Biol. Gabriela Guillén González

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y ARTES DE CHIAPAS

Manual de Microbiología y Parasitología COORDINACIÓN DE LICENCIATURA EN NUTRIOLOGÍA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA NUTRICIÓN Y ALIMENTOS

LICENCIATURA EN NUTRIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS PARA LA EXPERIENCIA ACADÉMICA

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

ELABORO: Q.F.B. MARÍA DOLORES TOLEDO MEZA

ACTUALIZÓ: BIOL. GABRIELA GUILLEN GONZALEZ



Laboratorio de Microbiología y Parasitología

Práctica No. 1

***Conocimiento y manejo del microscopio***

Objetivos

Conocer las partes típicas del microscopio óptico. Aprender a manejar el microscopio óptico. Conocer el manejo del microscopio estereoscópico

Material:

Cubreobjetos

Portaobjetos

Microscopio óptico

Microscopio estereoscópico Reactivos:

Aceite de inmersión

Muestras diversas: Cabello, hojas verdes, insectos, fibras de algodón , epidermis de la cebolla, sal, frotis sanguíneo, frotis

bacteriano.

Procedimiento:

Para microscopio óptico de campo claro

1.- Identificar cada una de las partes del microscopio. 2.- Colocar una de las muestras (excepto el frotis bacteriano y sanguíneo) en un portaobjeto y colocar encima de la muestra un cubreobjeto. 3.- Examine las muestras a través del objetivo de bajo poder (10x) y alto poder (40x). 4.- Dibuje lo observado. 5.- Al frotis bacteriano y sanguíneo colocarle una gota de aceite de inmersión y observar en el objetivo de inmersión (100x). 6.- Dibuje lo observado. Para microscopio estereoscópico:

1.- Colocar cada una de las muestras (excepto el frotis bacteriano y sanguíneo) en un portaobjeto o caja petri . 2.- Examine las muestras a través de los objetivos y dibuje lo observado. 3.- Compare esta observación con la realizada en el microscopio óptico. Cuestionario:

1.- Por medio de un dibujo, describa las partes del microscopio óptico. 2.- Describa la función de cada una de las partes del microscopio óptico. 3.- Describa las diferencias que existe entre un microscopio compuesto y un estereoscópico.




Práctica No. 2

***Estudio de la morfología de los mohos***

Objetivos:

Conocer las características microscópicas y macroscópicas de los hongos. Conocer la morfología de los mohos y distinguir microscópicamente entre un micelio, hifa y esporas. Conocer los géneros más importantes de mohos que pueden desarrollar en alimentos. Material:

Cubreobjetos

Portaobjetos

Pinza de disección

Cinta adhesiva transparente

Microscopio óptico

Microscopio estereoscópico. Reactivos:

Colorante azul de metileno Procedimiento:

Primera sesión:

Previo a práctica: Dejar tortillas , pan y una fruta en un lugar húmedo durante una semana.

Segunda sesión:

Observación macroscópica:

1.- Anote la pigmentación del moho y su aspecto (aterciopelado, velloso, algodonoso, etc).

Observación microscópica:

-Para un mismo género de moho realizar el método en fresco y el de cinta adhesiva.

-Realizar el método para tres mohos diferentes.

Método en fresco

1.- En un portaobjetos coloque una gota de colorante. 2.- Con las pinzas, desprenda pequeñas porciones del moho y colóquelo en la gota. 3.- Colocar un cubreobjetos y observar con objetivos de 10x y 40x. 4.- Dibuje lo observado e identifique morfología del moho, ver ilustraciones.

Método de cinta adhesiva



1.- En un portaobjetos coloque una gota de colorante. 2.- Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2 cm. 3.- Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie del moho. 4.- Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos. 5.- Eliminar el colorante sobrante con un papel. 6.- Observar con objetivos de 10x y 40x. 7.- Dibuje lo observado e identifique morfología del moho, ver ilustraciones. Cuestionario:

1.- Describa la clasificación taxonómica de hongos.

2.- Mencione dos especies de los siguientes hongos:

a)Hongos comestibles, b)Hongos venenosos, c)Hongos alucinógenos, d)Levaduras, e)Mohos

3.- Importancia de los hongos en la naturaleza.

