Biorremediación de un Suelo Contaminado con Hidrocarburos empleando Ácidos Húmicos y Lombrices

I

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS

DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD ZACATENCO

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA

Biorremediación de un Suelo Contaminado con Hidrocarburos,

empleando Ácidos Húmicos y Lombrices (Eisenia andrei)

Tesis que presenta:

César García Díaz

Para obtener el grado en:

MAESTRO EN CIENCIAS

EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA

Codirectores: Dra. Josefina Barrera Cortés

Dr. Ronald Ferrera Cerrato

México, D.F. 2008

II

Comité Tutorial

Dra. Josefina Barrera Cortés (Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN)

Dr. Ronald Ferrera Cerrato (Colegio de Postgraduados)

Dr. Hector Mario Poggi Varaldo (Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN)

Dr. Miguel Ángel Meléndez Lira (Física, CINVESTAV-IPN)

III

Agradecimientos

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo

económico otorgado para la realización de esta tesis a través de la beca de estudios

No.199742 y a el proyecto ―SEMARNAT-2002-C01-0154―.

Agradezco al CINVESTAV por la beca terminal otorgada para la conclusión de la

tesis.

IV

A la Dra. Josefina por el apoyo incondicional tanto personal como académico, que me brindo

a lo largo de la realización del proyecto.

Al Dr. Ronald por sus consejos académicos y personales que me brindó en cada ocasión

que tuve la oportunidad de reunirme con él, de manera incondicional.

Al Dr. Hector por sus comentarios valiosos para llevar a buen término este proyecto.

Al Dr. Miguel por sus comentarios sobre las posibles formas de analizar los resultados

obtenidos.

Al Dr. Frédéric Thalasso y al Dr. Luc Dendooven por permitirme el acceso ilimitado a sus

laboratorios en la Planta Piloto del Departamento, para llevar a cabo los análisis de la

caracterización de los materiales empleados en este proyecto.

A los auxiliares de investigación M. en C. Joel Alba Flores y M. en C. Marcos Luna por su

apoyo técnico para la realización de la tesis.

Al Dr. Fernando Esparza por su consejos; así como, el auxiliar de investigación M. en C.

Carlos Cruz y el auxiliar técnico Teresa Rodríguez.

A los auxiliares de investigación Ing. Calixto Ortega y la M. en C. Beatriz Altamirano por su

gran apoyo técnico, académico y personal; así como, al auxiliar técnico Humberto Moreno.

A la especialista Elvira Rios Leal y el auxiliar técnico Cirino Chávez, por su apoyo técnico

cromatográfico y consejos académicos brindados.

V

A mis padres y hermano

Por estar siempre conmigo y apoyarme nuevamente en cada momento en esta etapa de mi

vida y seguir orientándome para ser una mejor persona, gracias.

A mi novia

Claudia Ivonne por apoyarme en cada momento, compartir buenos momentos a su lado y

brindarme su amor, gracias.

A mis amigos

Miguel Ángel Rodríguez Mesa e Ivonne Esquivel Ríos, que me brindaron infinidad de

consejos para mi superación personal y académica; y que me permitieron pasar buenos

momentos con ustedes, gracias.

A mis compañeros

Por su compañía y amistad que me brindaron; y porque con su compañía el camino recorrido

fue mucho más sencillo, gracias.

VI

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 1

1.1. SUELO ..................................................................................................................................................... 1

1.1.1. Componentes del suelo .............................................................................................................. 3

1.1.2. Suelo y su dinámica .................................................................................................................... 4

1.1.2.1 Humus....................................................................................................................................... 5

1.1.2.1.1. Tipos de humus .............................................................................................................. 6

1.1.2.2. Composición del Humus (Substancias Húmicas) .............................................................. 6

1.1.2.3. Substancias Húmicas y sus propiedades............................................................................ 8

1.1.2.3.1. Propiedades detergentes de las Substancias Húmicas ......................................... 12

1.1.2.4. Humificación de HTP’s ......................................................................................................... 13

1.2. CONTAMINACIÓN DE SUELOS CON HIDROCARBUROS .......................................................................... 13

1.2.1. Petróleo y producción................................................................................................................ 14

1.2.2. Composición del Petróleo ......................................................................................................... 14

1.2.2.1. Complejos Altamente Recalcitrantes (Asfaltenos) ........................................................... 15

1.2.3. Transporte de los HTP’s en el ambiente ................................................................................ 16

1.2.4. Migración de la mezcla de HTP’s ............................................................................................ 17

1.2.5. Toxicidad de las fracciones recalcitrantes del petróleo........................................................ 19

1.2.5.1. Hidrocarburos Alifáticos (HA’s) ........................................................................................... 19

1.2.5.2. Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HPA’s)................................................................ 19

1.2.5.3. Compuestos heterocíclicos con azufre o nitrógeno ......................................................... 19

1.2.5.4. Efecto de los HTP’s en la salud .......................................................................................... 20

1.2.6. Biodegradación de los Hidrocarburos Totales del Petróleo ................................................ 21

1.2.6.1. Microorganismos degradadores de hidrocarburos .......................................................... 21

VII

1.3. TECNOLOGÍAS DE REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS (IN-SITU, EX-SITU) ............................... 23

1.3.1. Lavado de suelo ......................................................................................................................... 24

1.3.1.1. Surfactantes ........................................................................................................................... 24

1.3.2. Tecnologías de biorremediación de suelos contaminados .................................................. 26

1.3.2.1. Bioestimulación ..................................................................................................................... 27

1.3.2.2. Residuos agroindustriales ................................................................................................... 28

1.3.2.3. Vermicomposteo ................................................................................................................... 29

1.3.2.3.1. Las lombrices ............................................................................................................... 30

1.3.2.3.2. Las excretas de lombriz .............................................................................................. 30

1.3.2.3.3. Agregados de excretas ............................................................................................... 30

1.3.2.3.4. Canales o galerías formados por la lombriz ............................................................ 31

1.3.2.3.5. Enzimas de la lombriz ................................................................................................. 31

1.3.2.3.6. Efecto de fuentes orgánicas e inorgánicas de N sobre la población de lombrices

del suelo............................................................................................................................................. 33

1.3.2.3.7 Remoción de HTP’s empleando lombrices ............................................................... 33

1.3.3. Factores que afectan la biorremoción de hidrocarburos en el suelo ................................. 34

1.3.3.1. Relación Carbono Nitrógeno (C/N) .................................................................................... 35

2. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................................... 38

3. HIPÓTESIS .................................................................................................................................................. 38

4. OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 39

4.1. OBJETIVO GENERAL .............................................................................................................................. 39

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................................... 39

5. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................................... 40

5.1. SUELO ................................................................................................................................................... 40

5.2. EXTRACTO DE LEONARDITA ................................................................................................................. 41

5.3. LOMBRIZ ................................................................................................................................................ 41

VIII

5.4. VERMICOMPOSTA .................................................................................................................................. 40

5.5. BAGACILLO DE CAÑA ............................................................................................................................. 40

5.6. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................................................................ 42

5.6.1. Caracterización del suelo contaminado, bagacillo de caña, extracto de leonardita y

vermicomposta............................................................................................................................................. 43

5.6.2. Selección de la fuente de nitrógeno y relación C/N .............................................................. 44

5.6.3. Fermentación sólida del suelo contaminado ......................................................................... 45

5.6.3.1. Dispositivo experimental ...................................................................................................... 45

5.6.3.2. Diseño experimental factorial general ............................................................................... 46

5.6.3.3. Acondicionamiento de los tratamientos ............................................................................. 47

5.6.4. Lavado de suelo con substancias húmicas ........................................................................... 48

5.6.4.1. Diseño experimental factorial completo............................................................................. 48

5.6.5. Fermentación sólida del suelo lavado .................................................................................... 49

5.6.5.1. Acondicionamiento del suelo lavado .................................................................................. 49

5.6.6. Lixiviado....................................................................................................................................... 49

5.6.7. Análisis estadístico .................................................................................................................... 49

6. RESULTADOS Y DISCUSION.................................................................................................................. 50

6.1. CARACTERIZACIÓN DEL SUELO CONTAMINADO ................................................................................... 50

6.2. CARACTERIZACIÓN DEL BAGACILLO DE CAÑA ...................................................................................... 57

6.3. CARACTERIZACIÓN DE LA VERMICOMPOSTA ........................................................................................ 58

6.4. CARACTERIZACIÓN DEL EXTRACTO DE LEONARDITA ........................................................................... 59

6.5. SELECCIÓN DE LA FUENTE DE NITRÓGENO (EN FUNCIÓN DE LA SOBREVIVENCIA DE LA LOMBRIZ,

EISENIA ANDREI) ................................................................................................................................................ 61

6.6. FERMENTACIÓN SÓLIDA DEL SUELO CONTAMINADO ........................................................................... 63

6.6.1. Remoción de HTP’s de acuerdo al DEFG planteado ........................................................... 63

6.6.1.1. Efecto del bagacillo de caña en la remoción de HTP’s ................................................... 66

6.6.1.2. Efecto del extracto de leonardita (ácidos húmicos) en la remoción de HTP’s ............ 68

IX

6.6.1.3. Efecto de la presencia de la lombriz (Eisenia andrei) en la remoción de HTP’s ......... 74

6.6.1.4. Efecto de la vermicomposta en la remoción de HTP’s ................................................... 79

6.6.1.5. Efecto de la humedad (blanco ―a‖) en la remoción de HTP’s ........................................ 80

6.6.1.6. Efecto de la bioestimulación con sales minerales (blanco ―c‖) en la remoción de HTP’s ......... 80

6.6.2. Eficiencia de remoción de HTP’s en los diferentes tratamientos........................................ 81

6.6.3. Niveles de remoción de HTP’s libres de la fracción de asfaltenos ..................................... 82

6.6.4. Remoción HTP’s a largo plazo (11 meses) ........................................................................... 83

6.6.5. Remoción de asfalteno contenidos en la mezcla compleja de HTP’s ............................... 84

6.6.6. Fraccionamiento de los HTP’s residuales .............................................................................. 88

6.6.7. Análisis Estadístico de la Fermentación Sólida del Suelo ................................................... 90

6.6.8. Monitoreo de la población microbiana .................................................................................... 93

6.6.8.1. Carbono de biomasa ............................................................................................................ 93

6.6.8.2. Cuenta total para Bacterias ................................................................................................. 95

6.6.8.3. Cuenta total para Levaduras ............................................................................................... 98

6.6.8.4. Cuenta total para Hongos .................................................................................................. 101

6.6.8.5. Cuenta total para Actinomicetos ....................................................................................... 103

6.6.9. Correlación de la población microbiana hidrocarbonoclasta y la remoción de HTP’s ... 105

6.6.10. Formación de ácidos húmicos ............................................................................................... 108

6.6.11. Correlación de la formación de ácidos húmicos y la remoción de HTP’s ....................... 110

6.7. LAVADO DE SUELO CON SUBSTANCIAS HÚMICAS ................................................................................ 112

6.7.1. Análisis Estadístico de la remoción HTP’s del suelo lavado ............................................. 112

6.7.2. Determinación de la Concentración Micelar Crítica (CMC) del EL en solución ............. 115

6.8. FERMENTACIÓN SÓLIDA DEL SUELO LAVADO ..................................................................................... 119

6.8.1. Eficiencia de remoción de HTP’s en los diferentes los tratamientos ................................... 122

6.8.2. Niveles de remoción de HTP’s libres de la fracción de asfaltenos ...................................... 123

6.8.3. Fraccionamiento de los HTP’s residuales ............................................................................... 126

6.8.4. Monitoreo de la población microbiana...................................................................................... 128

6.8.4.1. Carbono de biomasa (Cb) ................................................................................................. 128

X

6.8.4.2. Cuenta total para Bacterias y Carbono de biomasa (Cb) ............................................. 129

6.9. TRATAMIENTO DEL LIXIVIADO.............................................................................................................. 130

7. CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 133

8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................................... 135

9. ANEXO........................................................................................................................................................ 153

XI

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Columna de suelo y la organización de sus diferentes horizontes 1

Figura 2. Componentes principales de los agregados del suelo 2

Figura 3. Propiedades fisicoquímicas de las substancias húmicas (SH), 7

Figura 4. Fragmento estructural hipotético de las Substancias Húmicas del suelo 11

Figura 5. Regeneración de la capacidad oxido-reducción de las quinonas 11

Figura 6. Regiones susceptibles de fragmentación y biodegradación en los asfaltenos 16

Figura 7. Migración de los HTP’s en el ambiente 18

Figura 8. Estrategia experimental para la remoción de HTP’s del suelo 42

Figura 9. Dispositivo experimental para llevar a cabo la fermentación sólida del suelo 45

Figura 10. Diseño Experimental Factorial General 46

Figura 11. Ácidos húmicos presentes en el suelo 51

Figura 12. Asfaltenos e hidrocarburos libres de asfaltenos, contenidos en el suelo 54

Figura 13. Perfil cromatográfico del hidrocarburo libre de asfaltenos 54

Figura 14. Perfil cromatográfico de los asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar 55

Figura 15. Flora microbiana total asociada al suelo 56

Figura 16. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al suelo 57

Figura 17. Flora microbiana total asociada a la vermicomposta 58

Figura 18. Ácidos húmicos y ácidos fúlvicos aislados de la vermicomposta 59

Figura 19. Estructura hipotética de los ácidos húmicos 60

Figura 20. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita 60

Figura 20. Lombriz Eisenia andrei en los microcosmos 61

Figura 21. Lombriz Eisenia andrei 62

Figura 22. Hidrocarburos totales del petróleo remanentes 64

Figura 23. Efecto de la presencia de bagacillo de caña en la remoción de HTP’s 67

Figura 24. Efecto de la ausencia de bagacillo de caña en la remoción de HTP’s 67

Figura 25. Representación tridimensional de los ácidos húmicos 68

Figura 26. Efecto de la presencia de extracto de leonardita en la remoción de HTP’s 69

XII

Figura 27. Efecto de la ausencia de extracto de leonardita en la remoción de HTP’s 69

Figura 28. Modelo de interacción de los ácidos húmicos con xenobióticos 72

Figura 29. Estructura de los agregados de asfalteno y floculación de estos 73

Figura 30. Efecto de la presencia de ácidos húmicos en los suelos compactos 73

Figura 31. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices 75

Figura 32. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices y extracto de leonardita 75

Figura 33. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices y bagacillo de caña 76

Figura 34. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices, bagacillo de caña y extracto de leonardita 76

Figura 35. Cocón de la lombriz Eisenia andrei y lombrices recién nacidas 78

Figura 36. Efecto de la vermicomposta en la remoción de HTP’s 79

Figura 37. Remoción de HTP’s después de 11 meses de tratamiento 83

Figura 38. Perfil cromatográfico de los asfaltenos 85

Figura 39. Perfiles cromatográficos del mejor tratamiento 87

Figura 40. Fraccionamiento de los HTP’s residuales antes y después del tratamiento 89

Figura 41. Interacción BC-L en presencia de EL 91

Figura 42. Interacción BC-L en ausencia de EL 91

Figura 43. Interacción BC-EL sin lombrices 92

Figura 44. Interacción BC-EL en presencia de 20 lombrices 92

Figura 45. Interacción BC-EL en presencia de 40 lombrices 92

Figura 46. Comportamiento del carbono de biomasa para los tratamientos del DEFG 93

Figura 47. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos ―a‖ y ―c‖ 94

Figura 48. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de las bacterias 96

Figura 49. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de las levaduras 99

Figura 50. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de los hongos 102

Figura 51. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de los actinomicetos 103

Figura 52. Correlación entre el crecimiento microbiano y la remoción de HTP’s 106

Figura 53. Síntesis de AH’s para los tratamientos sin EL del DEFG, a lo largo del proceso 109

Figura 54. Síntesis de AH’s para los tratamientos con EL del DEFG, a lo largo del proceso 109

Figura 55. Correlación entre la formación de ácidos húmicos y la remoción de HTP’s 111

XIII

Figura 56. Superficie de respuesta de la interacción S-EL, en presencia de 50ml de agua 113



Figura 59. Determinación de la CMC del EL 116

Figura 60. Posible interacción de los ácidos húmicos con las moléculas de suelo y HTP’s 118

Figura 61. Cinética de remoción de HTP’s del suelo lavado 119

Figura 62. Hidrocarburos totales del petróleo remanentes 121

Figura 63. Perfil cromatográfico del tratamiento del suelo lavado 125

Figura 64. Fraccionamiento de los HTP’s del suelo lavado antes y después del biotratamiento 127

Figura 65. Fraccionamiento de los HTP’s del suelo lavado biotratado y el mejor biotratamiento del

suelo sin lavar 127

Figura 66. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos y el suelo lavado 128

Figura 67. Efecto del lavado de suelo en las bacterias del tratamiento 129

Figura 68. Efecto del lavado de suelo en el nivel de remoción de HTP’s 129

Figura 69. Lixiviado del proceso de lavado 130

Figura 70. Perfil cromatográfico del lixiviado antes (A) y después (B) del tratamiento 132

XIV

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación general de los compuestos del petróleo 14

Tabla 2. Facilidad de degradación de HTP’s y productos de su metabolismo 21

Tabla 3. Tecnologías de remediación Ex situ de acuerdo a la USEPA 23

Tabla 4. Tecnologías de remediación In situ de acuerdo a la USEPA 24

Tabla 5. Tecnologías de Biorremediación Ex situ e In situ, de acuerdo a la USEPA 27

Tabla 6. Actividad enzimática detectada en la flora microbiana intestinal de la lombriz 32

Tabla 7. Efecto de diversos hidrocarburos sobre la lombriz 34

Tabla 8. Factores limitantes en la remoción de hidrocarburos totales del petróleo 35

Tabla 9. Determinaciones analíticas aplicadas a los materiales empleados 43

Tabla 10. Factores y niveles usados en el diseño factorial 33 48

Tabla 11. Caracterización física y química de los materiales empleados 52

Tabla 12. Caracterización biológica de los materiales empleados 53

Tabla 13. Hidrocarburos identificados en el suelo contaminado 55

Tabla 14. Porcentaje de remoción de HTP’s al termino del tratamiento (94 días) 64

Tabla 15. Velocidad de remoción de HTP’s (mgHTP’s/cm3•día) durante el tratamiento (94 días) 65

Tabla 16. Disminución de la eficiencia de remoción de los tratamientos del DEFG 81

Tabla 17. Remoción de HTP’s con y sin asfaltenos 82

Tabla 18. Eficiencia de remoción de asfaltenos en los tratamientos seleccionados 86

Tabla 19. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales 86

Tabla 20. Porcentaje de remoción de HTP’s del DEFG 90

Tabla 21. Porcentaje de remoción de HTP’s del DEFC para el lavado de suelo 112

Tabla 22. HTP’s removidos mediante lavado con ácidos húmicos 117

Tabla 23. Velocidad de remoción de HTP’s (mgHTP’s/cm3•día) durante el tratamiento (94 días) 120

Tabla 24. Porcentaje de remoción de HTP’s al termino del tratamiento (94 días) 121

Tabla 25. Disminución de la eficiencia de remoción de los tratamientos del DEFG y el suelo lavado 122

XV

Tabla 26. Niveles de remoción de HTP’s en función de la presencia de asfaltenos 123

Tabla 27. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales, para el suelo lavado 124

Tabla 28. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales, para el lixiviado 131

XVI

INDICE DE ANEXOS

A Análisis estadísticos 153

A1. Porcentaje de contribución de los términos del DEFG al modelo 153

A2. Análisis de varianza de los efectos seleccionados como principales contribuyentes del

análisis estadístico del DEFG 153

A3. Graficas de residuales del DEFG 154

A4. Graficas de residuales del DEFC 156

A5. Porcentajes de remoción de los diferentes tratamientos y el suelo lavado, respecto a

los blancos ―a‖, ―b‖ y ―c‖ 158

B Determinaciones analíticas

B1. Extracción de HTP’s (EPA 3550b) 159

B2. Recuperación de Asfaltenos 160

B3. Fraccionamiento de Hidrocarburos Ligeros (sin asfaltenos) 160

B4. Análisis cromatográfico 161

B5. Capacidad de Retención de Agua (CRA) 162

B6. Método de extracción de Substancias Húmicas del Suelo, método de la IHSS

(International Humic Substances Society) modificado 162

B7. Cuenta total en placa 164

B8. Microorganismos hidrocarbonoclastas 165

B9. Carbono de Biomasa (Islam and Weil, 1998) 165

B10. Elaboración del alimento de lombriz 166

XVII

NOTACIÓN

SH’s Substancias húmicas

AH’s Ácidos húmicos

M.O.S. Materia Orgánica del Suelo

HPA’s Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos

HTP’s Hidrocarburos Totales del Petróleo

S Suelo

EL Extracto de Leonardita

BC Bagacillo de Caña

VC Vermicomposta

CRA Capacidad de Retención de Agua

XVIII

RESUMEN

Las Interacciones físico-químicas y la estimulación biológica son la base de algunas tecnologías aplicadas

actualmente a la remediación de suelos contaminados. Se ha sugerido que el desarrollo de una tecnología

combina de estos dos principios aumentará la eficiencia de recuperación de suelos contaminados. El objetivo de

este trabajo fue evaluar el efecto de las lombrices de tierra (L) y los ácidos húmicos (AH), en la biorremediación

de un suelo arcilloso muy contaminado con complejas mezclas de hidrocarburos totales del petróleo (HTP)

intemperizados. Debido a la alta toxicidad de las sales minerales en las lombrices de tierra, fue usada

vermicomposta (VC), como fuente de nitrógeno y de fósforo.

Cuatro kg de suelo contaminado con 83000 mg HTP/kg de suelo (28.5% alifáticos, 15% aromáticos, 21.5%

saturados y 35% asfaltenos) fueron bioestimulados con agua (60% de la capacidad de retención de agua, CRA) y

VC; Relación C:N:P de 100:25:1. A continuación, L y AH, así como el bagacillo de caña (BC), se incorporaron de

acuerdo a un diseño factorial 3 × 2 × 2, de la siguiente manera: L, tres niveles: 0, 20, 40; BC, dos niveles: 0%,

6%, y AH, dos niveles: 0%, 1%. Por otra parte, cuatro kg de suelo contaminado con 83000 mg HTP/kg de suelo,

fueron lavados con una solución de ácidos húmicos (3g / L), con una relación 1:10 (suelo: solución) obteniéndose

suelo contaminado con 50000 mg HTP/kg de suelo (35.7% de remoción de HTP’s). Este suelo se bioestimuló de

acuerdo con el mejor tratamiento del suelo sin lavar (con BC, AH y 40 L). Los tratamientos se incubaron a

temperatura ambiente (25 ± 2°C) y pH 7 ±0.5, durante 94 días, aireándolos diariamente. Las muestras fueron

analizadas periódicamente para HTP residuales, producción de AH y crecimiento microbiano, como carbono de

biomasa y unidades formadoras de colonias (UFC/g suelo).

Según el ANDEVA, las variables L, AH y BC tienen un efecto significativo en la remoción de HTP con una p(F)

<0,05. El mayor porcentaje de remoción de HTP (64 ± 2% en 94 días) se obtuvo con el tratamiento compuesto

por BC, AH y 40 L. Este tratamiento removió el 35% de los asfaltenos, 85% de alifáticos, 78% de aromáticos y

73% saturados. En términos generales, los porcentajes de eliminación de HTP estuvieron en el rango de 64% a

28%, el más bajo correspondió a una prueba control preparada con agua y VC. El crecimiento microbiano y la

producción de AH, se correlacionaron con la remoción de HTP. Estos resultados se pueden explicar desde dos

puntos de vista: i) una mejor disponibilidad de todas las fracciones de hidrocarburos degradables, cuando se

añadieron AH, ii) la presencia de una microflora (del BC y VC) con la capacidad de consumir hidrocarburos. El

suelo lavado biotratado, tuvo una remoción de TPH de sólo 47±2% en 94 días. Este tratamiento removió el 15.7%

de los asfaltenos, 69.9% de alifáticos, 64.3% aromáticos y 52.6% saturados. Este resultado se puede explicar

debido a la pérdida de microorganismos hidrocarbonoclastas, después de lavar el suelo.

XIX

ABSTRACT

Physico-chemical interaction and microbial stimulation are the base of some technologies currently applied to the

remediation of polluted soils. It has been suggested that the development of a hybride technology combining these

two cleaning principles would increase the efficiency of polluted soil recuperation. The purpose of this work was to

evaluate the effect of earthworms (EW) and humic acids (HA), on bioremediation of clay soi l highly polluted with

complex mixtures of weathered total petroleum hydrocarbons (TPH). Due to the highly toxic effect of the mineral

salts on the earthworms, vermicomposta (VC) was used as nitrogen and phosphorous source.

Four kg of soil polluted with 83,000 mg TPH/kg of dry soil (28.5% aliphatics, 15% aromatics, 21.5% saturates and

35% asphaltenes) were biostimulated with water (60% of the water holding capacity, CRA) and VC; relation C:N:P

of 100:25:1. Next, EW and HA, as well as sugar cane bagasse (SCB), were incorporated according to a factorial

design 3×2×2, as follows: EW, three levels: 0, 20, 40; SCB, two levels: 0%, 6%; and HA, two levels: 0%, 1%. On

the other hand, Four kg of soil polluted with 83,000 mg TPH/kg of dry soil, were washed with a solution of humic

acids (3g/L) with a ratio 1:10 (soil:solution) obtaining soil polluted with 50,000 mg TPH/kg of dry soil (35.7% of

TPH removal). This soil were biostimulated according to the best treatment from the soil unwashed (with SCB, HA

and 40 EW). The treatments were incubated at environmental room temperature (25 ±2°C) and pH 7 ±0.5, during

94 days; the treatments were daily aerated. Samples were periodically analyzed for residual TPH, HA production

and microbial growth as biomass carbon and colony forming units (UFC/g of dry soil).

According to the ANOVA, the EW, HA and SCB factors have a significant effect on the TPH removal with a

p(F)<0.05. The highest TPH removal percentage (64 ±2% in 94 days) was obtained with the treatment composed

by SCB, HA and 40 EW. This treatment removed 35% of asphaltenes, 85% of aliphatics, 78% aromatics and 73%

saturates. In general terms, the TPH removal percentages were in the range 64% to 28%, the lowest one

corresponded to the control test prepared with polluted soil, water and VC. The microbial growth and HA

production, were correlated with the TPH’s removal. These results could be explained from two points of view: i) a

better availability of all degradable hydrocarbon fractions, when HA were added. ii) the presence of a microflora

(from SCB and VC) with the ability to consume hydrocarbons. The soil washed and biotreated has a TPH removal

of only 47±2% in 94 days. This treatment removed 15.7% of asphaltenes, 69.9% of aliphatics, 64.3% aromatics

and 52.6% saturates. This result could be explained due to the loss of hydrocarbonoclast microorganisms, after

soil washing.

1

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Suelo

El suelo es definido como el manto de roca erosionada que contiene materia orgánica, minerales y

nutrientes capaces de soportar el crecimiento de plantas, mientras que la fertilidad del suelo, es

atribuida a la actividad de los microorganismos.

El suelo se encuentra formado por capas denominadas horizontes. Estos horizontes van a variar tanto

en su estructura como en su población microbiana. Los horizontes se encuentran ordenados

empezando por el "0" y luego por letras en orden alfabético (Figura 1). El horizonte "0" es el formado

por desechos animales y plantas, es el horizonte orgánico; los horizontes A y B son los principales

depósitos de compuestos como óxidos y salicilatos; en ellos se llevan a cabo los fenómenos de

lixiviación y deposito de materiales orgánicos e inorgánicos. El horizonte C se caracteriza por una baja

actividad biológica y contienen acumulaciones de carbonatos de Ca y Mg, es el último horizonte y

colinda con la roca madre. La actividad microbiana se da principalmente en los 15-20 cm superiores

de la columna del suelo, después de esta profundidad, el número así como la actividad microbiana

disminuye (Sylvia, 1998)

Figura 1. Columna de suelo y la organización de sus diferentes horizontes.

2

El suelo, posee características físicas y químicas como: textura, densidad, porosidad, estructura, pH,

intercambio iónico, humedad y nutrientes, que le confieren sus propiedades (Sylvia et al, 1999). La

textura está dada principalmente por las proporciones de arcilla, limo y arena, que influyen en la

densidad y porosidad de los suelos; los cuales son un factor importante en la ecología de los

microorganismos, debido a que determinan el área superficial disponible para el crecimiento

microbiano (Atlas-Bartha, 1998).

La composición heterogénea (sólido, líquido, gaseoso) tanto a lo largo como a lo profundo del suelo,

permite el crecimiento microbiano formando un hábitat complejo (Figura 2), en donde existe una gran

competencia de los microorganismos por nutrientes, espacio y humedad. Los microorganismos que

conforman el suelo son numerosos y diversos, los más pequeños (bacterias, actinomicetos, levaduras

y hongos) son denominados microflora (Sylvia, et al, 1999). De los microorganismos que forman la

microflora, las bacterias son los más abundantes (108), seguidos por actinomicetos (10

6-10

7) y hongos

(104-10

6) (Sylvia, 1999).

Figura 2. Componentes principales de los agregados del suelo.

3

1.1.1. Componentes del suelo

Los componentes primarios del suelo son: 1) compuestos inorgánicos no disueltos, producidos por la

meteorización y la descomposición de las rocas superficiales; 2) los nutrientes solubles utilizados por

las plantas; 3) distintos tipos de materia orgánica, viva o muerta y 4) gases y agua requeridos por las

plantas y por los microorganismos. La naturaleza física del suelo está determinada por la textura. Los

suelos con un porcentaje elevado de arcilla, tienen baja porosidad (30-45%) y capacidad de retención

de agua. Si el suelo tiene mayor contenido de arcilla que arena con la misma cantidad de limo, el

suelo es cohesivo, teniendo una mayor capacidad de retención de agua y por lo tanto velocidades de

infiltración y aireaciones bajas. Esto se debe a que los poros de mayor tamaño son vaciados

rápidamente y la cantidad de agua que queda en la matriz del suelo es pequeña. En los suelos

arcillosos, el agua es absorbida en los poros pequeños y la disminución de su contenido es más

gradual. Por otro lado, la superficie neta negativa de las arcillas favorece la formación de agregados

que ocasionan el secuestramiento de nutrientes. Los agregados se forman por los enlaces iónicos

mediante catiónes polivalentes presentes en el suelo, entre arcillas y materia orgánica. Estos

complejos favorecen una gran adsorción de compuestos orgánicos hidrofóbicos (Soderstrom, 2000).

Las grandes partículas del suelo, como la arena y la grava, son en su mayor parte químicamente

inactivas; mientras que las pequeñas partículas inorgánicas, como las arcillas, presentan actividad

iónica, y además determinan en gran medida la capacidad de un suelo para almacenar agua. La parte

orgánica del suelo está formada por restos vegetales y animales, junto a cantidades variables de

materia orgánica amorfa llamada humus. Se forma a partir del proceso metabólico de los

microorganismos, al consumir compuestos orgánicos complejos que constituyen la materia viva. La

fertilidad de un suelo está relacionada directamente con el contenido de materia orgánica; ya que

mejora la estabilidad del suelo, aumentando su porosidad y capacidad de retención de agua; lo que

favorece el intercambio de gases y agua para los microorganismos. El humus además, favorece la

fijación de nutrientes y los mantiene más tiempo a disposición de los vegetales y los microorganismos.

4

La materia orgánica presenta una gran área superficial con propiedades de intercambio iónico, donde

se lleva a cabo la adsorción de compuestos orgánicos, lo cual puede limitar su biodisponibilidad. Las

componentes del suelo determinan la zona donde los microorganismos estarán adheridos. El 60% de

las bacterias se localizan en partículas recubiertas con materia orgánica; y solo se encuentran en el

0.02% de la superficie de partículas arenosas (Mihelcic, 1993). El componente liquido o solución de

suelo, está formado por agua con varias sustancias minerales, oxígeno y dióxido de carbono disueltos.

A través de esta solución, los nutrientes son absorbidos por los microorganismos. Los principales

gases contenidos en el suelo son oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono.

1.1.2. Suelo y su dinámica

El suelo es un organismo vivo: un consorcio de células vivas en una matriz orgánico-mineral. Ni las

células vivas, ni la composición de esta matriz son constantes: ambas varían con el tiempo y el lugar..

De hecho, existen muchas y variadas interacciones entre el suelo, los microorganismos y las plantas,

que influyen en gran medida sobre el crecimiento y el desarrollo de estas últimas. La macrofauna

conduce a la depredación de los microbios, a la estructura del suelo y a la descomposición de la

materia orgánica. Por ejemplo, las lombrices de tierra afectan en gran medida a la estructura física del

suelo: fomentan el crecimiento de las raíces y la ventilación del suelo gracias a las galerías que

fabrican en él, al tiempo que remueven la materia orgánica.

El suelo es una matriz compleja donde interactúa permanentemente el agua y el aire (Schwarzenbach

et al., 2003) y por lo tanto su contaminación puede propagarse directamente a las superficies, aguas

subterráneas y aire (Fent, 2003).

Cuando se sobrepasa la capacidad detoxificadora natural de la tierra, se alteran los ciclos

biogeoquímicos y la calidad del suelo se ve seriamente afectada, debido a una disminución de la

micro y macrofauna autóctona (Martín, 2004). La cual tiene la función de acelerar la descomposición

de la materia orgánica (mineralización que involucra la transformación de compuestos orgánicos en

inorgánicos) y su fijación a estructuras complejas estables como las substancias húmicas

5

(humificación que es la síntesis y/o unión química y/o biológica de compuestos de degradación de

residuos de origen vegetal y animal), que constituyen un 80% de la materia orgánica del suelo, y es

denominada Humus (Fründ, 1994).

1.1.2.1. Humus

En toda materia orgánica se deben presentar los procesos de mineralización (transformación de

compuestos orgánicos en inorgánicos) y humificación (síntesis y/o unión química y/o biológica de

compuestos de degradación de residuos de origen vegetal y animal), que conducen a la producción de

humus. Estos procesos son lentos, de varios meses a decenas de años, en función del tipo de materia

orgánica y los factores del medio ambiente (Perminova, 2005).

El humus se encuentra en la capa superior del suelo. Es producto de transformaciones,

descomposiciones y resíntesis de moléculas orgánicas, en las cuales no quedan vestigios

microscópicos visibles de los tejidos o células originales. Su color es oscuro y está conformado

básicamente por carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno, lo que contribuye a la agregación del suelo

(formación de terrones). El humus favorece la acción microbiana y su alta capacidad de intercambio

catiónico le permite retener nutrientes (Tan, 2003).

