante. Se puede
calcular un índice de sesgo de codón que dé una primera estimación
razonable de si es probable que un tramo de ADN sea codificante o
no codificante.
BIOINFORMÁTICA Y ANÁLISIS INFORMÁTICO
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
Algunos ejemplos simples de análisis en secuencias de ADN o
proteínas:
• Buscando secuencias de consenso conocidas.
Se conoce una variedad de secuencias de consenso cortas o motivos
de secuencia. El análisis de las secuencias de ADN puede revelar
promotores, sitios de unión a ribosomas (solo en procariotas),
terminadores y otras regiones reguladoras. Las repeticiones invertidas
en el ADN implican posibles estructuras de vástago y bucle, que a
menudo son sitios para la unión de proteínas reguladoras. El análisis de
las secuencias de proteínas puede indicar sitios de unión para iones
metálicos, cofactores, nucleótidos, ADN, etc.
HOMOLOGÍA
BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL
BLAST
BLAST
Secuencia
Base de
datos
IDENTIFICACIÓN DE CEPAS POR SECUENCIA DE GEN CODIFICANTE DE 16S rARN
Sobre 98,7% de identidad no se puede determinar si
dos organismos son de distintas especies o no.
(Stackebrandt and Ebers, 2006).
IDENTIFICACIÓN DE CEPAS POR SECUENCIA DE GEN CODIFICANTE DE 16S rARN
IDENTIFICACIÓN DE CEPAS POR SECUENCIA DE GEN CODIFICANTE DE OTROS GENES
CONSERVADOS
ANÁLISIS FILOGENÉTICO CON PROTEÍNAS CORE CONCATENADOS
GéneroFamilia EspeciaCepa
Alineamientos: 214922 sitios de 827 proteínas. Organismos: E. faecalis V583 (EfaeV583), E. faecium 1,231,408 (Efm_1231408), E. faecium Com15 (Efm_Com15), E. faecium DO (Efm_DO), E. italicus DSM 15952 (Eita_DSM15952), E. casseliflavusATCC12755 (Ecas_ATCC12755), E. gallinarum EG2 (Egal_EG2), and E. saccharolyticus 30_1 (Esac_30_1)
Repizo et al. BMC Genomics 2014, 15:489
GENÓMICA
La genómica se refiere al análisis de genomas completos, a diferencia de los genes individuales, ya sea por experimentación o análisis de datos. Estudio de genomas en su conjunto en lugar de un gen a la vez.
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
ENSAMBLANDO GENOMAS PEQUEÑOS POR SHOTGUN SEQUENCING
Se digiere el genoma en una gran
cantidad de pequeños fragmentos
adecuados para la secuenciación.
Todos los fragmentos pequeños se
clonan y secuencian.
Las computadoras analizan los
datos de secuencia para las
regiones superpuestas y ensamblan
las secuencias en varios contigs
grandes.
CERRAR BRECHAS ENTRECONTIGS
Dado que algunas regiones del genoma son inestables cuando se clonan, algunos huecos pueden permanecer incluso después de que este procedimiento se repita varias veces.
Para identificar brechas entre contigs, se hacen cebadores (primers) que corresponden a los extremos de los contigs(rosa).
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
CERRAR BRECHAS ENTRECONTIGS
Los cebadores de PCR
que corresponden a los
extremos de los contigs
se usan para amplificar
el ADN genómico. Si el
par de cebadores está
dentro de unas pocas
kilobases entre sí, se
hace un producto de
PCR y se puede
secuenciar.
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
CERRAR BRECHAS ENTRECONTIGS
Alternativamente se usa una sondas para identificar clones que hibridan con las sondas de dos lados de una brecha.
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
En este ejemplo, una sonda para el
final del contig # 3 (3b) y el comienzo
del contig # 4 (4a) se hibrida al
fragmento mostrado. Por lo tanto, la
secuencia de este clon debe cerrar la
brecha entre el contig # 3 y # 4.
EVITAR SOLAPAMIENTOS INCORRECTOS ENTRE SECUENCIAS REPETITIVAS
Si un clon es lo suficientemente grande como para contener completamente secuencias repetitivas, entonces las secuencias de flanqueo únicas pueden posicionar ese clon dentro del genoma.
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
EVITAR SOLAPAMIENTOS INCORRECTOS ENTRE SECUENCIAS REPETITIVAS
Si un fragmento clonado es
corto en relación con
secuencias repetitivas,
pueden producirse errores.
Aquí, el final del fragmento verde
clonado podría alinearse con la
primera o la segunda secuencia
repetitiva; por lo tanto, la secuencia
marcada c-d puede omitirse.
Determinar el espaciado y el número
de elementos repetitivos es
prácticamente imposible con clones
cortos.
Chapter 9 • Molecular Evolution * Clark, D.P.