ILUSTRACIONES

Esporas Hifas y micelio

Alternaria

Fusarium

Cladosporium

GÉNERO DE MOHOS

Cladosporium Alternaria



Aspergillus Penicillium

sp

Rhizopus Geotrichum

Mucor




Práctica No. 3

***Los microorganismos del cuerpo y la tinción de Gram***

Objetivos:

Realizar la tinción de Gram a microorganismos del cuerpo. Conocer el fundamento de la tinción de Gram. Diferenciar microorganismos Gram positivos de Gram negativos. Observar microorganismos del cuerpo humano. Material:

Hisopos estériles o cotonetes

Portaobjetos

Mechero Bunsen

Pinzas

Asa microbiológica

Papel seda

Varilla de tinción

Microscopio óptico Reactivos:

Safranina

Cristal violeta

Lugol

Acetona – alcohol (al 30% o 3 partes de acetona y 7 de alcohol)

Lugol

Aceite de inmersión Material biológico:

Muestra de exudado faríngeo, nasal y ótico. Procedimiento:

1.- Tomar la muestra faríngea, nasal y ótica con un hisopo estéril o cotonete y realizar un frotis en su respectivo portaobjeto. Si la muestra es muy seca, adicionar una gota de agua de la llave y realizar el frotis.

2.- Fijar la muestra con calor. 3.- Teñir con cristal violeta durante 1 minuto.

4.- Eliminar el exceso de colorante con agua de la llave.

5.- Añadir lugol durante un minuto.

6.- Lavar con acetona-alcohol, hasta decolorar.

7.- Teñir con safranina durante 1 minuto.

8.- Eliminar el exceso de colorante con agua de la llave.

Mucor



9.- Dejar secar y observar con objetivo de inmersión (100x).

10.- Dibuje lo observado.

11.-Observar en objetivo de 100x, el frotis proporcionado por el profesor.

Cuestionario:

1.- Describa la flora normal del cuerpo humano y clasifíquela por regiones.

2.- Mencione 3 diferencias entre microorganismos Gram positivos y Gram negativos.

3.- Mencione 4 microorganismos Gram positivos y Gram negativos que afecten al ser

humano.

4.- Describa la función de cada uno de los reactivos que se utilizan en la tinción de

Gram.




Práctica No. 4

***Tinción de Ziehl-Neelsen***

Objetivos:

Realizar la tinción de Ziehl-Neelsen en una muestra biológica. Conocer el fundamento de la tinción de Ziehl-Neelsen. Diferenciar microorganismos BAAR positivos de los BAAR negativos. Material:

Portaobjetos

Varilla de tinción

Asa microbiológica

Mechero Bunsen

Papel seda

Microscopio óptico Material biológico:

Expectoración Material por equipo:

Algodón

Alcohol Reactivos:

Fucsina fenicada

Azul de metileno

Solución ácido-alcohol (HCl al 3% en alcohol)

Aceite de inmersión Procedimiento:

1.- Tomar con el asa microbiológica una cantidad de muestra y realizar un frotis en el portaobjeto. 2.- Dejar secar y fijar con calor.

3.- Coloque encima de la varilla de tinción el portaobjetos que tiene la muestra.

4.- Teñir con fucsina fenicada durante 5 minutos. Pasando debajo del portaobjetos la llama del

mechero o una torunda de algodón n impregnada con alcohol prendida, de tal forma que se eliminen

vapores en la tinción. No ebullición Si los borde del frotis se empiezan a secar, añada más colorante.

5.- Lavar el exceso de colorante con agua de la llave.

6.- Decolorar con solución ácido-alcohol.

7.- Lavar con agua de la llave.



8.- Teñir con azul de metileno durante 1 minuto.

9.- Lavar con agua de la llave.

10.-Dejar secar y observar con objetivo de inmersión (100x).

Cuestionario:

1.- Describa la función de cada uno de los reactivos y el calor en la tinción de

Ziehl-Neelsen.

2.- Mencione un género de microorganismos BAAR positivos que son patógenos

en el ser humano.

3.- ¿Qué significa B.A.A.R.?




Práctica No. 5

***Esterilización y preparación de medios de cultivos***

Objetivos:

Conocer los métodos de esterilización por calor seco y calor húmedo. Conocer el manejo de la autoclave, olla de presión y horno de calor seco. Preparar medios de cultivo sólidos, semisólidos y líquidos. Material y equipo:

Tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapón de rosca

Cajas Petri estériles

Pipepas de 5 y 10 mL

Vidrio de reloj

Matraces Erlenmeyer de 125 y 250 mL

Agitador de vidrio

Espátula

Mechero Bunsen

Mechero Fisher

Parilla eléctrica

Balanza granataria

Autoclave

Horno de calor seco Por equipo traer:

Papel estrasa

Masking-tape

Algodón

Gasas

Benzal Medios de cultivo:

Medio SIM

Agar sal manitol

Agar bilis verde brillante

Caldo bilis verde brillante Procedimiento:

Esterilización de material de vidrio

1.- Envolver 5 pipetas de 5 mL con papel estrasa, poner masking tape y cinta testigo (se explicaran los pasos para envolver una pipeta). 2.- Esterilizar en el horno de calor seco a una temperatura de 160 a 180 oC, durante 1 hora o en

autoclave durante 15 minutos a 121oC y una presión de 15 libras in2.