La composición del humus depende en parte del tipo de suelo, ya que éste puede favorecer el

desarrollo de las sustancias orgánicas. Tiende a favorecer la aireación o, por el contrario, puede

paralizarla, originando condiciones de anaerobiosis (por ejemplo en suelos hidromorfos o arcillosos).

También participan en su formación la microflora, micro y mesofauna del terreno. El principal factor

que determina la composición del humus es el tipo de vegetación existente, pues de ella deriva la

materia prima cuyas sucesivas descomposiciones originan el humus. También el clima resulta

decisivo en este proceso, ya que la humedad y la temperatura influyen esencialmente sobre la

composición del humus y sobre los microorganismos que transforman la sustancia orgánica. Puede

ocurrir que la oxidación del producto bacteriano sea incompleta y los azúcares se caramelizan y

formen sustancias parecidas a las melaninas, de naturaleza cíclica, que engrosan el grupo aromático

6

de los precursores húmicos. También se producen condensaciones entre los aminoácidos y los ácidos

alcohólicos para generar cadenas alifáticas que constituirán los terminales activos de las sustancias

húmicas. (Perminova, 2005)

Las paredes bacterianas pueden dar lugar, mediante un proceso de carbonización en ambientes

reductores, a unas sustancias oscuras y poco activas que se conocen como huminas microbianas o

huminas heredadas, ya que se sitúan al margen del proceso general de humificación.

Los compuestos aromáticos, por la acción de grupos de bacterias específicas se fragmentan y

generan quinonas que son susceptibles de polimerizarse y generar núcleos aromáticos, de masa

molecular elevada, que son la base de todas las sustancias húmicas. Sobre estos núcleos aromáticos

se insertan la cadenas alifáticas ya citadas, ricas en grupos carboxílicos, amínicos y alcohólicos, para

generar los ácidos fúlvicos, ácidos húmicos y huminas de condensación que son los componentes

primordiales del humus (Tan, 2003).

1.1.2.1.1. Tipos de humus

Desde un punto de vista global (evolución, morfología, propiedades, unión a la fracción mineral) el

material orgánico se clasifica en tres tipos básicos de humus (Tan, 2003):

Mor. Materia orgánica muy poco transformada.

Moder. Mayor transformación de la materia orgánica (Fúlvicos y precursores).

Mull. Materia orgánica evolucionada (ácidos húmicos, coloración del horizonte muy oscura).

1.1.2.2. Composición del Humus (Substancias Húmicas)

El humus suele fraccionarse en tres compuestos, siguiendo su extracción del NaOH: humina, ácido

fúlvico y ácido húmico (Figura 3). La humina es la fracción que no contiene NaOH y que es susceptible

de ser dispersada. El ácido húmico, por su parte, es una fracción de humus soluble en NaOH, que

resulta insoluble cuando el pH es 2. El peso molecular del ácido húmico varía de 10.000 a 100.000

7

Daltones y está compuesto por anillos aromáticos, compuestos cíclicos de nitrógeno y cadenas

peptídicas de estructura indeterminada. El ácido húmico presenta una composición general de 57% de

carbono y 4% de nitrógeno. Los grupos funcionales del ácido húmico son el COOH, el OH fenólico, el

OH alcohólico y las cetonas. El ácido fúlvico es soluble en NaOH y a un pH 2. Resulta más pequeño

que el ácido húmico, con un peso molecular que va de 1.000 a 30.000 Daltones. No obstante, los

procedimientos de extracción sólo recuperan de un 10 a un 20% de los ácidos húmico y fúlvico que

hay en el suelo. Durante la extracción de los ácidos fulvicos, podemos recuperar también una gran

variedad de carbohidratos del suelo, como monosacáridos (hexosas como la glucosa y la galactosa,

así como pentosas como la arabinosa y la xilosa), disacáridos (sacarosa y celobiosa), olisacáridos

(celotriosa) polisacáridos (celulosa y hemicelulosa), aminoazúcares (glucosamina), alcoholes del azú-

car (como el manitol), ácidos azucarados (como los ácidos, galacturónico y glucurónico) y azúcares

mediados (Tan, 2003).

Figura 3. Propiedades fisicoquímicas de las substancias húmicas (SH), Stevenson

8

1.1.2.3. Substancias Húmicas y sus propiedades

La característica más importante de ácidos húmicos recae en su capacidad de unir iones metálicos

insolubles, los óxidos e hidróxidos, y liberarlos lenta y continuamente a las plantas cuando son

requeridos (Tan, 2003). Debido a estas propiedades, los ácidos húmicos son conocidos por producir

tres tipos de efectos: físico, químico y biológico.

Físicos

Los ácidos húmicos modifican físicamente la estructura del suelo.

Mejorar la estructura del suelo: Previenen la perdida elevada de agua y nutrientes en días

calurosos y suelos arenosos. En suelos pesados y compactos, la aireación del suelo y

retención de agua se mejora

Previenen el agrietamiento y la erosión de suelo, aumentando la capacidad de de la formación

de agregados.

Incrementan la capacidad de retención de agua y previenen la sequía.

Obscurecen el color del suelo y así ayudan a la absorción de la energía del sol.

Químicos

Los ácidos húmicos químicamente cambian las características de fijación del suelo.

Neutralizan los suelos ácidos y alcalinos; regulan el pH de los suelos.

Mejoraran y optimizan la absorción de nutrientes; así como, agua por las plantas.

Aumentaan la característica reguladora del suelo.

Actuar como quelador natural para iones metálicos bajo condiciones alcalinas y promueven su

transporte a las plantas.

Ricos tanto en sustancias orgánicas y minerales esenciales para el crecimiento vegetal.

Conservan los fertilizantes inorgánicos solubles en agua en las zonas de la raíz y reducen su

lixiviación.

9

Poseen capacidades extremadamente altas de intercambio catiónico.

Promueven la conversión de los nutrientes (N, P, K + Fe, Zn y otros oligoelementos) en las

formas disponibles para las plantas.

Realzan la absorción del nitrógeno por las plantas.

Reducen la reacción del fósforo con: Ca, Fe,Mg y Al de manera que los liberan en una forma

que sea disponible y beneficiosa a las plantas.

La productividad de fertilizantes minerales se aumenta considerablemente.

Liberan el dióxido de carbono del carbonato de calcio del suelo y permitir su uso en

fotosíntesis.

Ayudar a eliminar la clorosis debido a la deficiencia de hierro en plantas.

Reducir la disponibilidad de sustancias tóxicas en suelos.

Biológicos

Los ácidos húmicos estimulan la planta y la actividad de los microorganismos.

Estimulan las enzimas de la planta y aumentar su producción.

Actuan como catalizadores orgánicos en muchos procesos biológicos.

Estimulan el crecimiento y la proliferación de microorganismos en suelo.

Realzan la resistencia natural de la planta contra enfermedades y parásitos.

Estimulan el crecimiento de la raíz, especialmente verticalmente y permitir una mejor

absorción de alimentos.

Aumentan la respiración de la raíz y la formación de la raíz.

Promueven el desarrollo de la clorofila, de los azúcares y de los aminoácidos en plantas y

ayuda en la fotosíntesis.

Aumentan las vitaminas y el contenido mineral de plantas.

Espesan las membranas celulares en frutas y prolongan el tiempo de anaquel.

Aumentan la germinación y la viabilidad de semillas.

10

Estimulan el crecimiento vegetal (una producción más alta de la biomasa) acelerando la

división de célula, aumentando el índice de desarrollo en sistemas de la raíz y aumentando la

producción de la materia seca.

Aumentan la calidad de producciones; mejorar su aspecto físico y valor alimenticio.

La gran mayoría de los investigadores de las substancias húmicas, concuerdan en que gracias a los

grupos funcionales de éstas, se debe su actuación en las propiedades físicas y químicas del suelo, así

como en las funciones fisiológicas de las plantas y en la nutrición vegetal.

Se cree que las substancias húmicas intervienen directamente en una gran cantidad de procesos

fisiológicos involucrados con el crecimiento de las plantas e indirectamente en la nutrición vegetal en

forma similar a los intercambiadores de iones sintéticos (agentes quelatantes), sin embargo, este

mecanismo no está bien dilucidado (Schnitzer, 2000).

En la estructura de los AH, una de las formas muy interesantes, es la presencia de vacíos de variadas

dimensiones, los cuales pueden atrapar o unir otros componentes orgánicos como carbohidratos,

proteínas y lípidos o bien inorgánicos como arcillas minerales y oxihidróxidos. Además, los

carbohidratos y las proteínas, son adsorbidos en la superficie externa y en los vacíos internos, los

puentes de hidrógeno juegan un importante papel en su inmovilización, junto con el agua (Tan, 2003).

Los grupos funcionales, principalmente los oxigenados, están involucrados en reacciones con metales

y minerales, los que proveen elementos nutrimentales para las raíces de los vegetales. Los AH y los

AF pueden complejar y/o quelatar cationes, debido a su alto contenido de grupos funcionales libres

(Figura 4). La reducción de humus fue reconocida como un camino respiratorio en 1996 (Lovley, et.

al., 1996) y que las sustancias húmicas pueden desempeñar un papel importante en la biodegradación

anaerobia y la biotransformación de compuestos orgánicos así como inorgánicos. El humus puede

servir como un aceptador de electrones terminal que apoya la oxidación microbiana anaerobia de una

amplia variedad de substratos orgánico. El humus microbianamente reducido puede transferir

electrones a óxidos metálicos, como Fe (III) y Mn (IV), teniendo la regeneración humus a la forma

11

R

O H

O H

R

O

O

Bacterias reductoras

de humus

Bacterias oxidantes

de humus

oxidada. Así, las sustancias húmicas puede mediar tanto oxidación anaerobia como la reducción de

óxido metálica (Figura 5).

Figura 4. Fragmento estructural hipotético de las Substancias Húmicas del suelo (Kleinhempel, 1970). Los círculos indican

algunos de los grupos funcionales de la molécula como son: péptidos, carbohidratos, quinonas, moléculas aromáticas, etc.

Figura 5. Regeneración de la capacidad oxido-reducción de las quinonas, mediante bacterias oxidantes y reductoras de humus;

así como, procesos anaeróbicos.

Humus Oxidado

Humus Reducido

Acetato

CO2 Microorganismos

Nitrato

Amoniaco o N2

Fe3+

Fe2+

Proceso Abiótico

Microorganismos

12

Además, las substancias húmicas reducidas también pueden servir como un donante de electrones

para conseguir la reducción microbiana de aceptadores de electrones más oxidados, como el nitrato,

fumarato y clorato. Diversas pruebas indican que las quinonas en el humus pueden desempeñar

papeles diferentes que contribuyen a la biodegradación anaerobia y la biotransformación de

substratos ecológicamente importantes, así como contaminadores de prioridad (Field and Cervantes,

2005). Los Ácidos Húmicos y los compuestos de modelo de quinona apoyaron la oxidación microbiana

anaerobia de varios substratos importantes sirviendo como un aceptador de electrones terminal en

muchos ambientes diferentes. Los consorcios que respiran humus también mostraron la capacidad de

mineralización de contaminantes, como el tolueno, cuando el humus y quinonas fueron

proporcionados como un aceptador de electrones final (Field and Cervantes, 2005). Así, una

tecnología basada en la inyección substancias húmicas en acuíferos y sedimentos para estimular la

biorremediación de sitios contaminados puede ser considerada. Las substancias húmicas no

necesariamente tienen que ser suministradas en abundancia para estimular el biorremediación de

estos sitios (Tan, 2003).

1.1.2.3.1. Propiedades detergentes de las Substancias Húmicas

Recientemente se ha sugerido que los ácidos de húmicos son especies anfipáticas, cuyo

comportamiento en solución sugiere que forman pseudomicelas y agregados semejantes a las micelas

formadas por las familias de surfactantes sintéticos. Un modelo alternativo recientemente concebido

sugiere que los ácidos húmicos consisten en subunidades relativamente pequeñas que se asocian a

través de las interacciones moleculares débiles formando pseudomicelas (Conte, 2005; Quagliotto et.

al., 2006). Se piensa que las pseudomicelas de los ácidos húmicos pueden ser formadas por

enrollamiento y asociación intermolecular, dependiendo del peso molecular, características

estructurales y la polidispersión del ácido húmico en cuestión (Wandruszka, 2000).

13

1.1.2.4. Humificación de HTP’s

Diversos estudios han demostrado la posibilidad de polimerizar y humificar los HPA’s como el pireno

en periodos de un año (Nieman, 1998). Otros investigadores han demostrado que un cambio en los

grupos funcionales de los compuestos aromáticos permiten que estos sean más susceptibles a la

polimerización, en presencia o no de enzimas como la lacasa o polifenoloxidasa. Por otro lado, se ha

demostrado que estos compuestos pueden ser humificados o incorporados a precursores de

sustancias húmicas como ubiquinonas, compuestos fenólicos o compuestos derivados de la celulosa y

la lignina (Nieman, 1998). Estos experimentos han sido llevados en laboratorio en la mayoría de los

casos en forma muy controlada, como es el empleo de substratos de estudio marcados

radiactivamente y su cuantificación posterior mediante el análisis de seguimiento de la molécula

marcada. Sin embargo, este proceso de humificación no solo esta limitado a condiciones controladas,

ya que; en la naturaleza ocurre este proceso de humificación dando como resultado el denominado

―humus‖. La importancia de promover la formación y el uso de substancias húmicas en la remediación

de suelos altamente contaminados es evidente por sí misma. Las substancias húmicas pueden

mejorar la actividad de la biomasa en suelos lavados y contribuir a una adicional atenuación natural

después de haber sido sometido a un proceso de biorremediación.

1.2. Contaminación de Suelos con Hidrocarburos

La contaminación del suelo puede ser debida a los accidentes industriales tales como:

derramamientos, goteras, escapes de tanques de almacenamiento subterráneos (Ballarin-Denti et al.,

1999; Lee et al., 2002; Kiem et al., 2003) y actividades antropogénicas (combustión de combustibles

fósiles) (Simcik et al., 1999; Venkataraman et al. 2002) los cuales representan una fuente de

contaminación del medioambiente a largo plazo.

14

1.2.1. Petróleo y producción

En todo el mundo, aproximadamente 4 billones de toneladas métricas por año son producidas, y se ha

estimado que del 0.08 al 0.4% de la producción mundial termina por contaminar los océanos (Bartha,

1986, BP, 2008). No se tienen estimados de la cantidad de HTP’s que contaminan los suelos, pero se

considera que gran parte del petróleo producido se derrama de manera accidental, así como también

gran parte; se vierte al ambiente de manera ilegal. Aproximadamente el 90% de la contaminación

ocasionada por los HTP’s se debe a la actividad antropogénica, el otro 10 % se debe a derrames

accidentales tales como accidentes ocasionados durante su transporte, desastres en tanques de

almacenamiento, así como también por la ruptura de algunas tuberías.

1.2.2. Composición del Petróleo

Los hidrocarburos del petróleo crudo son clasificados como alcanos (iso y normal), cicloalcanos y

aromáticos. Los alquenos (compuestos insaturados análogos a los alcanos) raramente se encuentran

en el petróleo crudo. Frecuentemente estos se producen como consecuencia de los procesos de

craque. Los heterocompuestos que tienen en su estructura átomos de oxígeno (fenoles, ácidos

nafténicos), nitrógeno (piridina, pirrol, indol) y azufre (alquiltiol y tiofeno); son denominados resinas. El

petróleo crudo también contiene una fracción altamente asfáltica condensada que se encuentra

parcialmente oxigenada. En la Tabla 1 se enlista una clasificación de los componentes del petróleo.

Tabla 1. Clasificación general de los compuestos del petróleo. Fuente: Machin-Ramírez, 2000

Nombre Formula General

Algunos compuestos representativos

Hidrocarburos saturados CnH2n + 2 Metano, etano, butano,hexano

Hidrocarburos nafténicos CnH2n Ciclopentano, ciclohexano

Hidrocarburos aromáticos

Variable Benceno, tolueno, xileno, etilbenceno

Resinas Variable Piridinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos

Asfaltenos Variable Agregados de poliaromáticos, como ácido nafténico, metaloporfirinas

15

1.2.2.1. Complejos Altamente Recalcitrantes (Asfaltenos)

Los asfaltenos del petróleo son hidrocarburos que presentan una estructura molecular

extremadamente compleja, los cuales están conformados por diferentes proporciones de nitrógeno,

azufre y oxígeno (Pineda and Mesta-Howard, 2001). Estos compuestos ocasionan diversos problemas

como el bloqueo de tuberías de extracción y transporte de crudo, reducción de su aprovechamiento

económico y contaminación de los ecosistemas. La biodegradación de los asfaltenos es un proceso

que constituye un importante método para eliminar a estos compuestos y tratar de reducir los

problemas que ocasionan, sin embargo es un proceso que ocurre en proporciones muy reducidas. La

eliminación de la estructura micelar por la aplicación de solventes no polares o surfactantes y la

fragmentación de los asfaltenos por fotooxidación son los procesos iniciales necesarios para poder

degradar a estos compuestos.

Las estructuras que conforman a los asfaltenos como: los hidrocarburos lineales y ramificados,

heteropoliaromáticos y aromáticos, podrían degradarse en este orden a través de reacciones

bioquímicas como oxidaciones omega, beta y aromáticas respectivamente, que son procesos

distribuidos en una variedad importante de microorganismos (Pineda and Mesta-Howard, 2001).

Uno de los problemas más graves relacionados con éstos compuestos en el medioambiente, reside en

su resistencia a la biodegradación por actividad metabólica microbiana. Debido a éste hecho, las rutas

metabólicas involucradas en este proceso son de las menos conocidas en estos días, aunque, hay

ciertas evidencias que sugieren que algunos microorganismos tienen la capacidad potencial de

transformar asfaltenos y el mejor de los casos, eliminarlos (Figura 6).

Las comunidades microbianas en ecosistemas contaminados de esta manera tienden a ser

dominadas por aquellos organismos capaces de utilizar y/o de sobrevivir en presencia de los

compuestos tóxicos. Como resultado, estas comunidades son menos diversas que aquellos sistemas

de referencia no contaminados, aunque la diversidad también puede estar influenciada por la

16

complejidad de la mezcla de compuestos presentes y por el tiempo que las poblaciones han estado

expuestas.

Figura 6. Regiones susceptibles de fragmentación y biodegradación en los asfaltenos. 1: fotoxidación, 2: β-oxidación, 3: Ruta

metabólica del dibenzopireno, 4: Ruta metabólica similar al benzopireno, 5: Ruta metabólica del pireno, 6: Ruta metabólica

similar a la del benzo(a)pireno, 7: Ruta metabólica similar a los carbazoles.

1.2.3. Transporte de los HTP’s en el ambiente

Los HTP’s dispersados en el ambiente migran a través del suelo como: a) mezcla completa que se

infiltra en el suelo por la fuerza de la gravedad y acción capilar; b) componentes individuales que se

separan de la mezcla y se disuelven en el aire o el agua contenida en el suelo.

17

1.2.4. Migración de la mezcla de HTP’s

Cuando migra la mezcla completa, se tiene poca o nula separación de los componentes individuales y

la infiltración es normalmente rápida en comparación con la velocidad de disolución (Eastcott, et al.,

1989). Muchos compuestos del suelo que son insolubles en agua, son solubles en la mezcla y migran

junto con ella. Los factores que afectan la velocidad de infiltración son: tipo de suelo, tamaño de

partícula, contenido de humedad del suelo, vegetación, temperatura, y viscosidad de la mezcla.

Conforme la mezcla migra a través de la columna de suelo, pequeñas cantidades son

adsorbidas/absorbidas por partículas de este; produciéndose el fenómeno conocido como saturación

residual. Dependiendo de la resistencia de permanencia de la mezcla, el suelo puede estar saturado

por años (Dragun, 1988). La saturación residual determina el grado de contaminación del suelo, y

puede convertirse en una fuente continua de contaminación por los compuestos individuales que se

separen de la mezcla (Bauman, 1988).

Si el derrame es persistente, una extensa área puede verse afectada conforme los compuestos

individuales continúan separándose y migran lejos de la zona inicialmente contaminada. Cuando la

cantidad derramada es pequeña en comparación con la extensión de suelo disponible, se produce una

saturación residual y la migración de la mezcla normalmente cesa, antes de afectar los mantos

acuíferos. Si el agua pluvial se infiltra a través del suelo que contiene saturación residual, existe la

posibilidad de que se contaminen las aguas subterráneas debido a la migración de los componentes

individuales.

Si la cantidad derramada es grande en relación con el suelo disponible, la migración cesa conforme

llega a espacios porosos saturados con agua. En este caso, si la densidad de la mezcla es menor que

la del agua, el producto tiende a flotar a lo largo de la interface entre las zonas saturadas de agua y

las insaturadas, dispersándose horizontalmente en una capa delgada, normalmente en la dirección de

la corriente de agua subterránea, (Knox, 1993; Mackay, 1988). Si la densidad es mayor, la mezcla

migra hasta el manto acuífero por gravedad y cesa cuando ocurre saturación residual o cuando la

mezcla alcanza una superficie impermeable.

18

Conforme la mezcla migra a través de la columna de suelo, los componentes pueden separarse de la

mezcla y migrar independientemente, dependiendo de su volatilidad, solubilidad, potencial de sorción

y coeficiente de partición carbono orgánico-agua (Figura 7).

Figura 7. Migración de los HTP’s en el ambiente.

19

1.2.5. Toxicidad de las fracciones recalcitrantes del petróleo

1.2.5.1. Hidrocarburos Alifáticos (HA’s)

Se ha encontrado que los hidrocarburos alifáticos con cinco o más carbonos presentan propiedades

toxicas, causando efectos narcóticos, a causa de inhalaciones prolongadas o por exposición a altas

concentraciones de los mismos. Asimismo, se sabe que los hidrocarburos alifáticos no saturados y

cíclicos exhiben propiedades toxicas un poco menores que los de cadena lineal. No obstante, los

efectos anestésicos que presentan éstos últimos afectan seriamente el sistema nervioso central.

1.2.5.2. Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HPA’s)

Se ha observado que en suelos contaminados con hidrocarburos existe un grupo de compuestos

sumamente recalcitrantes como los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA), los cuales

independientemente del porcentaje que representan con respecto a la totalidad de compuestos de que

ésta constituido el petróleo, se ha comprobado su carcinogenicidad o mutagenicidad en seres vivos.

En Estados Unidos, la Agencia de Protección al Ambiente (EPA) regula actualmente 16 de estos HPA

como compuestos altamente peligrosos, como contaminantes de prioridad en agua y suelo. Estos

compuestos son nocivos al ambiente aun en pequeñas cantidades, como lo marcan los experimentos

que se han realizado con microorganismos y animales. En ratas se presentan problemas mutagénicos

con 2 ppm o efectos tumorogénicos con 3.5 ppm (ATSDR, 1995), los cuales son solo un ejemplo de la

diversidad de reportes existentes.

1.2.5.3. Compuestos heterocíclicos con azufre o nitrógeno

Aun cuando existen muy pocos trabajos sobre la toxicidad de los compuestos heterocíclicos con

azufre y nitrógeno, McFall et al. (1984) los han reportado como compuestos tóxicos con propiedades

mutagénicas y carcinogénicas. Por otro lado, un derrame de hidrocarburos en el suelo, interrumpe en

todos los casos, la vocación natural o uso antropogénico del suelo.

20

1.2.5.4. Efecto de los HTP’s en la salud

Los efectos en la salud se basan en compuestos específicos y dependen de factores como son: tipo

de compuesto (o fracciones presentes en los HTP’s), tiempo de exposición, concentración y cantidad

de compuestos detectados. Las fracciones de HTP’s se clasifican en grupos con características

similares de movilidad en el ambiente, determinadas por sus propiedades físicas y químicas

(densidad, solubilidad, presión de vapor, y tendencia a enlazarse con el suelo o partículas orgánicas).

Las fracciones de HTP’s con densidad menor o cercana a la del agua, como los compuestos no

acuosos en fase liquida (NAPLs), flotan formando capas superficiales muy delgadas (Mackay, 1984).

Dadas sus propiedades fisicoquímicas, pueden afectar a algunos organismos de la superficie;

mientras que, algunas clases de bacterias y hongos, degradan estas fracciones en compuestos más

simples. Las fracciones más pesadas de los hidrocarburos, como los poliaromáticos (PAH’s), son más

densas que el agua, y se acumulan en los substratos afectando a la fauna y flora marina de la zona.

La degradación parcial de HTP’s presenta efectos nocivos, como son la bioconcentración, la cual

aumenta en forma proporcional al peso molecular (PM) de los HTP’s, bioacumulación especialmente

PAH’s; alifáticos y aromáticos de bajo PM no son bioacumulables (Farrington, et al., 1982), y

biomagnificación. En algunos casos, estos efectos pueden ser eliminados, si la fuente contaminante

es removida (Cox et al., 1975; Williams et al., 1989).

21

1.2.6. Biodegradación de los Hidrocarburos Totales del Petróleo

La degradación microbiana de HTP’s se inicia por el ataque a fracciones alifática y aromática ligeras.

Los compuestos aromáticos de alto peso molecular, las resinas y los asfaltenos se consideran

recalcitrantes, o en el mejor de los casos son biodegradados muy lentamente (Shiaris, 1989). En la

Tabla 2 se muestra una clasificación de hidrocarburos, en términos del nivel de transformación y

recalcitrancia. De acuerdo a la facilidad de degradación, los hidrocarburos pueden ser secuenciados

de la siguiente manera (Perry and Cerniglia 1973): Alcanos lineales (C10 - C19) — Alcanos lineales

(C12 - C18) — Gases (C2 – C4) — Alquenos (C5 - C9), Alquenos ramificados hasta C12 — Alquenos

(C3 - C11) — Alquenos ramificados — Aromáticos — Cicloalcanos.

Tabla 2. Facilidad de degradación de HTP’s y productos de su metabolismo.

Facilidad de degradación Productos Compuestos fácilmente degradables

Alifáticos volátiles, n-parafinas, aromáticos Alquenos, alcadienos, alquinos

Alifáticos pesados, aromáticos Alcanos saturados, hidrocarburos cíclicos

Compuestos fenólicos Fenol, cresol, naftol, xilenol

Compuestos intermedios

Hidrocarburos poliaromáticos Aromáticos mono-, di- y trinucleares

Recalcitrantes

Residuos pesados Asfaltos, resinas

Alquitranes, ceras Ceras parafínicas Fuente: Lapinskas, J., 1989.

1.2.6.1. Microorganismos degradadores de hidrocarburos

La preferencia en el consumo de HTP’s está determinada por la fisiología del microorganismo, así

como por las características físicas y químicas del ambiente donde se desarrolla. De estos tres

factores, se considera que el primero es el más importante; ya que las condiciones ambientales

pueden ser controladas de alguna manera. Los diversos componentes de los HTP’s son degradados

principalmente en condiciones aerobias y la presencia de oxigenasas, mediante diversas rutas

metabólicas. Los microorganismos con capacidad degradadora de HTP’s han sido aislados en zonas

contaminadas. Puede considerarse que los microorganismos aclimatados, preferentemente de

22

naturaleza endógena, generaran mejores resultados que floras microbianas externas (Leahy and

Colwell, 1990). La aclimatación puede llevarse a cabo por un enriquecimiento selectivo de nutrientes,

o mediante la ingeniería genética; inserción de genes que favorezcan el catabolismo de hidrocarburos.

Algunos microorganismos que utilizan HTP’s como fuente de carbono, son Alcaligenes, Nocardia,

Pseudomonas, Mycobacterium. Es importante mencionar que las comunidades microbianas

aclimatadas, están conformadas principalmente por bacterias.

Se ha identificado una gran variedad de microorganismos con capacidad para degradar compuestos

derivados del petróleo; interesantemente, casi todos son eubacterias, aunque en algunos casos se

encontraron arqueobacterias y eucariotes (Vázquez-Duhalt, 2000). Aunque no han sido caracterizados

en su totalidad, muchos de estos microorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas,

que permiten la oxidación más ó menos específicas de algunas fracciones del petróleo. Esta oxidación

cambia las propiedades de los compuestos, haciéndolos susceptibles de ataques secundarios y

facilitando su conversión a bióxido de carbono y agua. En algunas ocasiones no es necesario llegar a

la mineralización, sino que basta una oxidación para disminuir notablemente su toxicidad o aumentar

su solubilidad en agua, incrementando su biodisponibilidad (Vázquez-Duhalt, 2000).

Uno de los géneros bacterianos más explotados en bioprocesos no-convencionales es Rhodococcus,

un grupo único consistente en microorganismos que presentan una gran diversidad metabólica,

particularmente hacia la utilización de compuestos hidrofóbicos tales como hidrocarburos, fenoles

clorados, esteroides, lignina, carbón y petróleo (Finnerty, 1992; Warhurst and Fewson, 1994).

Las bacterias del género Rhododoccus poseen una gran variedad de vías metabólicas para la

degradación y modificación de compuestos aromáticos, incluyendo las actividades de di-oxigenasa y

mono-oxigenasa sobre anillos así como la actividad de ruptura de catecol. Algunos aislados presentan

también la vía del 3-oxoadipato. La tolerancia de éstas bacterias a la falta de nutrientes, su carencia

de un sistema de represión catabólica y su persistencia ambiental las hace excelentes candidatas

para los tratamientos de biorremediación (Warhurst and Fewson, 1994).

23

Por otra parte, la inoculación con microorganismos exógenos, incluso cuando estos microorganismos

hayan sido aislados del mismo emplazamiento contaminado, no es en general efectiva (Martín, 2004).

Los microorganismos endógenos resultan efectivos, siempre y cuando, dispongan de los nutrientes

adecuados y se les suplemente con oxígeno, como tal o en forma de peróxido de hidrógeno. La mayor

eficiencia se obtiene probablemente optimizando la capacidad de la microflora indígena que es

prácticamente ubicua.

1.3. Tecnologías de remediación de suelos contaminados (in-situ, ex-situ)

La necesidad de restaurar los sitios contaminados con hidrocarburos, propicio el desarrollo de

tecnologías físicas y químicas, exclusivamente. Posteriormente después de la década de los 70's se

inicio el desarrollo de la biorremediación. De esta manera en la actualidad, la remediación de un suelo

puede llevarse a cabo por dos diferentes métodos, la Agencia de Protección Ambiental de Estados

Unidos (USEPA por sus siglas en inglés) clasifica a las tecnologías de remediación en dos grandes

grupos: las tecnologías ex-situ, y las tecnologías in-situ (USEPA 2008). En la primera se requiere de

excavación, o de cualquier otro proceso para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento

que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera de él (off site) y las tecnologías in-situ, que se

refieren al tratamiento del sitio contaminado en el mismo lugar. En la Tabla 3 y 4, se presentan las

tecnologías de remediación ex-situ e in-situ respectivamente, comprendidas dentro de la EPA (USEPA

2008).

Tabla 3. Tecnologías de remediación Ex situ de acuerdo a la USEPA.

Tecnologías (Ex situ)

Principio

Tratamiento químico Se basa en la adición de agentes químicos oxidativos

Incineración On-site Tratamiento térmico hasta CO2 en el mismo tugar

Biorremediación Empleo de organismos vivos

Incineración Off-site Tratamiento térmico hasta CO2 en incineradores especiales fuera del área

Solidificación y estabilización

Empleo de materiales de la construcción, cemento, limos hidratados entre otros para inmovilizar al contaminante

Neutralización Empleo de agentes alcalinos para neutralizar suelos ácidos y permitir la remediación.

Vitrificación El suelo contaminado se mezcla con arena de vidrio y se hace pasar una corriente eléctrica; para formar bloques de vidrio con el suelo contaminado.

Aireación mecánica Se emplea para eliminar compuestos volátiles empleando la aireación.

Separación física Los contaminantes se extraen y/o separan del medio contaminado, aprovechando sus propiedades físicas o químicas (volatilización, solubilidad, carga eléctrica).

Lavado de suelos Los contaminantes adsorbidos en las partículas finas del suelo son removidos con el uso de soluciones acuosas en un suelo excavado

24

Tabla 4. Tecnologías de remediación In situ de acuerdo a la USEPA.

Tecnologías (In situ)

Principio

Extracción de vapor Recuperación de componentes volátiles empleando corrientes de vapor

Solidificación y extracción

Empleo de materiales de la construcción, cemento, limos hidratados entre otros para inmovilizar al contaminante

Biorremediación Empleo de organismos vivos para la desintoxicación de los suelos contaminados

Lavado de suelo Los contaminantes sorbidos en las partículas finas del suelo son removidos con el uso de soluciones acuosas en un suelo excavado

Recuperación térmica

Utilizan calor para incrementar la volatilización (separación) de los contaminantes en un suelo

Fitorremediación La fitorremediación es un proceso que utiliza plantas para remover, transferir, estabilizar, concentrar y/o destruir contaminantes (orgánicos e inorgánicos) en suelos, lodos y sedimentos

Extracción doble fase

Este tipo de procesos, utiliza solventes orgánicos para disolver los contaminantes y así removerlos del suelo.

1.3.1. Lavado de suelo

Se utiliza para remover y/o concentrar contaminantes absorbidos en suelo, como son los metales,

hidrocarburos y PAH’s (Preslo, 1989). El suelo contaminado es excavado y alimentado a un sistema

que contiene una solución de lavado y algunos aditivos de pH controlado. Si el suelo tiene un alto

contenido de humus y/o arcilla, se deben realizar pre-tratamientos de separación y cribado, lo cual

incrementa Ios costos de operación. Estos también son incrementados por Ios post-tratamientos de

las corrientes acuosas.

1.3.1.1. Surfactantes

Los detergentes, también conocidos como surfactantes debido a que reducen la tensión superficial del

agua, son moléculas ―anfipáticas‖ formadas por grupos polares (cabeza) y largas cadenas carbonadas

hidrofóbicas (cola). Sus grupos polares forman puentes hidrógeno con las moléculas de agua,

mientras que las cadenas carbonadas se agregan debido a interacciones hidrofóbicas. En soluciones

acuosas, los surfactantes forman estructuras esféricas organizadas llamadas micelas, que por su

naturaleza anfipática, tienen la capacidad de solubilizar compuestos hidrofóbicos (Bhairi, 2001).

