BIOQUMICA DE LOS ALIMENTOS2010Bibliografa: Caracterizacin funcional y estructural de protenas. Pilosof, A. M.; Bartholomai, G.Disertante: Griselda Ballerini

Se las puede clasificar en tres gruposPROPIEDADES DE HIDRATACINDependen de la interaccin protena-aguaPROPIEDADES DEPENDIENTES DE LA INTERACCIN PROTENA-PROTENAPROPIEDADES DE INTERFASEDependen de la interaccin de la protena con dos fases inmiscibles

BEBIDASSolubilidad a diferentes pHPRODUCTOS CRNICOSAbsorcin de agua, retencin de agua y grasa, gelificacin, emulsificacinPRODUCTOS DE PANADERAAbsorcin de agua, viscoelasticidad, emulsificacin, espumadoCREMAS Y HELADOSEmulsificacin, espumado, viscosidadMAYONESAS, ADEREZOS, SALSASEmulsificacin, viscosidad

Tamao y forma molecularFlexibilidad molecularContenido de SH/SSSuperficialTotalBalance hidrofbico-hidroflicoCarga neta, carga superficialEntalpa de desnaturalizacinTemperatura de desnaturalizacin

METODOS DE EVALUACIN DE PROPIEDADES FUNCIONALES

EN SISTEMAS MODELOUtiliza pequeas cantidadesHay una evaluacin rpidaPermite comparar ingredientes de distintos orgenes o distintos procesos de obtencinEN SISTEMAS REALESSe requieren mayores cantidadesPermite evaluar la contribucin funcional real del ingrediente o sea su performance mediante la evaluacin de las cualidades organolpticas, textura del producto final o estabilidadEs indispensable en las etapas de optimizacin y definicin de la tecnologa industrial de produccinA NIVEL MOLECULAREstudio de la estructura molecular y de parmetros estructurales asociados a la fiuncionalidadPermite avanzar en el diseo de protenas de caractersticas especficas

PROPIEDADES DE HIDRATACIN

Vapor de aguaAgua lquida

ECUACIN PARA MODELAR LAS CURVAS DE ABSORCIN DE AGUAq = Q t / (B+t)q : cantidad total de agua absorbida en el tiempo tQ : mxima capacidad de absorcin de aguaB : tiempo necesario para absorber la mitad de la cantidad mxima de agua (Q/2)

CINTICA DE ABSORCIN DE AGUALa velocidad de absorcin de agua puede obtenerse diferenciando la ecuacin anterior con respecto al tiempo

APLICACIONES Sirve para determinar la absorcin espontnea de agua de cualquier material proteico en polvo Permite determinar adems de la capacidad de absorcin de agua (Q), loa velocidad de hidratacin. Este es un parmetro muy importante desde el punto de vista tecnolgico, vinculado a la prctica de rehidratacin que normalmente se realiza antes de la utilizacin de cualquier ingrediente proteico Permite estudiar el efecto de la temperatura, pH y la presencia de solutos en el agua de hidratacin

SOLUBILIDADLa solubilidad de un material proteico describe la capacidad de formar soluciones coloidales El concepto de solubilidad para protenas depende de las condiciones experimentales para solubilizar y recuperar la protena soluble y no puede ser definido por los productos de solubilidad usados por ejemplo para las sales.Este comportamiento complica la definicin de solubilidad enh el caso de las protenas y dado que no se puede hacer una definicin termodinmica, existen diferentes definiciones operacionales.La solubilidad de las protenas depende del estado fisicoqumico de sus molculas, el que puede ser alterado por Calentamiento, procesamiento, secado y condiciones de almacenamiento La solubilidad depende del pH, fuerza inica, T y solventes orgnicos

El conocimiento de las caractersitcas de solubilidad es til para: Seleccin de condiciones ptimas de extraccin de protenas Conocer las aplicaciones potenciales Optimizar las condiciones de procesamiento Indicar el grado de tratamiento trmicoNDICES MS COMUNES:NSI: ndice de solubilidad de N2 (100 . g N2 en solucin / N2 total)PDI : ndice de dispersibilidad de protena (100 . g de protena en dispersin / prot. total)

ETAPAS PARA LA DETERMINACIN DE LA SOLUBILIDADDispersin de la protena en H2O

Ajuste de pH al de estudio

Agitacin

Centrifugacin

Dosaje de nitrgeno en sobrenadante

MTODO DE REFERENCIA PARA DETERMINACIN DE N2KJELDAHL

OTROS MTODOS PARA DETERMINACIN DE PROTENA Absorbancia a 280 nm

Mtodo de Biuret

Mtodo de Lowry

Mtodo de Bradford

Mtodo del cido 4,4-Dicarboxil-2,2-biquinona (BCA)