Preparación de medios de cultivo.

1.-Preparar en matraces los siguientes medios de cultivo:

-80 mL de agar bilis verde brillante

-80 mL de agar sal manitol

-20 mL de caldo bilis verde brillante

-20 mL de medio SIM

-20 mL de agar bilis verde brillante

1) Realizar los cálculos correspondientes. 2) Pesar en un vidrio de reloj la cantidad necesaria del medio de cultivo. 3) Colocar el medio de cultivo ya pesado en un matraz Erlenmeyer. 4) Medir en una probeta graduada el agua destilada necesaria y añadir al matraz. 5) Agitar levemente tratando de disolver, sino se disuelve utilizar un agitador de vidrio. 6) Colocar un tapón de algodón al matraz y calentar hasta disolución completa del medio. Agitar

frecuentemente. NO DESCUIDAR. 7) Distribuir el medio necesario en tubos con tapón de rosca o de algodón. -3 tubos con 6 mL de agar bilis verde brillante c/u

-3 tubos con 6 mL medio SIM c/u

-3 tubos con 6 mL de caldo bilis verde brillante c/u

8) Esterilizar los medios de cultivo en autoclave o en olla de presión durante 15 minutos a 121oC y una presión de 15 libras in2.

9) Sacar los medios esterilizados. 10) Dejar enfriar el agar bilis verde brillante, antes de que solidifique, vaciar en 3 cajas Petri,

aproximadamente 20 a 30 mL por caja. Dejar solidificar. Realizar lo mismo con agar sal manitol. NOTA: Desinfectar el área de trabajo antes de vaciar el medio a las cajas.

11) Invertir las cajas Petri y refrigerar. 12) Inclinar en una superficie los tubos que contienen agar bilis verde brillante. Dejar solidificar. 13) Dejar los tubos con medio SIM en una gradilla y dejar solidificar. 14) Dejar enfriar los tubos con caldo bilis verde brillante. 15) Introducir todos los tubos en un vaso de precipitado y refrigerar.

Cuestionario:

1.- Clasifique los medios de cultivo.

2.- ¿Cuál es la diferencia entre un medio selectivo y un medio diferencial?.

3.- Describa los métodos de esterilización por calor seco y por calor húmedo.




Práctica No. 6

***Cultivo y metabolismo microbiano***

Objetivos:

Aprender a sembrar microorganismos por diversas técnicas. Observar características microscópicas y macroscópicas de los microorganismos aislados en cultivos

sólidos y líquidos. Conocer el manejo de la incubadora. Material:

Asa microbiológica

Mechero Bunsen

Portaobjetos

Papel seda

Varilla de tinción

Autoclave / olla de presión

Microscopio óptico

Incubadora Reactivos:

Medios preparados en la práctica No. 6

Colorantes para tinción de Gram

Aceite de inmersión Por equipo traer:

Muestra: Agua sucia y agua de frutas

Cotonetes

Masking-tape

Benzal

Procedimiento:

I. Primera sesión:

1.- Antes de realizar las diversas técnicas de siembra de cultivo, desinfecte el área donde va a

trabajar.



2- Sembrar por diversas técnicas los medios preparados en la práctica No. 6, utilizando un asa microbiológica previamente esterilizada en la flama del mechero para las muestras de agua y cotonetes para el exudado. Para cajas Petri: 1.- Numerar las cajas del 1 al 3, la número 3 será caja control, no se le pondrá muestra. 2.- Para cajas 1 y 2 de agar bilis verde brillante sembrar utilizando la técnica de estría cruzada o en cuadrante radial (ver figura No. 1) y para caja 1 y 2 de agar sal manitol sembrar utilizando la técnica de estriado continuo (ver figura No. 2.) 3.- Invertir las cajas e incubar de 24 a 48 horas a ±35 oC.

