BIOQUIMICA Y ¨VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA

BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

¨VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE

GRUPO SANGUÍNEO Y FACTOR RH, EN EL ÁREA DE HEMATOLOGIA DEL

LABORATORIO QUINTANILLA S.R.L.¨

INFORME DE PRACTICAS PRE-PROFESIONALES

PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE

QUIMICO FARMACEUTICO

Autora: Br. Pesantes Moreno, Lisbeth Karen

Asesor: Dr. Pedro Alva Plasencia

TRUJILLO – PERU

2011

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

http://www.google.com.pe/imgres?q=unt&um=1&hl=es&sa=N&biw=1440&bih=698&tbm=isch&tbnid=brQ-qJPCKhfoyM:&imgrefurl=http://www.noticiastrujilloperu.com/2011/09/ingresantes-universidad-nacional-de_25.html&docid=q30Ppw7X3Pp39M&w=311&h=252&ei=KyyLTouVCIry0gGY_dTSBA&zoom=1

BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

2

DEDICATORIA

Gracias Señor:

Por el inmenso amor que me brindas,

apoyándome en mis momentos difíciles,

ayudándome a superar los obstáculos

y por las grandes oportunidades que me ofreces,

por haber permitido la culminación

de mi informe , con el cual podré sacar mi título.

Lisbeth



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

3

A mis queridos padres, y amigos incondicionales:

Eugenia Moreno y Fidel Pesantes

Y las dos personas que siempre me ayudan y

son como mis segundos padres:

William Lara y Caridad Moreno

A los cuatro por la confianza, cariño que siempre me

brindan, por incentivarme a luchar por lo que quiero lograr en la

vida, y gracias a ellos el culminar mi carrera.

Lisbeth



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

4

AGRADECIMIENTO

A mi Asesor

Un agradecimiento muy especial a mi

maestro, guía y asesor:

Dr. Q.F. Pedro Alva Plasencia

Por su asesoramiento y valiosa orientación

en la realización de mi informe

de prácticas pre-profesionales.

Lisbeth



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

5

A mi amiga incondicional:

Viky Pinillos Pozo

Por su apoyo, y ayuda,

En la culminación de mi informe de internado

Lisbeth



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

6

JURADO DICTAMINADOR

Dr. Q.F. Jesús Gallardo Melendez (Presidente)

Dr. Q.F. Alva Plasencia, Pedro (Miembro)

Dr. Q.F. Yuri Curo Vallejos (Miembro)

Lisbeth Karen Pesantes Moreno



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

7

PRESENTACIÓN

Señores Miembros del Jurado Dictaminador:

Dado cumplimiento a lo establecido por el reglamento de grado y

título de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de

Trujillo, sometemos a vuestra consideración y criterio profesional el presente

informe intitulado:

“VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA

DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS Y FACTOR RH, EN EL

ÁREA DE HEMATOLOGÍA DEL LABORATORIO QUINTANILLA S.R.L”

Es propicia esta oportunidad para manifestar mi más sincero

reconocimiento a nuestra alma mater y toda su plana docente, que con su

capacidad y buena voluntad contribuyen a nuestra formación profesional.

Dejo a vuestro criterio señores del jurado dictaminador la calificación del

presente informe de prácticas pre-profesionales.

Trujillo 28 de Octubre del 2011

____________________________



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

8

RESUMEN

Es bien conocida la necesidad de validar los métodos de análisis y, en concreto,

este informe aborda la validación de la determinación de grupos sanguíneos y

factor Rh con los métodos de análisis cualitativos, clasificados por la USP XXX;

utilizando el manual de DIAGAST, siendo sus reactivos preparados a partir de

anticuerpos producidos por DIAGAST, provenientes del sobrenadante de

cultivos in vitro de hibridomas de origen murino o humano.

Se utilizó los parámetros de avidez (tiempo que media entre la mezcla del

reactivo con los eritrocitos y la aparición de la aglutinación), especificidad y

sensibilidad (es la capacidad o habilidad de detectar muestras negativas y

positivas respectivamente cuando realmente lo son), especificidad (la capacidad

del producto para identificar correctamente las muestras carentes del antígeno

en cuestión) y robustez (medida de la capacidad de un procedimiento analítico

de permanecer inafectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los

parámetros del método); haciendo uso de tablas de contingencia, y tablas con

respuestas utilizando solamente la percepción como; aglutinación ausencia: (-),

aglutinación presencia baja: (+), aglutinación presencia media: (++),

aglutinación presencia alta: (+++).