25

El empleo de surfactantes, se ha propuesto como una técnica para incrementar la biodisponibilidad de

contaminantes orgánicos hidrofóbicos (HOC’s) como HTP’s, PCB’s, explosivos, clorofenoles,

pesticidas, entre otros, y así facilitar su biodegradación (Majer et al..1999). Los surfactantes pueden

ser sintetizados químicamente o bien por algunos microorganismos, en este último caso se les conoce

como biosurfactantes. Estos compuestos incrementan la solubilidad de los HOCs a través de una fase

micelar (hidrofílica/hidrofóbica), la cual propicia la desorción de los contaminantes del suelo hacia la

fase líquida, lográndose así un incremento en la biodisponibilidad de los HOC’s. La solubilización de

los contaminantes se lleva a cabo solamente cuando se forma la fase micelar, la cual se obtiene

cuando la concentración del surfactante es superior a la concentración micelar critica (CMC), es decir,

arriba de la concentración máxima a la cual el monómero del surfactante aún se mantiene en solución

(Ko et al., 2000).

La CMC es una propiedad muy sensible a la temperatura y polaridad del medio, y generalmente su

valor se reporta a temperaturas entre 20 y 25°C. El número de agregados para formar una micela, es

el valor promedio del número de monómeros en una micela. Los diferentes tipos de surfactantes que

son empleados para lavar el suelo, están en función de la naturaleza del contaminante a ser removido.

Por ejemplo, los pesticidas son eliminados por surfactantes no-iónicos como el Tritón X-100 y

biosurfactantes como los ramnolípidos (Noordman et al. 2000; Mata-Sandoval, 2002). Los

Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAH) pueden ser lavados por alquilfenol etoxilato (Garon et al.,

2002), (Cuypers et al., 2002) y otro surfactantes aniónicos como SDS (Chun et al.2002).

El uso de surfactantes no iónicos, es una de las prácticas más comunes y efectivas empleadas para la

desorción de compuestos orgánicos hidrofóbicos (HOCs) (Kotterman at al., 1998; Ghosh, 1997). La

eficiencia de desorción de un surfactante depende de su naturaleza, de la dosis empleada, de la

hidrofobicidad del contaminante, de la interacción surfactante-suelo y del tiempo de contacto

surfactante-suelo (Guha et al., 1996).

Sin embargo, la mejor eficiencia de desorción no está siempre relacionada con la mejor eficiencia de

degradación, debido principalmente a que el empleo de una alta concentración de surfactante puede

26

inhibir la degradación (Laha y col., 1992). Stelmack y col. (1999), demostraron que el uso de

surfactantes reduce la adhesión de las bacterias en la superficie hidrofóbica, dando como resultado

una baja actividad de biodegradación. Para solucionar este tipo de problema, algunos investigadores

recomiendan la utilización de surfactantes fácilmente biodegradables, como el Brij 30, Brij 35 y Tween

80 (Ghosh, 1997).

Abiola y col. (1997), determinaron que el uso de surfactantes favorece la remoción de HTP en un

suelo contaminado con 20,000 mg/kg de suelo. Los sistemas experimentales fueron biopilas estáticas

y alargadas con y sin surfactante. El grupo observó que solamente en las biopilas alargadas

adicionadas de surfactante se favoreció la biodegradación de hidrocarburos.

Kotterman y col. (1998), evaluaron la oxidación de PAHs utilizando diversos surfactantes. En este

estudio se determinó que el surfactante Tween 80 (1 - 2.5 g/L), presentó la menor toxicidad sobre el

sistema ligninolítico de la bacteria Bjerkandera sp., así como un mayor estímulo en la velocidad de

oxidación del antraceno y del benzo(a)pireno. Por su parte, Ghosh en 1997, evaluó la biodegradación

de PAHs en suelos utilizando cuatro diferentes surfactantes no iónicos, en este estudio observó

degradaciones de fenantreno de 70 - 80% en 98 días, al emplear concentraciones de surfactantes de

2.5 g/L o mayores; este resultado fue atribuido principalmente a que arriba de este valor se presenta la

formación de micelas, además de que se aumenta el tiempo de vida del surfactante en el suelo.

1.3.2. Tecnologías de biorremediación de suelos contaminados

En lo que se refiere a la Biorremediación, esta tiene como antecedente el tratamiento biológico de

efluentes, lo cual permitió que la investigación en esta área se desarrollara de manera rápida. El

termino biorremediación, se utiliza para describir una variedad de sistemas que utilizan organismos

vivos (plantas, hongos, bacterias entre otros, para remover (extraer), degradar (biodegradar) o

transformar (biotransformar) compuestos orgánicos tóxicos en productos metabólicos menos tóxicos o

inocuos.

27

Dentro de los procesos biológicos que suceden en la biorremediación, las enzimas funcionan como

catalizadores, dado que pueden modificar moléculas orgánicas (contaminantes) produciendo cambios

en su estructura así como en sus propiedades toxicológicas incluso, dar como resultado la completa

conversión de dichos compuestos en productos inorgánicos como agua, CO2 o formas inorgánicas de

N, P y S (Alexander 1994). En lo que se refiere a las tecnologías de Biorremediación, la Tabla 5

resume estas empleando el mismo criterio de las tecnologías de remediación: Ex-situ e In-situ.

Tabla 5. Tecnologías de Biorremediación Ex situ e In situ, de acuerdo a la USEPA.

Tecnología (Ex-situ)

Principio

Biopila Es un tratamiento en fase solida, aerobio en el que se trata fuera del sitio contaminado, utiliza equipo para airear mecánicamente, mezclar el suelo y nutrientes.

Bioreactores Se basa en la remoción de contaminantes empleando reactores en un sistema de lodos. Permite la combinación controlada y eficiente de procesos químicos, físicos y biológicos, que mejoran y aceleran la biodegradación.

Composta o vermicomposta

El composteo es un proceso biológico mediante el cual es posible, convertir residuos orgánicos en materia orgánica estable, gracias a la acción de diversos microorganismos o el efecto de las lombrices.

Biolabranza El suelo contaminado se mezcla con agentes de volumen y nutrientes, y se remueve (labra) periódicamente para favorecer su aireación.

Tecnologías (In situ)

Principio

Lagunas Se basa en el tratamiento de suelo inundándolos con agua para recuperar compuestos volátiles.

Bioventeo Se basa en la aireación a través de columnas, para estimular la actividad microbiana y la degradación del contaminante

Fitorremediación Es un proceso que utiliza plantas junto con microorganismos para remover, transferir, estabilizar concentrar y/o destruir contaminantes (orgánicos e inorgánico) en suelos o sedimentos

1.3.2.1. Bioestimulación

De las tecnologías de biorremediación, la bioestimulación es una tecnología atractiva ya que utiliza

los microorganismos autóctonos para la remoción de hidrocarburos y es in situ. En esta tecnología de

biorremediación, se suministran nutrientes a los microorganismos capaces de degradar hidrocarburos,

lo que les permite llevar a cabo tanto un crecimiento, como una actividad metabólica. En suelos

contaminados con hidrocarburos, la deficiencia de N y P en relación al C, generada por la

contaminación, es un factor limitante para que los microorganismos autóctonos puedan llevar a cabo

la remoción de hidrocarburos (Atlas, 1981; Leahy and Colwell, 1990). Esta deficiencia de nutrientes

28

puede ser balanceada utilizando como método de remediación a la bioestimulación (Boopathy et al,

1997; Leahy and Colwell, 1990).

Los nutrientes son clasificados en macronutrientes y micronutrientes. Los macronutrientes son

aquellos compuestos requeridos en grandes cantidades y que forman parte de las macromoléculas de

las células como carbohidratos, lípidos y ácidos nucleídos; entre los macronutrientes se tiene al C,

seguido del N, P y S (Atlas 1981; Sylvia et al, 1999). Los micronutrientes, a diferencia de los

macronutrientes, son requeridos en menor cantidad y sirven como componentes estructurales o bien

como elementos que favorecen la actividad enzimática capaz de degradar los contaminantes. Entre

estos elementos se encuentran el Ca, Zn, Mo, Cu, Mn, y Mg (Sylvia et al, 1999).

Algunos microorganismos pueden sintetizar todos sus componentes a partir de una fuente de carbono

como los hidrocarburos y algunos nutrientes minerales, mientras que otros requieren nutrientes más

complejos e inclusive de compuestos más específicos como aminoácidos, purinas, pirimidinas y/o

vitaminas (Atlas, 1981; Sylvia et al, 1999). Para que estos componentes puedan ser asimilados por los

microorganismos, se necesita que estos sean disponibles, se encuentren en cantidades suficientes y

como moléculas fáciles de asimilar. En la bioestimulación el N y el P son los nutrientes

frecuentemente adicionados a suelos contaminados (Atlas 1981; Leahy and Colwell, 1990).

1.3.2.2. Residuos agroindustriales

El adicionar un texturizante al suelo contaminado con hidrocarburo permite incrementar la actividad

microbiana, debido a que mejora el transporte de los contaminantes hacia los microorganismos;

además incrementa la porosidad en la mezcla suelo-agua-texturizante. La adsorción con carbón

activado puede ser altamente eficiente en la remoción de muchos elementos traza en el agua, pero su

alto costo prohíbe su aplicación a gran escala, además de los problemas que presenta en cuanto a su

disposición una vez que ha sido usado. Los desechos agrícolas representan recursos naturales no

utilizados y en algunos casos presentan serios problemas de disposición final, de ahí que se busquen

alternativas para convertirlos en productos útiles. El aserrín ha merecido diversos estudios para la

29

remoción de contaminantes tales como colorantes, sales y metales pesados a partir de agua y

efluentes acuosos (Shukla et al., 2002). Las paredes celulares del aserrín consisten principalmente de

celulosa y lignina, además de muchos grupos hidroxilos provenientes de taninos u otros compuestos

fenólicos. Esos grupos a un pH apropiado son intercambiadores iónicos efectivos. La lignina, un

componente de la madera, es un hetreopolímero constituido por unidades de fenilpropano. La

interacción con los grupos funcionales de este compuesto da la capacidad de adsorción de la madera

hacia compuestos orgánicos (Kubick and Apitz, 1999). En un estudio realizado para la eliminación de

cobre con aserrín de mango se encontró que el tamaño de partícula mas apropiado para la adsorción

fue de 100 µm, logrando una eficiencia de adsorción del 81% en una solución que contenía 17 mg/L

de Cu (II) a pH de 6.25°C y 50 g/L de aserrín (Ajmal et al., 1998). Gupta et al., (2002), usaron

residuos de la industria azucarera (bagacillo de caña), para la remoción de lindano y malatión, para un

tiempo de contacto de 60 min a pH de 6 la remoción fue del 97-98%. Resultados similares obtuvieron

utilizando DDT y DDE. Se ha reportado que cuando se utilizan soportes en procesos biológicos, la

eficiencia del proceso se mejora cuando los contaminantes son adsorbidos reversiblemente (Fava,

1996).

1.3.2.3. Vermicomposteo

El vermicompostaje es una forma alternativa de generar abono y eliminar desechos orgánicos. La

acción de la lombriz en su proceso digestivo produce un agregado notable de bacterias que actúan

sobre los nutrientes macromoleculares, elevándolo a estados directamente asimilables por las plantas,

lo cual se manifiesta en notables respuestas de las cualidades organolépticas de frutos y flores, como

así también resistencia a los agentes patógenos (Ferruzzi, 1994).

El vermicompostaje de hecho es la actividad de alimentar lombrices con restos vegetales y recoger los

excrementos, de alto poder fertilizante. Es una actividad limpia que no produce mal olor y que genera

un fertilizante seco.

30

Durante el proceso de vermicompostaje se generan compuestos bioactivos que son de importancia

para los procesos bioquímicos y reguladores de los suelos, como las enzimas: amilasa, celulosa,

lipasa, invertasa, proteasa, amidasa, ureasa, monoestereasa (fosfatasa acida y alcalina), arilsulfatasa

y deshidrogenase. Además, se generan distintos tipos de antibióticos, vitaminas, hormonas y

substancias húmicas (ácidos húmicos, fúlvicos y huminas), de gran valor (Quintero, 2002).

1.3.2.3.1. Las lombrices

El cuerpo de las lombrices, interna y externamente, es el sitio de los procesos metabólicos, como son

la producción interna y externa de moco, respiración, paso de material por su intestino y excreción de

compuestos nitrogenados. A este nivel la actividad microbiana es estimulada en el intestino por un

sistema mutualístico de digestión, que aumenta la capacidad de las lombrices para ingerir residuos

orgánicos. Similarmente, la producción de moco externo actúa como un estimulador para el

crecimiento y producción de microorganismos (Ferruzzi, 1994).

1.3.2.3.2. Las excretas de lombriz

Las excretas de lombriz son productos del material que pasa a través de su intestino de la lombriz son

excretados en dos principales formas: globular y granular, las cuales tienen diferentes tamaños,

estabilidad y duración, contenido de nutrientes y sus efectos sobre la dinámica de la materia orgánica

y la actividad microbiana es muy diferente (Ferruzzi, 1994).

1.3.2.3.3. Agregados de excretas

Los agregados de excretas son creados por lombrices anécicas (lombrices que viven dentro del suelo,

cavan galerías verticales y durante la noche suben a la superficie del suelo alimentándose de materia

orgánica) y consisten en la acumulación de excretas depositadas en la superficie y material orgánico

dentro y fuera de las galerías o canales abiertos en la superficie del suelo. Estas estructuras pueden

31

ser consideradas como hábitat de los microorganismos y fauna del suelo, así como aceleradoras de la

descomposición de la materia orgánica (Ferruzzi, 1994).

1.3.2.3.4. Canales o galerías formados por la lombriz

Los canales formados son producidos por el trabajo de las lombrices por su trayecto en el suelo,

llegan a ser permanentes (algunos años) o temporales, también pueden ser abiertos o llenos de

excretas y son principalmente importantes por su intercambio de agua, gases y movimiento de suelo.

Además, sirven como ruta preferencial para la expansión de las raíces de las plantas (Ferruzzi, 1994).

1.3.2.3.5. Enzimas de la lombriz

Las lombrices tienen un sistema digestivo muy completo, debido a la asimilación y al impacto en la

actividad microbiana, este proceso de digestión es muy importante en la regulación de la dinámica de

la materia orgánica. A través del paso por su intestino, los materiales ingeridos son rápidamente re-

estructurados de manera física, química y biológica hasta convertirlos en las excretas. Esto lo logran

por medio de la ayuda de diferentes enzimas que producen (Tabla 6). De las principales enzimas

encontradas en el intestino se pueden citar: quitinasas, proteasas, fosfatasas, celulasas, y algunas

otras enzimas glucosídicas (Lattaud et al., 1999).

Estas enzimas les permiten digerir bacterias, protozoarios, hongos y descomponer parcialmente

residuos de plantas. Algunas especies pueden participar en la descomposición de lignina y el proceso

de humificación ya que poseen peroxidasas, las cuales destruyen el enlace aromático de la lignina, las

enzimas peroxidasas han sido encontradas en el intestino de Eisenia foetida (Hassett et al., 1988;

Quintero, 2002).

El origen de estas enzimas, ya sea por la lombriz o por microorganismos, han sido encontradas en

diferentes géneros; sin embargo, el complejo enzimático es distinto para cada especie y su origen

32

puede ser de la pared intestinal y así presumiblemente, propia de la lombriz o de la microbiota que

vive en el intestino de la lombriz (Hassett et al., 1988).

Se ha encontrado que las lombrices posee citocromo P-450, actividad monooxigenasa, que son

enzimas responsables del metabolismo de HPA’s en hongos y algas (Cerniglia, 1993). Además

Eisenia foetida presenta un complejo glicolipoproteinico (G-90) con actividad mitogenica y antioxidante

esto hace pensar que la lombriz se sirve de dicho complejo para protegerse del daño celular contra

contaminantes como los xenobióticos (Grdisa et at, 2001).

Se han reportado diferentes bacterias asociadas al intestino, a las excretas o en el fluido interno de

sus huevecillos, como son: Pseudomonas, Acidobacterium, Nocardia, Alcaligenes, Rhodococus,

Azotobacter y algunos hongos como son Penicillum, Mucor, Aspergillus entre otro gran número de

microorganismos (Morgan and Burrows, 1982; Singleton et al., 2003; Pizl and Nováková, 2003).

Algunos de estos microorganismos pueden degradar HPA’s, tal es el caso de Pseudomonas,

Alcaligenes, Nocardia, Rhodococus, Azotobacter y Penicillum (Cerniglia, 1993; Johnsen et al., 2005).

Tabla 6. Actividad enzimática detectada en la flora microbiana intestinal de la lombriz.

Especie Enzimas Observaciones Referencia

E. andrei Fosfotriesterasa Hidroliza fosfotriesteres pesticidas Lee et al., 2001

E. andrei Catalasa, citocromo reductasa acetil colin esterasa, Glutatión

Actividad con metales: Pb, Cu, Zn, Hg, Co, Fe, Cd Denis-Saint et al., 2001

E. andrei Citocromo P-450, Peroxidación lipídica

Con benzo(a)pireno la actividad aumenta Saint-Denis et al., 1999

E. fetida Complejo glicolípido proteínico (G-90)

Actividad anticoagulante y fibrinolítica Hrzenjak et al., 1998

E. fetida Complejo glicolípido proteínico (G-90)

Aumenta la proliferación celular, actividad mitogénica y actividad antioxidante

Grdisa et al., 2001

E. fetida Citocromo P-450, monooxigenasa

Citocromo P-420 y Citocromo P-450, NADPH citocromo C-reductasa y actividad monooxigenasa

Achazi et al., 1998

33

1.3.2.3.6. Efecto de fuentes orgánicas e inorgánicas de N sobre la población de lombrices

del suelo

Investigaciones realizadas por Edwards and Lofty (1982) en Rothamsted, y otros trabajos citados por

Lampkin, (2002) encontraron que la remoción de la paja y ciertas técnicas de cultivo afectan a las

lombrices y otros organismos del suelo. También se encontró un mayor número de especies de

lombrices en suelos tratados con fertilizantes orgánicos que en suelos no tratados. Se observó una

alta correlación positiva entre dosis de N inorgánico y población de lombrices, probablemente por la

mayor producción de raíces y residuos, aunque también se observó que las fuentes orgánicas de N

aumentaban más la población que fuentes inorgánicas. Sin embargo, los suelos que recibieron ambas

fuentes de N, orgánico e inorgánico resultaron con las más alta población de lombrices. Edwards and

Lofty (1982) consideran que el efecto prejudicial de fertilizantes informado en otras publicación se

puede deber al aumento de la acidez del suelo causada por su uso.

1.3.2.3.7. Remoción de HTP’s empleando lombrices

La lombriz en su hábitat natural está expuesta a una variedad de compuestos alcaloides de plantas,

hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA’s) y pesticidas que inducen sistemas de citocromo P-450

(enzima que inicia la ruta de degradación de los HPA’s en algunas algas, bacterias y hongos; así

como, compuestos persistentes en el ambiente producidos por el hombre), y otros sistemas

enzimáticos que las protegen y ayudan a metabolizar diferentes compuestos (Achazi et al., 1998). Las

lombrices acumulan muchos contaminantes orgánicos lipofílicos (xenobióticos y metales pesados,

entre otros) de su medio ambiente. Son capaces de acumular compuestos lipofílicos no solo por

absorción pasiva de la fracción disuelta en el agua intersticial a través de la pared del cuerpo (Belfroid

et al., 1993), también por asimilación intestinal durante el paso de suelo contaminado a través del

intestino (Belfroid et al., 1994).

Liste and Alexander (2002) encontraron que las lombrices son capaces de asimilar HPA’s de la

porción remanente en suelos, que no son disponibles por otras técnicas de extracción convencionales.

34

Está demostrado que la desaparición de fenantreno y fluoranteno en suelos se acelera por la

presencia de lombrices del tipo Lumbricus rubellus (Ma et al., 1995). Belfroid et al. (1995) reportaron

que compuestos del tipo PCB’s (Bifenilos policlorados) son asimilados por lombrices de E. andrei,

después de la exposición alimenticia a pesar de su gran tamaño molecular y que un aumento en la

concentración de dichos compuestos en el alimento, resulta en un aumento proporcional en la

concentración en las lombrices.

La capacidad de un número de especies poliquetes y oligoquetos para metabolizar en vivo una

variedad de xenobióticos, incluyendo hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA’s) y aromáticos

clorados, sugieren que sistemas de citocromo P-450 son activos en este grupo de anélidos, los cuales

pudieran facilitar la eliminación de estos compuestos de la lombriz (Lee, 1985), en el Tabla 7 se

muestran algunos estudios que demuestran la capacidad enzimática de las lombrices para vivir en

presencia de hidrocarburos y otros compuestos xenobióticos.

Tabla 7. Efecto de diversos hidrocarburos sobre la lombriz.

Especie Contaminante Observaciones Referencia

E. fetida Petróleo crudo Tolera y sobrevive a 1.5% de petróleo Safwat et al., 2002

Lumbricus terrestris

Petróleo crudo Es muy sensible no tolera 0.5% Safwat et al., 2002

E. fetida Antraceno, criseno, pireno y benzo(a)pireno

Asimilación mayor en suelos con poca materia orgánica

Tang et al., 2002

E. fetida Fenantreno, pireno y criseno

Asimila compuestos que no son disponibles por extracción soxhlet

Liste y Alexander, 2002

Lumbricus rubellus

Fenantreno y fluoranteno Mayor bioacumulación bajo estrés nutricional Wei-Chun et al., 1995

E. andrei Hexabromobenceno y octacloronaftaleno

Mayor asimilación y con mayor contaminante en tejidos y una lenta aliminación

Belfroid et al., 1995

E. fetida CClorobencenos La eliminación aumenta con materia orgánica

Belfroid y Sijm, 1998

1.3.3. Factores que afectan la biorremoción de hidrocarburos en el suelo

En las superficies activas del suelo donde prevalecen las condiciones aerobias, la biodegradación de

estos compuestos es usualmente rápida y extensiva a condiciones de temperatura y humedad

favorables. Sin embargo, son muchas las limitantes para que el proceso de biodegradación se lleve a

cabo de manera eficiente. Existen otros como los asfaltenos que mediante periodos prolongados de

35

tiempo pueden se biodegradados en solo un 5 al 35% (Pineda and Mesta-Howard, 2001). El estado

físico de los HTP’s determina el área superficial inicial donde puede comenzar la biodegradación, un

incremento en el área superficial correlaciona positivamente con la biodegradación.

Las variables más importantes que limitan la biorremoción de Hidrocarburos Totales del Petróleo

(HTP’s) son: la biodisponibilidad, la transferencia de masa, las heterogeneidades espaciales y las

pérdidas abióticas. Dada la baja solubilidad de estos compuestos en agua, una de las estrategias para

la biorremediación en suelo es la adición de surfactantes naturales o sintéticos, que solubilicen a los

HTP’s y aumenten su biodisponibilidad (Ghosh, 1997).

La escasez de nutrientes, especialmente nitrógeno y fósforo limitan el crecimiento de microorganismos

degradadores de hidrocarburos. Otros micronutrientes como el hierro o azufre también son

indispensables aunque en pequeñas cantidades para mejorar el proceso de remoción. En la Tabla 8

se resume algunos de los factores que son limitantes en el proceso de biodegradación.

Tabla 8. Factores limitantes en la remoción de hidrocarburos totales del petróleo

Factor limitante Ejemplos Composición de los hidrocarburos

Estructura, cantidad, toxicidad

Estado físico Agregación, propagación, dispersión, adsorción

Potencial de agua Fuerza osmótica, exclusión de agua de agregados hidrofóbicos

Temperatura Influencia en la evaporación y velocidades de degradación

Oxidantes O2, NO3- o SO4=

Nutrientes minerales N, P, Fe

Reacción Valores bajos de pH son limitantes

Microorganismos Los microorganismos degradadores por lo general se encuentran en poca cantidad

1.3.3.1. Relación Carbono Nitrógeno (C/N)

La transformación del N orgánico a N disponible realizada por microorganismos está influenciada por

la relación C/N de la sustancia agregada al suelo. Si la relación C/N es menor que 20 la

transformación orgánica ocurre y se libera al suelo N disponible para las plantas. Sin embargo, si la

36

relación C/N es mayor que 30 el desbalance debido al exceso de carbono impide que la

transformación ocurra, a no ser que exista N disponible en el suelo que pueda ser usado por los

microorganismos. El resultado neto es una disminución o inmovilización del N disponible del suelo.

Para relación es C/N entre 20 y 30 puede no ocurrir ni liberación ni inmovilización de N disponible

(Tisdale, et al., 1993).

La descomposición de la materia orgánica es llevada a cabo por los organismos vivos, los cuales

utilizan el carbón como fuente de energía y el nitrógeno para construir su estructura. Mas nitrógeno

que carbono es necesario, pero si el exceso de carbono es muy grande, la descomposición decrece

cuando el nitrógeno es empleado y algunos microorganismos mueren, el nitrógeno almacenado es

entonces utilizado por otros microorganismos para formar nuevo material celular, y en el proceso más

carbono es empleado. Así la cantidad de carbono es reducida a un nivel más accesible mientras que

el nitrógeno es reciclado (Gotaas, 1956).

Los microorganismos utilizan cerca de 30 partes de carbono por cada parte de nitrógeno, una relación

C/N de 30 (en cantidades disponibles), por lo que esta relación parecería ser la más favorable para la

descomposición de la materia orgánica.

El nitrógeno es más difícil de conservar que el fósforo, potasio, y los micronutrientes los cuales, de

acuerdo a su condición química en la cual están presentes, son perdidos solo por lixiviación. El

nitrógeno puede ser perdido por lixiviación, pero la mayor pérdida viene del escape de amonio u otros

gases volátiles nitrogenados a la atmósfera (Gotaas, 1956).

La pérdida de nitrógeno como amoniaco durante la degradación aeróbia es afectada por la relación

C/N, el pH, el contenido de humedad, aireación, temperatura, forma de los compuestos nitrogenados

al inicio de la degradación, y la capacidad adsorptiva y de capacidad de retención de nitrógeno por la

materia presente.

37

El contenido de humedad de los proceso de degradación afecta la conservación del nitrógeno. El agua

sirve como solvente y diluyente del amoniaco, de manera que reduce la presión de vapor y

volatilización. Un contenido de humedad en el rango de 50 – 70%, asistirá a la conservación del

nitrógeno. La aireación y volteo afectan de manera adversa la conservación de nitrógeno. Si el

amoniaco está presente, éste escapará más fácilmente cuando el material es mezclado y expuesto a

la atmósfera. Aunque, si la relación C/N es suficientemente alta la perdida de nitrógeno durante el

mezclado será baja (Gotaas, 1956). Algunos materiales como la celulosa y materia fibrosa porosa,

tienen la capacidad de absorber o mantener la humedad y las sustancias volátiles, y disminuyen su

tendencia a escapar. Existe evidencia considerable que los materiales de este tipo juegan una parte

en la reducción de las pérdidas de nitrógeno.

38

2. JUSTIFICACIÓN

La degradación de hidrocarburos totales del petróleo (HTP’s) intemperizados de suelos reales

contaminados, es una prioridad mundial debido a su efecto tóxico sobre los seres vivos, es por esta

razón que es de interés desarrollar tecnologías de remediación efectivas y económicamente viables.

Las tecnologías de biorremediación han demostrado ser eficientes y económicas; sin embargo,

pueden ser lentas y poco eficientes en la remoción de las fracciones más recalcit rantes de los HTP’s

como son los asfaltenos e hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA’s). Entre las principales

limitaciones se encuentran la ausencia de nutrientes, la biodisponibilidad de los hidrocarburos y la

diversidad de microorganismos hidrocarbonoclastas. La degradación de estos hidrocarburos se puede

llevar a cabo por procesos de co-metabolismo, donde participen microorganismos característicos de la

transformación de moléculas aromáticas como la lignina presente en residuos celulolíticos y los

microorganismos asociados a la flora intestinal de la lombriz. La desorción de hidrocarburos de las

partículas de suelo ha sido comúnmente realizada a base de tensoactivos sintéticos. Aunque,

materiales tensoactivos de origen orgánico, tales como los biotensoactivos y ácidos húmicos, son una

opción interesante. En lo que concierne a los ácidos húmicos, moléculas complejas que evolucionan

en el curso del tiempo, existen reportes científicos acerca de su poder tensoactivo y capacidad para

incorporar estructuras aromáticas en su molécula.

En el presente trabajo se propuso evaluar el efecto de la presencia de lombrices (Eisenia andrei) y la

adición de ácidos húmicos en forma de extracto de leonardita con el objetivo de reducir los tiempos de

remediación de suelos arcillosos contaminados.

3. HIPÓTESIS

Las propiedades fisicoquímicas de los Ácidos Húmicos; así como, la flora microbiana asociada al

intestino de lombriz Eisenia andrei y su efecto mecánico sobre el suelo, permitirán reducir el tiempo de

restauración de un suelo contaminado.

Se ha considerado que el lavado de suelo con ácidos húmicos, reducirá aún más el tiempo de

restauración del suelo contaminado.

39

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Evaluar el efecto de la implementación de una tecnología en serie: lavado-fermentación sólida,

enfocado a reducir los tiempos de restauración de suelos altamente contaminados con hidrocarburos

totales del petróleo (HTP’s) e hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA’s) intemperizados.

4.2. Objetivos específicos

4.2.1. Determinar la fuente de nitrógeno para bioestimular el suelo contaminado, en función de la

sobrevivencia de la lombriz.

4.2.2. Evaluar el efecto de la incorporación de la lombriz (Eisenia andrei) con o sin alimento

(bagacillo de caña), en el proceso de remoción de HTP’s y HPA’s del suelo contaminado

en fermentación sólida.

4.2.3. Evaluar el efecto de la adición de ácidos húmicos, en el proceso de remoción de HTP’s y

HPA’s del suelo contaminado en fermentación sólida.

4.2.4. Determinar el efecto y niveles de remoción de HTP’s del suelo contaminado, mediante

lavados con soluciones de ácidos húmicos.

4.2.5. Evaluar el efecto de biotratar el suelo contaminado lavado con ácidos húmicos, en el

proceso de remoción de HTP’s y HPA’s en fermentación sólida.

40

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Suelo

Se utilizó un suelo proveniente del campo 10 perteneciente a la petroquímica Escolin, ubicada en el

municipio de Poza Rica, Veracruz, localizada en la zona central del estado a 20° 32" latitud norte y 97°

27" longitud oeste, a una altura de 50 metros sobre el nivel del mar. La zona pertenece a la región

hidrológica RH-27 "Tuxpan Nautla", que forma parte de las cuencas de los ríos Nautla, Tecolutla,

Cazones y Tuxpan además de la laguna de Tamihua. La zona se considera con un clima cálido, una

temperatura promedio de 24.2°C, su precipitación pluvial media anual es de 1,010mm y su humedad

relativa varía entre 76 y 80%. El suelo se obtuvo mediante una serie de muestras que se tomaron

desde una profundidad de 50 cm de diferentes puntos del sitio y posteriormente estas muestras se

secaron y mezclaron entre sí para tener una muestra representativa del suelo. El suelo fue

homogenizado, triturado y cribado en malla 25 para su caracterización.

5.2. Bagacillo de caña

Producto de desecho de un procesadora de hojas de papel (Kimberly-Clarck) del estado de Veracruz,

previamente precomposteada. El bagacillo de caña fue homogenizado y triturado para su

caracterización.

5.3. Vermicomposta

Producto de la vermicomposta de paja y estiércol bovino previamente precomposteados.

Proporcionada por el modulo de vermicompostaje del área de microbiología del Colegio de

Postgraduados del Departamento de Edafología. La vermicomposta fue homogenizada y cribada en

malla 10 para su caracterización.

41

5.4. Extracto de Leonardita (EL)

La leonardita son depósitos de un tipo de carbón suave usualmente encontrados en conjunto con

depósitos de lignita. La leonardita es el producto final del proceso de humificación a lo largo de 70

millones de años aproximadamente. Se empleo el producto comercial Humintech® Powhumus® el

cual es un acondicionador natural del suelo y bioestimulante de las plantas que contiene substancias

húmicas naturales incluyendo, ácidos húmicos y ácidos polihidroxicarboxílicos derivados de

Leonardita.

5.5. Lombriz

Eisenia andrei (Bouché 1972) con clitelio, proporcionada por el Dr. Ronald Ferrera Cerrato del Colegio

de Postgraduados del programa de postgrado en Edafología.

42

Fermentación Sólida

del Suelo

Caracterización del

suelo, bagacillo de

caña, vermicomposta

y leonardita

Selección de la fuente

de nitrógeno

Lavado de Suelo

Fermentación Sólida

del Suelo LavadoEmpleo de ácidos

húmicos

Tratamiento de

Lixiviados

5.6. Estrategia Experimental

La estrategia experimental estuvo dividida en seis etapas, como se indica en la Figura 8. El primer

bloque comprende la caracterización física, química y biológica del suelo, bagacillo de caña,

vermicomposta y extracto de leonardita. Posteriormente se llevó a cabo la selección de la fuente de

nitrógeno para la fermentación sólida, en función de la sobrevivencia de la lombriz; así mismo, se

establecieron las condiciones para el lavado de suelo empleando soluciones de ácidos húmicos. Una

vez seleccionada la fuente de nitrógeno, se llevó a cabo la fermentación sólida del suelo, previo a su

acondicionamiento de acuerdo a un diseño experimental indicado en la sección 5.6.3.2. El suelo

lavado, se acondicionó en función al mejor tratamiento obtenido en la fermentación sólida. Los

lixiviados fueron analizados para su posterior tratamiento.

Figura 8. Estrategia experimental para la remoción de HTP’s del suelo de Poza Rica, Veracruz.

43

Determinación Unidades Método Referencia S VC EL BC

Físicas

Humedad % Gravimétrico AS-05*

Capacidad de Retención de Agua % Gravimétrico AS-06*

Densidad % Gravimétrico AS-04*

Químicas

Materia orgánica % Oxidación de la

materia orgánica AS-07*

Carbono total % Oxidación del

carbono total

TOC-Vcsn

Shimadzu

Carbono orgánico % Oxidación del

carbono orgánico

TOC-Vcsn

Shimadzu

Carbono inorgánico %

Oxidación del

carbono inorgánico

TOC-Vcsn

Shimadzu

Nitrógeno Total % micro kjeldahl Fernández, 2006

Fósforo asimilable % Extracción del

fósforo disponible AS-10*

pH Potenciométrico AS-02*

Ácidos Húmicos % Extracción y

asilamiento IHSS

Ácidos Fúlvicos % Extracción y

asilamiento IHSS

HTP's mg/Kg de

suelo

Extracción por

sonicación EPA 3550b

Asfaltenos (Asf) mg/Kg de

suelo Extracción

ASTM D 6560-

00 (2005)

H. Libres de Asfaltenos (HLA)

H. Alifáticos (HA) % Fraccionamiento Fernández, 2006

H. Aromáticos (HAr) % Fraccionamiento Fernández, 2006

H. Policíclicos Aromáticos (HPA) % Fraccionamiento Fernández, 2006

Biológicas

Carbono de Biomasa % Irradiación-Extracción

Islam y Weil 1998

Bacterias UFC/g de muestra

Cuenta en placa Fernández, 2006

Actinomicetos UFC/g de

muestra Cuenta en placa Fernández, 2006

Levaduras UFC/g de muestra

Cuenta en placa Fernández, 2006

Bacterias hidrocarbonoclastas UFC/g de


Levaduras hidrocarbonoclastas UFC/g de


Hongos hidrocarbonoclastas UFC/g de


5.6.1. Caracterización del suelo contaminado, bagacillo de caña, extracto de leonardita y

vermicomposta

La caracterización de los elementos indicados anteriormente se llevó a cabo empleando los métodos

analíticos mostrados en la Tabla 9.