GELIFICACINLas protenas determinan las caractersticas de muchos alimentos por debido a su propiedad de gelificar.La textura, propiedades organolpticas y calidad de productos como gelatinas, embutidos crnicos, surimi, yogur, postres lcteos, productos de panadera, etc, estn vinculados a la formacin de un gel proteico

Agregacin ordenadaBalance de fuerzas atractivas y repulsivasConstitucin de una matriz o red proteica capaz de retener aguaDebido a que los geles pueden presentar un comportamiento soft que se rompe y fluye bajo la aplicacin de fuerzas muy pequeas, una definicin estricta es muy difcil y es por eso que se utilizan los trminos fuerte y dbil para la clasificacin de los geles

Nomenclatura relativa a la formacin de estructuras proteicas Precipitacin: separacin de la solucin Asociacin: interaccin de molculas de protena caracterizado por uniones dbiles entre sitios especficos, formacin de monmeros, dmeros, etc. No hay modificacin estructural (cuando hay estructura cuaternaria) Agregacin: trmino general para las interacciones no especficas protena-protena, que incluyen floculacin, coagulacin y gelificacin Floculacin: agregacin coloidal debido a interacciones protena-protena al azar que no involucran cambios conformacionales de importancia. Se mantiene la estructura nativa Coagulacin: agregacin desordenada que implica cambios conformacionales importantes. Desnaturalizacin Gelificacin: agregacin ordenada que implica cambios conformacionales de importancia

Desde el punto de vista microestructural existen distintos tipos de geles proteicos: Filamentos finos, involucran un entrecruzamiento por asociacin fsica (no covalente) entre las cadenas laterales gelatina termoreversible Redes particuladas que involucran la agragacin mediante uniones covalentes y no covalentes de protenas globulares parcialmente dedsnaturalizadas en forma de racimos de uvas (clusters) o lineales para formar una hilera de partculas (strins of beads)

Protenas globulares gelificantesProtenas del msculo

Clara de huevo (ovoalbmina)

Casenas de la leche (Coagula por accin de la quimosina y Ca++)

Protenas del lactosuero (-Lactoglobulina, -lactoalbmina)

Protenas de la soja

Cmo ocurre la gelificacin?En general mediante tratamiento trmico a T> a la de desnaturalizacinEl mecanismo aceptado para la desnaturalizacin y gelificacin de protenas globulares se describe:(PN)n < -- > n PN -- > n PD n PD -- > (PD)nSe obtiene por: Hidrlisis enzimtica moderada (micelas de casena, protenas de la soja) Adicin de iones Ca (casena, protenas de la soja= Tratamientos a altas presiones Cambios de pH (embutidos, yogur)

GELIFICACIN DE PROTEINAS GLOBULARES

Interacciones que estabilizan la estructura de los geles

TIPOGRUPOSFUNCINPROTENACovalente---S---S---Puentes, ordenSoja, WPC, ovoalbminaPuente H--NHO=C--Puentes, viscosidad, estabilidadtodasHidrofbicasNo especficoViscosidadtodasInicas--NH3+; COO-Interaccin con el solvente o salesTodas, depende del pH

GELIFICACIN POR CALOR DE PROTENAS GLOBULARESLa transformacin por calentamientode una solucin proteica a gel se describe mediante varias etapasa- La protena se desnaturaliza por accin del calorb- las molculas proteicas interaccionan entre si, llegando al punto gel donde la interaccin es suficientemente importante como para generar una matriz primaria con propiedades viscoelsticasc- con el tiempo y el enfriamiento se forma la matriz de equilibrio es decir el gelPara describir estas situaciones existen modelos matemticos: Modelo de FLORY-STOCKMAYER (1941-1974): la gelificacin es un evento sbito que ocurre cuando es alcanzado un cierto grado de entrecruzamiento, se alcanza un valor crtico (punto gel) en el que la viscosidad diverge a infinito Teora de la percolacin: (Stauffer -1992): se asume que los monmeros forman agregados pequeos y que en cierto punto (punto gel) se inicia el entrecruzamiento

Se calienta en tubos de ensayo sellados, a distintas temperaturas y tiempos, dispersiones de protenas de concentraciones apropiadas y posteriormente se las enfra

Las condiciones de temperatura y tiempo son propias para cada protena

La gelificacin puede ocurrir durante el calentamiento (protenas de soja, lactosuero, clara de huevo) o luego del enfriamiento (gelatina, loisozima)

Factores que afectan la gelificacin:ESTUDIO DEL FENMENO DE GELIFICACIN Concentracin de protena Temperatura / tiempo de gelificacin Fuerza inica / tipo de soluto Grado de desnaturalizacin de la protena