Para todos los parámetros cumplió con los requisitos de validación, verificando

la utilización de los métodos analíticos correspondientes para determinar los

grupos sanguíneos y factor Rh.

Palabras claves: avidez, especificidad, sensibilidad, repetitibilidad y robuste



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

9

ABSTRACT

It is well known the need to validate methods of analysis and, specifically, this

report addresses the validation of blood grouping and Rh factor of qualitative

analysis methods, classified by the USP XXX, using the manual DIAGAST being

their reagents prepared from antibodies produced by DIAGAST, the supernatant

from in vitro culture of murine hybridoma or human.

We used the parameters of avidity (time between the reagent mixture of

erythrocytes and the onset of agglutination), specificity and sensitivity (the

capacity or ability to detect positive and negative samples, respectively, when

really they are), specificity (the product's ability to correctly identify the samples

lacking the antigen in question) and strength (a measure of the ability of an

analytical procedure to remain unaffected by small but deliberate variations in

method parameters) using contingency tables, and tables with responses using

only the perception as; agglutination absence (-), low presence aggregation: (+),

average presence agglutination: agglutination (++), high presence: (+++).

Keywords: avidity, specificity, sensitivity, repeatability and robustness



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

10

ÍNDICE

PAGINAS PRELIMINARES Pag.

Dedicatoria……………………………………..………………….……....i

Agradecimiento…………………………………………………………..iii

Jurado Dictaminador…………………………………………………….v

Presentación……………………………………………………….…….vi

Resumen………………………………………………………….……..vii

Abstract............................................................................................viii

I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………1

II. MATERIAL Y MÉTODOS ……………………………………….……...6

III. RESULTADOS……………………………….......................................14

IV. DISCUSIÓN……………………………………………………………...19

V. CONCLUSIONES……………………………………………………….22

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………….23

VII. ANEXOS

ILUSTRACIÓN



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

11

I. INTRODUCCIÓN

La introducción de métodos de control de calidad es cada vez más

frecuente en los laboratorios de análisis clínicos, generando respuestas más

de tipo cualitativo que cuantitativo, por lo cual se debe conocer sus

características de rendimiento, vigilando de modo constante su control de

calidad, para así no tener consecuencias inadecuadas en los resultados de

los pacientes(1),(2).

La calidad de los servicios debe presentar confiabilidad y uniformidad en

las mediciones, cuyo fundamento está establecido en la evaluación de las

mismas. Según las normas del ISO 15189, si se utilizan procedimientos

desarrollados por el laboratorio, estos deben validarse apropiadamente para

el uso al que están destinados en forma documentada y reconocer su

competencia para realizar ensayos. Así la validación, la confirmación

mediante el suministro de evidencia objetiva, que un sistema, un equipo y un

proceso de producción; cumplan con los requisitos para su utilización o

aplicación específica (3) (4) (5) (6).

Para la demostración de la validación de los procedimientos durante la

evaluación de la competencia técnica de los laboratorios de análisis clínicos

se requiere aplicar criterios uniformes y consistentes que además signifique

un valioso ahorro en tiempo y dinero, ya que así se minimizan los riesgos de

errores generados durante el proceso, siguiendo sus actividades tal y cómo



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

12

están descritas, y que pueden obtener un producto con los requisitos

especificados, ya que cada una de las etapas del proceso es diseñada y

controlada para tener la máxima seguridad que el resultado cumple con las

especificaciones (4) (5).

Los resultados en la validación recopilan datos cuya evaluación

constituye una función importante, en donde sus pruebas de control de

calidad se verifican frente a los requisitos de eficacia y determinando su

eficiencia en un proceso (6).