Tabla 9. Determinaciones analíticas aplicadas a: el suelo, vermicomposta, leonardita y bagacillo de caña.

*NOM-021-SEMARNAT-2000, S Suelo, VC Vermicomposta, EL Extracto de Leonardita, BC Bagacillo de caña

44

5.6.2. Selección de la fuente de nitrógeno y relación C/N

La metodología empleada se basó en las Normas de la Organisation for Economic Co-operation and

Development (OECD) test guidelines for the testing of chemicals: Earthworm, acute toxicity tests (207)

and Earthworm reproduction test (222). Se realizaron microcosmos con 100 gramos de suelo

adicionado con Sulfato de Amonio como fuente de nitrógeno y Fosfato Monobásico de Potasio como

fuente de fósforo, propuesta por diversos autores para propósitos de bioestimulación de suelos

contaminados (Atlas and Bartha, 1973; Espitia, 2002; Corona e Iturbide, 2005), hasta obtener una

relación C/N/P de 100/10/1 que corresponde a una relación C/N 10. Se probó además una relación

C/N/P de 100/4/1 que corresponde a una relación C/N 25, con la finalidad de que no ocurra ni

liberación ni inmovilización de nitrógeno disponible (Tisdale, 1993). A cada microcosmo se le

incorporaron 10 lombrices y la humedad se mantuvo a 60%.CRA-Suelo. El experimento se llevó a

cabo por duplicado.

45

5.6.3. Fermentación sólida del suelo contaminado

5.6.3.1. Dispositivo experimental

En un contenedor de 50×40×20 cm aprox., se elaboraron dos compartimientos de 20×30×20 cm

aprox. de malla 40 de plástico para retener el suelo del sistema y a las lombrices, alrededor de ellas

se colocó unicel de una pulgada de ancho, con la finalidad además de formar los dos tratamientos, de

aislarlos del frío y mantener una temperatura entre 15 y 20ºC. Se colocaron piedras de mármol en el

fondo de las cajas con la finalidad de evitar anaerobiosis en el fondo de los tratamientos, permitir flujo

de aire y evitar en lo posible que se formen colonias microbianas en la superficie de este soporte y

que pudieran interferir con los resultados (Figura 9).

Figura 9. Dispositivo experimental para llevar a cabo la fermentación sólida del suelo.

20cm

20cm

30cm

46

S/BC

S/EL 0

S/BC

S/EL 20

S/BC

S/EL 40

S/BC

N/EL 0

S/BC

N/EL 20

S/BC

N/EL 40

N/BC

S/EL 0

N/BC

S/EL 20

N/BC

S/EL 40

N/BC

N/EL 0

N/BC

N/EL 20

N/BC

N/EL 40

Número de Lombrices

0 20 40

Ex

tra

cto

de

Le

on

ard

ita

(EL

)

No

Si

Ex

tra

cto

de

Le

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ard

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(EL

)

No

Si

Ba

ga

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lo d

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añ

a (B

C)

No

Si

5.6.3.2. Diseño experimental factorial general

Un Diseño Experimental Factorial General (DEFG), se empleó para evaluar los efectos de: Extracto de

Leonardita (EL) a dos niveles: 0%/1%; la presencia de bagacillo de caña (BC) a dos niveles: 0%/6%;

así como, la aplicación y actividad de lombrices (L) a tres niveles: 0/20/40; en la remoción de HTP’s

(Fig 10). Los tratamientos control fueron: a) suelo al 60% CRA, b) suelo al 60% de la CRA y

bioestimulado con vermicomposta (blanco del DEFG → N/BC, N/EL,0) y c) Bioestimulación con

Sulfato de Amonio y Fosfato Monobásico de Potasio hasta una relación C/N/P 100/4/1. Se

realizaron blancos estériles de ―a‖ y ―b‖.

Figura 10. Diseño Experimental Factorial General (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

47

5.6.3.3. Acondicionamiento de los tratamientos

Se colocaron cuatro kilogramos de suelo contaminado en un mezclador de 100 Kg de capacidad,

marca Ortiz Conrado. Posteriormente dos litros de agua se adicionaron gradualmente hasta obtener

una mezcla homogénea con aproximadamente 60% de la capacidad de retención de agua (CRA). Se

adicionó 250 g de bagacillo de caña (alimento para la lombriz, texturizante y fuente de

microorganismos) cuando el tratamiento lo requería, este fue calculado de acuerdo al número máximo

de lombrices por tratamiento (40 lombrices) y la cantidad de alimento ingerido por lombriz por día

(anexo). Se mantuvo el pH en aproximadamente 7 y la temperatura del sistema alrededor de 20°C. La

humedad del suelo se mantuvo y monitoreó semanalmente empleando un medidor del contenido

volumétrico de agua presente en el suelo TDR 200 Fieldscout de Spectrum Technologies. Cada

semana se mezcló de forma manual todo el tratamiento, con la finalidad de homogenizar e incorporar

aire al sistema. Los tratamientos fueron analizados periódicamente para determinar remoción de

HTP’s, producción de ácidos húmicos (AH), crecimiento microbiano como carbono de biomasa (Cb) y

unidades formadoras de colonias (UFC). Así mismo, se llevó a cabo el fraccionamiento de los

hidrocarburos al inicio y al final del tratamiento, para ser analizarlos mediante cromatografía de gases.

48

5.6.4. Lavado de suelo con substancias húmicas

5.6.4.1. Diseño experimental factorial completo

Un Diseño Experimental Factorial Completo (DEFC) fue empleado para evaluar los efectos de la

relación EL(Extracto de Leonardita)/Agua/Suelo en la remoción de HTP’s. Con la finalidad de elegir las

mejores condiciones de remoción de HTP’s en el lavado estas 3 variables independientes fueron

consideradas a 3 niveles, que de acuerdo a los Diseños Factoriales corresponde a un diseño 33. La

Tabla 10 resume el diseño factorial.

Tabla 10. Factores y niveles usados en el diseño factorial 33

Cada tratamiento fue diseñado de la siguiente manera:

En frascos de 200 ml se adicionaron los componentes EL, suelo y agua de acuerdo al DEFC

de la Tabla 10.

A continuación se llevó a cabo el lavado, mediante agitación orbital a 200 rpm durante 24

horas.

Después la mezcla se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min.

El suelo lavado (precipitado) se secó a 40ºC durante 24 horas.

Por último se cuantificó HTP’s residuales y extraídos, del suelo lavado y el lixiviado

respectivamente; empleando el método EPA 3550b.

Factores Rango de los Niveles -1 0 1 X1 Extracto de Leonardita (g) 0.1 1 10 X2 Suelo (g) 5 10 15 X3 Agua (ml) 50 100 150

49

5.6.5. Fermentación sólida del suelo lavado

5.6.5.1. Acondicionamiento del suelo lavado

Cuatro kilogramos de suelo fueron lavados bajo las mejores condiciones determinadas en la sección

5.6.4.1. El suelo se seco, trituró, homogenizó y se acondicionó como se describió en la sección

5.6.3.3. A continuación se adicionó o no BC, EL y lombrices en función del mejor tratamiento obtenido

del DEFG de la sección 5.6.3.2.

5.6.6. Lixiviado

Al lixiviado obtenido se le analizó contenido de HTP’s, para poder tratarlo posteriormente.

5.6.7. Análisis estadístico

La evaluación de los resultados de los diseños experimentales del ensayo de remoción de

hidrocarburos del suelo contaminado en cultivo sólido, así como; el lavado de suelo contaminado con

soluciones de ácidos húmicos; se realizó mediante Design Expert (versión 6.0) con un nivel de

significancia del 95% (p<0.05).

50

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. Caracterización del Suelo Contaminado

El suelo posee una concentración de materia orgánica media (6.1-10.9% para suelos volcánicos), así

como un contenido de fósforo disponible y nitrógeno bajos; menor a 15 mg/kg de suelo y menor a

10mg/Kg de suelo respectivamente, lo cual indica la necesidad de incorporar ambos nutrientes (Tabla

11). La baja disponibilidad de nitrógeno y fósforo puede ser causada por una relación C/N elevada,

debido a que bajo estas condiciones existe un consumo instantáneo de nitrógeno por los

microorganismos presentes en el suelo para generar biomasa, este fenómeno es conocido como

―robbing‖ (Gotaas, 1956). Se determinó una concentración elevada de carbono inorgánico por lo cual

se considera un suelo de tipo volcánico o calcáreo (NOM-021-SEMARNAT-2000); debido a que tiene

suficiente carbonato de calcio como para que haga efervescencia cuando se trata con una solución de

HCl al 10%, caso común de los suelos de tipo molisol.

De acuerdo con la NOM-021-SEMARNAT-2000 por el valor del pH, el suelo contaminado es

considerado neutro (pH 6.6 -7.3). En este caso el pH que presenta el suelo contaminado, presenta un

pH dentro del rango sugerido (6 a 8) para crecimiento microbiano (Alexander, 1994). El pH del suelo

juega un papel muy importante en el proceso de degradación. Su magnitud determina el tipo de flora

microbiana activa, la actividad enzimática, la disociación y solubilidad de moléculas de CO2, la

disponibilidad de nutrientes y la degradación de los contaminantes (Alexander, 1994).

La concentración de substancias húmicas fue de 1.6% (ácidos húmicos y ácidos fúlvicos) valor

considerado bajo debido a que el rango de substancias húmicas presentes en el suelo varía entre:

0-1.6% bajo, 1.6-3% medio y de 3% en adelante es alto de acuerdo a la clasificación propuesta por

Tan (2003). La concentración y tipo de substancias húmicas en el suelo está determinada por la

actividad microbiana, tipo de vegetación y temperatura entre otros. La temperatura determina el grado

de descomposición de la materia orgánica; así como, de las substancias húmicas, ya que en un clima

cálido como lo es el estado de Veracruz, la degradación de estas estructuras es más activa. Como el

51

suelo de Poza Rica ha estado contaminado por alrededor de 30 años relación C/N ≈ 76 es muy

elevada para propósitos de humificación, que implica una nula o lenta formación de ácidos húmicos.

Los ácidos húmicos obtenidos fueron de color gris (Figura 11), los cuales están asociados con los

suelos de tipo molisol.

Figura 11. Ácidos húmicos presentes en el suelo

El suelo presentó una concentración de hidrocarburos menor a la máxima recomendada en la Norma

Oficial Mexicana para propósitos de biorremediación <10%HTP’s (NOM-138-SEMARNAT/SS-2003).

La composición de hidrocarburos en términos de las fracciones de asfaltenos, alifática, aromática y

policíclica aromática se presenta en la Tabla 11. Se observa una alta concentración de las fracciones

asfáltica y policíclica aromática, ambos, considerados como recalcitrantes. Este suelo posee un valor

promedio de 35±1% de asfaltenos lo que indica un proceso de intemperización avanzado (Figura 12).

De acuerdo a la composición de hidrocarburos considerados como degradables, la máxima remoción

de hidrocarburos esperada sería del 65%. Muchos compuestos del petróleo, especialmente los

alcanos lineales, son conocidos por su fácil degradación. No obstante, su baja solubilidad en agua

puede limitar su transformación hasta su mineralización.

La intemperización podría afectar el proceso de biodegradación, por la adsorción/absorción de los

hidrocarburos a las partículas de suelo; así como, a la ausencia de hidrocarburos de fácil degradación.

52

Det

erm

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3

± 0

.5

4 ±

0.5

14

5

± 0

.5

Cap

acid

ad d

e R

eten

ció

n d

e A

gu

a

%

67

.6 ±

3

30

± 4

N

/A

70

0 ±

5

D

ensi

dad

%

1

.43 ±

0.0

3

0.5

± 0

.02

0.6

0

.15 ±

0.0

2

Qu

ímic

as

Mat

eria

org

ánic

a

%

8.8

± 0

.04

28

.8 ±

0.5

81.9

8

2.1

± 0

.5

Car

bo

no

to

tal

%

7.6

± 0

.09

1

7 ±

0.5

42.8

4

7.6

± 0

.5

Car

bo

no

org

ánic

o

%

6.1

± 0

.05

1

6.7

± 0

.5

42.8

4

7.6

± 0

.5

Car

bo

no

in

org

ánic

o

%

1.5

± 0

.07

0

.3 ±

0.5

N

/D

N/D

N

itró

gen

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l %

0

.02 ±

0.0

04

1

.32 ±

0.5

0.8

3

0.2

3 ±

0.5

F

ósf

oro

asi

mil

able

%

0

.1 ±

0.0

1

2 ±

0.0

2

< 0

.1

0.0

1 ±

0.5

pH

7 ±

0.0

5

6.9

± 0

.05

9.8

5

6.5

± 0

.05

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cid

os

Hú

mic

os

%

0.2

3 ±

0.0

5

2.3

4 ±

0.5

91.5

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úlv

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s %

1

.42 ±

0.0

3

1.8

6 ±

0.5

4

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8

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0 ±

30

00

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alte

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e su

elo

3

5 ±

1

H.

Lib

res

de

Asf

alte

no

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LA

)

65

± 2

H.

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fáti

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) %

28.5

± 1

H.

Aro

mát

ico

s (H

Ar)

%

1

5 ±

1

H

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ura

do

s (

HS

) %

21.5

± 1

53

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ció

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L

BC

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Car

bo

no

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a

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3.1

2 ±

0.2

3

9.8

4 ±

0.5

1

5.5

2 ±

0.3

2

4.4

3 ±

0.4

9

Bac

teri

as

UF

C/g

mu

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a

1.5

× 1

06

1.2

8 ×

10

9 1.5

1 ×

10

7 2.7

× 1

07

Act

ino

mic

eto

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FC

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ues

tra

2.6

× 1

05

3.2

× 1

06

2.2

× 1

07

2.1

× 1

05

Levad

ura

s U

FC

/g m

ues

tra

1.1

5 ×

10

4 5.3

× 1

05

3.4

× 1

07

2.3

× 1

05

Ho

ngo

s U

FC

/g m

ues

tra

8.2

× 1

03

N/D

N

/D

N/D

B

acte

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hid

roca

rbo

no

clas

tas

UF

C/g

mu

estr

a

6.7

× 1

06

6.8

× 1

06

4.2

× 1

03

4.5

× 1

06

Levad

ura

s

hid

roca

rbo

no

clas

tas

UF

C/g

mu

estr

a

8.2

× 1

04

2.4

× 1

04

2.3

× 1

04

N/D

Ho

ngo

s

hid

roca

rbo

no

clas

tas

UF

C/g

mu

estr

a

2.7

× 1

03

2.6

× 1

04

N/D

7.3

× 1

04

54

Figura 12. Asfaltenos (A) e hidrocarburos libres de asfaltenos (B), contenidos en el suelo.

El hidrocarburo libre de asfalteno se sometió a un análisis cromatográfico de gases, obteniéndose un

perfil cromatográfico con 130 señales, de las cuales 18 fueron identificadas como: Tolueno, Xileno,

C12, C14, Acenafteno, C16, Antraceno, C18, Fenantreno, C20, Fluoranteno, C22, C24, Criseno, C26,

C28, Benzo(a)pireno y C30, como se muestra en la Figura 13.

Figura 13. Perfil cromatográfico del hidrocarburo libre de asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar.

A B

55

Figura 14. Perfil cromatográfico de los asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar.

Los asfaltenos mostraron un perfil cromatográfico en su

mayoría, revelando compuestos con elevado peso

molecular (Figura 14). Estructuralmente los asfaltenos son

moléculas muy complejas que contienen cicloalcanos,

alcanos de cadenas largas, naftenos, pirenos, etc. (Martín-

Gila, 2007); lo cual se observa en el perfil cromatográfico

obtenido. La concentración de hidrocarburos considerados

potencialmente tóxicos, carcinogénicos y mutagénicos

como el Criseno y el Benzo(a)pireno se detectaron por

encima de la concentración máxima permitida por la NOM-

138-SEMARNAT/SS-2003. Estos datos revelan la

necesidad de remediar este suelo. Así mismo se

identificaron compuestos aromáticos, policíclicos

aromáticos e hidrocarburos de cadenas largas (C28), tanto

para los HTP’s como para los asfaltenos (Tabla 13).

Tabla 13. Hidrocarburos identificados en el

suelo contaminado

56

La población mínima requerida para llevar acabo procesos de biorremediación es de 103 UFC/gramo

de suelo (Providenti, 1993). De acuerdo a la Tabla 12, la población microbiana está dentro de este

parámetro. El sitio ha estado expuesto a la contaminación por varios años, induciendo la aclimatación

de algunos microorganismos hidrocarbonoclastas y la desaparición de los susceptibles. Esto puede

ser observado, por el contenido y variedad de microorganismos cultivados en caja petri (Figura 11).

Se ha reportado que bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos, están implicados en la degradación

de hidrocarburos. No obstante, gran parte de la remoción ha sido realizada mediante consorcios y

actividad enzimática presente en algunos géneros de estos microorganismos.

Figura 15. Flora microbiana total asociada al suelo: bacterias (Agar nutritivo), actinomicetos (Agar czapeck) y levaduras (Agar

maltosa sabouraud) bajo una dilución 1×103.

La flora microbiana total asociada a este suelo no es muy variada (Figura 15); ya que, se observaron

no más de 3 cepas distintas en el caso de bacterias y levaduras; no obstante, su número es elevado

(UFC). Estos resultados podrían predecirse, dada la selección natural de la flora microbiana de los

suelos en presencia de algún agente xenobiótico. Ha sido reportado que solo sobrevivirán aquellas

cepas o aquellos microorganismos con capacidad de formar consorcios y que tengan la capacidad

enzimática para emplear los xenobióticos. La flora microbiana hidrocarbonoclasta es ligeramente

superior a la total (Tabla 12); sin embargo, es pobre en diversidad microbiana (Figura 15). Lo cual

indica que la mayor parte de los microorganismos presentes en el suelo es tolerante al contaminante.

Esta relación de floras microbianas indica un proceso de añejamiento e intemperización del suelo

contaminado.

57

Figura 16. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al suelo (Agar Mineral + queroseno, dilución 1×103).

6.2. Caracterización del Bagacillo de Caña

El bagacillo de caña con el que se trabajo ya ha pasado por el proceso de composteo natural, lo cual

permite que sea muy adsorbente como lo muestra su CRA ≈ 700% (Tabla 11). Al ser una fibra

orgánica ligera posee una densidad muy baja y posee un alto contenido de carbono orgánico

considerando que es prácticamente celulosa 41%, fibra 16% y lignina 21% (Alvarado 1989). El análisis

microbiológico mostró que posee una población y diversidad microbiana elevada (2×107 UFC), en

todos los niveles estudiados aún para microorganismos hidrocarbonoclastas (Tabla 12). Como se

puede observar, las bacterias hidrocarbonoclastas, son como en el caso del suelo, muy abundantes

debido a que existe una presión de selección por substrato; la flora asociada a el bagacillo de caña

debe de ser capaz de degradar lo componentes principales del bagacillo antes mencionados

(Alvarado 1989). Existen diversas enzimas involucradas en el rompimiento de estructuras ligninolíticas

como son la polifenol oxidasa, manganeso peroxidasa o lacasa, para el caso de los hongos o en

enzimas tipo oxigenasas en el caso de las bacterias. Esta actividad enzimática sugiere que los

microorganismos asociados al bagacillo de caña son capaces de consumir hidrocarburos alifáticos y

aromáticos.

58

6.3. Caracterización de la Vermicomposta

La vermicomposta, desecho metabólico de la digestión de la lombriz, no posee tanto carbono debido

al consumo de este por los microorganismos asociados. De acuerdo a la bibliografía, el pH cercano a

la neutralidad, contenido de nitrógeno y fósforo está dentro de los rangos descritos para el humus de

lombriz de acuerdo a Ferruzi (1994) como se observa en la Tabla 11. Una característica de la

vermicomposta es su alta cuenta microbiana y contenido de substancias húmicas, hecho que se

comprueba en los análisis realizados. Debido a que la vermicomposta posee un gran número de

nutrientes; entre los cuales figuran aminoácidos, vitaminas, azúcares, etc. (Ferruzi, 1994); posee una

elevada flora microbiana total muy diversa, con alrededor de 20 cepas distintas (Figura 17). Además

posee flora microbiana hidrocarbonoclasta (Tabla 12). La presencia de microorganismos

degradadores de hidrocarburos era de esperarse debido a la mezcla compleja de materia orgánica

transformada por este tipo de flora microbiana. En el presente estudio se utilizó vermicomposta

producida a partir de paja y estiércol bovino, previamente precomposteados. La paja al ser un

desecho agroindustrial al igual que el bagacillo de caña; poseen estructuras ligninolíticas y celulolíticas

que determinan la flora microbiana asociada. Como se indicó anteriormente el bagacillo de caña

posee microorganismos hidrocarbonoclastas, es probable que la paja también los posea, debido a que

está constituida por celulosa y lignina.

Figura 17. Flora microbiana total asociada a la vermicomposta: bacterias (Agar nutritivo), actinomicetos (Agar czapeck) y

levaduras (Agar maltosa sabouraud) bajo una dilución 1×103. Flora microbiana hidrocarbonoclasta, (Agar Mineral + queroseno,

dilución 1×103).

59

Por otro lado, durante el proceso de compostaje al cual fue sometido el estiércol bovino, diversos

microorganismos asociados a este fueron eliminados debido a las altas temperaturas generadas

durante el proceso (alrededor de 70ºC antes de estabilizarse la composta), dando como consecuencia

la presencia de microorganismos termofílicos y que pueden además estar involucrados en la

degradación de hidrocarburos.

Los ácidos húmicos y fúlvicos aislados de la vermicomposta, fueron de café oscuro y naranja/café,

respectivamente (Figura 18). El color café oscuro indica un grado de polimerización avanzado; en

tanto que el color naranja/café indica la presencia del ácido crénico (amarillo claro) y el ácido

apocrénico (amarillo-pardo) (Tan, 2003).

Figura 18. Ácidos húmicos y ácidos fúlvicos aislados de la vermicomposta.

6.4. Caracterización del Extracto de Leonardita

La Tabla 11 resume las características del extracto de leonardita del producto comercial PowHumus ®

de la empresa Humintech ®; a excepción de la flora microbiana analizada, los datos restantes fueron

proporcionados por la empresa Humintech. Como podemos observar la flora microbiana total asociada

es elevada no obstante su baja diversidad microbiana (Tabla 12). Esto podría indicar que las cepas

asociadas al extracto de leonardita están bien adaptadas a incorporar este material como fuente de

carbono, nitrógeno y energía, debido a su estructura molecular altamente recalcitrante. No obstante

los ácidos húmicos, poseen una estructura molecular diversa (Figura 19), conformada por péptidos,

oligosacáridos, quinonas, hidrocarburos, anillos aromáticos, etc.; que los hace adecuados para el

60

consumo microbiano en procesos co-metabólicos donde son reducidos u oxidados para consumir

diversas moléculas aledañas a estos (Tan, 2003). El extracto de leonardita posee además flora

microbiana hidrocarbonoclasta (Figura 20), que de acuerdo a lo mencionado con anterioridad acerca

de la gran diversidad estructural de su molécula, es de esperarse que si soporta actividad microbiana;

parte de esta, debe poseer la actividad enzimática capaz de interaccionar con moléculas altamente

recalcitrantes para emplearla como fuente de carbono y energía.

Figura 19. Estructura hipotética de los ácidos húmicos indicando las principales estructuras que la componen (Kleinhempel,

1970).

Figura 20. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita (Agar Mineral + queroseno, dilución 1×103).

61

6.5. Selección de la fuente de nitrógeno (en función de la sobrevivencia de la lombriz,

Eisenia andrei)

La adición de nitrógeno a través de sales como se indicó en la sección 5.6.2; mostraron efectos

tóxicos en las lombrices; ya que, éstas comenzaron a salirse de los microcosmos y a agruparse entre

sí o sobre restos de bagacillo de caña (Figura 20).

Figura 20. Lombriz Eisenia andrei en los microcosmos agrupándose debido a los efectos adversos del sustrato sólido.

Si las lombrices se enterraban manualmente resurgían a la superficie. Algunas murieron en

aproximadamente 1 hora. La cuenta de lombrices posterior a un tiempo de incubación de 1 hora,

mostró una mortalidad de 80%. La lombriz en contacto directo con el suelo contaminado permaneció

viva, es por ello que la adición de sales se consideró como un elemento tóxico para ésta.

La fuente de nitrógeno (Sulfato de Amonio) propuesta por diversos autores para propósitos de

bioestimulación de suelos contaminados (Atlas and Bartha, 1973; Espitia. 2002; Corona e Iturbide,

2005), provocó la muerte de la lombriz Eisenia andrei (Figura 21), con una de LD50 de 3g/kg. De

acuerdo a la bibliografía, se encontró que el Sulfato de Amonio es tóxico por encima de 2.8g/L en

ratones y por encima de 7.5g/l en bacterias (de acuerdo a la hoja de especificaciones de Merck). Al

probar otras fuentes de nitrógeno como: Nitrato de Sodio, Nitrato de Potasio y Urea; el resultado fue el

62

mismo. El suelo presentó un fuerte olor a amoniaco un día después de que se adicionó Sulfato de

Amonio (cantidad suficiente para obtener la relación C/N/P 100:10:1). Se consideró que la muerte

de la lombriz pudo ser por asfixia ya que respira por la piel. Entonces se procedió a disminuir la

cantidad de Sulfato de Amonio no obstante, las lombrices siguieron muriendo. Como fuente alternativa

de nitrógeno se utilizaron Nitratos; ya que, estos no presentan el proceso de descomposición y

amonificación. Con lo Nitratos se obtuvo el mismo resultado aun cuando el suelo no presentó olor

alguno a amoniaco. Posteriormente se optó por la adición de Urea. De acuerdo a la hoja de

seguridad, la urea no es tóxica para la micro y macroflora del suelo; no obstante concentraciones de

2g/kg de suelo provocó la muerte de la lombriz en un periodo de 5 días, aun cuando se adicionó para

una relación C/N de 25. Valor inferior al recomendado en literatura para propósitos de remediación de

suelos contaminados (C/N de 10). Dados estos resultados, finalmente se optó por utilizar la

vermicomposta disponible como fuente de nitrógeno. Su aplicación al suelo contaminado no mostró

efectos tóxicos. Esta se adicionó a manera de fijar una relación C/N de 25, valor que evita la liberación

e inmovilización del N disponible (Tisdale et al., 1993). Adicional al aporte de Nitrógeno, la

vermicomposta también sirvió como fuente de fósforo, por lo cual ninguna sal para proporcionar estos

elementos fue adicionada. La vermicomposta se adicionó en aproximadamente 16% por kilogramo de

suelo.

Figura 21. Lombriz Eisenia andrei

63

6.6. Fermentación Sólida del Suelo Contaminado

6.6.1. Remoción de HTP’s de acuerdo al DEFG planteado

El diseño experimental factorial general (DEFG) propuesto permitió determinar el efecto de las

variables independientes: bagacillo de caña, extracto de leonardita y lombrices (Eisenia andrei). Se

observan niveles de remoción en el rango de 15000 a 45000ppm, que corresponden a un 29 y 63% de

remoción respectivamente. El máximo nivel de remoción (63%) se obtuvo en el sistema conformado

por BC, EL y 40 lombrices. La línea punteada, indica el máximo nivel de remoción teórico debido al

contenido de 35% de la fracción asfáltica; es decir, 45500 mg HTP’s/Kg de suelo. El tratamiento

bioestimulado con EL (al 1%), BC (al 6%) y lombrices (40) produjo el porcentaje más alto del remoción

de HTP’s (63±1.5%). El rendimiento de este tratamiento fue 117% más, comparado con el tratamiento

control ―b‖ (remoción de HTP’s de 29±2.1%) y 385% más, si se compara con el tratamiento control ―a‖

(remoción de HTP’s de un 13±1.2%), al cual únicamente se le adicionó el 60% de la CRA. El peor

biotratamiento fue al que se le agregó solamente vermicomposta (VC); sin embargo, incluso su

resultado inferior, demuestra un mejor comportamiento si se compara con el tratamiento del control

(a). El funcionamiento relativamente bueno de la VC, se podría atribuir al cambio observado en la

textura del suelo contaminado y el posible aumento de la porosidad. La VC se utiliza generalmente

como fertilizante en el cultivo de cosechas debido a sus características nutrimentales (Ferruzzi, 1994);

se sugiere que tales características estimularon la actividad microbiana del suelo.

La Tabla 14 muestra un resumen condensado de los porcentajes de remoción alcanzados por los 12

tratamientos en un periodo de 94 días, incluyendo los 2 blanco adicionales y en la Figura 22 se

muestra a manera de resumen los HTP’s residuales. Como era de esperarse y en comparación con el

blanco ―b‖, la adición de BC y EL incrementa hasta un 59% los niveles de remoción HTP’s y el

tratamiento adicionado de BC, EL y 40 lombrices incrementa un 117% los niveles de remoción de

HTP’s. Si consideramos el blanco ―a‖, estamos hablando de un incremento del 385% en comparación

con el mejor tratamiento (BC, EL y 40 lombrices). Se obtiene un incremento del 174% de remoción en

comparación con el blanco ―c‖, cuando están presentes el BC, EL y 40 lombrices. La incorporación de

64

N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40 Suelo Lavado

Remoción HTP's 44 54 55 63 47

N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20 Blanco "a"


N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0 Blanco "c"

Blanco "b"


N/BC S/BC

N/EL S/EL N/EL S/EL

vermicomposta incrementa hasta un 123% los niveles de remoción de HTP’s, respecto a blanco ―a‖, lo

cual nos indica la importancia de su presencia en los tratamientos.

Tabla 14. Porcentaje de remoción de HTP’s al termino del tratamiento (94 días), (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Blanco ―a‖ Suelo al 60% de la CRA-S

Blanco ―c‖ Suelo al 60% de la CRA-S; bioestimulado con sales minerales

Figura 22. Hidrocarburos totales del petróleo remanentes antes del tratamiento y después de éste.

65

N/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 40 S/BC, N/EL, 40 S/BC, S/EL, 40

0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095

1 semana 2.16 1.67 2.89 3.71

1 mes 0.88 0.7 1.29 1.22

2 meses 0.67 0.72 0.81 0.95

3 meses 0.46 0.57 0.57 0.67

N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20 Blanco (a)

0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095

1 semana 3.55 1.56 3.38 3.81 0.32

1 mes 0.81 0.77 1.03 1.21 0.2

2 meses 0.54 0.71 0.7 0.85 0.14

3 meses 0.37 0.51 0.5 0.58 0.14

N/BC, N/EL, 0

Blanco (b)

0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095

1 semana 1.03 0.9 2.76 3.42 0.27

1 mes 0.53 0.6 0.86 1.01 0.38

2 meses 0.38 0.65 0.54 0.65 0.25

3 meses 0.3 0.42 0.34 0.45 0.24

N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0 Blanco (c)

En la Tabla 15, se indica la evolución en la velocidad de remoción de HTP’s a lo largo de los 94 días

de tratamiento, observándose que todos los tratamientos estuvieron por encima de los indicados por

Bossert and Bartha, 1984; los cuales indican que entre 5000 – 10000 ppm HTP’s en suelos nativos la

velocidad de remoción esta alrededor de 0.08 a 1.38 mgHTP’s/cm3•día.

Tabla 15. Velocidad de remoción de HTP’s (mgHTP’s/cm3•día) durante el tratamiento (94 días), (S Si/Presencia; N

No/Ausencia).

Conversiones valor/1.43 = mgHTP’s/g•día; (valor×1000)/1.43 = mgHTP’s/día

66

6.6.1.1. Efecto del bagacillo de caña en la remoción de HTP’s

El bagacillo de caña se adicionó con la finalidad de nutrir a las lombrices y con la finalidad de evaluar

el efecto de su presencia en los tratamientos. No obstante, dadas sus propiedades este componente

probablemente impartió textura y porosidad extra al suelo.

La presencia del bagacillo de caña estimula la remoción de los hidrocarburos ya sea por:

la contribución de su elevada carga microbiana total e hidrocarbonoclasta como se demostró

durante la caracterización de este; a la cual seguramente están asociados diversos grupos

microbianos que secretan enzimas del tipo oxigenasas (ya que para poder sobrevivir en el

bagacillo de caña deben consumir celulosa y lignina; que a su vez son precursores de las

substancias húmicas) que tienen la capacidad de oxidar anillos aromáticos y estructuras

alifáticas para poder ser metabolizadas estas estructuras menos complejas.

el efecto texturizante que favorece la formación de poros o microporos de aire.

como una fuente más de alimento que permite un co-metabolismo del contaminante.

En la Figura 23, se observar que un 6% de bagacillo de caña adicionado al suelo, incrementó la

velocidad de remoción de HTP’s, desde 0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈3.4

mgHTP’s/cm3•día; durante la primera. Sin este componente (Figura 24) el incremento es de

0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈1 mgHTP’s/cm

3•día. Estas velocidades de remoción son

superiores a las reportadas por Bossert and Bartha (1984), de 0.095 a 1.38 mgHTP’s/cm3•día, no

obstante que la concentración inicial del contaminante fue mayor a la manejada por ellos de 5000 a

10000 ppm de HTP’s. El incremento en la velocidad de remoción permite que estos tratamientos

disminuyan el tiempo de tratamiento del suelo contaminado y por consiguiente se incremente la

eficiencia de remoción. Ya se ha reportado (Pandey, 2000), que la incorporación de bagacillo de caña

incrementa los niveles de remoción (dependiendo de la composición del tratamiento). En el presente

estudio los incrementos fueron en un 25 a un 33% ó dependiendo del tratamiento respecto al blanco

―b‖.