METAGENOMICA
Construcción de bibliotecas
metagenómicas de diversas fuentes. Las
bacterias de muestras marinas o de agua
dulce se concentran mediante el uso de
un filtro de porosize de 0,1 a 0,8 μm, y los
virus se concentran utilizando un filtro de
<0,1 μm antes de extraer el ADN y luego
se fragmentan. Las bibliotecas que
contienen pequeños fragmentos de ADN,
insertadas en un plásmido, se analizan en
busca de nuevos genes, mientras que las
bibliotecas que contienen fragmentos de
ADN más grandes, se insertan en un
vector de cromosoma artificial fosmid,
cósmido o bacteriano, se analizan para
detectar los operones que codifican
complejos de proteínas o vías
metabólicas.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
ENZIMAS IDENTIFICADAS EN BIBLIOTECAS METAGENÓMICAS
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
METAGENÓMICA
Un vector SIGEX, denominado p18GFP, contiene el gen gfp que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del plac del promotor inducible por IPTG (plásmido superior). Los fragmentos de ADN metagenómico se insertan en el sitio de clonación múltiple (MCS) entre plac y gfp. Si un fragmento insertado contiene un promotor constitutivo que está activo en la célula huésped e impulsa la expresión de gfp o una secuencia que no interrumpe la actividad de plac (por ejemplo, una secuencia que lleva un terminador transcripcional), las células que llevan estas construcciones emitirán Fluorescencia verde en presencia del inductor, IPTG.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
METAGENÓMICA
Si el inserto lleva un promotor y elementos reguladores que se activan solo en
presencia de un sustrato de interés, por ejemplo, benzoato y unidad de
expresión de gfp, estas células emitirán una fluorescencia verde cuando se
agregue el sustrato. ND, no determinado porque las células que expresan gfp en
presencia de IPTG se eliminan en la primera etapa de selección SIGEX.
FLUORESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING (FACS)
Las inserciones de los clones que emiten
fluorescencia verde solo en presencia del
sustrato se analizan para identificar secuencias
completas o parciales que codifican enzimas
catabólicas. Se pueden requerir experimentos
adicionales para aislar operones catabólicos
completos.
TRANSCRIPTOMICA
La transcriptómica (o
genómica funcional ) estudia
los patrones de transcripción,
ya sea cualitativamente para
determinar qué genes se
expresan o
cuantitativamente para
medir los cambios en los
niveles de transcripción de
los genes.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
TRANSCRIPTOMICA
Uno de los objetivos de los estudios de expresión génica es descubrir los genes que están regulados hacia arriba y hacia abajo en condiciones específicas (el transcriptoma).
La transcriptómica estudia la transcripción simultánea de miles de genes (perfiles de expresión génica) de una muestra celular o de tejido.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
MICROMATRIZ DE ADN (DNA CHIP)
El ARNm se extrae de dos muestras
(muestra 1 y muestra 2) y, durante la
transcripción inversa, las primeras cadenas
de ADNc se marcan con los colorantes
fluorescentes Cy3 y Cy5, respectivamente.
Las muestras de ADNc se mezclan y se
hibridan con una matriz ordenada de
secuencias de genes o de
oligonucleótidos específicos de genes.
Después de la reacción de hibridación,
cada celda de sonda se escanea en
busca de colorantes fluorescentes y se
registran las emisiones separadas.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
MICROMATRIZ DE ADN (DNA CHIP)
Las células de sonda que producen
solo una emisión verde o roja
representan genes que se transcriben
solo en las muestras 1 y 2, respectivamente; Las emisiones
amarillas indican genes que están
activos en ambas muestras; y
ninguna emisión (negro) representa genes que no se transcriben en
ninguna de las muestras.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
TRANSCRIPTOMICA
Imagen de fluorescencia de
una micromatriz de ADN
hibridada con ADNc marcado
con Cy3 y Cy5.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
TRANSCRIPTOMICA
Perfiles de expresión génica con una micromatriz
de oligonucleótidos. El ARNm se purifica con una
secuencia de poli (dT) que tiene una extensión de
la secuencia del cebador de la ARN polimerasa
T7. Después de la síntesis de ADNc bicatenario, la
segunda hebra de ADNc actúa como un molde
para la síntesis de ARNc por la ARN polimerasa T7
en presencia de ATP, trifosfato de citidina (CTP),
trifosfato de guanosina (GTP), trifosfato de uridina
(UTP), y CTP biotinilado. UTP. Los círculos grises
representan nucleótidos biotinilados incorporados.