Estas pruebas se realizan para determinar las especificaciones mínimas

que deben tener los sueros hemoclasificadores ABO y Rh. La determinación

de grupos sanguíneos es de gran importancia por las repercusiones que

puede haber al realizar una transfusión sanguínea. El sistema ABO es el más

relevante, seguido del Rh por su potencia inmunogénica. Sin embargo en

muchos laboratorios al ser una prueba rápida, con material y equipo mínimos

se realiza la validación del procedimiento interno y menos frecuente el

externo. Al llevar a cabo esta validación, específicamente de los reactivos

como parte del proceso de tipificación, se corrobora que cumplan con las

especificaciones de la norma (código de color, aspecto, especificidad y avidez

en cada rutina y potencia en cada cambio de lote), para su aceptación y uso.

El resto de las actividades son para los equipos y material utilizados (7)(8).



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

13

El sistema ABO es el primer sistema de grupo sanguíneo, dividido en 4

grupos: A, B, AB, O; para la tipificación ABO, la sangre se mezcla con

anticuerpos contra sangre tipo a y tipo b, y la muestra se revisa para ver si los

glóbulos sanguíneos se aglutinan. La falta de aglutinación de los glóbulos

sanguíneos indica que la persona tiene sangre tipo ab. Si dichos glóbulos se

aglutinan, eso significa que la sangre reaccionó con uno de los anticuerpos (9) (10).

Según la USP XXX (2007), las mediciones analíticas se realizan usando

métodos y equipos que han sido probados para asegurar que se ajustan al

propósito de la medición; clasificándose en dos categorías para su validación:

métodos cuantitativos y métodos cualitativos las que determinan cuatro

parámetros: avidez, especificidad, sensibilidad, y robustez; para verificar si el

método analítico para determinar los grupos sanguíneos y factor RH cumplió

con las especificaciones establecidas y sus resultados obtenidos son

confiables(11) (12).

La precisión es el grado de coincidencia obtenida bajo las mismas

condiciones del procedimiento en el mismo día en un intervalo corto de tiempo

(mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra homogénea y en el

mismo equipo (bajo las mismas condiciones) (13).

La avidez es el tiempo que media entre la mezcla del reactivo con los

eritrocitos y la aparición de la aglutinación (14).



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

14

La especificidad es la capacidad del producto para identificar

correctamente las muestras carentes del antígeno en cuestión, evaluar

inequívocamente el analito en presencia de sustancias (impurezas, productos

de degradación, la matriz); capacidad de un anticuerpo para reconocer un

antígeno, cada antisuero se hace reaccionar con las diferentes células y no

debe existir aglutinación inespecífica (9) (13) (16).

La sensibilidad es la capacidad o habilidad de detectar muestras

positivas cuando realmente lo son.

La robustez es la medida de la capacidad de un procedimiento analítico

de permanecer inafectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los

parámetros del método y provee una indicación de su fiabilidad en

condiciones de uso normales (17).

El hecho de contar con los procesos validados no solo significa para el

laboratorio de análisis clínico emitir resultados exactos y precisos que

permitan garantizar seguridad y confianza por parte del paciente y el

profesional, sino también significa un valioso ahorro en tiempo y dinero, con lo

cual se hace menos necesario la verificación de un determinado resultado; así

también es importante tener la colaboración y capacitación del personal

técnico y profesional; por lo cual el personal debe estar debidamente

capacitado, entrenado y consciente que tras su trabajo tiene una gran

responsabilidad (17) (18).



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

15

Por lo anteriormente mencionado; el Químico Farmacéutico, en el área

del laboratorio de análisis clínico, es un profesional altamente capacitado para

la realización del procedimiento de validación de los procesos analíticos y es

conocedor de la importancia de estos dentro del sistema de gestión de calidad

y con esto demostrar su competencia al respecto.

Es por esto que se realizó el presente informe, para lo cual se planteó el

siguiente problema:

¿El método analítico para la determinación de Grupos Sanguíneos y el

Factor Rh, empleado en el Laboratorio Quintanilla S.R.L., cumple con los

parámetros de validación requeridos?

Objetivos:

1. Garantizar que los métodos analíticos seleccionados para la

determinación de grupos sanguíneos y factor Rh empleado en

el Laboratorio Quintanilla S.R.L.; dé resultados reproducibles y

confiables.

2. Verificación de la precisión, avidez, especificidad y sensibilidad

del método analítico para la determinación de grupos

sanguíneos y factor Rh, empleado en el Laboratorio Quintanilla S.R.L.