67

Figura 23. Efecto de la presencia de bagacillo de caña en la remoción de HTP’s, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Figura 24. Efecto de la ausencia de bagacillo de caña en la remoción de HTP’s, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

68

6.6.1.2. Efecto del extracto de leonardita (ácidos húmicos) en la remoción de HTP’s

La adición de ácidos húmicos (AH’s) mediante el extracto de leonardita (EL) tuvo la finalidad de

determinar su efecto en la remoción de HTP’s. En las Figuras 26 y 27, podemos observar que la

adición de extracto de leonardita mejora la remoción de HTP’s, pero no de manera inmediata. Este

comportamiento puede sugerir que se está llevando a cabo interacciones del tipo fisicoquímicas sobre

las de tipo biológico. El investigador Nieman (1998) llevó a cabo estudios en los que demostró que el

pireno se unió más a los ácidos húmicos que a los ácidos fúlvicos en el proceso de humificación en un

suelo contaminado artificialmente. Una parte del contaminante fue adsorbida y/o absorbida de tal

manera que estos no fueron disponibles para los microorganismos como fuente de energía. Otro

estudio llevado a cabo por Feificova, et. al. (2005), demostró que la presencia de ácidos húmicos

mejora los niveles de remoción e incrementa la tolerancia a fenol y catecol. Estos autores reportan

que existe inhibición el crecimiento microbiano ligeramente, no obstante esto podría haber sido

provocado por la elevada interacción hidrofóbica de los ácidos húmicos con los HPA’s de acuerdo a lo

expuesto por Nieman. Estos experimentos sugieren que pudo existir la incorporación de hidrocarburos

aromáticos a los ácidos húmicos lo cual seguramente se llevó a cabo como se muestra en una

representación tridimensional en la Figura 25.

Figura 25. Representación tridimensional de los ácidos húmicos, en donde se observan restos de péptidos (A), oligosacáridos

(B) e interacciones con hidrocarburos aromáticos (C).

A

B

C

C

C

69

Figura 26. Efecto de la presencia de extracto de leonardita en la remoción de HTP’s, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Figura 27. Efecto de la ausencia de extracto de leonardita en la remoción de HTP’s, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

70

Es por ello que se observa una fase de ―adaptación‖ en las cinéticas de remoción de HTP’s, lo cual

parece indicar que los microorganismos consumen el contaminante de manera gradual, por lo que los

niveles de remoción se ven favorecidos con el transcurso del tiempo.

La adición de ácidos húmicos tiene efectos similares a la adición de lombrices, pero a diferencia de

éstas, los ácidos húmicos pueden ser incorporados sobre grandes extensiones de suelo contaminado

aportando muchos beneficios atribuidos a los ácidos húmicos como: evitar la lixiviación y expansión

del contaminante, además de su bajo costo y abundancia en la tierra.

La incorporación de extracto de leonardita puede incrementar los niveles de remoción (dependiendo

de la composición del tratamiento), de un 23 a un 38% más dependiendo del tratamiento respecto al

blanco ―b‖, lo cual nos indica la importancia de la presencia de los ácidos húmicos.

La Figura 26 muestra que la adición de extracto de leonardita es un 1% incremento la velocidad de

remoción de HTP’s de 0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈1.7 mgHTP’s/cm

3•día en la primera

semana; mientras que la ausencia de este (Figura 27) solo incrementa de 0.095 mgHTP’s/cm3•día

(nivel basal) a ≈1 mgHTP’s/cm3•día. Estas velocidades de remoción son inferiores a las obtenidas

cuando está presente el bagacillo de caña, no obstante, al mismo tiempo son superiores a las

reportadas por Bossert and Bartha (1984); quienes han reportado incremento de 0.08 y 1.38

mgHTP’s/cm3•día en suelos intemperizados contaminados con 5000 a 10000ppm de HTP’s.

La flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita, pudo estar implicada en la

remoción del hidrocarburo; debido a que su única fuente de carbono y energía fue la estructura

altamente compleja de los ácidos húmicos; nos sugiere que estas deben de tener una amplia gama de

maquinarias enzimáticas capaces de degradar diversos tipos de estructuras aromáticas presentes en

éstas, además considerando que Lovley, et. al. (1996) demostró que los ácidos húmicos pueden ser

empleados como aceptores finales de electrones durante procesos aerobios o anaerobios en suelo

contaminado con HPA’s; estos pueden contribuir a la oxidación o reducción de los hidrocarburos

presentes; de esta manera favorecer la remoción más eficientemente ya sea debido a la flora

71

microbiana proporcionada por los ácidos húmicos o por el empleo de éstas por lo microorganismos

presentes en el suelo. Los ácidos húmicos contiene estructuras del tipo quinonas que están

involucradas en estos procesos de oxido reducción; Field and Cervantes (2005) demostraron la

interacción de microorganismos en reacciones REDOX empleando humus y quinonas relacionadas; lo

cual apoya nuestra suposición del efecto de los ácidos húmicos derivados del extracto de leonardita

en la remoción de HTP’s.

Estudios previos sobre el efecto de la incorporación de los AH’s en suelos contaminados con

hidrocarburos demostraron que estos mejoran la actividad microbiana (Mosley, 1998), incrementa la

retención de Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HPA’s) (Soderstrom, 2000; Conte, 2001; Nieman

J. K. C., 2005), tienen actividad de tensioactivos (Guetzloff and Rice, 1994; Engebretson and

Wandrusrka, 1994; Wandruszka, 2000; Conte, 2005; Quagliotto et. al., 2006), etc. En estos

experimentos reportados la contaminación por hidrocarburos no superaba las 10000ppm, además de

que el tipo de hidrocarburo era ligero como aceites pesados o gasolinas; es decir, libre de la fracción

asfáltica. Es por ello que únicamente se trabajó con una concentración (1%) debido a que Mosley

(1998); indica que empleando concentraciones por encima o por debajo de este valor no se estimula

bien el crecimiento microbiano; sin embargo, Liem et. al. (2004) indica que el incremento de la

concentración de ácidos húmicos mejora la remoción de hidrocarburos.

En estudios previos llevados por nuestro grupo de trabajo (datos no mostrados), se observó que los

ácidos húmicos derivados del extracto de leonardita (sin modificaciones posteriores, como la

sulfonación para mejorar su solubilidad en agua), tienen la capacidad de ―solubilizar‖ la fracción ligera

de los HTP’s en la concentración presente en el suelo contaminado en estudio; empleando una

solución al 0.2% de EL; concentración mucho menor a la que se trabajo en los tratamientos. Se

emplean comillas para el término ―solubilizar‖, ya que se emplea en un sentido no convencional; lo

correcto sería decir que a partir de cierta concentración, las interacciones hidrófobas entre moléculas

de surfactantes se tornan suficientemente importantes respecto a las interacciones hidrofílicas

surfactante/agua para que se forme espontáneamente una asociación. Este conocimiento no ha sido

reportado en la literatura hasta lo mejor de nuestro conocimiento; es decir, para hidrocarburos totales

72

libres de asfalteno. Estos resultados nos indicaron la elevada probabilidad de interacción entre los

ácidos húmicos derivados de la leonardita y el contaminante a tratar.

Si al contaminante no se le remueven los asfaltenos la ―solubilización‖ se me muy disminuida.

Numerosos estudios indican la capacidad de los ácidos húmicos de interactuar con hidrocarburos

policíclicos aromáticos (Perminova, et al., 2006; Saparpakorn, Kim and Hannongbua, 2007). La

interacción comprende la incorporación de los HPA’s a su centro hidrofóbico al formar estructuras

semejantes a micelas o interaccionando con ellos mediante enlaces de tipo π (Kubicki and Apitz,

1999; Käcker, 2002; Wijnja, Pignatello and Malekani, 2004) (Figura 28); sin embargo, la mayoria de

ellos se enfocan a hidrocarburos policíclicos aromáticos modelo como el pireno y no en mezclas

complejas.

Figura 28. Modelo de interacción de los ácidos húmicos con xenobióticos. ( Wershaw, 1989; Engebretson and von Wandrusrka

1994; Perminova, 2005; Saparpakorn, Hyoun and Hannongbua 2007).

Los asfaltenos son moléculas polares y extremadamente compleja (Pineda and Mesta-Howard, 2001).

En forma natural usualmente se encuentran formando complejos con resinas y aceites (Subiaga and

73

Cuattrocchio, 2000). En la Figura 29, se muestra la composición de agregados de asfaltenos. La

complejidad de este tipo de estructuras dificulta la eficiencia de solubilización, aún con los ácidos

húmicos.

Figura 29. Estructura de los agregados de asfalteno y floculación de estos.

No obstante se ha considerado que una modificación estructural de los ácidos húmicos (AH’s) podría

incrementar la interacción AH’s-HPA’s descrita anteriormente e incluso permitir una mayor

biodisponibilidad (Perminova, et al., 2006). Los ácidos húmicos tienden a disminuir las cargas

positivas del suelo debidas a los iones sodio como se observa en la Figura 30, disminuyendo la

dureza y compactación del suelo (Tan, 2003). En el presente estudio la disminución de la resistencia a

la ruptura (dureza) registrada fue de 177.7Kg/cm2 a 33.3Kg/cm

2; es decir, 1/5 de la dureza inicial.

Figura 30. Efecto de la presencia de ácidos húmicos en los suelos compactos.

74

6.6.1.3. Efecto de la presencia de la lombriz (Eisenia andrei) en la remoción de HTP’s

Como era de esperarse entre mayor fuera el contenido de lombrices en los tratamientos, debería

mejorase el proceso de remoción de HTP’s, debido a los reportes del empleo de lombrices en suelos

contaminados con hidrocarburos (Singera, et al., 2001; Schaefera, 2005; Contreras-Ramos, 2006).

Estos resultados pueden ser debido a que las lombrices, durante el proceso de alimentación,

fragmentan los residuos, incrementan la actividad microbiana y los índices de descomposición y/o

mineralización de los residuos orgánicos, alteran las propiedades físicas y químicas de los materiales,

provocando un efecto de composteo o humificación mediante el cual la materia orgánica inestable es

oxidada y estabilizada. El producto final, comúnmente llamado vermicomposta (VC) es obtenido

conforme los residuos orgánicos pasan a través del intestino de la lombriz, y es bastante diferente al

material original (Atiyeh et al., 2000). Además, se ha demostrado que bajo la acción de las lombrices

se incrementa tanto la velocidad de mineralización del nitrógeno como los índices de conversión del

N-NH4+

a N-NO3-

(Atiyeh et al., 2002), lo cual contribuyen a mantener un ciclo del nitrógeno activo

mejorando los niveles de remoción de HTP’s.

Las Figuras 31, 32, 33 y 34 muestran que la presencia de un número creciente de individuos,

incrementa la velocidad de remoción de HTP’s durante la primera semana, incrementando de

0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈2.2 mgHTP’s/cm

3•día; mientras que la ausencia de estas solo

incrementa de 0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈1.1 mgHTP’s/cm

3•día. Estas velocidades de

remoción están por encima de las reportadas por Bossert and Bartha (1984); ya que indican que para

suelos contaminados con 5000 a 10000 ppm de HTP’s las velocidades de remoción oscilan entre 0.08

y 1.38 mgHTP’s/cm3•día.

La incorporación de lombrices y el numero de estas (20 40), puede incrementar los niveles de

remoción (dependiendo de la composición del tratamiento), de un 20 a un 52% más dependiendo del

tratamiento respecto al blanco ―b‖.

75

Figura 31. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Figura 32. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices y extracto de leonardita, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

76

Figura 33. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices y bagacillo de caña, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Figura 34. Remoción de HTP’s en presencia de lombrices, bagacillo de caña y extracto de leonardita, (S Si/Presencia; N

No/Ausencia)

77

Mientras los microorganismos son responsables de la degradación bioquímica de la materia orgánica

en el proceso de vermicomposteo, las lombrices acondicionan el sustrato y promueven la actividad

microbiana. Las lombrices podrían ser consideradas batidoras mecánicas ya que desintegran el

material orgánico, lo que incrementa el área superficial expuesta a los microorganismos y mueven los

fragmentos y los excrementos ricos en bacterias, en consecuencia homogenizan el material orgánico

(Domínguez et al., 2003). La bacterias Xanthomonas maltophilia ó Pseudomonas maltophilia son

especies de bacterias que residen en la cavidad coelomica de las lombrices, y por lo cual también

están fuertemente relacionadas con la vermicomposta. Estas bacterias han mostrado una eficiencia

elevada en la biorremediación de HPA’s (Lowry and Hurley, 2005) por lo que, la actividad de las

lombrices es considerada de tipo físico/mecánico y bioquímico. Los procesos mecánicos incluyen:

aeración del substrato, mezclado, y molienda. El proceso bioquímico es afectado por la

descomposición microbiana del substrato en el intestino de las lombrices (Buck et al., 2000).

Los resultados obtenidos indican que a mayor número de lombrices se mejora el nivel de remoción,

debido a que se incrementa el efecto de estas sobre el suelo. A pesar de los niveles de remoción

alcanzados, existió una pérdida dramática de peso de las lombrices. Al inicio del tratamiento las

lombrices pesaban alrededor de 0.4 g y después del tratamiento su peso disminuyó en alrededor de

un 70%. En aquellos tratamientos sin bagacillo de caña las lombrices perecieron en alrededor de dos

meses y medio. Algunos reportes indican que las lombrices pueden perder hasta un 50% de su peso,

después de no recibir alimento durante 64 días (Beyer, 1996). En este estudio la pérdida excesiva de

peso podría estar relacionada a la gradual eliminación de microorganismos, que son fuente de

nutrientes para ellas. Se observó que en presencia de bagacillo de caña, proliferaron bastante bien; ya

que, 10 lombrices al cabo de un mes generaron 30 cocones (datos no mostrados, Figura 35), por lo

tanto la dilución del alimento en el suelo y la presencia del contaminante pudieron provocar que la

lombriz tuviera que llevar a cabo una mayor ingesta de suelo más alimento, para cubrir sus

necesidades fisiológicas. Un mayor consumo de suelo por consiguiente estará asociado a una mayor

incorporación de tóxicos hacia el interior de la lombriz, provocando una intoxicación crónica que

gradualmente la llevara a la muerte. El los tratamientos que contenían ―VC, BC, EL, 40‖ y

―VC, EL, 40‖ se observaron nuevas lombrices (17 y 10 respectivamente), lo cual nos sugiere una

78

posible detoxificación del suelo ya que en los otros tratamientos no hubo reproducción. Es posible que

el incremento en el número de individuos permitiera un incremento en la remoción de aquellos

hidrocarburos presentes que eran tóxicos para las lombrices.

Figura 35. Cocón de la lombriz Eisenia andrei y lombrices recién nacidas

Pequeñas cantidades de HPA’s han sido encontradas en el tejido de la lombriz, cuando estos se

encuentra en el suelo. Se tiene el conocimiento de las lombrices acumulan contaminantes presentes

de su medioambiente y que esta acumulación no es solo por adsorción pasiva a través de la pared del

cuerpo de la lombriz, sino que también es durante el paso del suelo contaminado a través de su

intestino (Belford, 1998).

Contreras-Ramos (2006) al contaminar suelo con Fenantreno, Antraceno y Benzo(a)pireno con

alrededor de 500 mg/Kg de cada HPA en presencia de Eisenia foetida (especie muy emparentada con

Eisenia andrei); analizó el tejido de la lombriz y determinó concentraciones de alrededor de 0.1, 0.01

y 0.001 ppm del contaminante respectivamente; por lo que el nivel de adsorción de contaminantes por

la piel de la lombriz se considera bajo. Además la presencia de Eisenia foetida permitió obtener

niveles de remoción de estos contaminantes en alrededor de 99%, 91% y 61% respectivamente;

incrementando el nivel de remoción de estos compuestos al doble respecto al control. Estas

investigaciones presentan evidencia sobre el efecto que tiene la lombriz sobre algunos contaminantes;

sin embargo, las contaminaciones por TPH’s son mucho más complejas en cuanto a variedad de

contaminantes a remover.

79

6.6.1.4. Efecto de la vermicomposta en la remoción de HTP’s

Este efecto se observó en el sistema constituido por vermicomposta y agua al 60% de su CRA, el cual

corresponde al blanco ―b‖ (Figura 36). El nivel de remoción máximo fue de 29% en un tiempo de 94

días. Esta reportado que la vermicomposta mejora las características estructurales del terreno y

desliga suelos arcillosos. Por otra parte los agregados que posee, permiten obtener una gran área

superficial, que le permite adsorber y absorber fuertemente elementos nutritivos (Atiyeh, 2000), lo cual

presumiblemente favoreció la estimulación de la flora microbiana del suelo, capaz de consumir

hidrocarburos como fuente de carbono y/o energía. La presencia de flora microbiana

hidrocarbonoclasta presente en la vermicomposta (Tabla 12), pudo haber encontrado las condiciones

necesarias para sobrevivir en el suelo contaminado y desarrollarse, de esta manera contribuir a la

degradación del contaminante.

Figura 36. Efecto de la vermicomposta en la remoción de HTP’s.

80

6.6.1.5. Efecto de la humedad (blanco “a”) en la remoción de HTP’s

El blanco “a”, al solo poseer la humedad necesaria para mantener una actividad de agua adecuada

para el crecimiento de microorganismos de acuerdo con Smith, (1985); permitió un nivel de remoción

de un 13%, lo cual nos indica que existen muy pocos recursos nutricionales para llevar a cabo la

mineralización del contaminante; ya que, existe flora microbiana hidrocrabonoclasta considerable en el

suelo (7×106 UFC/g de suelo) como se comentó anteriormente, la población mínima requerida para

llevar acabo procesos de biorremediación es de 104 a 10

7 UFC/gramo de suelo. En las cinéticas de

remoción de HTP’s se observar una muy baja velocidad de remoción durante la primera semana y

durante el resto del periodo, incrementando de 0.095 mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈0.32

mgHTP’s/cm3•día; mientras que al final del tratamiento esta tiene una velocidad de solo 0.095

mgHTP’s/cm3•día (nivel basal) a ≈0.14 mgHTP’s/cm

3•día. Estas velocidades de remoción a pesar de

ser demasiado bajas, están por encima de las reportadas por Bossert and Bartha (1984).

6.6.1.6. Efecto de la bioestimulación con sales minerales (blanco “c”) en la remoción de

HTP’s

El blanco “c”, debido a que contiene nutrientes en forma de sales minerales para obtener una

relación C/N 25 se obtuvo una remoción del 23%. Las sales minerales adicionadas, a pesar de su

rápida asimilación, pueden causar intoxicación en los ecosistemas debido a su concentración (Merck)

por lo que se ve disminuido o atenuado el proceso de remoción de HTP’s. Este efecto se pudo

apreciar cuando se realizaba la cuenta total; ya que, la flora microbiana del blanco (a) era más rica en

variedad de cepas que el blanco (c). Las velocidades de remoción también fueron bajas respecto a los

tratamientos del DEFG (Diseño experimental factorial general), llegando como máximo a un 0.27

mgHTP’s/cm3•día.

Los blancos estériles “a” y “c” removieron 3%, indicando que es muy necesaria la flora microbiana

del suelo.

81

día de inicio

disminución HC Totales HC teóricos removibles %R de los HC del tratamiento

eficiencia % R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos) (HC libres de Asfaltenos)

N/BC, N/EL, 0

Blanco (b)

N/BC, N/EL, 20 36 30 47 83

N/BC, N/EL, 40 44 41 63 93

S/BC, N/EL, 0 36 32 51 86

S/BC, N/EL, 20 44 44 67 91

S/BC, N/EL, 40 44 50 78 92

N/BC, S/EL, 0 44 33 50 82

N/BC, S/EL, 20 44 47 72 97

N/BC, S/EL, 40 44 44 68 82

S/BC, S/EL, 0 44 39 60 84

S/BC, S/EL, 20 63 54 83 97

S/BC, S/EL, 40 63 61 93 96

Blanco (a) 83 11 17 83

Blanco (c) 83 19 29 81

863022 19

6.6.2. Eficiencia de remoción de HTP’s en los diferentes tratamientos

Durante la evolución de remoción de HTP’s de los tratamientos, su eficiencia disminuyó a las pocas

semanas o se extendió a meses, si consideramos el porcentaje de remoción de hidrocarburos de cada

tratamiento de manera individual como 100% la eficiencia comenzó a disminuir a partir del día

indicado en la Tabla 16.

Tabla 16. Periodo de tiempo a partir del cual comenzó la disminución de la eficiencia de remoción para cada tratamiento.

El blanco ―b‖, parece que consume la mayor parte de sus nutrientes al día 22, por lo que su remoción

es lenta a los largo del tiempo de tratamiento, en comparación con el blanco ―a‖ y ―c‖ los cuales tardan

hasta cerca de 83 días en obtener alrededor de un 83% de remoción pero el tratamiento es muy lento.

El tratamiento compuesto por BC, EL y 40 lombrices es eficiente hasta el día 63 indicando que el

efecto de todas las variables involucradas mantiene activo a este sistema por un periodo prolongado

de tiempo; lo mismo ocurre con la mayoría de los tratamientos; sin embargo, algunos de ellos dejan de

ser eficientes a los 44 días posiblemente debido a la carencia de algún componente, lo que puede

llevar a un disminución de flora microbiana compleja o consorcio altamente degradador de

hidrocarburos.

82

HC Totales HC teóricos removibles

% R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos)

N/BC, N/EL, 0

Blanco (b)

N/BC, N/EL, 20 35 55

N/BC, N/EL, 40 43 68

S/BC, N/EL, 0 34 56

S/BC, N/EL, 20 48 73

S/BC, N/EL, 40 57 84

N/BC, S/EL, 0 42 61

N/BC, S/EL, 20 51 74

N/BC, S/EL, 40 57 84

S/BC, S/EL, 0 43 71

S/BC, S/EL, 20 58 86

S/BC, S/EL, 40 64 98

Blanco (a) 13 20

Blanco (c) 23 36

28 45

6.6.3. Niveles de remoción de HTP’s libres de la fracción de asfaltenos

Si a la concentración inicial de HTP’s de 69000ppm de los tratamientos, le restamos la fracción

recalcitrante representada por los asfaltenos (35%), la concentración teórica de HTP’s removible sería

de 44850ppm, los niveles de remoción se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17. Remoción de HTP’s con y sin asfaltenos

Se ha indicado la importancia de la presencia de cada uno de los componentes de los tratamientos y

el efecto que implicó su presencia; por lo que los resultados reflejan que se puede mejorar y disminuir

el tiempo de remoción de HTP’s de este suelo contaminado, a pesar de que estos resultados indican

que es posible la remoción hasta un 98% sin considerar la fracción de asfaltenos. Sin embargo,

independientemente de los resultados es necesario determinar la composición real o aproximada del

hidrocarburo remanente. Ya se ha indicado que los asfaltenos e inclusive diversos hidrocarburos como

los carbazoles, son estructuras altamente recalcitrantes (Pineda and Mesta-Howard, 2001), por lo que

no necesariamente un 98% de remoción de hidrocarburos libres de asfaltenos indican que se ha

removido totalmente y el hidrocarburo residual es únicamente asfalteno.

83

6.6.4. Remoción HTP’s a largo plazo (11 meses)

La Figura 37 presenta la concentración de HTP’s residuales para el mejor tratamiento (S/BC, S/EL, 40

lombrices) y algunos que contrastan en su composición; hasta el día 94 y posteriormente al día 330.

Figura 37. Remoción de HTP’s después de 11 meses de tratamiento, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Los análisis de HTP’s posteriores al día 330 para el mejor tratamiento no muestra diferencias

significativas; sin embargo, el tratamiento sin lombrices al cabo de 6 meses removió una

concentración similar demostrando la importancia de éstas. La ausencia de extracto de leonardita (EL)

incrementa casi 9 meses el proceso de tratamiento. La ausencia de BC, EL y lombrices conlleva a un

tiempo de tratamiento de alrededor de 11 meses. El blanco ―a‖ removió un 20% aproximadamente

después de 11 meses de tratamiento.

84

Estos resultados sugieren que no existen las condiciones nutricionales adecuadas para llevar a cabo

la remoción total del contaminante en algunos tratamientos. Se asume que la flora microbiana se

atenúa ó simplemente no se dispone de la maquinaria enzimática necesaria para poder continuar con

la remoción del hidrocarburo remanente dado su carácter excesivamente recalcitrante. La

comparación de los diferentes tratamientos refleja la capacidad de los diferentes sistemas para

remover HTP’s, no obstante solo uno de los tratamientos es altamente eficiente para realizar dicha

tarea en menor tiempo.

6.6.5. Remoción de asfalteno contenidos en la mezcla compleja de HTP’s

El análisis de los asfaltenos remantes se observa en la Tabla 18. Existen fracciones de la molécula de

asfalteno susceptibles a mineralizarse como las cadenas alifáticas laterales, posteriormente las

estructuras aromáticas y en mucho menor grado las estructuras policondensadas (Rontani et. al.

1985), por lo cual bajo las condiciones adecuadas es posible removerlos. Martín-Gila, et al. (2007)

determinaron parcialmente la composición de los asfaltenos identificando los siguientes hidrocarburos:

Alcanos (n-hexano; 2-metilpentano, C6H14; y fitano, C20H42); cicloalcanos o naftenos

(ciclopentano, C5H10; ciclohexano, C6H12 y metilciclopentano, C6H12); hidrocarburos aromáticos

(tetralino, C10H12; acenafteno, C12H10; y metilnafteno, C11H10) and policíclicos, como el pireno.

Otros sistemas sulfurados no de hidrocarburos como derivados tiol: etanotiol, C2H6S o

dimetilsulfuro, C2H6S; tiofeno, C4H4S and benzotiofeno C8H6S, los cuales se asume se

producen durante la degradación de los asfaltenos.

Compuestos nitrogenados como: 2-metilpiridina, C6H7N; quinolina, C9H7N e indol, C8H7N; y

compuestos que contienen oxígeno como: ácido esteárico, C18H36O2; ciclopentano ácido

carboxílico, C6H10O2; o fenol, C6H6O, han sido caracterizados.

85

Algunos de estos hidrocarburos fueron identificados en el sobrenadante muestras de asfaltenos

suspendidos en hexano. El análisis cromatográfico de estas muestras permitió observar hidrocarburos

de alto peso molecular (Figura 38).

Figura 38. Perfil cromatográfico de los asfaltenos.

La presencia de VC, EL, BC y 40 lombrices permitió obtener el mayor grado de remoción de

asfaltenos en un menor tiempo; sin embargo, los otros tratamientos también presentaron las

condiciones necesarias para llevar a cabo su remoción aunque en menor proporción y en un periodo

de tiempo mayor. Pineda and Mesta-Howard (2001) indican que se han reportado casos de niveles de

remoción de asfaltenos de entre 5 y 35%. Como se había indicado anteriormente, con el mejor

tratamiento (VC, EL, BC y 40 lombrices) se obtuvo 63% de remoción de HTP’s que corresponden a

24409ppm residuales, los cuales corresponden a un 98% de remoción de hidrocarburos teóricos

removibles, por lo que se puede suponer que el hidrocarburo restante sería únicamente asfalteno.

Como podemos observar en la Tabla 18, de los 24409ppm de HTP’s remantes de este tratamiento,

63.5% corresponden a asfaltenos y el resto a hidrocarburos degradables.

86

Suelo inicial HTP's Asfaltenos VC + EL + BC + L %R VC + EL + BC %R VC + EL %R VC %R

Tolueno* 163.4 * N/D N/D N/D N/D

Xileno* 46.1 N/D N/D N/D N/D

C12* 187.9 537.8 186 7.3 96 243.2 29 14.6 92

C14* 162.3 207.8 28 5.2 97 94.4 42 4.1 97

Acenafteno* 111.2 N/D N/D N/D N/D

C16* 173.1 N/D N/D N/D N/D

Antraceno* 182.2 N/D N/D N/D N/D

C18* 294.1 16.1 95 72.4 75 84.3 71 6.3 98

Fenantreno* 731.3 * N/D 45.2 94 N/D 3.6 99.5

C20* 780.4 * N/D N/D N/D N/D

Fluoranteno* 959.6 * N/D N/D 450.0 53 264.6 72

C22* 931.6 * N/D N/D N/D 144.9 84

C24* 1038.7 * N/D 403.5 61 611.6 41 444.2 57

Criseno* 569.3 * N/D N/D 63.3 89 N/D

C26* 1883.4 N/D 302.0 84 524.0 72 259.2 86

C28* 1255.7 * N/D N/D N/D N/D

Benzo(a)pireno* 703.5 * N/D N/D N/D N/D

C30* 181.1 N/D N/D N/D N/D

señales

cromatográficas 18 9 3 6 7 8

identificadas

señales

cromatográficas 130 30 28 37 48 40

totales

mg*/Kg de suelo

Tabla 18. Eficiencia de remoción de asfaltenos en los tratamientos seleccionados.

Tratamiento Días de

tratamiento

mg A*/Kg de

suelo

mg HCLA*/Kg de

suelo %A %HCLA

%Remoción de

A

VC 330 19800.83 12369.11 61.58 38.42 18

VC+EL 280 17948.34 7655.63 70.25 29.75 26

VC+EL+BC 180 17320.47 7638.63 69.39 30.61 28

VC+EL+BC+L 94 15505.9 8903.28 63.48 36.52 38

24500 mg A/Kg de suelo iniciales; *A: Asfaltenos; *HCLA: hidrocarburos libres de asfaltenos

El tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en la fracción libre de asfalteno, se analizó mediante

cromatografía de gases. Los resultados se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales; así como, su porcentaje de remoción.

Concentración mínima detectada: 0.1 mg HTP’s/Kg de suelo; N/D: no detectado; %R: porcentaje de remoción

87

De acuerdo con los resultados obtenidos el mejor tratamiento (VC, BC, EL y 40 lombrices), permitió

reducir hasta concentraciones inferiores a 0.1mg HTP’s/Kg de suelo, los hidrocarburos Criseno y

Benzo(a)pireno considerados por la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 como hidrocarburos prioritarios

tóxicos. Las 25 señales cromatográficas no identificadas para este tratamiento indica la presencia de

hidrocarburos del tipo recalcitrante. La superposición de cromatogramas correspondientes a la

muestra de asfaltenos y el mejor tratamiento de HTP’s residuales extraídos al día 94, se presenta en

la Figura 39. De acuerdo a los perfiles mostrados, los hidrocarburos remanetes podrían ser los

presentes en las estructuras de los asfaltenos (Martín-Gila J., et al., 2007). La señal cromatográfica

observada a los 44.6 min no fue identificada; sin embargo, de acuerdo a los hidrocarburos presentes

ántes y despés de esta señal puede corresponder al pentacosano (C25). Este puede ser producto de

la degradación de hidrocraburos alifáticos de mayor peso molecular o producto de degradación de

algun hidrocarburo de alto peso molecular.

Figura 39. Perfiles cromatográficos del mejor tratamiento (BC, EL y 40 L) en comparación con los HTP’s iniciales y asfaltenos.

De acuerdo a los resultados de la Tabla 19, existió ―generación‖ de los hidrocarburos C12 y C14 para

este tratamiento, lo cual nos indica que pueden ser estos, producto de la degradación de los

hidrocarburos de cadena más larga o de la biosíntesis de hidrocarburos por las bacterias presentes en

el tratamiento. Rapp and Gabriel-Jürgens (2003) reportaron que el género Rhodococcus sp., tiene la

capacidad de degradar hidrocarburos alifáticos de 16 carbonos. Park, et.al. (2001, 2005) reportaron

que la bacteria Vibrio furnissii es capaz de sintetizar hidrocarburos de 14 a 27 carbonos. Todos los

88

tratamientos removieron Tolueno y Xileno presente en el hidrocarburo inicial; así como,

Benzo(a)pireno y Criseno con excepción del tratamiento con VC y EL (89%R) totalmente. Los niveles

máximos de HTP’s residuales permitidos reportados en la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 indica que,

todos los suelos biotratados pueden ser considerados para uso de suelo de tipo agrícola, forestal,

recreativo y de conservación; debido a que los hidrocarburos mencionados estan por debajo de la

norma. Los tratamientos que contiene VC y EL; así como, el blanco ―b‖ aún poseen remantes de

fluoranteno, a pesar de los 10 meses de tratamiento. La estructura molecular del fluoranteno es

relativamente compleja y probablemente es más difícil se asimilar para la flora microbiana presente en

estos tratamientos.

6.6.6. Fraccionamiento de los HTP’s residuales

La concentración de las cuatro fracciones del hidrocarburo, antes y después del mejor biotratamiento,

se muestra en la Figura 40. Se muestra que el porcentaje del retiro fue relacionado con la clase de

estructura del hidrocarburo. La composición de los hidrocarburos residuales sugiere que la continuidad

de los procesos de remoción podría ser posible solamente si los nutrientes requeridos están

disponibles. Interesantemente, los procesos del bioestimulación empleados aquí, removieron

hidrocarburos de peso molecular elevado y de estructura compleja (≈35%) contenidos en un suelo de

baja porosidad. Tales resultados fueron asociados al aumento de la porosidad del suelo, debido a la

adición de vermicomposta y el efecto de los ácidos húmicos; así como, al posible co-metabolismo

presente entre la diversa fuente de microorganismos agregados, de bagacillo de caña y las lombrices..

89

Figura 40.Fraccionamiento de los HTP’s residuales antes y después del tratamiento.

90

6.6.7. Análisis Estadístico de la Fermentación Sólida del Suelo

En la Tabla 20 se muestran los resultados obtenidos del nivel de remoción de HTP’s de los

tratamientos del DEFG (Diseño Experimental Factorial General).

Tabla 20. Porcentaje de remoción de HTP’s del DEFG.

BC (%) EL (%) L %R

0 0 0 29

6 0 0 37

0 1 0 40

6 1 0 46

0 0 20 36

6 0 20 48

0 1 20 48

6 1 20 56

0 0 40 44

6 0 40 55

0 1 40 54

6 1 40 63

Empleando el Programa Design Expert versión 7 se obtuvo el Análisis Estadístico de la remoción de

HTP’s obtenido del DEFG para la fermentación sólida del suelo, para ello se obtuvo un primer

diagnóstico de efectos principales que involucra la suma de cuadrados y el ―% de Contribución‖ que

mide la contribución porcentual de cada uno de los términos del modelo a la suma de cuadrados total

(Anexo A1). Debido a que el porcentaje de contribución es con frecuencia una guía aproximada pero

efectiva de la importancia relativa de cada término del modelo, se seleccionaron aquellos términos

cercanos al 1%. Posteriormente el ANDEVA (Anexo A2), indicó que todas las variables involucradas

en el modelo son significativas; sin embargo, las interacciones BC-EL y BC-L también son

significativas.