AGAR BILIS VERDE BRILLANTE

Cajas: Muestra Tipo de siembra

Caja 1 Agua sucia Estría cruzada

Caja 2 Agua de frutas Estría cruzada

Caja 3 Ninguna (Caja control) Ninguna

a) b)

c)

d)

Fig. No.1



AGAR SAL MANITOL

Cajas: Muestra Tipo de siembra

Caja 1 Exudado ótico Estría ondulada

Caja 2 Exudado nasal Estría ondulada

Caja 3 Ninguna (Caja control) Ninguna

Para tubos: 1.- Numerar los tubos del 1 al 3 para cada medio de cultivo, el número 3 será tubo control, no se le pondrá muestra. 2.- Recuerde que antes de realizar la técnica de siembra o de inoculación, debe de esterilizar el asa con la flama del mechero. 3.- Al tubo 1 y 2 con agar bilis verde brillante , sembrar con la técnica de estría ondulada(ver fig. No.3), al tubo 1 y 2 de medio SIM, sembrar con la técnica de picadura (ver fig. No.4) y al tubo 1 y 2 de caldo bilis verde brillante, sembrar por agitación del asa (ver fig. No.5).

AGAR BILIS VERDE BRILLANTE

Tubos: Muestra

Tipo de siembra

Tubo 1 Agua sucia Estría ondulada

Tubo 2 Agua de frutas Estría ondulada

Tubo 3 Ninguna (Tubo

control)

Ninguna

Fig. No.2

Fig. No.3

Fig. No.5



4.- Colocar los tubos en un cesto e incubar de 24 a 48 horas a ±35 oC.

II. Segunda sesión

1.- Observar y anotar las características macroscópicas de los microorganismos aislados . Para cajas: anotar el color y la forma de las colonias. Ver siguiente figura:

MEDIO SIM

Tubos: Muestra

Tipo de siembra

Tubo 1 Agua sucia Picadura

Tubo 2 Agua de frutas Picadura

Tubo 3 Ninguna

(Tubo control)

Ninguna

CALDO BILIS VERDE BRILLANTE

Tubos: Muestra

Tipo de siembra

Tubo 1 Agua sucia Agitar el asa con

muestra en el caldo

Tubo 2 Agua de frutas Agitar el asa con

muestra en el caldo

Tubo 3 Ninguna (Tubo

control)

Ninguna

Fig. No.4

Forma:

Puntiforme Circular Amiboide Rizoide Fusiforme

Fig. No.5



Para tubos:

Tubos sembrado con estría ondulada:

Tubo sembrado por picadura

Si el medio toma una coloración negra, es por H2S liberado por la bacteria.

Tubos en medio líquido:

a) Crecimiento superficial:

Filiforme

Filiforme Rizoide Equinulada Perlada Difusa Arborescente

Perlada Equinulada Rizoide

Arborescente

Floculento Anillado Peliculado Membranoso



b) Sedimento: compacto, grumoso, granular o viscoso. c) Cantidad de sedimento: abundante, escaso o nulo.

2.- Realizar la tinción de Gram de las colonias aisladas en cajas Petri donde hubo crecimiento.

3.- Observar en objetivo de inmersión (100x) las características microscópicas de la tinción

realizada.

4.- Dibuje lo observado e interprete sus resultados.

5.- Esterilizar los medios utilizados.

Cuestionario:

1.- ¿Qué características macroscópicas y microscópicas se toman en cuenta en la identificación de

bacterias?

2.- Escriba una lista de microorganismos patógenos que pueden transmitirse a través del aire, agua,

alimentos y suelo.




Práctica No. 7

***Análisis microbiológico del exudado faríngeo***

Objetivos:

Describir la utilidad del análisis microbiológico de un exudado faríngeo. Conocer los principales agentes etiológicos de faringitis o amigdalitis. Efectuar el diagnóstico de faringitis o amigdalitis estreptocóccica, estafilocóccicas o candidiásicas.

Material:

Abatelenguas

Asa bacteriológica

Hisopos estériles

Mechero Bunsen

Mechero Fisher

Matraces de 250 mL

Espátula

Portaobjetos

Parrilla eléctrica

Balanza granataria

Autoclave

Incubadora

Microscopio óptico

Reactivos:

Aceite de inmersión.

Colorantes y reactivos de Gram.

Medios de cultivo:

Agar Biggy

Agar eosina azul de metileno

Agar sal-manitol

Gelosa sangre de carnero Primera sesión:

I. Preparación de medios de cultivo

1.- Preparar los siguientes medios de cultivo:

- 90 mL de agar eosina azul de metileno

- 90 mL de agar sal-manitol

- 90 mL de agar Biggy

2.- Esterilizar los medios de cultivo en autoclave o en olla de presión durante 15 minutos a 121oC

y una presión de 15 libras in2.