El ARNc biotinilado se purifica, se fragmenta en
trozos de 50 a 100 nucleótidos de longitud y se
hibrida a un microarray de oligonucleótido. La
micromatriz se trata con estreptavidina-ficoeritrina
y las células de la sonda (cuadrados negros) se
analizan para determinar la emisión (amarilla) de
la estreptavidina-ficoeritrina biotinada.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
TRANSCRIPTOMICA
Perfil de expresión génica del
tejido hepático cirrótico. Las
columnas 1 a 7 y 8 a 15 son
muestras de hígado de pacientes
con cirrosis del hígado inducida
por el etanol y el virus de la
hepatitis C, respectivamente. La
muestra de cada paciente se
comparó con el tejido hepático
normal. El cluster está formado por
2.965 genes. Los asteriscos
denotan pacientes con cirrosis
severa del hígado.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
PROTEÓMICA
La proteómica es el estudio integral de
todas las proteínas, es decir, el proteoma,
de una célula, tejido u organismo desde
una variedad de perspectivas, que
incluyen estructura, función, perfil de
expresión e interacciones proteína-
proteína.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
PROTEÓMICA
• Las proteínas comprenden el componente activo
de las células. • Las modificaciones postraduccionales, que
influyen en la función y localización de la proteína a menudo no se pueden predecir a partir de la secuencia.
• La función de una proteína a veces puede inferirse determinando las condiciones bajo las cuales se expresa y activa.
• Algunos marcos de lectura abiertos anotados (ORF) no codifican proteínas, y otros codifican proteínas cuyas funciones no se pueden predecir a partir de la secuencia.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
PROTEÓMICA. PAGE 2D
PAGE 2D para la separación de proteínas.
• Primera dimensión. El enfoque isoeléctrico se realiza para separar primero las proteínas en una mezcla en función de su carga neta. La mezcla de proteínas se aplica a un gel de gradiente de pH. Cuando se aplica una corriente eléctrica, las proteínas migrarán hacia el ánodo (+) o el cátodo (-), dependiendo de su carga neta. A medida que las proteínas se mueven a través del gradiente de pH, ganarán o perderán protones hasta que alcancen un punto en el gel donde su carga neta es cero. El pH en esta posición del gel se conoce como el punto isoeléctrico y es característico de una proteína dada. En ese punto, una proteína ya no se mueve en la corriente eléctrica.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
PROTEÓMICA. PAGE 2D
PAGE 2D para la separación de proteínas.
• Segunda dimensión. Varias proteínas en una muestra pueden tener el mismo punto isoeléctrico y, por lo tanto, migrar a la misma posición en el gel en la primera dimensión. Por lo tanto, las proteínas se separan aún más en función de las diferencias en sus pesos moleculares (MW) por electroforesis, en ángulo recto con la primera dimensión, a través de un gel de dodecilsulfato de sodio (SDS) y poliacrilamida.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
PROTEÓMICA
PROTEÓMICA
Una mancha que contiene una
proteína desconocida que se
separó mediante PAGE 2D se
escinde del gel y se trata con
tripsina. Los péptidos de tripsina
purificados se separan por MALDI–
TOF MS.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
PROTEÓMICA . MALDI–TOF MS
Mass fingerprinting de péptidos. El
conjunto de masas peptídicas de la
proteína desconocida se utiliza para
buscar en una base de datos que
contiene las masas de péptidos trípticos
para cada proteína secuenciada
conocida, y se determina la mejor
coincidencia. Los sitios de escisión de
tripsina de proteínas conocidas se
determinan a partir de la secuencia de
aminoácidos y, en consecuencia, las
masas de los péptidos trípticos son fáciles
de calcular.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)
PROTEÓMICA. ESI-MS-MS
Secuenciación de péptidos utilizando ESI-MS-MS. Los péptidos trípticos se separan de acuerdo con
sus relaciones masa / carga (m / z), y la
secuencia de aminoácidos de un péptido
seleccionado se determina con un
espectrómetro de masas (MS). El péptido
seleccionado se fragmenta e ioniza para generar
una escala de péptidos más pequeños que
difieren en aminoácidos individuales (aquí solo se
representa la escalera de iones y [y1, y2, etc.]).
Las diferencias en las masas de los péptidos
fragmentados corresponden a las masas
características de los aminoácidos. La proteína
desconocida se identifica buscando una base
de datos de proteínas con las secuencias de
aminoácidos de dos o más péptidos.
PROTEÓMICA
Electroforesis en gel diferencial 2D para el análisis
cuantitativo de la expresión de proteínas. Las proteínas de dos proteomas se marcan con los
colorantes fluorescentes Cy3 y Cy5, respectivamente.
Las muestras marcadas con fluorescencia se
combinan y se separan mediante 2D PAGE. El gel se
escanea para cada colorante fluorescente, y se
registran los niveles relativos de los dos colorantes en
cada mancha de proteína. El gel se tiñe con un
colorante proteico, y cada punto con una proteína
desconocida se escinde y se trata con tripsina. Los
péptidos se separan por ESI-MS-MS, y se determinan las
secuencias de aminoácidos de algunos péptidos
seleccionados. La proteína se identifica mediante la
búsqueda en una base de datos de proteínas para
una posible coincidencia con las secuencias de
aminoácidos de dos o más péptidos.
Bernard R. Glick, Capítulo 5 (p146-172)