Seguimiento experimental de la gelificacinLa esencia del proceso de gelificacin es el punto gel, es decir el punto donde ocurre la transformacin de lquido a slidoEsto indica que las propiedades que caracterizan esa transicin son de naturaleza mecnicaMtodos reolgicos dinmicos (espectroscopa mecnica) en los que se aplica un esfuerzo oscilatorio, como nica alternativa del monitoreo de la gelificacin

Determinacin de la estabilidad trmicaCalorimetra diferencial de barrido (DSC)Determinar el grado de desnaturalizacin de la protenaSe lograMidiendo la energa requerida para la desnaturalizacin, ya que la T vara linealmenteRequiere de una referencia y determinar la influencia de las condiciones del medioLa desnaturalizacin se observa como un pico endotrmico y el area del pico es el cambio de entalpa del proceso

El flujo calrico se grafica en funcin de la T de la muestra o del tiempo transcurrido

Medir el tamao de los agregados formadosEl grado de desnaturalizacin proteicaCintica de los procesos involucrados

Una vez formado el gel se realizan ensayos macroscpicos

Textura, reometra, prdida de agua,etc.Caracterizacin estructural de los geles por diferentes tipos de microscopa.Mtodos para el estudio de la agregacinPara estudiar las primeras etapas dl proceso de gelificacin se utilizan diferentes tcnicas que brindan informacin complementaria

Electroforesis PAGEEs una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas para la separacin y caracterizacin de protenasPuede hacerse en condiciones nativas, disociante y reductora

Dispersin dinmica de luz (Dynamic Light Scattering)Las mediciones arrojan informacin acerca del dimetro de las partculas y de la intensidad, relacionada a la velocidad de crecimiento y nmero de partculas se determinan parmetros relacionados al tamao de las partculas presentes en la muestra se registra la intensidad de la luz refractada/dispersada por la muestra a partir de un haz de luz laser incidente el comportamiento de la intensidad fluctuante que se registra, se ajusta por medio de una funcin de autocorreccinPueden realizarse mediciones in-situ, en equipos que cuenten con control de temperatura y a velocidades de crecimiento de agregados dentro de la sencibilidad del equipo, o exsitu con calentamiento y enfriamiento externo, relizandose posteriormente la medicin

Tilting testEvaluacin visual del tiempo de gelificacin (Relhkin et al., 1998) En un bao termostatizado a temp. Constante, se calientan tubos transparentes conteniendo una muestra de la solucin proteica a estudiar A tiempos sucesivos se retiran los tubos del bao Puede determinarse el tiempo de gelificacin observando la deformacin directamente al extraer el tubo del bao El tiempo de gelificacin se determina como el tiempo necesario para que el menisco de la solucin contenida en los tubos no sufra deformacin o no fluya al inclinarloEste mtodo puede ser utilizado tambin para estimar la concentracin de protena mnima para la formacin de un gel, o las combinaciones tiempo-temperatura adecuada

Determinacin del punto gel y evolucin de parmetros viscoelsticos Ensayos mecnicos de pequeas deformaciones Permiten el seguimiento de la gelificacin y la caracterizacin del comportamiento de los geles La solucin proteica se coloca entre un par de platos paralelos cuya temperatura puede ser controladaLa muestra es sometida a una deformacin oscilatoria. Los parmetros viscoelsticos del mateiral son determinados por comparacin entre la deformacin aplicada y el esfuerzo resultante En los experimentos de reometra oscilatoria, la relacin entre deformacin y esfuerzo puede describirse mediante el mdulo complejo G*, definido como:G: mdulo viscoso (energa disipada por el sistema durante la deformacin)G: mdulo elstico (energa almacenada por el sistema durante la deformacin)

La transicin de una estructura viscosa (sol) a una viscoelstica (gel) durante el calentamiento puede ser monitoreada por reometra dinmica oscilatoria como el punto de cruce entre el mdulo viscoso (G) y el elstico (G) momento en el cual el ngulo de desfasaje es de 45 y la tangente del ngulo de prdida (tg =G/G= 1

Caracterizacin macroestructural de gelesEl gel se puede caracterizar desde el punto de vista macroestructural o microestructural. Por lo general hace falta aplicar ms de una metodologa para caracterizarlo adecuadamenteVicoelasticidad Reometra dinmica oscilatoria (G, G, tg Ensayos de relajacinTextura test de fractura Dureza, fracturabilidad, elasticidad, adhesividad, cohesividadPropiedades de flujo Viscosidad aparente, tixotropaCapacidad de retencin de agua