3. Verificación de la robustez del método analítico para la

determinación de grupos sanguíneos, empleado en el

Laboratorio Quintanilla S.R.L.



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

16

II. MATERIAL Y MÉTODO

2.1. MATERIAL

2.1.1. Muestra

La sangre recogida de los pacientes adultos con fenotipo

identificado en dos tubos con diferentes anticoagulantes: EDTA y

heparina, examinada en un plazo de 48 horas, sin ninguna señal

de hemólisis, conservada entre + 2°C y + 8°C, con grupo

sanguíneo y factor Rh definido en su historia clínica.

Se excluyó la muestra de sangre recogida de un recién nacido, ya

que no está totalmente desarrollado y puede dar resultados

débiles.

2.1.2. Material de laboratorio

20 láminas

Pipetas automáticas de precisión ajustables

Puntas

Tubos con Heparina

Tubos con EDTA

Guantes

Mezclador



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

17

2.1.3. Equipos

Balanza analítica

Microscopio

Micropipetas automáticas de precisión ajustables y validadas.

2.1.4. Reactivos

2.1.4.1. Componentes (19)

1. 1 frasco de ANTI-A

Tampón fosfatos, Azida zódica < 0,1%, color azul.

Colorante: Patet Blue.

2. 1 frasco de ANTI-B

Tampón fosfatos, Azida zódica < 0,1%, color amarillo.

Colorante: Tartrazine.

3. 1 frasco de ANTI-D

Inmunoglobulina ANTI D. 0.300 MG / 1.5 O 2 ML.



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

18

2.1.4.2. Fabricante

DIAGAST

2.1.4.3. Lote

70888

2.1.4.4. Vencimiento

01/01/ 2012



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

19

2.2. MÉTODOS (5) (6) (9) (12) (19)

2.2.1. VALIDACION DE LA MICROPIPETA

Se valoró en relación al peso/volumen, con respecto a la densidad

del agua que es igual a 1.Se tomó 50 uL. de agua q/p y se colocó

sobre una lámina porta objetos limpia y tarada, pesada en balanza

analítica debidamente calibrada en 20 muestras consecutivas

indistintas, hallándose el porcentaje de exactitud de cada una.

2.2.2. MÉTODO DE LA HEMO-AGLUTINACIÓN

Se enfrentó los eritrocitos de fenotipo identificado con sus

reactivos específicos: ANTI-A, ANTI-B, ANTI-D. La aglutinación

fue indicativa de la presencia o ausencia de los correspondientes

antígenos.

2.2.2.1. Técnica en placa a temperatura ambiente

- Con ayuda de un cuentagotas del frasco, se colocó I

gota de cada reactivo antigénico (50 uL.) en una lámina

porta objetos limpia; luego se tomó 50 uL. de los

eritrocitos y se colocó al lado de cada una de las gotas



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

20

del reactivo, teniendo cuidado de que las gotas no entren

en contacto.

- Los eritrocitos con el reactivo se mezclaron, con un

movimiento en espiral, realizado con el extremo de un

agitador, deforma que se dibujó un círculo proporcionado

de 2 a 3 cm de diámetro.

- Se incubó la placa durante 30 seg. a temperatura

ambiente sin agitar y llevar a la lectura de microscopio en

30 seg., 2 min. y 5 min., respectivamente; donde se

observó la presencia de aglutinación.

2.2.3. EVALUACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS(9) (12) (19)

Para el método de hematoaglutinación, se tomaron los métodos

analíticos cualitativos, según la clasificación reportada en la

USP XXX, indicados anteriormente:

1. Precisión (Técnica de lámina)

Para la lectura de las reacciones, se procesó 10 muestras de

cada grupo sanguíneo y factor Rh al 100% de muestra

sanguínea con fenotipo identificado; mezclándose los eritrocitos



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

21

con los reactivos antigénicos, en un área de 2 cm de diámetro.

Luego se inclinó la lámina para observar la presencia de

aglutinación. La reacción debe leerse antes de los 2 minutos

para evitar que los reactivos se sequen y brinden resultados

falsos positivos.