Debido a que las interacciones BC-EL y BC-L fueron significativas, estas se graficaron.

La interacción entre BC-L, indica que la presencia de BC mejora el nivel de remoción hasta en un

33%. La presencia de EL, mejora hasta en 38% la remoción de HTP’s, como se muestra en las

Figuras 41 y 42.

91

0

10

20

30

40

50

60

70

N/BC S/BC

%R

em

oci

ón

de

HTP

's

Interacción Bagazo de Caña (BC) - Lombrices (presencia de EL)

0 lombrices 20 lombrices 40 lombrices

0

10

20

30

40

50

60

70

N/BC S/BC

%R

em

oci

ón

de

HTP

's

Interacción Bagazo de Caña (BC) - Lombrices (ausencia de EL)

0 lombrices 20 lombrices 40 lombrices

Figura 41. Interacción BC-L en presencia de EL

Figura 42. Interacción BC-L en ausencia de EL

La interacción de BC-EL, indica que las lombrices y el número de individuos presentes incrementa

significativamente la remoción de HTP’s durante el tratamiento hasta en un 52%, como se muestra en

las gráficas 43, 44 y 45.

92

0

10

20

30

40

50

60

70

80

N/BC S/BC

%R

em

oci

ón

de

HTP

's

Título del eje

Interacción Bagazo de Caña (BC) - Extracto de Leonardita (EL) (0 lombrices)

S/EL N/EL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

N/BC S/BC

%R

em

oci

ón

de

HTP

's

Título del eje


S/EL N/EL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

N/BC S/BC

%R

em

oci

ón

de

HTP

's

Título del eje


S/EL N/EL

Figura 43. Interacción BC-EL

sin lombrices


en presencia de 20 lombrices


en presencia de 40 lombrices

93

6.6.8. Monitoreo de la población microbiana

6.6.8.1. Carbono de biomasa

Esta metodología permite analizar toda la biomasa viva contenida en la muestra; es decir, bacterias,

levaduras, hongos y actinomicetos. La Figura 46, muestra la tendencia de los resultados obtenidos

durante los 94 días de tratamiento.

Figura 46. Comportamiento del carbono de biomasa para los tratamientos del DEFG, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Se observa un incremento y disminución drástica de la biomasa microbiana durante el primer mes de

tratamiento, posiblemente debida a la actividad de agua presente durante el acondicionamiento de los

tratamientos al inicio del experimento, que permite un desarrollo momentáneo de la flora microbiana

presente. La repentina disminución sugiere una preselección de la flora microbiana debido a los altos

niveles del contaminante. Después de 44 días de tratamiento se observa una recuperación aparente

94

de la actividad microbiana, que sugiere el inicio de la detoxificación del suelo, provocando como

consecuencia el establecimiento y desarrollo de microorganismos hidrocarbonoclastas más

específicos y tolerantes. Al cabo de 60 días de tratamiento se observa una recuperación de la flora

microbiana lo cual sugiere una restauración de esta.

En los blancos ―a‖ y ―c‖, el carbono de biomasa (Cb) presenta un crecimiento durante las primeras

semanas (Figura 47); sin embargo, después de este tiempo no vuelve a incrementar

significativamente. Lo cual indica la atenuación de estos sistemas. El blanco ―c‖, corresponde al

tratamiento bioestimulado con sales minerales (sulfato de amonio, como fuente de nitrógeno). Podría

decirse que estos nutrientes son tóxicos a la flora microbiana nativa del suelo. En el caso del blanco

―a‖ se esperaba que la flora microbiana se mantuviera constante a lo largo del proceso dado que solo

se le adicionó agua y por lo tanto no se tienen las condiciones nutricionales adecuadas para llevar a

cabo la remoción del contaminante.

Figura 47. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos ―a‖ y ―c‖

95

6.6.8.2. Cuenta total para Bacterias

La cuenta bacteriana mostró una variación acorde a la composición de los tratamientos (Figura 48).

Los sistemas adicionados con BC, presentaron un incremento de bacterias totals entre 108 a 10

9; sin

embargo, se vio afectada la flora hidrocarbonoclasta. El mayor incremento se observó en los sistemas

que contenían adicionalmente EL y 40 lombrices (108 UFC/g de suelo). En todos los casos la flora

microbiana total fue mayor hasta un orden de magnitud (10 veces mayor) con relación a la

hidrocarbonoclasta. La relación flora microbiana total/flora microbiana hidrocarbonoclasta se vio

disminuida en los sistemas adicionados con EL. Solo en el sistema preparado con BC, EL y 40

lombrices, la relación de floras microbianas se aproximó a 1. Detalles del efecto de la composición de

los sistemas en el crecimiento bacteriano se describen a continuación.

Nota: Únicamente se presentarán los gráficos de aquellos tratamientos representativos en donde se

observe el efecto de cada variable (S ó N/BC, S ó N/EL y S ó N/40 lombrices), ya que se observó un

comportamiento similar para aquellos tratamientos con 20 lombrices.

En la Figura 48-A se observa que la ausencia de BC, EL y lombrices mantuvo prácticamente

constante a las bacterias totals; sin embargo existió una disminución de las hidrocarbonoclastas,

probablemente por ausencia de nutrientes, lo cual se ve reflejado en el carbono de biomasa después

de 15 días. Por otra parte, la presencia de lombrices estimula la actividad microbiana total y en menor

proporción la hidrocarbonoclasta, debido a las razones explicadas con anterioridad (Figura 48-B).

El extracto de leonardita incrementa la flora microbiana hidrocarbonoclasta (Figura 48-C), debido a

que se ha demostrado que los ácidos húmicos incrementan la tolerancia de bacterias y levaduras ante

hidrocarburos aromáticos, permitiendo que se desarrollen mejor (Feificova, et. al., 2005). Este efecto

se observa entre los días 30-50, ya que el carbono de la biomasa no cae drásticamente. La presencia

de BC no mejora el crecimiento heterótrofo e hidrocarbonoclasta, pero tampoco lo perjudica (Figura

48-D).

96

Figura 48. Efecto del BC, EL y L en las cinéticas de crecimiento de las bacterias

Hidrocarbonoclastas Totales Carbono de biomasa (Cb)

A B

C D

E F

G H

97

Cuando en el tratamiento está presente tanto el BC como las lombrices, se estimula el crecimiento de

la flora microbiana total e hidrocarbonoclasta, además no se ve disminuido el carbono de biomasa

durante un largo periodo, permitiendo así una restauración de la flora microbiana en menor tiempo. La

presencia de BC y EL (Figura 48-E), mejora la flora hidrocarbonoclasta y en general evita en gran

medida el descenso del carbono de biomasa, lo que nos indica los beneficios de los ácidos húmicos.

Cuando el tratamiento posee BC, EL y lombrices (Figura 48-F), la flora hidrocarbonoclasta se ve

favorecida a lo largo del tiempo y tiende a ser prácticamente equivalente a la total. Respecto al

carbono de biomasa éste disminuye poco respecto a su valor inicial. Se observa una rápida

recuperación de la flora microbiana lo que indica que se lleva a cabo una detoxificación rápida del

suelo contaminado.

Los blancos ―a‖ y ―c‖ (Figuras 48-G y 48-H), mantuvieron una concentración de microorganismos

constante a lo largo del tiempo del tratamiento. Debido a que el blanco ―a‖ únicamente tiene agua pero

no nutrientes necesarios para remover el hidrocarburo, la flora microbiana se mantuvo en un estado

basal, por otra parte el blanco ―c‖ al poseer nutrientes en forma de sales minerales, favoreció el

crecimiento al parecer de la flora total (datos no mostrados), pero no de la hidrocarbonoclasta. De

acuerdo a las hojas de especificaciones de Merck, el sulfato de amonio puede llegar a ser tóxico para

las bacterias, de hecho advierte sobre su incorporación a suelos y acuíferos.

98

6.6.8.3. Cuenta total para Levaduras

Las levaduras presentaron un comportamiento semejante a las bacterias (Figura 49); debemos de

tomar en cuenta que conforme transcurre el tiempo del tratamiento, se van llevando a cabo

adaptaciones y substituciones de la flora microbiana.

Como se observa las levaduras tendieron a mantenerse estables conforme transcurrió el tiempo lo

cual nos puede indicar que se adaptaron al contaminante, de hecho fueron identificadas algunas de

las cepas por nuestro grupo de trabajo como Candida tropicallis y Pichia sp., géneros identificados

como degradadores de hidrocarburos (Duursma, Dowson, 1983).

Se observó en general que la ausencia de BC, EL y lombrices; es decir, únicamente el sistema

bioestimulado con vermicomposta (Figura 49-A), no afectó negativamente el crecimiento microbiano;

de hecho, hubo un crecimiento considerable de las levaduras totals presentes pero no en el caso de

las hidrocarbonoclastas; lo cual sugiere que las levaduras se encontraban posiblemente es fase de

latencia esperando las condiciones favorables para reproducirse. Este comportamiento nos indica que

las levaduras presentes en el suelo, son capaces de tolerar periodos prolongados de sequia y

carencia de nutrientes, por lo que una caracterización de estas pueden ser de gran ayuda al realizar

bioaumentación en otros suelos semejantes.

La sola presencia de lombrices favorece a las levaduras totals (Figura 49-B), pero interfiere

gradualmente con las hidrocarbonoclastas, es posible que la flora microbiana asociada al intestino de

la lombriz compita con la flora microbiana nativa del suelo y la desplace gradualmente. La sola

presencia de EL (Figura 49-C), por otro lado favorece el crecimiento de la población de levaduras

como lo ha demostrado Feificova, (2005).

99

Figura 49. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de las levaduras


A B

C D

E F

100

La incorporación de BC en los tratamientos mantiene activo el crecimiento microbiano e incrementa la

flora total (Figura 49-D), posiblemente debido a la elevada cuenta microbiana natural que posee. Si al

tratamiento se adicionan lombrices (Figura 49-E), se mejora ambos tipos de floras microbianas, lo cual

sugiere que el efecto de mezclado, aireación, distribución de nutrientes y flora microbiana por la

lombriz actúa de manera sinérgica con la presencia de la flora microbiana asociada al BC.

El EL en conjunto con BC (Figura 49-F), mejoran el crecimiento de las levaduras y los mantuvieron

casi constantes a los largo del proceso, se observa claramente el efecto sobre las levaduras totals

propiciado por el BC. Si el BC, EL y las lombrices están presentes se observa un crecimiento máximo

de las levaduras totals, lo cual refleja el sinergismo de los componentes mencionados.

101

6.6.8.4. Cuenta total para Hongos

La Figura 50 muestra la cuenta de hongos en el curso del tiempo. En general la cuenta de hongos

totales e hidrocrabonoclastas se mantuvo en el rango de 104 y 10

5, respectivamente. El máximo

crecimiento detectado fue hasta 106. Se observa que los hongos presentes en los distintos sistemas

son en su mayoría hidrocrabonoclastas. Hacia el final del tiempo de tratamientos, el tipo de hongo que

predomina es el hidrocrabonoclasta. La diferencia de la cuenta total de hongos totales e

hidrocarbonoclastas, pueden ser ocasionada por el tipo de nutrientes empleados para llevar a cabo la

cuenta total.

La evolución de los hongos se vio favorecida con el transcurso del tiempo, la mayoría de los

tratamientos comenzaron a tener un incremento en la población microbiana a partir del primer mes,

algunos investigadores (Yateem et al., 1998; Mollea et al., 2005; Mancera at al., 2007) han

demostrado la capacidad de ciertos hongos como Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus,

Trametes versicolor, Rhizopus sp., Penicillium funiculosum y Aspergillus sydowii; de mineralizar HPA’s

y HTP’s.

El crecimiento de hongos en los tratamientos solo se vio favorecido al principio de los tratamientos,

posiblemente debido a la presencia de agua, ya que en general todos los tratamientos alcanzaron un

crecimiento alrededor de las 1,000,000 UFC/g suelo seco, al cabo de 2 meses de tratamiento; por lo

que la presencia o ausencia del BC, EL o las lombrices no tuvieron un efecto muy significativo en el

crecimiento de los hongos.

102

Figura 50. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de los hongos


A B

C D

E F

103

6.6.8.5. Cuenta total para Actinomicetos

Los actinomicetos se desarrollaron en gran medida en mayor proporción a partir del primer mes

(Figura 51). Su cuenta microbiana inicial y final se encuentra dentro de los rangos reportados por

Pizzul (2006), cuyo rango es de 105-10

6 UFC/gramo de suelo. Pérez-Armendáriz (2004) reporta una

concentración de entre 107-10

8 durante la remoción de hidrocarburo en suelo. Los actinomicetos como

Streptomyces, Nocardia, etc., son capaces de generar antibióticos para limitar el crecimiento

bacteriano desfavorable, lo cual puede tener efecto negativo en el crecimiento de bacterias y

levaduras; por lo que su crecimiento puede afectar a los microorganismos que los rodean.

Figura 51. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinéticas de crecimiento de los actinomicetos.

Desempeñan un papel importante en el reciclaje del carbón orgánico y pueden degradar los polímeros

complejos. Muchas cepas tienen la capacidad de solubilizar la lignina y de degradar compuestos

relacionados con la lignina; produciendo enzimas degradadoras de celulosa/hemicelulosa; así como

104

enzimas extracelulares tipo peroxidasas, por lo que también están involucrados en la formación de

substancias húmicas.

En general las condiciones óptimas para su crecimiento son temperaturas de 25-30°C y en pH neutro

(Pizzul, 2006). La temperatura promedio de los sistemas fue de 28ºC por lo que se pudo desarrollar

las condiciones necesarias para su reproducción. Los actinomicetos poseen muchas características

que les permiten ser buenos candidatos para su uso en el biotratamiento de suelos contaminados con

agentes orgánicos. Producen enzimas extracelulares que degradan una amplia gama de compuestos

orgánicos complejos y esporas que son resistentes a la desecación. Además, su crecimiento

filamentoso con frecuencia favorece la colonización de las partículas de suelo.

Otra característica interesante dentro de este grupo de microorganismos, especialmente con respecto

a la degradación de compuestos hidrofóbicos, es su producción de tensioactivos (Pizzul, 2006). En el

caso de los actinomicetos, la actividad de sus tensioactivos es debido: a) a la producción de los

biosurfactantes extracelulares, especialmente glicolípidos, como los lípidos del trealosa producidos por

la especie de Rhodococcus o lipopeptidos producidos por una especie de Arthrobacter. Muchos

actinomicetos pueden degradar diversos agentes contaminantes, incluyendo varios pesticidas. Por

ejemplo, los miembros del género Arthrobacter degradan el 4-clorofenol, la atrazina y alaclor por

Streptomyces.

Además los actinomicetos nocardioform (e.g. Rhodococcus, Gordonia, micobacteria) son

degradadores conocidos de hidrocarburos alifáticos e HPA’s en suelo (Piñero and Rivas, 2004).

Además, en algunos sitios contaminados representan un grupo dominante entre los degradadores

(Pizzul, 2006).

105

6.6.9. Correlación de la población microbiana hidrocarbonoclasta y la remoción de HTP’s

Cada una de las variables de estudio, afecta positivamente la flora microbiana hidrocarbonoclasta y

por lo tanto se ve reflejado en los niveles de remoción de HTP’s alcanzados por los diferentes

tratamientos (Figura 52). Como se observa en la Figura 52-A, la ausencia de BC, EL y lombrices,

provocó una pérdida de la flora hidrocarbonoclasta. Después de de la segunda semana, es posible

que los nutrientes aportados por la vermicomposta se hallan consumido rápidamente por lo que

durante las primeras semanas existió cierto nivel de remoción acelerado. Si el ciclo de nitrógeno no se

regenera de la manera adecuada, existe el denominado ―robbing‖ de nitrógeno (Gotaas, 1956), por lo

que los microorganismos ya no tienen suficiente nitrógeno para crecer y por lo tanto dejan de

consumir hidrocarburo.

Es posible que las lombrices con el paso del tiempo consuman la flora microbiana nativa, las cuales

no están es las mejores condiciones ambientales para reproducirse; por lo que la remoción se

favorece pero a largo tiempo. El EL al favorecer el crecimiento microbiano (Figura 52-B), permite que

estas actúen poco a poco sobre el contaminante permitiendo tolerar mejor los contaminantes

(Ferficova, 2005), es posible y de acuerdo a Nieman (1998) que parte de los hidrocarburos se hayan

incorporado a las substancias húmicas.

Cuando está presente el BC (Figura 52-C), se mejora el crecimiento de la flora microbiana

hidrocarbonoclasta durante las primeras semanas, pero estas después se atenúan indicando que

existe probablemente una sucesión microbiana o existe hidrocarburos más recalcitrante o tóxicos. La

presencia simultánea del BC y lombrices (Figura 52-D), ejercen un efecto sinérgico en la remoción de

hidrocarburos, lo cual se ve reflejado en un incremento en la remoción de HTP’s.

106

Figura 52. Correlación entre el crecimiento microbiano y la remoción de HTP’s, ante la presencia o ausencia de BC, EL y L

Hidrocarbonoclastas Remoción de HTP’s

A B

C D

E F

G H

107

El EL y el BC, permiten que la flora microbiana sea más activa durante todo el proceso (Figura 52-E),

lo cual nos indica por un lado que los ácidos húmicos, favorecen la remoción de los hidrocarburos ya

sea por efecto directo sobre la flora microbiana o por su acción fisicoquímica sobre estas moléculas; y

por otro lado la presencia de bagazo de caña al estimular la flora microbiana debido a las presencia de

su elevada flora microbiana hidrocarbonoclasta. Si además están presentes las lombrices se obtiene

las mejores condiciones para la remoción (Figura 52-F).

La ausencia del VC, BC, EL y lombrices (Figura 52-G); mantiene constante la flora microbiana nativa,

pero a pesar de esto, es probable que esta no sea lo suficientemente especializada como para llevar a

cabo la remoción; ya que, esta flora microbiana está presente desde tiempo atrás. Por lo tanto ésta ya

esta aclimatada a las condiciones del suelo, pero aún con la adición de nutrientes salinos

(Figura 52-H) no se mejora la remoción por lo que este suelo requirió la presencia de la flora

microbiana proporcionada el BC, EL y lombrices, para llevara a cabo la remediación del suelo.

108

6.6.10. Formación de ácidos húmicos

La formación y descomposición de ácidos húmicos (AH’s), se lleva a cabo de manera natural en los

suelos; sin embargo, la cantidad presente está influenciada por el tipo y cantidad de materia orgánica;

así como, de la flora microbiana presente. Se ha mencionado el rol de los AH’s a nivel biológico y

fisicoquímico en los procesos de remoción de HTP’s en los tratamientos; sin embargo, debemos de

tomar en cuenta la síntesis de éstos y su evolución a lo largo del tiempo, en cada tratamiento en

particular; ya sea, de los AH’s nativos o los adicionados de manera exógena.

Es imprescindible la síntesis de AH’s para que los sistemas funcionen mejor. Se ha demostrado que la

incorporación exógena de AH’s permite en general incrementar los niveles de remoción en función al

tipo de hidrocarburo presente (Mosley, 1998). Además permiten que se generen más AH’s en menor

tiempo, debido tal vez a que funcionan como céntros de nucleación, a partir de los cuales los

microorganismos presentes los emplean en reacciones redox (Field and Cervantes, 2005), pero a la

vez reaccionan con moléculas orgánicas presentes lo que contribuye a que se formen en mayor

cantidad y complejidad.

Las Figuras 53 y 54, indican cómo afectan positivamente las variables en estudio en la formación de

AH’s, durante el tiempo de tratamiento. La presencia de BC o las lombrices o ambos, incrementa

hasta en un 100% la síntesis, respecto a los AH’s nativos.

109

Figura 53. Síntesis de AH’s para los tratamientos sin EL del DEFG, a lo largo del proceso.

Figura 54. Síntesis de AH’s para los tratamientos con EL del DEFG, a lo largo del proceso.

110

6.6.11. Correlación de la formación de ácidos húmicos y la remoción de HTP’s

A pesar de que la VC incorpora una pequeña cantidad de AH’s (0.03%) parece no ser suficientes

como para incrementar los niveles basales de AH’s presentes en el suelo (0.5%) (Figura 55). La

presencia de lombrices incrementa la generación de AH’s, estudios llevados a cabo por Pramanik

(2007) en sistemas de vermicompostas empleando la lombriz Eisenia foetida, indican que existe

formación de AH’s aún cuando el alimento para la lombriz este desprovisto de estos. La diversa flora

microbiana asociada al intestino de la lombriz, puede ser la causante de su formación acelerada de

AH’s; ya que, en un sistema de composta su generación es casi la mitad. En el presente estudio el

incremento de AH’s puede estar relacionado a la remoción de HTP’s, ya que estos pueden

interaccionar con los hidrocarburos.

Se observó que en los tratamientos adicionados con BC (Figura 55-D), incremento la síntesis de AH’s

en un 25%. Los AH’s se generan a partir de restos de células animales, vegetales y bacterianas;

algunas hipótesis de su síntesis podría ser a partir de la lignina, que es un polisacárido presente en el

BC en un 20% aproximadamente, por lo que la presencia de éste puede propiciar la formación de más

AH’s. La presencia de lombrices pude incrementar un 60% la formación de AH’s (Figura 55-B). El

efecto combinado de la presencia de BC y lombrices puede incrementar hasta un 87% la generación

de AH’s. Los tratamientos adicionados únicamente con AH’s en forma de extracto de leonardita

(Figura 55-C), se incrementa la formación de estos y se mejora los niveles de remoción de HTP’s,

únicamente se adicionó 1% (40g por tratamiento) de AH’s a este tratamiento, por lo que la flora

microbiana hidrocarbonoclasta incorporada por estos, es muy baja en comparación, por ejemplo de la

VC que se adicionó alrededor de 600g o el BC con 250g. Se asume que los incrementos de HTP’s

removidos fue gracias a las interacciones de tipo fisicoquímico (Perminova, 2006; Saparpakorn 2007)

sobre los hidrocarburos presentes y el efecto de amortiguación ante condiciones adversas que

imparten estos (Mosley R. 1998). La Figura 55, indica el efecto sinérgico ocasionado por cada una de

las variables presentes en cada tratamiento en específico. La formación de ácidos húmicos se

mantuvo constante en el caso de los blancos ―a‖ y ―c‖ (alrededor de 0.5%), debido a que no existieron

las condiciones necesarias para poder sintetizarlos.

111

Figura 55. Correlación entre la formación de ácidos húmicos y la remoción de HTP’s, ante la presencia o ausencia de BC, EL y L

Ácidos Húmicos Remoción de HTP’s

A B

C D

E F

112

6.7. Lavado de suelo con substancias húmicas

6.7.1. Análisis Estadístico de la remoción HTP’s del suelo lavado

En la Tabla 21 se muestran los porcentajes de HTP’s removidos mediante lavado de suelos con

ácidos húmicos de acuerdo al diseño experimental planteado.

Tabla 21. Porcentaje de remoción de HTP’s del DEFC para el lavado de suelo.

EL (g) Suelo (g) Agua (ml) Concentración

del EL (g/L) %R

0.1 5.0 50.0 2.0 3.1

1.0 5.0 50.0 20.0 16.5

10.0 5.0 50.0 200.0 22.5

0.1 10.0 50.0 2.0 45.3

1.0 10.0 50.0 20.0 1.0

10.0 10.0 50.0 200.0 1.0

0.1 15.0 50.0 2.0 50.1

1.0 15.0 50.0 20.0 16.2

10.0 15.0 50.0 200.0 34.5

0.1 5.0 100.0 1.0 0.3

1.0 5.0 100.0 10.0 19.4

10.0 5.0 100.0 100.0 12.1

0.1 10.0 100.0 1.0 3.9

1.0 10.0 100.0 10.0 33.4

10.0 10.0 100.0 100.0 8.1

0.1 15.0 100.0 1.0 30.2

1.0 15.0 100.0 10.0 11.8

10.0 15.0 100.0 100.0 20.2

0.1 5.0 150.0 0.7 1.0

1.0 5.0 150.0 6.7 1.0

10.0 5.0 150.0 66.7 7.4

0.1 10.0 150.0 0.7 1.7

1.0 10.0 150.0 6.7 13.8

10.0 10.0 150.0 66.7 1.0

0.1 15.0 150.0 0.7 19.6

1.0 15.0 150.0 6.7 21.2

10.0 15.0 150.0 66.7 5.0

1.0 10.0 100.0 10.0 33.4

Para poder determinar si las variables en estudio son significativas estadísticamente y si tiene un

efecto significativo, se llevó a cabo el análisis estadístico.

113

Empleando el Programa Design Expert versión 7 se obtuvo el análisis de estadístico del experimento

del porcentaje de remoción de HTP’s después del lavado del suelo, para ello se obtuvo un primer

diagnóstico de efectos principales que involucra la suma de cuadrados y el ―% de Contribución‖ que

mide la contribución porcentual de cada uno de los términos del modelo a la suma de cuadrados total

(Anexo A3). De acuerdo al análisis de datos, se sugiere un modelo factorial 2FI. Posteriormente el

ANDEVA, indicó que todas las variables involucradas en el modelo son significativas; sin embargo, la

interacción EL-S fue significativa. A continuación se analizaron las graficas de interacciones, así como,

la de los residuales (Anexo A4).

Debido a que la interacción EL-S fue significativa, esta se graficó.

La interacción entre S-EL a niveles de concentración bajos; es decir, 2g/L permite obtener el mayor

nivel de remoción de HTP’s como se observa en las Figuras 56, 57 y 58.

Figura 56. Superficie de respuesta de la interacción S-EL, en presencia de 50ml de agua.

114



115

En este estudio se trabajaron concentraciones que van desde las 666ppm hasta las 200,000ppm.

Estas concentraciones se establecieron en base al trabajo realizado por (Conte, 2005; Quagliotto, et.

al., 2006), el cual es el trabajo más reciente que indica por primera vez que un surfactante natural no

tóxico como los ácidos húmicos (HA) aislados de leonardita, son capaces de remover cantidades

similares de hidrocarburos en suelos contaminados, tal y como lo hace un surfactante sintético. En

este trabajo se emplearon concentraciones de 10ppm basándose en el trabajo de Guetzloff and Rice,

1994., a pesar de que éste indica que los ácidos húmicos (de síntesis química de Aldrich) poseen la

capacidad de generar micelas y solubilizar DDT (hidrofóbico) a una concentración de 7.4g/L. Este

último artículo es cuestionado debido a que el empleo de la solubilidad como único factor para

determinar la concentración micelar crítica (CMC) puede ser cuestionado. Cuando se adiciona un

agente tensioactivo al agua, éste comienza a desplazar a las moléculas de agua, evitando su unión

mediante puentes de hidrógeno, dando como consecuencia una disminución de la tensión superficial.

La CMC es el punto en el cual la superficie del liquido (en este caso agua), se encuentra

completamente saturada del componente en estudio y la adición de una molécula mas de este

compuesto genera la formación de micelas con la capacidad de incorporar en su centro hidrofóbico

moléculas hidrofóbicas como los HPA’s (Wandruszka, 2000). Las pruebas hidrofóbicas tienden a

interaccionar con los núcleos aromáticos y complejos de los ácidos húmicos y por lo tanto los valores

de la CMC para un compuesto en específico depende de su solubilidad. Sin embargo existen otros

artículos que mencionan una CMC tan baja como 4mg/L Quagliotto, et. al. (2006).

6.7.2. Determinación de la Concentración Micelar Crítica (CMC) del EL en solución

Graficando la disminución de la tensión superficial contra la concentración del EL en solución, se

observa un comportamiento asintótico, del cual para poder determinar la CMC es necesario interpolar

este comportamiento y leer el valor obtenido en el eje de las abscisas (método empleado por diversos

investigadores como Salager, 1993; Wandruszka and Young, 2001; Liang, 2007). De acuerdo a los

resultados obtenidos se determinó la CMC del EL en 2g/L; este resultado estuvo de acuerdo al

obtenido mediante el DEFC planteado para el lavado de suelo contaminado. Por debajo de la CMC es

116

como si solo existiera agua en el tratamiento; sin embargo, por encima las micelas se deforman y

pierden sus cualidades de emulsificar moléculas hidrofóbicas; por esta razón al disminuir o

incrementar la concentración de EL en solución, se disminuyó la capacidad de ―disolver‖ el

hidrocarburo.

Se empleó un tensiómetro (LAUDA - TD1C), para determinar la Concentración Micelar Crítica (CMC)

del EL en solución obteniéndose el comportamiento que muestra la Figura 59.

Figura 59. Determinación de la CMC del EL.

De acuerdo al ANOVA del DEFC del lavado de suelo, en promedio se removió un 30% de HTP’s a

concentraciones de 2g/L de EL en una relación 10:1 (solución de ácidos húmicos:suelo); por lo tanto

está relación se empleó para llevar a cabo el lavado de 10Kg de suelo contaminado para llevar a cabo

la fermentación sólida del suelo lavado (se empleo una concentración de 3g/L, como medida de

seguridad). La Tabla 22, indica la cantidad de hidrocarburo removido durante el lavado de 10Kg de

suelo; así como, la cantidad de hidrocarburos en cada fracción que se obtuvo como consecuencia del

117

proceso. Se removió 35.7% de HTP’s, nivel semejante al obtenido en el diseño experimental,

planteado para el lavado de suelo con ácidos húmicos (DEFC).

Tabla 22. HTP’s removidos mediante lavado con ácidos húmicos.

Durante el proceso de lavado, las partículas de suelo de menor diámetro formaron una especie de

―emulsión‖ estable (favorecida por la presencia de ácidos húmicos), la cual solo pudo ser rota por

centrifugación, con lo cual se obtuvo un lodo. El análisis de HTP’s contenidos en esta especie de

―lodo‖ arrojó valores altos de HTP’s (30000 mg HTP’s/Kg de suelo).

El nivel de remoción está en función del tipo de contaminante, la intemperización y el tipo de

surfactante empleado. Estudios realizados por nuestro grupo de trabajo (datos no mostrados)

indicaron que los ácidos húmicos son capaces de ―solubilizar‖ 0.2g de hidrocarburo libre de asfalteno

de este suelo a una concentración de 0.2% de EL en un volumen de 50ml, en menor tiempo y con

mayor eficiencia que los surfactantes sintéticos SDS, Tritón X100 y Tergitol. Conte, et. al. (2005)

también empleó ácidos húmicos para remover una contaminación de 5000ppm de HPA’s en

comparación con SDS, Tritón X100 y agua; demostrando que los tres surfactantes remueven

cantidades semejantes de HPA’s (alrededor de 60%, siendo ligeramente mejor los ácidos húmicos).

Cho, et. al. (2002) realizó un estudio sobre la capacidad de los ácidos húmicos para mejorar la

biodisponibilidad de los HPA’s (naftaleno, fenantreno y pireno) en comparación con los surfactantes

sintéticos SDS y Tritón X100, indicando que los ácidos húmicos fueron más eficaces. Bhandari et. al.

(2000) quienes aplicaron Citrikleen ® para llevar a cabo el lavado de 20000ppm de diesel lograron

remover 65% de éste contaminante. Torres, et. al. (2005) contaminó suelo 100000ppm de petróleo del

Batab (Campeche, México), el cual fue lavado con SDS y E600 al 1%. Estos autores determinaron

niveles de remoción de 20.4-32.9%.

118

Balcke, et. al., (2005) ha demostrado que los ácidos húmicos pueden recubrir diversas partículas o

arcillas, debido a las diversas cargas que poseen (Figura 60). Esta propiedad es de interés para

aplicar los ácidos húmicos en la elaboración de soportes inertes para realizar biorremediación in-situ.

Figura 60. Posible interacción de los ácidos húmicos con las moléculas de suelo y HTP’s, que permitió la formación de un ―lodo‖

en el lixiviado.

119

6.8. Fermentación Sólida del Suelo Lavado

6.8.1. Remoción de HTP’s debido al lavado de suelo

El suelo lavado, se acondicionó de acuerdo al mejor tratamiento del DEFG de la fermentación sólida

del suelo: BC, EL y 40 lombrices. La cinética de HTP’s removidos se muestra en la Figura 61.

Figura 61. Cinética de remoción de HTP’s del suelo lavado en comparación con los blancos y el mejor tratamiento del DEFG.

Se puede apreciar que a pesar de que el proceso de lavado permitió remover 36% de HTP’s

(20000 mg HTP’s/Kg de suelo), el desempeño del biotratamiento es inferior. Se había considerado

que el lavado previo del suelo permitiría incrementar la eficiencia del biotratamiento y como

consecuencia disminuir el tiempo remoción del contaminante. No obstante, se asume que es posible

que se haya eliminado parte de la flora microbiana hidrocarbonoclasta; así como, nutrientes presentes

en el suelo. En este sistema nacieron 40 lombrices y no hubo muerte de las lombrices incorporadas

120


0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095

1 semana 2.16 1.67 2.89 3.71 0.36

1 mes 0.88 0.7 1.29 1.22 0.32

2 meses 0.67 0.72 0.81 0.95 0.26

3 meses 0.46 0.57 0.57 0.67 0.2

N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20 Blanco (a)

0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095

1 semana 3.55 1.56 3.38 3.81 0.32

1 mes 0.81 0.77 1.03 1.21 0.2

2 meses 0.54 0.71 0.7 0.85 0.14

3 meses 0.37 0.51 0.5 0.58 0.14

N/BC, N/EL, 0

Blanco (b)

0 dias 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095

1 semana 1.03 0.9 2.76 3.42 0.27

1 mes 0.53 0.6 0.86 1.01 0.38

2 meses 0.38 0.65 0.54 0.65 0.25

3 meses 0.3 0.42 0.34 0.45 0.24

N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0 Blanco (c)

inicialmente, lo cual sugiere la eliminación de hidrocarburos tóxicos para está durante el proceso de

lavado; no obstante, hubo una dramática disminución en la velocidad de remoción.

En la Figura 61 se observar que el lavado de suelo provocó una fuerte disminución en la velocidad de

remoción de HTP’s durante la primera semana, incrementando de 0.092 mgHTP’s/cm3•día (nivel

basal) a solo ≈0.36 mgHTP’s/cm3•día. Estas velocidades de remoción están entre las reportadas por

Bossert and Bartha (1984); ya que indican que para suelos contaminados con 5000 a 10000 ppm de

HTP’s han determinado velocidades de remoción entre 0.08 y 1.38 mgHTP’s/cm3•día. En la Tabla 23,

se indica la evolución en la velocidad de remoción de HTP’s a lo largo de los 94 días de tratamiento.