Viscoelasticidaad Por remetro oscilatorio de pequea amplitud de deformacin el barrido de deformacin se usa para determinar los lmites del comportamiento viscoelstico lineal. En esta regin las propiedades reolgicas no son dependientes de la deformacinEl espectro mecnico de un gel muestra la variacin (Gy G) en funcin de la frecuencia y permite definir un gel segn criterios reolgicos

Grfico1

300.1

300.2

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302

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303

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305

305.1

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306

306.1

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306.3

306.4

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306.7

306.8

306.9

Frecuencia (Hz)

G(Pa)

Hoja1

0.01300.1

0.02300.2

0.03300.3

0.04300.4

0.05300.5

0.06300.6

0.07300.7

0.08300.8

0.09300.9

0.1301

0.11301.1

0.12301.2

0.13301.3

0.14301.4

0.15301.5

0.16301.6

0.17301.7

0.18301.8

0.19301.9

0.2302

0.21302.1

0.22302.2

0.23302.3

0.24302.4

0.25302.5

0.26302.6

0.27302.7

0.28302.8

0.29302.9

0.3303

0.31303.1

0.32303.2

0.33303.3

0.34303.4

0.35303.5

0.36303.6

0.37303.7

0.38303.8

0.39303.9

0.4304

0.41304.1

0.42304.2

0.43304.3

0.44304.4

0.45304.5

0.46304.6

0.47304.7

0.48304.8

0.49304.9

0.5305

0.51305.1

0.52305.2

0.53305.3

0.54305.4

0.55305.5

0.56305.6

0.57305.7

0.58305.8

0.59305.9

0.6306

0.61306.1

0.62306.2

0.63306.3

0.64306.4

0.65306.5

0.66306.6

0.67306.7

0.68306.8

0.69306.9

Hoja1

Frecuencia (Hz)

G(Pa)

Hoja2

Hoja3

Ensayo de grandes deformaciones se estudian parmetros reolgicos en condiciones de procesamiento de alimentos y correlacionados a la evaluacin sensorial la deformacin es aplicada a alta velocidad, fuera de la regin lineal de viscoelasticidad resultan de utilidad para estudios comparativos

Perfil de textura El anlisis del perfil de textura (TPA) es un mtodo objetivo correlacionado con el anlisis sensorial de la textura. El ensayo comprende las dos compresiones sucesivas de una muestra imitando el proceso de masticacin Un pequeo cilindro de gel se coloca sobre la plataforma de un texturmetro tipo prensa. Sobre ellos acta un plato plano que lo comprime hasta una determinada altura predeterminada ( por ejemplo un porcentaje de la altura inicial). Las compresiones se realizan a una velocidad constante durante las cuales se registra la evolucin de la fuerza en funcin del tiempo o la deformacin

Del anlisis de los perfiles de fuerza vs tiempo, se obtienen los parmetros de textura del materialDUREZA: Altura del primer pico, F1. Se define como la resistencia a la compresin. Es la fuerza que debe aplicarsepara lograr una deformacin dada.COHESIVIDAD: A3/(A1+A2). Cada rea representa el trabajo hecho en cada compresin siendo una integral de fuerza sobre distancia, es funcin directa del trabajo necesario para vencer las uniones internas del materialELASTICIDAD: t2/t1. Es la habilidad para recuperar la forma original luego de una suave deformacinADHESIVIDAD: A4. Es el trabajo necesario para levantar el plato de la muestra. Es la capacidad de pegarse a otros materiales. Representa el trabajo necesario para vencer las fuerzas atractivas entre la superficie de un gel y la superficie de otros materiales.

Capacidad de retencin de aguaSe aplica una fuerza externa (presin o centrifugacin y se miode la cantidad de agua liberada por el gel en el cual el agua es adsorbida por un material poroso

Caracterizacin microestructuralMicroscopa ptica: Primer mtodo ptico empleado con fines de caracterizar cualitativamente la microestructura de los geles. Es comn aplicar colorantes para mejorar el contraste y diferenciar estructuras. Fuente de iluminacin la luz

Caracterizacin microestructuralMiscroscopa confocal: Captura luz laser. Se ussan fluorforos para aumentar el contraste y la nitidez .

Caracterizacin microestructuralMiscroscopa electrnica de barrido (SEM). Genera imgenes tridimensionales topogrficas, permite distinguir agregados de molculas y espacios vacos. La imagen se genera por electrones secundarios liberados desde la superficie del especimenMiscroscopa electrnica de transmisin (TEM). Visualiza un campo de corte de poca profundidad (0,05 a 0,1 m) pero de alta resolucin de detalles

Cromatografa lquida de alta performanceLa cromatografa es una tcnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos qumicos. La muestra es distribuida entre dos fases, una estacionaria y otra mvil, de tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es selectivamente detenido por la fase estacionaria.