3.- Sacar los medios esterilizados.

4.- Dejar enfriar y vaciar en 3 cajas Petri estériles ( utilizar 3 cajas para cada medio de cultivo).

5.- Dejar solidificar, invertir y refrigerar.

Segunda sesión (Extraclase):

4.- Recolección de muestras de exudado faríngeo. La muestra se toma en ayuno, con ayuda de un

hisopo se frota la parte posterior de la garganta, en las amígdalas o donde haya inflamación.

5.- Descargar la muestra, realizando un estriado continuo en gelosa sangre, agar sal-manitol, agar

eosina azul de metileno y agar Biggy.

6.- Incubar dichos medios, a ±35 oC durante 24 - 48 horas.

Tercera sesión:

7.- Observación de las características macroscópicas en los medios que hayan presentado

crecimiento.

8.- Realizar tinción de Gram de las colonias sospechosas. Observar las características

microscópicas a inmersión.

9.- Identificar los microorganismos que desarrollaron en las cajas, dependiendo de las

características microscópicas, macroscópicas y bioquímicas de éstos.

10.- Esterilizar los medios utilizados.

Cuestionario:

1.- Describa los microorganismos que conforman la flora habitual de faringe.

2.- Describa los principales agentes etiológicos de patologías de las vías respiratorias altas.

3.- ¿Cuáles son los microorganismos que se pueden aislar en un exudado faríngeo, en pacientes

debilitados u hospitalizados?.

4.- ¿Cuál es la utilidad de un cultivo de exudado faríngeo?

Hisopo




Práctica No. 8

***Búsqueda de parásitos en hortalizas***

Objetivos:

Realizar coproparasitoscópico por método directo y por concentración. Identificar parásitos intestinales (quistes, huevecillos, larvas) mediante examen microscópico. Material:

Tubos de ensayo de 13 x 100 mm

Pipetas transfer

Vaso de precipitado de 1000 mL

Portaobjetos

Cubreobjetos

Aplicadores de madera

Papel seda

Centrífuga

Microscopio óptico

Papel Material biológico:

Hortalizas: rábano, lechuga, apio, acelga, cilantro, repollo Reactivos:

Solución salina isotónica (NaCl al 0.85%)

Lugol

Solución de ZnSO4 (densidad 1.18 g/mL) -Disolver 330g de sulfato de zinc en aproximadamente 670 mL de agua destilada y ajustar la densidad a

1.18 g/mL).

Procedimiento:

- Preparación de la muestra

1.- En un vaso de precipitado, hacer una suspensión de cada hortaliza, sumergiendo las hojas o la

hortaliza en 500 mL de solución salina isotónica y dejar reposar una hora.

2.-Decantar la muestra y dividir el sedimento en dos tubos de ensayo (enumerar como tubo 1 y tubo

2).

3.-Centrifugar las muestras a 2500 rpm durante 10 minutos.

4.-Decantar la muestra.

-Método directo:



1.- Colocar una gota del sedimento del tubo 1 en un portaobjeto y otra gota en otro portaobjeto, a este segundo adicionarle una gota de Lugol. 3.-Poner en cada muestra el cubreobjeto y observar al microscopio con el objetivo de 10x y 40x.

-Método de concentración:

1.- Resuspenda el sedimento del fondo del tubo 2, con 1 – 2 mL de sulfato de zinc. 2.- Lleve el volumen hasta 5 mm antes de la orilla del tubo, con el sulfato de zinc. 3.- Centrifugue 1 minuto a 1000 rpm. 4.- Deje reposar por 2 – 3 minutos. 5.- Tome con una pipeta Pasteur o con el asa bacteriológica una o dos gotas de la película superficial. 6.- Coloque la muestra sobre el portaobjetos y añada una gota de Lugol. 10.-Coloque un cubreobjetos sobre la muestra y observe a 10x y 40x.

11.-Decante el sobrenadante y con la misma pipeta Pasteur o con el asa, tome una muestra del

sedimento y añada una gota de Lugol.

12.- Coloque un cubreobjetos sobre la muestra y observe a 10x y 40x.

Cuestionario:

1.- Describa la clasificación taxonómica de los parásitos. 2.- De las siguientes enfermedades parasitarias, indique el agente causal y su forma de transmisión. Protozoarios:Amibiasis b) Giardiasis c) Toxoplasmosis d) Paludismo e) Enfermedad de Chagas

Helmintos:

a) Teniasis b) Ascariasis c) Trichuriasis d) Triquinosis e) Enterobiasis

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