2. Avidez

La avidez de los reactivos hemoclasificadores se realizó usando

la técnica en placa y a temperatura ambiente. Se mide por la

extensión y rapidez con que un anticuerpo aglutina o reacciona

con el antígeno correspondiente, el tiempo teórico para los

grupos sanguíneos es de un máximo de 2 seg. para que se

inicie la aglutinación hasta los 30 seg., esto para los grupos

sanguíneos y para el factor Rh de un máximo tiempo de

aglutinarse de 30 seg. hasta los 2 min.

3. Sensibilidad y Especificidad

Se realizó una tabla de contingencia, tanto para verificar la

especificidad y la sensibilidad del método analítico cualitativo

para la determinación de los grupos sanguíneos y factor Rh;

enfrentando las muestras con fenotipo identificado para cada



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

22

grupo sanguíneo, evaluándolas según los siguientes

parámetros:

Falso Positivo (FP): Muestras (+) por el método a probar y (-)

por el método de referencia.

Falso Negativo (FN): Muestras (-) por el método a probar y (+)

por el método de referencia.

Positivo Verdadero (VP): Muestras (+) por el método a probar y

(+) por el método de referencia.

Negativo Verdadero (VN): Muestras (-) por el método a probar y

(-) por el método de referencia.

Y posteriormente para obtener su respectivo porcentaje, se

utilizó las siguientes fórmulas, tanto para sensibilidad y

especificidad:

Sensibilidad: VP/(VP +FN)

Especifidad : 100 x VN /(FP +VN)



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

23

4. Robustez (8)

4.1. Factores en cuenta: Dos tipos de anticoagulantes y

tiempo

Se procesó 5 muestras con fenotipo identificado en

historia clínica de cada grupo sanguíneo para los dos tipos

de anticoagulantes: EDTA y heparina anotando las

lecturas observadas en microscopio a diferentes tiempos:

30 seg., 2 min., 5 min., obteniéndose su promedio

respectivo, calificando la intensidad de la aglutinación

(formación de cúmulos) de la siguiente manera:

(-) : Aglutinación ausencia

(+) : Aglutinación presencia baja

(++) : Aglutinación presencia media

(+++) : Aglutinación presencia alta



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

24

III. RESULTADOS

Tabla Nº 1

Porcentaje de exactitud de la micropipeta usada para determinar los

grupos sanguíneos y factor Rh, en el área de hematología del Laboratorio

Quintanilla S.R.L.

Nº de

muestras

X de las láminas con 50 uL de H2O

% de

exactitud

1 49,5 99 2 49,6 99,2 3 49,8 99,6 4 49,8 99,6 5 49,9 99,8 6 49,7 99,4 7 49,6 99,2 8 49,5 99 9 49,8 99,6

10 49,9 99,8 11 49,8 99,6 12 49,7 99,4 13 49,6 99,2 14 49,8 99,6 15 49,8 99,6 16 49,7 99,4 17 49,8 99,6 18 49,6 99,2 19 49,6 99,2 20 49,8 99,8 X 49,72 99,42



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

25

Tablas Nº 2

Precisión del método analítico para determinar los grupos sanguíneos y el

factor Rh, en el área de hematología del Laboratorio Quintanilla S.R.L.

Reactivo

Grupos

sanguíneos

X de la aglutinación de las 10 muestras

Anti A A Pos. Anti B B Pos.

AB Neg. O Pos.

Anti D Rh+ Pos.

Leyenda:

Pos: Positivo Neg: Negativo



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

26

Tabla Nº 3

Determinación de la avidez, del método analítico para determinar los

grupos sanguíneos y el factor Rh, en el área de hematología del

Laboratorio Quintanilla S.R.L.

Reactivo antigénico

Grupo sanguíneo de las muestras

Número de muestras evaluadas

Máximo tiempo en segundos para que

se inicie la aglutinación

Anti A A 10 5´´ Anti B B 10 8´´ Anti D Rh+ 10 35 ´´



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

27

Tabla Nº 4

Porcentaje de la sensibilidad y especificidad, del método analítico para

determinar los grupos sanguíneos y el factor Rh, en el área de

hematología del Laboratorio Quintanilla S.R.L.