Se observa que en todos los tratamientos la tasa de remoción fue superior a las reportadas por

Bossert and Bartha, 1984; a excepción de la obtenida con el suelo lavado. Este último valor es

prácticamente igual al obtenido con el blanco ―c‖ (bioestimulado con sales minerales). Este hecho

puede ser debido a que se removieron hidrocarburos más fácilmente asimilables.

Tabla 23. Velocidad de remoción de HTP’s (mgHTP’s/cm3•día) durante el tratamiento (94 días)

Conversiones valor/1.43 = mgHTP’s/g•día; (valor×1000)/1.43 = mgHTP’s/día

La Tabla 24 muestra un resumen condensado de los HTP’s residuales; así como, los porcentajes de

remoción alcanzados por los 12 tratamientos en un periodo de 94 días, incluyendo los 2 blanco

adicionales y el suelo lavado; en la Figura 62 se muestra a manera de resumen los HTP’s residuales.

Como era de esperarse y en comparación con el blanco ―b‖, el suelo lavado incremento en un 62% la

121



N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20 Blanco "a"


N/BC, N/EL, 0 N/BC, S/EL, 0 S/BC, N/EL, 0 S/BC, S/EL, 0 Blanco "c"

Blanco "b"


remoción de HTP’s, un 260% en comparación con el blanco ―a‖ y un 100% con relación al blanco ―c‖.

A pesar de estos incrementos en los niveles de remoción y con relación a los tratamientos control, su

desempeño fue inferior debido a que removió 30% menos HTP’s que el mejor tratamiento del suelo sin

lavar. Realizar este tratamiento; aparte de ser más costoso, equivale a incorporar 40 lombrices

únicamente; EL y 40 lombrices; BC y 40 lombrices ó BC y EL, de los cuales el más económico y viable

sería la incorporación de BC y EL.

Tabla 24. Porcentaje de remoción de HTP’s al termino del tratamiento (94 días).

Blanco ―a‖ Suelo al 60% de la CRA-S

Blanco ―c‖ Suelo al 60% de la CRA-S; bioestimulado con sales minerales

Figura 62. Hidrocarburos totales del petróleo remanentes antes del tratamiento y después de éste.

122

día de inicio

disminución HC Totales HC teóricos removibles %R de los HC del tratamiento

eficiencia % R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos) (HC libres de Asfaltenos)

N/BC, N/EL, 0

Blanco (b)

N/BC, N/EL, 20 36 30 47 83

N/BC, N/EL, 40 44 41 63 93

S/BC, N/EL, 0 36 32 51 86

S/BC, N/EL, 20 44 44 67 91

S/BC, N/EL, 40 44 50 78 92

N/BC, S/EL, 0 44 33 50 82

N/BC, S/EL, 20 44 47 72 97

N/BC, S/EL, 40 44 44 68 82

S/BC, S/EL, 0 44 39 60 84

S/BC, S/EL, 20 63 54 83 97

S/BC, S/EL, 40 63 61 93 96

SL 63 46 70 95

Blanco (a) 83 11 17 83

Blanco (c) 83 19 29 81

863022 19

6.8.2. Eficiencia de remoción de HTP’s en los diferentes los tratamientos

La eficiencia de remoción de HTP’s disminuyó a las pocas semanas o se extendió a meses, si

consideramos el porcentaje de remoción de hidrocarburos de cada tratamiento de manera individual

como 100% la eficiencia comenzó a disminuir a partir del día ―x‖, como muestra la Tabla 25.

Tabla 25. Periodo de tiempo a partir del cual comenzó la disminución de la eficiencia de remoción para cada tratamiento.

El tratamiento del suelo lavado acondicionado con VC, BC, EL y 40 lombrices es eficiente hasta el día

63 indicando que el efecto de todas las variables involucradas mantiene activo a este sistema por un

periodo prolongado de tiempo; sin embargo, alrededor del día 44 se tiene un nivel de remoción del

80% de su tratamiento lo que nos indica que puede existir un rompimiento de una flora microbiana

compleja o consorcio altamente degradador de hidrocarburos de este tratamiento. La remoción para

este tratamiento es creciente a los largo de todo el proceso, pero muy lenta como se indico

anteriormente.

123

HC Totales HC teóricos removibles

% R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos)

N/BC, N/EL, 0

Blanco (b)

N/BC, N/EL, 20 35 55

N/BC, N/EL, 40 43 68

S/BC, N/EL, 0 34 56

S/BC, N/EL, 20 48 73

S/BC, N/EL, 40 57 84

N/BC, S/EL, 0 42 61

N/BC, S/EL, 20 51 74

N/BC, S/EL, 40 57 84

S/BC, S/EL, 0 43 71

S/BC, S/EL, 20 58 86

S/BC, S/EL, 40 64 98

SL 47 73

Blanco (a) 13 20

Blanco (c) 23 36

28 45

6.8.3. Niveles de remoción de HTP’s libres de la fracción de asfaltenos

Si a la concentración inicial de HTP’s de 69000ppm de los tratamientos, le restamos la fracción

recalcitrante representada por los asfaltenos (35%), la concentración teórica de HTP’s removible sería

de 44850ppm, los niveles de remoción se muestran en la Tabla 26.

Tabla 26. Niveles de remoción de HTP’s en función de la presencia de asfaltenos.

Se ha indicado la importancia de la presencia de cada uno de los componentes de los tratamientos y

el efecto que implicó su presencia; por lo que los resultados reflejan que se puede mejorar y disminuir

el tiempo de remoción de HTP’s de este suelo contaminado aún cuando este ha sido lavado, pero se

obtiene un 73% de remoción de la fracción libre de asfalteno. En este tratamiento los asfaltenos

remantes siguieron siendo unas 22400ppm, que son aproximadamente un 33% de asfaltenos en el

suelo contaminado lavado, lo cual demuestra que el lavado de suelo eliminó cierta flora microbiana,

hidrocarburos o nutrientes indispensables para llevar a cabo una remoción mayo de la fracción

asfáltica.

124

Suelo inicial HTP's Asfaltenos SL (ántes) %R SL (después) %R

Tolueno* 163.4 * 65.1 60 N/D

Xileno* 46.1 N/D N/D

C12* 187.9 193.7 3 N/D

C14* 162.3 70.1 57 N/D

Acenafteno* 111.2 N/D N/D

C16* 173.1 N/D N/D

Antraceno* 182.2 94.1 48 75.0 59

C18* 294.1 N/D 141.1 52

Fenantreno* 731.3 * 103.7 86 N/D

C20* 780.4 * N/D N/D

Fluoranteno* 959.6 * N/D 393.4 59

C22* 931.6 * N/D 589.5 37

C24* 1038.7 * 607.4 42 N/D

Criseno* 569.3 * N/D N/D

C26* 1883.4 1116.1 41 904.6 52

C28* 1255.7 * 272.8 78 210.0 83

Benzo(a)pireno* 703.5 * 558.3 21 N/D

C30* 181.1 N/D N/D

señales

cromatográficas 18 9 9 6

identificadas

señales


totales

mg*/Kg de suelo

Para conocer el tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en la fracción libre de asfalteno, las

muestras fueron analizadas mediante cromatografía de gases obteniéndose los resultados que se

muestran en la Tabla 27.

Tabla 27. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales, para el suelo lavado.


El proceso de lavado de suelo permitió eliminar Xileno, Acenafteno, Fluoranteno, Criseno; así como,

algunos hidrocarburos alifáticos de cadena larga, pero no del todo al Antraceno, Fenantreno y al

Benzo(a)pireno. Se ha indicado la capacidad que tiene los ácidos húmicos de ―solubilizar‖ los

hidrocarburos libres de la fracción asfáltica y como estos actúan sobre los HPA’s; por lo que se

esperaba que fueran capaces de interaccionar con algunas de estas moléculas; no obstante el nivel

125

de remoción del 36% de HTP’s se detectaron 80 señales cromatográficas no identificadas, que nos

indica que este suelo aún está muy contaminado.

Por otro lado, el nivel de remoción obtenido por el tratamiento de suelo lavado que contiene VC, BC,

EL y 40 lombrices después de la fermentación sólida, permitió eliminar por completo los hidrocarburos

Criseno y Benzo(a)pireno considerados por la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 como hidrocarburos

prioritarios tóxico. Aún existe la presencia de 40 señales cromatográficas no identificadas para este

tratamiento lo que indica que aún existen diversos hidrocarburos recalcitrantes. Aun existe la

presencia de Antraceno y Fluoranteno, los cuales son hidrocarburos carninogénicos, aunque en

menor concentración; así como, la presencia de hidrocarburos alifáticos de cadena larga debido

posiblemente como consecuencia de la degradación de hidrocarburos más complejos. Los perfiles

cromatograficos superpuestos de este tratamiento, de los asfaltenos y de los HTP’s inciales

(Figura 63), indican que los hidrocarburos remantes pueden ser muy semejantes a los encontrados en

los asfaltenos, si consideramos la degradación de estos; ya que, pueden liberar hidrocarburos muy

diversos (Martín-Gila et al., 2007). Se observa una señal cromatográfica a los 44.6min muy elevada la

cual no fue identificada; sin embargo, de acuerdo a los hidrocarburos presentes ántes y despés de

esta señal puede corresponder al pentacosano (C25).

Figura 63. Perfil cromatográfico del tratamiento del suelo lavado acondicionado con VC, BC, EL y 40 lombrices en comparación

con la muestra inicial y los asfaltenos.

126

Esta ―generación‖ de hidrocarburos de cadena larga en comparación con el suelo lavado pueden tener

un origen natural, más que de origen antropogénico. Duursma and Dowson, (1983), nos indica que

pueden ser producto de biosíntesis de hidrocarburos por las bacterias presentes en el tratamiento ya

que estas pueden producir hidrocarburos alifáticos con cadenas de entre 13 y 31 carbonos. Conforme

a la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003, el tratamiento del suelo lavado se pueden considerar para su

uso de suelo de tipo agrícola, forestal, recreativo y de conservación; debido a que los hidrocarburos

mencionados estan por debajo de la norma.

6.8.4. Fraccionamiento de los HTP’s residuales

El proceso de lavado permitió remover cerca del 60% y 30% de la fracción alifática y aromática

respectivamente (Figura 64). De acuerdo a experimentos previos, realizados por el grupo de trabajo;

se observó la capacidad de los ácidos húmicos, de ―solubilizar‖ a los hidrocraburos libres de

asfaltenos provenientes de este suelo contaminado. De acuerdo a las propiedades fisicoquímicas de

los ácidos húmicos se esperaba que durante el proceso de lavado, estos tuvieran cierto grado de

interacción del contaminante. Se nota una fuerte interacción sobre hidrocraburos de cadena lineal

sobre los aromáticos.

La concentración de las cuatro fracciones del hidrocarburo, antes y después del mejor biotratamiento,

se muestra en la Figura 65. Se muestra que el porcentaje del retiro fue relacionado con la clase de

estructura del hidrocarburo. La composición de los hidrocarburos residuales sugiere que la continuidad

de los procesos de remoción podría ser posible solamente si los nutrientes requeridos están

disponibles. Interesantemente, los procesos del bioestimulación empleados aquí, removieron

hidrocarburos de peso molecular elevado y de estructura compleja (≈ 35%) contenidos en un suelo de

baja porosidad. Tales resultados fueron asociados al aumento de la porosidad del suelo, debido a la

adición de vermicomposta y el efecto de los ácidos húmicos; así como, al posible co-metabolismo

presente entre la diversa fuente de microorganismos agregados, de bagacillo de caña y las lombrices.

127

Figura 64. Fraccionamiento de los HTP’s del suelo lavado antes y después del biotratamiento.

Figura 65. Fraccionamiento de los HTP’s del suelo lavado biotratado y el mejor biotratamiento del suelo sin lavar.

128

6.8.5. Monitoreo de la población microbiana

6.8.5.1. Carbono de biomasa (Cb)

La Figura 66, muestra la tendencia de los resultados obtenidos durante los 94 días de tratamiento.

Figura 66. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos y el suelo lavado.

El suelo lavado presentó un comportamiento muy similar a los obtenidos para la fermentación sólida

del suelo sin lavar del DEFG (Diseño experimental factorial general), a pesar de que mostró

incremento el carbono de biomasa significativo durante las primeras semanas no se recuperó después

de los 20 días de tratamiento, indicando que la flora microbiana presente fue muy pobre ó los

microorganismos indispensables que formaban parte de consorcios fueron eliminados durante el

proceso de lavado.

129

6.8.5.2. Cuenta total para Bacterias y Carbono de biomasa (Cb)

La flora hidrocarbonoclasta total con el tiempo fue disminuyendo (Figura 67), lo cual se ve reflejado en

el carbono de biomasa, como consecuencia de este descenso el nivel de remoción de HTP’s fue muy

lento y muy pobre (Figura 68).

Figura 67. Efecto del lavado de suelo en las bacterias del tratamiento.

Figura 68. Efecto del lavado de suelo en el nivel de remoción de HTP’s.

130

6.9. Tratamiento del Lixiviado

Este lixiviado presentó la formación de una capa grasosa y viscosa, lo que sugiere la formación de

una biopelícula de microorganismos y la presencia de hidrocarburos en su superficie (Figura 69). Este

fue tratado inyectándole aire para favorecer la remoción de los hidrocarburos remanentes. Como se

indicó anteriormente el lixiviado tuvo una concentración de 3000ppm.

Figura 69. Lixiviado del proceso de lavado.

Para conocer el tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en el lixiviado, las muestras fueron

analizadas mediante cromatografía de gases obteniéndose los resultados que se muestran en la

Tabla 28. Únicamente se detectaron los hidrocarburos Fluoranteno, C24 y C26, los cuales se

encontraban en mayor concentración en el suelo antes del tratamiento. Debido a la dilución que hubo

sobre el contaminante del suelo durante el proceso de lavado (100 litros de solución de ácidos

húmicos: 10 kilogramos de suelo contaminado) por lo que es posible que los hidrocarburos

monitoreados no se hayan detectado. Después del tratamiento del lixiviado, no se detectaron los

hidrocarburos monitoreados. No obstante se detectaron 6 señales cromatográficas, lo cual sugiere

que sean hidrocarburos recalcitrantes. La concentración final de hidrocarburos en la muestra fue de

250ppm.

131

Suelo inicial HTP's Asfaltenos SN (ántes) %R SN (después) %R

Tolueno* 163.4 * N/D N/D

Xileno* 46.1 N/D N/D

C12* 187.9 N/D N/D

C14* 162.3 N/D N/D

Acenafteno* 111.2 N/D N/D

C16* 173.1 N/D N/D

Antraceno* 182.2 N/D N/D

C18* 294.1 N/D N/D

Fenantreno* 731.3 * N/D N/D

C20* 780.4 * N/D N/D

Fluoranteno* 959.6 * 270.8 72 N/D

C22* 931.6 * N/D N/D

C24* 1038.7 * 553.4 47 N/D

Criseno* 569.3 * N/D N/D

C26* 1883.4 781.8 58 N/D

C28* 1255.7 * N/D N/D

Benzo(a)pireno* 703.5 * N/D N/D

C30* 181.1 N/D N/D

señales


identificadas

señales


totales

mg*/Kg de suelo

Tabla 28. Tipo y concentración de hidrocarburos residuales, para el lixiviado


La Figura 70, muestra los perfiles cromatográficos obtenidos de lixiviado antes y después del

tratamiento. El lixiviado tratado no mostró casi hidrocarburos. Lo cual sugiere que durante el proceso

de lavado, se incorporaron microorganismos hidrocarbonoclastas contenidos en el suelo e el lixiviado,

lo que permitió remover los hidrocarburos

132

Figura 70. Perfil cromatográfico del lixiviado antes (A) y después (B) del tratamiento.

133

7. CONCLUSIONES

Caracterización de los materiales

Todos los materiales empleados presentaron crecimiento microbiano hidrocarbonoclasta, lo

cual indica que cada material puedo contribuir a la remoción de HTP’s del suelo contaminado.

Selección de la fuente de nitrógeno

La lombriz Eisenia andrei, no sobrevive a la relación C/N: 10 ó 25, adicionando sulfato de

amonio, nitrato de sodio, nitrato de potasio o urea, como fuente de nitrógeno, propuesta para

la remoción de hidrocarburos de este suelo.

Fermentación sólida del suelo

Se obtuvo un 63% de remoción de HTP’s con el tratamiento adicionado con BC, EL y 40

lombrices, en un periodo no mayor a 3 meses.

Se removieron los hidrocarburos alifáticos en un 85.5%, los policíclicos aromáticos en un

78.4%, los saturados en un 73.2%y los asfaltenos en un 35.8%; con el tratamiento adicionado

con BC, EL y 40 lombrices.

El empleo de VC como bioestimulante, permite una remoción del 23% de HTP’s.

La presencia de Bagacillo de caña y Extracto de Leonardita en los tratamientos, mejora la

remoción de hidrocarburos e incrementa la actividad de la flora microbiana.

Los niveles de remoción de hidrocarburos se ven favorecidos ante la presencia de la lombriz y

mejora con el número de individuos presentes en presencia de alimento.

134

Lavado de suelo con ácidos húmicos

Se removió un 35.7% de HTP’s mediante el proceso del lavado con ácidos húmicos (Con una

concentración de 2g/L de Extracto de Leonardita), 65% del total de hidrocarburos extraíbles

del suelo.

Fermentación sólida del suelo lavado

Se obtuvo un 47% de remoción de HTP’s con el tratamiento adicionado con BC, EL y 40

lombrices, en un periodo no mayor a 3 meses.

Se removieron los hidrocarburos alifáticos en un 69.9%, los policíclicos aromáticos en un

64.3%, los saturados en un 52.6%y los asfaltenos en un 15.7%; con el tratamiento adicionado

con BC, EL y 40 lombrices.

La velocidad de remoción de HTP’s se ve seriamente afectada por el proceso de lavado,,

siendo 10 veces menor que el mejor biotratamiento de suelo sin lavar, bajo las mismas

condiciones.

135

8. BIBLIOGRAFÍA

Abiola A. y Olenyk, M. (1997). Effects of amendment surfactants on bioremediation of hydrocarbon

contaminated soil by composting. 34th. Annual Soil Science Workshop.

Achazi, R., Flenner, G, Livingstone, D., Peters, L., Schaub, K., and Schiwe, E. (1998). Cytochrome

p450 and dependent activity in unexposed and PAH-exposed terrestrial annelids. Comparative

Biochemistry and Physiology Part C, 121:339-350.

Ajmal M., Khan A.H., Ahmad S., Ahmad A. (1998). Role of sawdust in the removal of copper (II) from

industrial wastes. Wat. Res. 32(10): 3085-3091.

Alexander, M. (1994). Biodegradation and bioremediation. Academic Press, San Diego. 302 pp.

Atlas, R. M. (1981). Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective.

Microbial Reviews. 45(1): 180-209.

Atlas, R. M. and Bartha, R. (1998). Microbial ecology: Fundamentals and applications. 4th edition,

Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California, USA.

Balcke G.U., Georgi A., Woszidlo S., Kopinke F.D., Poerschman (2005). Utilization of inmobilized

humic organic matter for In-Situ subsurface remediation. Use of humic substances to remediated

polluted environments: from theory to practice, Springer, 203-232.

Ballarin-Denti, A., Bertazzi, P.A., Facchetti, S., Fanelli, R., Mocarelli, P., (1999). Chemistry, Man and

Environment. The Severo Accident 20 Years on: Monitoring, Epidemiology and Remediation.

136

Belfroid, A., Sikkenk, M., Seinen, W., Gestel, K., and Hermens, J. (1994). The toxico-kinetic behavior

of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei) experiments in soils. Environ. Toxicol Chem. 13:93-

99.

Belfroid, A. and Sijm, D. (1998). Influence of soil organic matter content on elimination rate of

hydrophobic compounds in the earthworms: possible causes and consequences. Chemosphere,

37:1221-1234.

Bhairi, S.M. (2001). Detergents: a guide to the properties and uses of detergents in biological systems.

Calbiochem-Novabiochem Corporation. 41 pp.

Bhandari A., Novak J.T., and Dove D.C. (2000). Effect of soil washing on petroleumhydrocarbon

distribution on sand surfaces. Journal of Hazardous Substance Research Vol. 2

Biogenesis soil washing technology. EPA 540/SR-93/510, September 1993.

Boopathy, R. (2000). Factors limiting bioremediation technologies. Bioresource Technology. 74: 63-67.

Bossert I. y R. Bartha (1984). The fate of petroleum in soil ecosystems. In: ATLAS R.M. (Ed.),

Petroleum Microbiology. Macmillan Publishing Co., New York. 473p.

Cerniglia, C.E. (1984). Microbial metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons. Adv. Appi Microbiol.

30:31-71.

Cerniglia, C. E. (1993). Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation. 3:551-

368.

137

Cho H. H., Choi J, Goltz M. N., and Park J. W. (2002). Combined Effect of Natural Organic Matter and

Surfactants on the Apparent Solubility of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Published in J. Environ.

Qual. 31:275–280.

Chun, C.L., Lee, J.-J., Park, J.-W., (2002). Solubilization of PAH mixtures by three different anionic

surfactants. Environ. Poll. 118, 307–313.

Conte, P.; Agretto, A.; Spaccini, R.; Piccolo, A.; (2005). Soil remediation: humic acids as natural

surfactants in the washings of highly contaminated soils. Environ. Pollut. 135, 515-522.

Contreras-Ramos, S.M., Alvarez-Bernal, D. & Dendooven, L. (2006). Eisenia foetida increased

removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil, Environmental Pollution 141, 396–401.

Cox BA. Anderson JW. Parker JC. (1975). An experimental oil spill: The distribution of aromatic

hydrocarbons in the water, sediment, and animal tissues within a shrimp pond. In: Proceedings of the

Conference on the Prevention and Control of Oil Pollution, 607-612.

Cuypers, C., Pancras, T., Grotenhuis, T., Rulkens, W., (2002). The estimation of PAH bioavailability in

contaminated sediments using hydroxypropyl-b-cyclodextrin and Triton X-100 extraction techniques.

Dragun, J. (1988). Microbial degradation of petroleum products in soil. In: Soils contaminated by

petroleum: Environmental and public health effects. New York, NY: John Wiley and Sons, 289-298.

Duursma E.K., Dowson R., (1983). Marine Organic Chemistry, pag 327 – 350.

Eastcott, L., Shiu, W., Mackay, D. (1989). Modeling petroleum products in soils. In: Petroleum

contaminated soils, Vol. 1. Chelsea, MI: Lewis Publishers, Inc. 63-80.

138

Edwards, C & J.R. Lofty. (1982). Nitrogenous fertilizers and earthworm populations in Agricultural soils.

Soil Biology and Bichemistry 14: 515-521.

Engebretson R. R. and Wandrusrka R. V. (1994). Microorganization in Dissolved Humic Acids.

Environ. Sci. Technol., 28, 1934-1941.

Feificova D., et. al. (2005). Influence of humic acids on the growth of the microorganisms utilizing toxic

compounds (comparison between yeast and bacteria), Chimia 59, No. 10, 749-752.

Fent, K., (2003). Ecotoxicological problems associated with contaminated sites. Toxicol. Lett. 140/141,

353–365.

Fernández L. L. C., et al. (2006). Manual de técnicas de análisis de suelos aplicadas a la remediación

de sitios contaminados. INE-SEMARNAT-IMP, México.

Ferruzzi, C. (1994). Manuale del Lombricoltore. Edagricole, Bologna, Italia.

Field J.A. and Cervantes F.J. (2005). Microbial redox reactions mediated by humus and structurally

related quinines. Springer, Use of humic substances to remediated polluted environments: from theory

to practice. 343-352.

Field J.A., Brady J. (2003). Riboflavin as a redox mediator accelerating the reduction of the azo dye

Mordant Yellow 10 by anaerobic granular sludge. Water Sci. Tech. 48(6): 187-193.

Finnerty, W. R. 1992. The biology and genetics of the genus Rhodococcus. Annu. Rev. Microbiol.

1992. 46:193-218

139

Fründ, R., k. Guggenberg, K. Haider, H. Knicker, I. Kögel-Knaber, H.-D. Lüdeman, J. Luster, W. Zech

and M. Spiteller (1994). Recent advances in the spectroscopic characterization of soil humic

substances and their ecological relevance. Z. Pflanzenernähr. Bodenk, 157: 175-186.

Garon, D., Krivobok, S., Wouessidjewe, D., Seigle-Murandi, F., (2002). Influence of surfactants on

solubilization and fungal degradation of fluorine. Chemosphere 47, 303–309.

Ghosh, M. M. (1997). Kinetic considerations in surfactant-enhanced bioavailability of soil-bound PAH.

1997. The Sixth International in situ and on site Bioremediation Symposium. Battelle. 2: 575-580.

Gotaas, H. (1956). Composting: Sanitary disposal and reclamation of organic wastes. World Health

Oganization, Switzerland.

Grbic-Galic, D.t Vogel, T. (1987). Transformation of toluene and benzene by mixed methanogenic

cultures. Appl. Environ. Microbiol. 53:254-260.

Grdisa, M., Popovic, M., and Hrzenjak, T. (2001). Glycolipoprotein extract (g-90) from earthworm

Eisenia fetida excreta some antioxidative activity. Comparat. Biochem. Physiol Part A., 128:821-825.

Guetzloff, T.F. and J.A. Rice, (1994). Does humic acid form a micelle? Sci. Total Environ., Vol. 152,

31-35.

Guha, S. y Jaffé, P. R. (1996). Bioavailability of hydrophobic compounds partitioned into the micellar

phase of nonionic surfactants. Environ. Sci. Technol. 30: 1382-1391.

Gupta V.K., Jain C.K., Ali I., Chandra S., Agarwal S. (2002). Removal of lindane and malathion from

wastewater using bagasse fly ash a sugar industry waste. Wat. Res. 36(10): 2483-2490.

140

Hassett, D., Bieesi, M.f and Harfcenstein, R. (1988). Earthworm peroxidase: distribution microbial

action and molecular weight. Soil Biol Bioch., 20:887-890.

Hayes, K., Meyers, J., Huddleston, R. (1997). Biopile Treatability, Bioavailability, and Toxicity

Evaluation of a Hydrocarbon - Impacted Soil. Applied Bioremediation of Petroleum Hydrocarbons.

Heitkamp, MA. Franklin, W., Cerniglia, C. (1988). Microbial metabolism of polycyclic aromatic

hydrocarbons: isolation and characterization of a pyrenfi bacterium. Appt. Environ. Microbiol. 54:2549-

2555.

Holman C., et al. (2005). Catalysis of PAH Biodegradation by Humic Acid Shown in Synchrotron

Infrared Studies.

Iturbe-Argüelles, R; Flores -Torres, C; Chávez -López, C. y Roldán-Martín, A. (2002). Saneamiento de

suelos contaminados con hidrocarburos mediante biopilas. Ingeniería, Investigación y Tecnología III.

1: 25-35.

Johnsen, A., Wick, L., and Hariris, H. (2005). Principles of microbial PAH-degradation In soil.

Environm. Pollut, 133:71-84.

Jonge, H.; Freijer, J. I.; Verstraten, J. M. y Westerveld, J. (1997). Relation between bioavailability and

fuel oil hydrocarbon composition in contaminated soils. Environ. Sci. Technol. 31: 771-775.

Jordan R., Payne J. (1980). Fate and weathering of petroleum spills in the marine environment: A

literature review and synopsis. Ann Arbor, Ml: Ann Arbor Science Publisher, Inc.

Käcker T., Haupt E., Garms C., Francke W., Steinhart H. (2002). Structural characterisation of humic

acid-bound PAH residues in soil by 13

C-CPMAS-NMR-spectroscopy: evidence of covalent bonds.

Chemosphere 48, 117–131.

141

Kaestner. M., Mahro, B. (1996). Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils

affected by the organic matrix of compost. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44(5):668-675.

Kiem, R., Knicker, H., Ligouis, B., Ko¨ gel-Knabner, I., (2003). Airborne contaminants in the refractory

organic carbon fraction of arable soils in highly industrialized areas. Geoderma 114, 109–137.

Kim, Y., Lee, D., (2002). Solubility enhancement of PCDD/F in the presence of dissolved humic matter.

J. Haz. Mat. B91, 113–127.

Knackmuss H.J. (1996). Basic knowledge and perspectives of bioelimination of xenobiotic compounds.

Journal of Biotechnology 51: 287-295.

Knox, R.C. (1993). Spatial moment analysis for mass balance calculations and tracing movement of a

subsurface hydrocarbon mound. Ground Water Monitoring & Remediation 13(3): 139-147.

Ko, S. O.; Schlautman, M. A y Carraway, E. R. (2000). Cyclodextrin-enhanced electrokinetic removal

of phenanthrene from a model clay soil. Environ. Sci. Technol. 34: 1535-1541.

Kotterman, M. J. J.; Rietberg, H.J.; Hage, A. y Field J. A. (1998). Polycyclic aromatic hydrocarbon

oxidation by the white-rot fungus Bjerkandera sp. strain BOS55 in the presence of nonionic surfactants.

Biotechnol. Bioeng. 57(2); 220-227.

Kubicki J.D., Apitz S.E. (1999). Model of natural organic matter and interactions with organic

contaminants. Organic Geochemistry. 30: 911-927.

Kuhlman, M.I., Greenfield, T.M., (1999). Simplified soil washing processes for a variety of soils. J. Haz.

Mat. 66, 31–45.

142

Laha, S. y Luthy, R. G. (1992). Effects of nonionic surfactants on the solubilization and mineralization

of phenanthrene in soil-Water systems. Biotechnol. Bioeng. 40: 1367-1380.

Laine, M. M. y Jorgensen, K. S. (1997). Effective and safe composting of chlorophenolcontaminated

soil in pilot scale. Environ. Sci. Technol. 31: 371-378.

Lampkin, Nicolas. (2002). Organic Farming. 104 Valley Road, Ipswich IP1 4PA, United Kingdom, Old

Pond Publishing. 747 p.

Lattaud, G, Mar, P., Garvfn, M., Locati, S., and Rouland, C. (1999). Enzymatic digestive capabilities in

geophagous earthworms-origin and activities of cellulolytic enzymes. Pedobiologia, 43:842-850.

Leahy, G. P. and Colwell, R. R. (1990). Microbial degradation of hydrocarbons in the environment.

Microbial Reviews. 54(3): 305-315.

Lee, K. (1985). Earthworms: Their ecology and relationships with soils and land use, Academic Press,

New York.

Liang Y., Britt D. W., McLean J. E., Sorensen D. L., Sims R. C. (2007). Humic acid effect on pyrene

degradation: finding an optimal range for pyrene solubility and mineralization enhancement. Appl

Microbiol Biotechnol, 74:1368–1375.

Liem L. E., Facey R. M., Carrigan I., Blyth J., Fischer M., and Henderson A. (2004). Enhanced

hydrocarbon bioremedation through the addition of humic substances.

Liste, H.; Alexander, M. (2002). Chemical assay of availability to earthworms of polycyclic aromatic

hydrocarbons in soil. Chemosphere.

143

Lovley, D., et. al. (1996). Humic substances as electron acceptors for microbial respiration, Nature 382,

445-448.

Lovley, D., Woodward, J., Chapelle, F. (1994). Stimulated anoxic biodegradation of aromatic

hydrocarbons using Fe(lll) liquids. Nature. 370:128-136.

Lowry, D., Hurley, C., (2005). Vermicompost is successfully used in bioremediation pilot on soil

hydrocarbons. Biocycle 46, 6.

Ma, W., Immerzeel, J., and Bodt, J. (1995). Earthworms and food interactions on bioaccumulation and

disappearence in soil of polycyclic aromatic hydrocarbons: studies on phenentrene and fluoranthene.

Ecotoxicol. Environm, Safety, 32:220-232.

Mackay D. (1984). Chemical and physical behavior of hydrocarbons in freshwater. In: Oil in freshwater

Chemistry, biology, countermeasure technology. New York: Pergamon Press, 85-94.

Majer, R. M; Pepper, I. L y Gerba, C. P. Environmental Microbiology. Academic Press. 2a Edición. 583

pp.

Mann, M.J., (1999). Full-scale and pilot-scale soil washing. J. Haz. Mat. 66, 119–136.

Martín, M. C.; González, B. A. y Blanco, S. M. J. (2004). Tratamientos biológicos de suelos

contaminados: contaminación por hidrocarburos. Aplicaciones de hongos en tratamientos de

biorrecuperación. Rev Iberoam Micol; 21: 103-120.

Martín-Gila J., Navas-Gracia L. M., Gómez-Sobrino E.,Correa-Guimaraes A., Hernández-Navarro S.,

Sánchez-Báscones M., Ramos-Sánchez M. del C. (2007). Composting and vermicomposting

experiences in the treatment and bioconversion of asphaltens from the Prestige oil spill. Bioresource

Technology (in press)

144

McBride, M. B. (1994). Environmental Chemistry of Soils. New York. Oxford. USA.

McFall, T. (1984). Mutagenic activity of methyl- substituent tri- and tetracyclic aromatic sulfur

heterocyclic. Mut. Res. 135 (2): 97-103.

Michel, F., Reddy, C. (1998). Effect of Oxygenation Level on Yard Trimmings Composting Rate, odor

Production, And Compost Quality In Bench -Scale Reactors. Compost Science & Utilization 6(4): 6-14.

Mihelcic, J.R., Lueking, D.R., Mitzell, R.J., y Stappleton, J.M. (1993). Bioavailability of sorbed- and

separate-phase chemicals. Biodegradation. 4:141-153.

Montgomery, D.C. Diseño y Análisis de Experimentos. Grupo Editorial Iberoamérica, S.A. de C.V.

México, D.F. 1991.

Morgan, M. and Burrows, I. (1982). Earthworm microorganisms interactions. Exp, stn. rep.,

Rothamsted.

Mosley R.. The effects of humates on remediation of hydrocarbon and salt contaminated soils. 5th

International Petroleum Environmental Conference, Albuquerque, New Mexico, October 20th – 23rd,

1998.

Nieman J.K.C., Kimball D.O., McLean J.E., Sims R.C., Sims J.L., Sorensen D.L., and Rice J.A. (1998).

Humification of pyrene in contaminated soil during land farming. Proceedings of the 1998 Conference

on Hazardous Waste Research.

Nieman J.K.C., Sims R.C., Sorensen D.L., McLean J.E. (2005). Humic Acid Toxicity in Biologically

Treated Soil Contaminated with Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and Pentachlorophenol. Arch.