Leyenda:

Reactivos antigénicos

X cualitativo de las 10 muestras de sangre hemoclasificadas para cada grupo sanguíneo

A B AB O Rh+ Rh -

Anti - A VP (10) FN (0) VP (10) FN (0) _ _

Anti - B FN (0) VP (10) VP (10) FN (0) _ _

Anti – D _ _ _ _ VP (10) FN (0)

% de Sensibilidad

100 100 100 100 0 100

% de Especificidad

100 100 100 100 0 100

Falso Positivo (FP): Muestras (+) por el método a probar y (-) por el

método de referencia.

Falso Negativo (FN): Muestras (-) por el método a probar y (+) por el método de referencia.

Positivo Verdadero (VP): Muestras (+) por el método a probar y (+) por el método de referencia.

Negativo Verdadero (VN): Muestras (-) por el método a probar y (-) por

el método de referencia.

Sensibilidad: VP/(VP +FN)

Especifidad : 100 x VN /(FP +VN)



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

28

Tabla Nº 5

Calificación y porcentaje de la robustez del método analítico en la determinación los grupos sanguíneos, en el

área de hematología del Laboratorio Quintanilla S.R.L.

Reactivo

Tipo de

anticoagulante

TIEMPO

Nº de muestras

Porcentaje

Anti A

HEPARINA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 %

30II + + + + + + + + + + 15 2I +++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ + ++ ++ 40 5I +++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ 45

EDTA

30II ++ ++ ++ + + + + ++ ++ + 20 2I +++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ 35 5I +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ ++

+ 45

Anti B

HEPARINA

30II + + + + + + + + + + 15 2I ++ ++ + + ++ + ++ + + ++ 40 5I +++ ++ + ++ ++ ++ ++ + ++ ++ 45

EDTA

30II + + ++ + ++ ++ ++ + ++ ++ 30 2I ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 35 5I ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ 40

Leyenda:(-) : Aglutinación ausencia

(+) : Aglutinación presencia baja (++) : Aglutinación presencia media (+++) : Aglutinación presencia alta



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

29

IV. DISCUSIÓN

La validación de un método analítico se mide con los parámetros que sean

evaluados para el proceso; estos serán dependientes directos de la naturaleza del

método y las especificaciones con las que se debe cumplir; según la USP XXX

está clasificado en método de determinación cualitativo para la determinación de

grupos sanguíneos y factor Rh, a los que corresponden evaluar especificidad,

sensibilidad, repetitividad y robustez. Antes de empezar con la validación de los

parámetros para determinar los grupos sanguíneos, se validó la calibración de las

pipetas, para que el margen de error al usarlas sea el mínimo al tomar las

muestras, valorando en relación al peso/volumen, con respecto a la densidad del

agua que es igual a 1.

La utilización de las muestras de sangre con fenotipo identificado nos permitió

detectar las anomalías en: la manipulación, los reactivos, los materiales. Cuando

se compararon los resultados de la prueba y el diagnóstico, se interpreto cuatro

posibilidades que se resumió en una tabla de contingencia en donde se observó

que:

En la tabla Nº 1: Se observó que se validó correctamente la micropipeta a usar,

ya que nos dio el 99,42 % de exactitud, calibrándola correctamente para su

posterior uso del cual depende la validación en sí de los grupos sanguíneos y

factor Rh.



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

30

En la tabla Nº 2: Se presentan los resultados obtenidos de la precisión del método

analítico para la determinación de los grupos sanguíneos y factor RH, al evaluar

10 muestras para cada grupo; todos nos dieron presencia de aglutinación, con lo

que se corroboro que cada reactivo fue específico y preciso para cada grupo ya

que no existió ningún tipo de interferencias. Por precisión señalo la dispersión de

los resultados obtenidos con análisis repetidos sobre la misma muestra, sea en la

misma serie (precisión en la serie), sea en varias series (precisión entre las series)

(8)(9).

En la tabla Nº 3: Al determinar la avidez, se observó que las diferentes

aglutinaciónes de los eritrocitos respectivos para cada grupo sanguíneo, se inicio

en el tiempo respectivo, así tenemos para el reactivo antigénico A, aglutinó a los

5´´, para el Anti B aglutinó a los 8´´ y para el Anti D aglutinó a los 35´´. La reacción

de aglutinación para el Anti D demora más tiempo porque este reactivo es menos

sensible para los pacientes con factor Rh+, para que se asi determine

correctamente algún grupo Rh – existente.