Environ. Contam. Toxicol. 49, 283–289.

145

NOM-021-RECNAT-2000. Establece las especificaciones de fertilidad, salinidad y clasificación de

suelos, estudio, muestreo y análisis.

NOM-138-SEMARNAT/SS-2003. Límites máximos permisibles de hidrocarburos en suelos y las

especificaciones para su caracterización y remediación.

Noordman, W.H., Bruining, J.-W., Wietzes, P., Janssen, D.B., (2000). Facilitated transport of a PAH

mixture by a rhamnolipid biosurfactant in porous silica matrices. J. Contam. Hydr. 44, 119–140.

Pandey, A., Socool, C.A., Nigam, P. and Socool, V.T. (2000) Biotechnological potential of agro-

industrial residues I: sugarcane bagasse. Bioresource Technology 74, 69–80.

Park, K.S., Sims, R.C., Doucette, W.J., Matthews, J.E. (1988). Biological transformation and

detoxification of 7,12-dimethylbenz(a)anthracene in soil systems. J. Water Pollut. Control Fed.

60:1822-1825.

Park, M. O., Tanabe, M., Hirata, K. and Miyamoto, K. (2001) Isolation and characterization of a

bacterium that produces hydrocarbons extracellularly which are equivalent to light oil. Applied

Microbiology and Biotechnology 56, 448–452.

Park M. O., Heguri K., Hirata K. and Miyamoto K. (2005).Production of alternatives to fuel oil from

organic waste by the alkane-producing bacterium, Vibrio furnissii M1. Journal of Applied Microbiology,

98, 324–331

Pérez-Armendáriz B., Loera-Corral O., Fernández-Linares L., Esparza-García F. and Rodríguez-

Vázquez R. (2004).Biostimulation of micro-organisms from sugarcane bagasse pith for the removal of

weathered hydrocarbon from soil. Letters in Applied Microbiology, 38, 373–377.

146

Perminova, I. V., et al. (2006). Mediating effects of humic substances in the contaminated

environments; Concepts, Results, and Prospects. Viable Methods of Soil and Water Pollution

Monitoring, Protection and Remediation, 249–273.

Perminova, I. V.; Hatfield, K.; Hertkorn, N. (2005). Use of humic substances to remediated polluted

environments: from theory to practice. NATO Science Series. Series IV: Earth and environmental

series. Vol. 52

Perry, J.J., Cerniglia, C.E. (1973). Studies on the degradation of petroleum by filamentous fungi. In The

Microbial Degradation of Oil Pollutants Workshop: Georgia State University, pp. 89-94.

Pettyjohn, W.A., y Hounslow, A.W. (1983). Organic compounds and groundwater pollution. Ground

Water Monit Rev. 3:41-47.

Pineda F. G., Boll Argüello. G., Mesta Howard A. M. (2002). Biodegradación de asfaltenos por un

corsorcio microbiano asilado de petróleo crudo ―maya‖. Rev. Int. Contam. Ambient. 18 (2) 67-73

Pineda F. G. and Mesta-Howard A. M. (2001). ―Petroleum asphaltenes: generated problematic and

possible biodegradation mechanisms‖; Revista Latinoamericana de Microbiología. 43, 3, 2001, P 143-

150.

Piñero B. J. y Rivas N. (2004). Isolation and Characterization of a Moderate Thermohilic and

Acidophilic Cellulolytic Actinomycete Strain. Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XIV, Nº 5, 412 – 418.

Pizl, V. and Nováková, A. (2003). Interactions between microfungi and Eisenia andrei (oligochaeta)

during cattle manure vermicomposting. Pedobiologia, 47:895-899.

Pizzul, L. 2006. Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by Actinomycetes. Swedish

University of Agricultural Sciences, Doctoral dissertation.

147

Pollard, S. J. T; Hrudey, S. E y Fedorak, P. M. (1994). Bioremediation of petroleum and creosote

contaminated soils: A review of constraints. Waste Management & Research. 12: 173-194.

Potter, C. (1997). Biopile Treatment of Soils Contaminated With Hazardous Waste. Seminar Series on

Bioremediation of Hazardous Waste Sites: Practical Approaches to Implementation. 10-1 -10-5.

Pramanik, P., Ghosh G.K., Ghosal P.K., Banik P. (2007). Changes in organic – C, N, P and K and

enzyme activities in vermicompost of biodegradable organic wastes under liming and microbial

inoculants. Bioresource Technology 98, 2485–2494.

Presto. L, Millar. W.. Suyama. M. Maclearn. I., Fleischer. E. (1989). Available Remedial Technologies

for Petroleum Contaminated Soils. En Calabrese, E. Petroleum Contamination, Lewis Pub., pp. 115-

125.

Providenti, M.A.; Lee, H.; Trevors,J.T. (1993). Selecting factors limiting the microbial degradation of

recalcitrant compounds. Journal of Industrial Microbiology. 12, 379-395.

Quintero, L. R. (2002). Formación de humus y dinámica enzimática en el proceso de vermicompostaje.

Tesis de Doctorado, Edafología, Colegio de Postgraduados, Montecillo, Estado de México, México.

Quagliotto, P.; Montoneri, E.; Tambone, F.; Adani, F.; Gobetto, R.; Viscardi, G.; (2006). Chemicals

from Wastes: Compost-Derived Humic Acid-like Matter as Surfactant Environ. Sci. Technol., 40, 1686

– 1692.

Ramirez Gama, R.M. Manual de prácticas de microbiología general. Facultad de química, UNAM.

México, D.F. 2000.

148

Rapp P. and Gabriel-Jürgens L.H.E. (2003). Degradation of alkanes and highly chlorinated benzenes,

and production of biosurfactants, by a psychrophilic Rhodococcus sp. and genetic characterization of

its chlorobenzene dioxygenase. Microbiology, 149, 2879–2890.

Rieser-Roberts, E. (1998). Biodegradation/Mineralization/Biotransformation/Bioaccumulation of

petroleum constituents and associated metals. Section 3. In: Remediation of petroleum contaminated

soils. Biological, physical and chemical processes. Lewis Publishers. Boca Raton, CRC Press.

Rontani J.F., Bosser-Joulak F., Rambeloarisoa E., Bertrand J.C. y Giusti G. (1985). Analytical study of

asphalt crude oil: asphaltenes biodegradation. Chemosphere 14, 1413-1422.

Rubin, H. (2001). Synergistic mechanisms in carcinogenesis by polycyclic aromatic hydrocarbons and

by tobacco smoke: a bio-historical perspective with updates. Carcinogenesis. 22 (12): 1939-1950.

Salager J. L., (1993). Surfactentes en solución acuosa. Univerdidad de los Andes, Mérida-Venezuela,

Versión 2.

Saparpakorn P., Kim J.H. and Hannongbua S. (2007). Investigation on the Binding of Polycyclic

Aromatic Hydrocarbons with Soil Organic Matter: A Theoretical Approach. Molecules 12, 703-715.

Savage, G.M., Diaz, L.F., Golueke, C.G. (1985). Disposing of organic hazardous wastes by

composting. BioCycle. 26:31-34.

Schaefer M., Juliane F. (2007). The influence of earthworms and organic additives on the

biodegradation of oil contaminated soil. Applied soil ecology 36, 53 – 62.

Schaefera M., Petersenb S. O., Filser J. (2005). Effects of Lumbricus terrestris, Allolobophora

chlorotica and Eisenia foetida on microbial community dynamics in oil-contaminated soil. Soil Biology &

Biochemistry 37, 2065–2076.

149

Schnitzer, M. (2000). Life Time Perspective on the Chemistry of Soil Organic Matter. D. L. Sparks

(Ed.). Advances in Agronomy, Academic Press. 98: 3-58.

Schulz-Berendt V. y Poetzsch E. (1995). Large-scale experience with biological treatment of

contaminated soil. En: Applied Bioremediation of hydrocarbons. Hinchee, R.E.; Kittel, J.A. y Reisinger,

H.J. (Eds.). Battele Press.

Schwarzenbach, A.R., Gschwend, P.M., Imboden, D.M., (2003). Environmental Organic Chemistry.

second ed. J. Wiley and Sons, New York.

Semple, K.T.; Reid, B.J. y Fermor, T.R. (2001). Impact of composting strategies on the treatment of

soils contaminated with organic pollutants. Environ. Pollution. 112: 269-283.

Shiaris, M.P. (1989). Seasonal biotransformation of naphthalene, phenantrene and benzo(a)pyrene in

surfacial estuaring sediments. Appl. Environ. Microbiol. 55:1391-1399.

Shukla A., Zhang Y., Dubey P., Margrave J.L., Shukla S. (2002). The role of sawdust in the removal of

unwanted materials from water. Journal of Hazardous Materials. B95: 137-152.

Simcik, M.F., Eisenreich, S.J., Lioy, P.J., (1999). Source apportionment and source/sink relationships

of PAHs in the coastal atmosphere of Chicago and Lake Michigan. Atm. Environ. 33, 5071–5079.

Singer, M.E., Finnerty, W.R. (1984). Microbial metabolism of straight-chain and branched alkanes. In

Petroleum Microbiology. Atlas, R.M. Ed. Macmillan , NY. pp. 1-59.

Singera A.C., Jurya W., Luepromchaia E., Yahngb C. S., Crowley D.E. (2001). Contribution of

earthworms to PCB bioremediation. Soil Biology & Biochemistry 33, 765-776.

150

Singleton, D., Hendrix, B., Coleman, D., and Whitmann, W. (2003). Identification of uncultured bacteria

tighly associated with the intestine of the earthworm Lumbicus rubellus (lumbricidae; oligochaeta). Soil

Biol. Biochem., 35:1547-1555.

Smith, J.E. (1985). Biotechnology Principles. Am. Soc. for Microbiology. Ed. J.E. Smith, pp 39-75.

Soderstrom, S. (2000). Effects of soil/sediment organic matter on the desorption, bioavailability,

sequestration, and transformation of phenanthrene. EPA Grant Number. U915551. University of

Michigan.

Stegmann, R., Lotter, S., Heerenklage, J. (1991). Biological treatment of oil-contaminated soils in

bioreactors. In On-Site Bioreclamation. Processes for Xenobiotic and Hydrocarbon Treatment.

Hinchee, R. Eds. Butterwoth-Heinemann, Stoneham, MA. Pp. 188-208.

Stelmack, P. L; Gray, M. R y Pickard, M. A. (1999). Bacterial adhesion to soil contaminants in the

presence of surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 65: 163-168.

Subiaga A., Cuattrocchio A. (2000). Partes fundamentales y reología de asfaltos para uso vial.

LEMaC Centro Investigaciones Viales UTN Reg. La Plata. Buenos Aires- Argentina.

Sutherland, J., Selby, A., Freeman, J., Evans, F., Cemiglia, C. (1991). Metabolism of phenanthrene by

Phanerochaete chrisosporium. Appl. Environ. Microbiol. 57: 3310-3316.

Sylvia, D. M.; Fuhrman, J. J.; Hartel, P. G. and Zuberer, D. A. (1999). Principles and applications of soil

microbiology, Pretince Hall, New Jersey, USA.

Tan, K. H. (2003). Humic matter in soil and the environment. Principles and Controversies. Marcel

Dekker, Inc. Athens, Georgia, USA.

151

Tisdale, S.L., Nelson, W.L., Beaton, J.D. & J.L. Havlin. (1993). Soil fertility and fertilizers. 5th ed. New

York, USA, Macmillan Publishing Company. 634 p.

Torres L. G., Aguirre A. L., Verdejo A. & Iturbe R. (2005). Enhanced soil-washing treatment for soils

which are highly contaminated with crude oil. WIT Transactions on Ecology and the Environment, Vol

81.

Vázquez-Duhalt, R. 2000. Environmental oil biocatalysis, in Olguín, E.J., Sánchez, G. y Hernández E.

(eds) Environmental biotechnology and cleaner bioprocesses, London: Taylor and Francis Publishers,

pp. 191-207

Van Deuren, J.; Wang, Z. y Ledbetter, J. (1997). Remediation Technologies Screening Matrix and

Reference Guide. 3ª Ed. Technology Innovation Office, EPA.

Velasco, J.A.; Volke T.L. (2003). El composteo: una alternativa tecnológica para la biorremediación de

suelos en México. Gaceta Ecológica, INE, No. 66, pp, 41-53.

Venkataraman, C., Negi, G., Sardar, S.B., Rastogi, R., (2002). Size distributions of polycyclic aromatic

hydrocarbons in aerosol emissions from biofuel combustion. Aer. Sci. 33, 503–518.

Warhurst, A.M. and C.A. Fewson. 1994. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus. Crit.

Rev. Biotechnol. 14:29-73

Wallace, A. and G. A. Wallace. (1994). Water-Soluble Polymers help protect the Environment and

correct Soil Problems. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 25:105-108.

Wandruszka R. V. (2000). Humic acids: Their detergent qualities and potential uses in pollution

remediation. Geochem. Trans., 2.

152

Wandruszka R. V. and Young C. (2001). A Comparison of aggregation behavior in aqueous humic

acids. Geochem. Trans., 2001, 2

Weissenfels, W., Beyer, M., Klein, J. (1990). Degradation of phenantrene, fluorene and fluoranthene by

pure bacterial cultures. Appl. Microbiol. Biotechnot. 32:479-484.

Wershaw R. L. (1989). Application of a Membrane Model to the Sorptive Interactions of Humic

Substances. Environmental Health Perspectives, Vol. 83, pp. 191-203.

Wijnja H., Pignatello J. J., and Malekani K (2004). Formation of π–π Complexes between

Phenanthrene and Model π -Acceptor Humic Subunits. J. Environ. Qual. 33:265–275.

Williams, R. T., Keehan, K. R. (1993). Hazardous and industrial waste composting. In Hoitink and

Keener (Eds.), Science and Engineering of Composting: Design, Environmental, Microbiological and

Utilization Aspects, 363-381. Renaissance Publications, Worthington, Ohio.

Xu, H., S. Lesage and L. Durham, (1994). The use of humic acids to enhance removal of aromatic

hydrocarbons from contaminated aquifers. Part I: Laboratory studies. Fourth Annual Symposium on

Groundwater and Soil Remediation, Calgary Alberta. September 21-23. Pages 635-666

Zeyer, J., Kuhn, E., Schawarzenback, R. (1986). Rapid microbial mineralization of toluene and 1,3-

dimetthylbenzene in the absence of molecular oxygen. Appl. Environ. Microbiol. 52:944-947.

Páginas de Internet consultadas:

http://www.epa.gov/tio/remed.htm.

http://www.bp.com

http://www.frtr.gov/matrix2/top_page.html

http://www.epa.gov/tio/remed.htm

http://www.bp.com/

http://www.frtr.gov/matrix2/top_page.html

153

9. ANEXO

A1. Porcentaje de contribución de los términos del DEFG al modelo.

Término Suma Cuadrados % Contribución Términos implicados en el Modelo (M)

o como parte del error (e)

A-BC 243 23 M

B-EL 280 27 M

C-L 515 49 M

AB 5 1 M

AC 6 1 M

BC 1 0 e

ABC 1 0 e

Residuales 0

A2. Análisis de varianza de los efectos seleccionados como principales contribuyentes del

análisis estadístico del DEFG.

ANDEVA para el modelo factorial seleccionado cuadrático Tabla de análisis de varianza

Suma de

Significado de los F p-valor

Cuadrados g.l. Cuadrados Valor Prob > F

Modelo 1049.3 7.0 149.9 449.7 < 0.0001 significantivo

A-BC 243.0 1.0 243.0 729.0 < 0.0001 B-EL 280.3 1.0 280.3 841.0 < 0.0001 C-L 514.7 2.0 257.3 772.0 < 0.0001 AB 5.3 1.0 5.3 16.0 0.0161 AC 6.0 2.0 3.0 9.0 0.0331 Residual 1.3 4.0 0.3

Total 1050.7 11.0

El valor F del modelo (449.71) indica que el modelo es significativo. Solo hay un

0.01% de probabilidad de que " El valor F del modelo" sea debido a ruido.

Valores de "Prob > F" menores que 0.0500 indican que los términos del modelo son significativos.

En este caso A, B, C, AB, AC son términos significativos del modelo. Valores superiores a 0.1000 indican que los términos del modelo no son significativos.

Desv. Estd. 0.577350269

R-cuadrada 0.99873096 Significado 46.33333333

Adj R-cuadrada 0.99651015

C.V. % 1.246079718

Pred R-cuadrada 0.98857868 PRESS 12

Adeq Precision 72.4784451

154

Design-Expert® Software

Remoción de HTP's

Color points by value of

Remoción de HTP's:

63

29

Internally Studentized Residuals

No

rma

l %

Pro

ba

bili

ty

Normal Plot of Residuals

-1.50 -0.75 0.00 0.75 1.50

1

5

10

20

30

50

70

80

90

95

99


Remoción de HTP's


Remoción de HTP's:

63

29

Run Number

Inte

rna

lly S

tud

en

tiz

ed

Re

sid

ua

ls

Residuals vs. Run

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

1 3 5 7 9 11

A3. Graficas de residuales del DEFG.

Los puntos de la gráfica de residuales (Figura A3-1), se localizan razonablemente próximos a una

línea recta, brindando apoyo a la conclusión de que BC (A), EL (B), L (C), BC-EL (AB) y BC-L (AC),

son los principales efectos significativos y que satisfacen los supuestos fundamentales del análisis.

Figura A3-1. Gráfica normal de residuales.

Se observa una dispersión equitativa de los residuales entre + 3.0 y – 3.0 (Figura A3-2).

Figura A3-2. Gráfica de residuales contra tratamiento.

155


Remoción de HTP's


Remoción de HTP's:

63

29

2

2

2

2

22

BC

Inte

rna

lly S

tud

en

tiz

ed

Re

sid

ua

ls

Residuals vs. BC

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

1 2


Remoción de HTP's


Remoción de HTP's:

63

29

2

22

B:EL

Inte

rna

lly S

tud

en

tiz

ed

Re

sid

ua

ls

Residuals vs. EL

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

1 2


Remoción de HTP's


Remoción de HTP's:

63

29

2

C:L

Inte

rna

lly S

tud

en

tiz

ed

Re

sid

ua

ls

Residuals vs. L

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

1 2 3

Como se observa en estas gráficas (Figura A3-3) la varianza no es demasiada para cada uno de los

efectos.

156


Sqrt(Remoción + 1.00)


Sqrt(Remoción + 1.00):

7.14533

1.1351

Internally Studentized Residuals

No

rma

l %

Pro

ba

bili

ty

Normal Plot of Residuals

-1.99 -1.12 -0.25 0.63 1.50

1

5

10

20

30

50

70

80

90

95

99





7.14533

1.1351

Run Number

Inte

rna

lly S

tud

en

tiz

ed

Re

sid

ua

ls

Residuals vs. Run

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

1 10 19 28

A4. Graficas de residuales del DEFC.

Los puntos de la gráfica de residuales (Figura A4-1), se localizan razonablemente próximos a una

línea recta, brindando apoyo a la conclusión de que S (B), Agua (C) y EL-S (AB), son los principales

efectos significativos y que satisfacen los supuestos fundamentales del análisis.

Figura A4-1. Gráfica normal de residuales.

Se observa una dispersión equitativa de los residuales entre + 3.0 y – 3.0 (Figura A4-2).

Figura A4-2. Gráfica de residuales contra tratamiento.

157





7.14533

1.1351 2

EL

Inte

rna

lly S

tud

en

tiz

ed

Re

sid

ua

ls

Residuals vs. EL

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

0.10 2.57 5.05 7.53 10.00





7.14533

1.1351 2

B:Suelo

Inte

rna

lly S

tud

en

tiz

ed

Re

sid

ua

ls

Residuals vs. Suelo

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15





7.14533

1.1351 2

C:Agua

Inte

rna

lly S

tud

en

tiz

ed

Re

sid

ua

ls

Residuals vs. Agua

-3.00

-1.50

0.00

1.50

3.00

50 67 83 100 117 133 150

Como se observa en esta Figura A4-3, la varianza no es demasiada para cada uno de los efectos.

158


respecto a filas 52 35 49 37


24 20 30 22


Blanco "b"

0 0 0 0


respecto a columnas 0 23 25 43


0 33 33 56


Blanco "b"

0 38 28 59


respecto al blanco 52 86 90 117

del tratamiento N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20

24 66 66 93


Blanco "b"

0 38 28 59



bioestimulación N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20

57 109 109 143


Blanco "b"

26 74 61 100



suelo + agua N/BC, N/EL, 20 N/BC, S/EL, 20 S/BC, N/EL, 20 S/BC, S/EL, 20

177 269 269 331


Blanco "b"

123 208 185 254

respecto al blanco 62

del tratamiento

respecto al blanco 104 Suelo Lavado

bioestimulación

respecto al blanco 262

suelo + agua

Porcentaje de remoción entre tratamientos

A5. Porcentajes de remoción de los diferentes tratamientos y el suelo lavado, respecto a los

blancos “a”, “b” y “c”.

159

Determinaciones Analíticas

Para evaluar las determinaciones que a continuación se enlistan, se tomó una muestra

completamente al azar de los tratamientos; para ello se dividió la caja del tratamiento en 9 segmentos

imaginarios y empleando una calculadora se seleccionó la función de ―random‖ la cual permite obtener

al azar tres números; de esta manera se tomó la muestra desde la superficie hasta el fondo del

tratamiento para posteriormente mezclarlos en lo posible de manera homogénea las tres

sub-muestras. De la muestra mencionada anteriormente se tomaron 50g para realizar los análisis

mencionados en la sección de materiales y métodos.

B1. Extracción de HTP’s (EPA 3550b)

Se elabora un cartucho de papel filtro Whatman de tal forma que pueda almacenar suelo en su interior

y se pone a peso constante (colocarse guantes de látex para evitar transferir humedad y grasa a los

cartuchos). Se determina la humedad del suelo a analizar. Posteriormente se pesa aproximadamente

un gramo de suelo colocándolo en el cartucho. Se coloca el cartucho con muestra en un frasco de

vidrio de 4.5 × 10cm con tapa y se adicionan 40ml de diclorometano. Se sónica la muestra empleando

un equipo de ultrasonido Branson® DHA-1000 durante 40min. Esta operación se hace por triplicado.

El sobrenadante se trasvasa a otro frasco de vidrio y se permite la evaporación del diclorometano

hasta sequedad para llevar a cabo la recuperación de asfaltenos. El cartucho posteriormente se lleva

a peso constante, para determinar la concentración de HTP’s (ppm) se aplica la siguiente fórmula:

160

B2. Recuperación de Asfaltenos

Empleando los HTP’s obtenidos se la etapa anterior se adicionan 40ml de pentano y se coloca en el

frasco un agitador magnético y se agita por 10min (se observa inmediatamente la precipitación del

asfalteno). Posteriormente la mezcla se centrifuga a una velocidad de 10,000 rpm, a una temperatura

de 4 °C, también por 10 minutos, se realiza una decantación y con el precipitado que se vaya

obteniendo, se repite la misma operación cuatro ocasiones, (dilución, agitación y centrifugación), el

sobrenadante se va aclarando en cada operación pero no llega a ser incoloro.

Tanto del precipitado como del sobrenadante se evapora el solvente y se cuantifica asfaltenos en el

primero e hidrocarburos ligeros en el segundo.

B3. Fraccionamiento de Hidrocarburos Ligeros (sin asfaltenos)

Los hidrocarburos ligeros se separan en tres fracciones que son alifáticos, aromáticos poli cíclicos y

saturados por el método de cromatografía en columna.

Se emplea una columna de vidrio de 20 cm de longitud con diámetro interior de 0.85 cm, empacada

con sílica gel (malla 60 – 200); primero se coloca en su parte interior un tapón de fibra de vidrio para

evitar la sílica sea arrastrada por el solvente, después la columna se llena con hexano, purgando en

repetidas ocasiones para sacar todas las burbujas de aire atrapadas y después se adiciona sílica gel

activada previamente (24 horas a 100°C), cuidando que no queden burbujas de aire atrapadas.

Primera fracción (hidrocarburos Alifáticos). Se pesan 0.1 g de hidrocarburos ligeros (libres de

asfaltenos), se disuelven en hexano y se colocan en la parte superior de la columna. El eluyente para

la primer fracción es hexano con este solvente se obtienen los hidrocarburos alifáticos, que producen

una coloración verde-amarillo tenue, esta y todas las fracciones a recuperar se deben recibir en un

vaso de precipitados de 100 ml puestos anteriormente a peso constante, para cuantificar los

hidrocarburos correspondientes. La obtención de esta primera fracción tarda aproximadamente 6:30 h,

161

siendo el criterio para concluir esta separación la aparición gradual de una mancha amarilla. Se

recomienda montar en la parte superior de la columna de fraccionamiento un matraz de separación

con el solvente que se esté alimentando a la columna, igualando los flujos de entrada y de salida de la

columna que es aproximadamente de 20 gotas por minuto.

Segunda fracción (hidrocarburos Aromáticos). Se adicionó un eluyente compuesto por benceno –

hexano (1:3). Con éste se fraccionarán los hidrocarburos aromáticos que producen una coloración

amarillo brillante. La obtención de esta fracción demora unas 5:00 h misma que se da por terminada

cuando el efluente sea incoloro.

Tercera fracción (hidrocarburos Policíclicos Aromáticos). Se cambia la adición del solvente a otro

compuesto por acetona – metanol (1:1), con el que se obtiene la tercera fracción que componen los

hidrocarburos saturados y que producen una coloración café, esta fracción se obtiene en

aproximadamente 3:00 horas y el criterio para concluir la recuperación de ésta es también cuando el

efluente sea totalmente incoloro.

B4. Análisis cromatográfico

Se empleo un cromatógrafo de gases Perkin Elmer, Auto System con detector de ionización de flama

(FID), las condiciones bajo las cuales se operó el equipo fueron; columna capilar SIL 8CV de 25m de

longitud y de 0.32×0.4µm, que utiliza helio, como gas acarreador a un flujo de 6 mL/min. La

temperatura del inyector y detector se mantuvo a 240 y 280ºC respectivamente, la temperatura del

horno se programó a 60ºC por 4min; con rampas de temperatura de 60 a 140ºC a 10ºC/min; de 140ºC

a 180ºC a 2ºC/min y de 180 a 280ºC a 15ºC/min.

162

B5. Capacidad de Retención de Agua (CRA)

Pesar 10g de muestra a peso constante y determinar humedad inicial posteriormente colocar la

muestra en un vaso de precipitados de 250mL y adicionar 100mL de agua, mezclar mediante

agitación magnética durante 20min. Colocar la muestra húmeda en un embudo con papel filtro ambos

a peso constante y permitir que el agua absorbida a la muestra se libere de este de manera natural.

En el momento en que ya no salga más agua por el cuello del embudo, pesar la muestra más el

embudo y por diferencia de pesos determinar la CRA.

B6. Método de extracción de Substancias Húmicas del Suelo, método de la IHSS (International

Humic Substances Society) modificado

1. Equilibrar la muestra a un valor de pH entre 1-2 con 1 M HCl a temperatura ambiente. Ajustar

el volumen de la solución con 0.1 M HCl para proveer una concentración final en un rango

comprendido de 10 mL liquido/1 g muestra seca. Agitar la suspensión por una hora, con la

finalidad de eliminar carbonatos adheridos a las substancias húmicas y que interfieran con la

determinación.

2. Separar el sobrenadante del residuo por decantación después de permitir que la solución

descanse (o mediante centrifugación a baja velocidad 10000rpm – 10min). Conservar el

sobrenadante para el tratamiento con la resina XAD-7.

3. Neutralizar el residuo del suelo con 1 M NaOH a pH=7.0 entonces adicionar 0.1 NaOH bajo

una atmósfera de N2 hasta obtener una relación de 10:1.

4. Extraer la suspensión bajo N2 con agitación intermitente por un mínimo de 4 horas. Permitir

que la suspensión alcalina descanse toda la noche y recolectar el sobrenadante por

decantación o centrifugación.

5. Acidificar el sobrenadante con 6 M HCl con agitación constante hasta pH=1.0 y después

permitir que la suspensión descanse de 12 – 16 horas.

163

6. Centrifugar para separar las fracciones de ácido húmico (precipitado) y el ácido fúlvico

(sobrenadante – FA Extracto 2).

7. Redisolver la fracción de ácido húmico adicionando un volume mínimo de 0.1 M KOH bajo N2.

Adicionar KCl sólido hasta obtener 0.3 M (K+) y después centrifugar a una velocidad alta para

remover los sólidos suspendidos.

8. Reprecipitar el ácido húmico como en el paso 5. Centrifugar y descartar el sobrenadante.

9. Suspender el ácido húmico precipitado en una solución 1:1 de 0.1 M HCl/0.3 M HF. Agitar

toda la noche a temperatura ambiente. Esto con la finalidad de eliminar silicates adheridos a

las ácido húmico.

10. Centrifugar y repetir el tratamiento de HCl/HF (Paso 9), si es necesario, hasta que el

contenido de cenizas sea inferior a 1%.

11. Transferir el precipitado a un tubo de dialisis con agua destilada y dializar en un frasco con

agua destilada, hasta que el agua del recipiente de una reacción negativa de Cl- cuando se

adiciona AgNO3 al 1%. Esto tiene la finalidad de eliminar el exceso de acido clorhídrico en la

muestra.

12. Liofilizar el ácido húmico o secar a 60ºC.

13. Pasar el sobrenadante del paso 2 a través de una columna con resina XAD-7. Descartar el

efluente, eluir la columna de XAD-7 que contiene sorbido al ácido fúlvico con 0.65 volúmenes

de la columna de agua destilada. No conservar esta agua destilada.

14. Desorber la columna XAD-7 con un volumen de columna de 0.1 M NaOH, seguido de 2-3

volúmenes de agua destilada.

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15. Inmediatamente acidificar con 6 M HCl a pH=1. Adicionar HF concentrado a una

concentración final de 0.3 M HF. El volumen de la solución debe de ser suficiente para

mantener la solubilidad del ácido fúlvico.

16. Pasar el sobrenadante del paso 6 a través de de la columna con XAD-7.

17. Repetir los pasos 14 y 15

18. Combinar los eluyentes finales de los pasos 15 y 17, y pasarlos de Nuevo por la columna.

Eluir con 0.65 volúmenes de la columna de agua destilada.

19. Obtener el eluato final con un volumen de columna de 0.1 M NaOH seguido de 2 columnas de

agua destilada.

20. Liofilizar la elución para recuperar el ácido fúlvico.

Crecimiento microbiano

B7. Cuenta total en placa

Para evaluar el crecimiento microbiano por cuenta en placa; se realizaron diluciones seriales del

suelo, bagacillo de caña, vermicomposta y extracto de leonardita (de 1×10-1

a 1×10-10

) a partir de 1

gramo de muestra. Una muestra de 100µL de cada dilución fue distribuida en cajas Petri previamente

preparadas con medio sólido. Se emplearon medios de cultivo complejos para el crecimiento de todo

tipo de bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos en el menor tiempo, agar nutritivo (Bioxon) para

bacterias, agar maltosa sabouraud (DB Difco) para hongos y levaduras; así como, agar czapeck

(Bioxon) para actinomicetos. Las cajas Petri fueron incubadas a 32ºC durante 7 días, realizando la

cuenta total después de éste periodo.

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Criterio para el conteo de colonias: 20-200 por caja

El número de UFC/g de suelo (peso seco) se obtuvo de la siguiente manera:

UFC/mL = (No. de colonias / 0.1 mL de inóculo) x factor de dilución

UFC/g = (UFC/mL) x (9 mL) / peso de la muestra (g)

B8. Microorganismos hidrocarbonoclastas

Se realizaron diluciones seriales del suelo, bagacillo de caña, vermicomposta y extracto de leonardita

(1×10-1

a 1×10-10

) a partir de 1 gramo de muestra. Una muestra de 100µL de cada dilución fue

distribuida en cajas Petri previamente preparadas con medio sólido. El criterio para la selección de

cepas hidrocarbonoclastas, fue su capacidad de crecer en medio mineral adicionado de queroseno

como fuente de carbono. El medio mineral (1 L) consistió de dos soluciones; solución A (0.9L):

K2HPO4 (0.8g), KH2PO4 (0.2g), KCl (0.1g), Na2FeEDTA (0.014g), Na2MoO4·2H2O (0.025g), NH4NO3

(1g) y Agar-Agar (15g) y la solución B (0.1L): MgSO4·7H2O (0.2g) y CaCl2 (0.06g) (Renie, 1981;

modificado por R. Ferrera-Cerrato). Ambas soluciones, previamente preparadas y ajustadas a pH 7,

fueron esterilizadas por separado a 121ºC por 18 min, antes de ser mezcladas bajo condiciones de

esterilidad; por último se adicionó biotina y ácido p-aminobenzoico (10 mg/L). Se impregna un papel

filtro con 0.5mL de queroseno y se coloca en la tapa superior de la caja Petri. Las cajas Petri fueron

incubadas a 32ºC durante 7 días, realizando la cuenta total después de éste periodo.

B9. Carbono de Biomasa (Islam and Weil, 1998)

Colocar en dos frascos 10g de suelo del tratamiento, irradiar una de las muestras en microondas

(700W de potencia) por 7 segundos (para proporcionar 800kJ/g de suelo), adicionar 25ml de una

solución de K2SO4 0.5M a cada frasco y agitar por 1 hora. Centrifugar la mezcla a 10000rpm por 10

minutos, transferir 5ml de sobrenadante a otro frasco, adicionar 5ml de Ácido Sulfúrico y 1ml de

K2Cr2O7 0.1M. Irradiar las muestras 13 segundos, dejar enfriar y adicionar 19ml de agua destilada

desionizada (para completar 30ml de volumen final). Leer en espectrofotómetro a 590nm. Realizar una

curva tipo de sacarosa con las siguientes concentraciones: 0, 10, 20, 40, 80, 200, 400ppm realizar los

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mismo pasos mencionados anteriormente. Realizar blanco de reactivos y hacer la prueba por

duplicado.

Cálculos varios

B10. Elaboración del alimento de lombriz

La preparación del alimento (bagacillo de caña) se fundamentó en que las lombrices en promedio

consumen su peso en un día, excretando el 60% de éste.

El promedio en peso de las lombrices es de 0.375g, que se colocaron en el sistema, si se colocan 40

lombrices y en un periodo de 90 días consumirán:

0.375g/lombriz,día x 40 lombrices x 90 días = 1350g de alimento

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Biorremediación de un Suelo Contaminado con Hidrocarburos empleando Ácidos Húmicos y Lombrices