En la tabla Nº 4: Se presenta que al verificar la sensibilidad y especificidad del

método analítico cualitativo para determinar los grupos sanguíneos y factor Rh, se

detectó que para cada aglutinación de muestra correspondiente a su reactivo

antigénico dio un verdadero positivo como resultado, asegurando así una

sensibilidad al 100%; y dio un verdadero negativo para cada reacción en donde se

empleó reactivo antigénico diferente para la muestra con fenotipo identificada.



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

31

Tabla Nº 5: Al determinar la robustez de la determinación de grupos sanguíneos,

la aglutinación correspondiente para cada grupo permaneció inafectado por

variaciones en sus parámetros y provee una fiabilidad en condiciones para uso

normal. Así no hubo significada alteración de las aglutinaciones al cambiar de

anticoagulante, EDTA por heparina; y al realizar la reacción de aglutinación en un

intervalo corto de tiempo (3 veces el mismo día), por un mismo analista, en la

misma muestra homogénea y en el mismo equipo (bajo las mismas condiciones),

aumenta no significativamente la presencia de aglutinación, para los diferentes

grupos sanguíneos, por lo que su precisión obtenida bajo las mismas condiciones

de operación, fue la adecuada(11)(14).



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

32

V. CONCLUSIONES

Luego de haber aplicado los parámetros establecidos de validación del método

analítico para la determinación de los grupos sanguíneos, en el Laboratorio

Quintanilla S.R.L se concluye lo siguiente:

1. La avidez de los reactivos se mantuvo dentro del rango de tiempo para que

reaccionen, siendo así el adecuado.

2. La sensibilidad para la determinación de grupos sanguíneos y el factor Rh,

fue capaz de detectar las muestras positivas.

3. Se concluyó que los reactivos para determinar los grupos sanguíneos,

tienen una especificidad del 100% respecto a los resultados esperados

4. Se demostró la especificidad para cada Grupo Sanguíneo y factor Rh;

5. Se demostró la Robustez para cada parámetro establecido.

6. Al determinar los parámetros de validación cualitativos, concluimos en dar

como validado al método analítico para la determinación de los grupos

sanguíneos en el Laboratorio Quintanilla S.R.L.



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

33

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Castro, M.: Validación de Métodos analíticos. Asociación Española de

Farmacéuticos de la Industria. Sección Catalana 1º ed. Ed Farma

Internacional. España.2000. Pp: 70-74

2. Castillo, B ; González, R.: Protocolo de Validación de Métodos Analíticos

para la Cuantificación de Fármacos. Revista Cubana de Farmacia [online].

ene.-abr. 2000, vol.30, no.1. Pp: 2-4.

Disponible en:

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034751519960001

00009&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0034-7515.

Consultado: 14 de Octubre de 2011

3. Castelluci, F.: “Recomendaciones Armonizadas para la validación de

Métodos de Análisis (Informe Técnico)”. París. 2005. Pp: 5-6

4. Grupo ACMS. Determinación de métodos analíticos. Argentina. 2010.

Disponible en:

http://www.iso15189.es/informacion-iso-15189-grupo-acms.html


5. García, E.: Validación con base en los criterios de aplicación de la norma

nmx-ec-17025-imnc-2006 en mediciones químicas y físicas. 2009.

Disponible en:



http://www.iso15189.es/informacion-iso-15189-grupo-acms.html

BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

34

http://www.ema.org.mx/descargas/ema_semac09/11_junio/12aplicacion17

025_11junio.pdf


6. Mendoza, L.: Control de calidad de sueros hemoclasificadores ABO, Rh y

suero de coombs.2009.

Disponible en:

http://www.institutolicon.com.mx/cursos/d8/c_de_c_de_reactivos.pdf


7. Rodríguez, G.; Blanco, R.: “Aseguramiento de la calidad analítica y

norma ISO 17 025 en laboratorios químicos y clínicos”. Rev.

Costarricense de Ciencias Médicas. San José, Costa Rica. Vol. 22 (2).

2001.

Disponible en:

http://www.ia.csic.es/sea/revista/VOL36-34/03.pdf

Consultado: 16 de Octubre del 2011

8. Espinosa, G.: Métodos Basados en la unión Ag-Ac. 2009.

Disponible en:

http://www.uco.es/grupos/inmunologia-

molecular/inmunologia/tema17/etexto17.htm


9. Guía de Validación de Métodos Analíticos. Perú. 2009

Disponible en:

http://www.ministeriodesalud.go.cr/protocolos/guiavalidacionmetodosanalit

icos.pdf



http://www.ema.org.mx/descargas/ema_semac09/11_junio/12aplicacion17025_11junio.pdf

http://www.ema.org.mx/descargas/ema_semac09/11_junio/12aplicacion17025_11junio.pdf

http://www.institutolicon.com.mx/cursos/d8/c_de_c_de_reactivos.pdf

http://www.ia.csic.es/sea/revista/VOL36-34/03.pdf

BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

35


10. Instituto Nacional de Estándares y la Tecnología. Líneas directivas

para evaluar y expresar incertidumbre en la medida NIST resultan ", NIST

nota técnica1297, 2001.

11. Organización Mundial de la Salud. Comité de Expertos de la OMS en

Especificaciones para las Preparaciones Farmacéuticas. 2003. 32º

Informe, Anexo 5. Ginebra.

12. The united states pharmacopea convention. The United States

Pharmacopea XXX. 30º Edition. USA. 2007. Pp: 1436-1437, 3328-3331.

13. Tapia, M.: Desarrollo y Validación de Metodologías Analíticas. Memoria

de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico. Santiago.

Universidad de Chile.2003.

14. Lic. Batista, L.: Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1999; 15(2):137-

43.

Instituto de Hematología e Inmunología

http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol15_2_99/hih10299.pdf

15. Revista de divulgación científico - tecnológica del estado de morelos.

Grupos Sanguíneos A, B, O Y Su Frecuencia. 2010.

Disponible en:

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/47/GRUPOS_SANGUIN

EAOS_Y_SU_FRECUENCIA.pdf

Consultado: 28 de Setiembre del 2011.

16. Lovine, S.: El laboratorio en la práctica clínica. los grupos sanguíneos.

Tercera edición. 2008.



http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol15_2_99/hih10299.pdf

BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

36

Disponible en:

http://www.medicinapreventiva.com.ve/laboratorio/grupos.htm

Consultado: 28 de Setiembre del 2011.

17. IUPAC: Compendium of Chemical Terminology. 2da ed. 1997. Disponible

en:

http://www.iupac.org/goldbook/L03540.pdf

Consultado: 15 de Octubre de 2011.

18. Martínez, M: “Validación de la Metodología Analítica para la Cuantificación

de Sodio y Potasio por Fonometría de Llama,” Informe de práctica

prolongada para optar al título de Químico Farmacéutico, Universidad de

Chile,. Chile. 2004.

Disponible en:

http://www.cybertesis.cl/tesis/uchile/2004/martinez_m/sources/martinez_m.

pdf

Consultado: 16 de Octubre de 2011.

19. ICH.: Guidance for Industry. Q2B Validation of Analytical Procedures:

Methodology. Noviembre. 2003. Pp: 1 – 10.

Disponible en:

http://www.fda.gov/cder/guidance/1320fnl.pdf

Consultado 14 de Octubre de 2011.



http://www.medicinapreventiva.com.ve/laboratorio/grupos.htm

http://www.iupac.org/goldbook/L03540.pdf

http://www.cybertesis.cl/tesis/uchile/2004/martinez_m/sources/martinez_m.pdf

http://www.cybertesis.cl/tesis/uchile/2004/martinez_m/sources/martinez_m.pdf

BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

37



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

38



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

39

ANEXO Nº1:



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

40



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

41

ANEXO Nº2:

Especificaciones de los reactivos hemoclasificadores



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

42

ANEXO Nº3:

Calificación cualitativa de la reacción de los grupos sanguíneos observados

en el microscopio

FUENTE: Lovine-Selva: El laboratorio en la práctica clínica. Los grupos

sanguíneos.Tercera Edición. 2008



BIBLIO

TECA D

E FARMACIA

Y B

IOQUIM

ICA

43



Documents

BIOQUIMICA Y ¨VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA