UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFacultad de Ciencias QumicasCarrera de QumicaLaboratorio de ElectroqumicaNombre: Carla CobaProyecto de Laboratorio1. Tema: Elaboracin de un biosensor de dopamina 2. Objetivo: Elaborar un biosensor para dopamina a partir de la cscara de pltano3. Fundamento terico:BiosensorUn biosensor se puede definir como un dispositivo compuesto por dos elementos fundamentales: un receptor biolgico preparado para detectar especficamente una sustancia aprovechando la exquisita especificidad de las interacciones biomoleculares y un transductor o sensor, capaz de interpretar la reaccin de reconocimiento biolgico que produce el receptor y "traducirla" en una seal cuantificable. Los dos constituyentes del biosensor estn integrados conjuntamente y es precisamente esta ntima unin de dos mundos opuestos (el "vivo" y el "inerte") la que le confiere a los dispositivos biosensores sus especiales caractersticas de sensibilidad y selectividad.Frente a ellas los biosensores ofrecen la posibilidad de obtener medidas directas, continuas, de forma rpida y con alta sensibilidad. Muchos biosensores ofrecen tambin las ventajas del pequeotamaoy laportabilidad, por lo que se podran utilizar en cualquier lugar, como el hogar o la consulta del mdico. Esto adems significa que la cantidad de muestra para hacer el anlisis es relativamente baja (demicroananolitros), lo que es muy importante si se trata de anlisis de sangre o deADNo si la muestra es cara o difcil de conseguir. (Instituto de Microelectrnica de Madrid)Determinacin de dopaminaLa dopamina o DA (4-(2-aminoetil) benceno-1, 2-diol) es una catecolamina biognica de origen natural, formada por la descarboxilacin de 3, 4-dihidroxifenilalanina . Es un precursor a la epinefrina y la norepinefrina en una ruta biosinttica, que funciona como un neurotransmisor en los sistemas nerviosos central y perifrico . La concentracin insuficiente debido a la prdida de clulas productoras de DA puede dar lugar a una enfermedad llamada enfermedad de Parkinson en el que una persona pierde la capacidad de ejecutar movimientos suaves y controlados . DA se puede suministrar como una medicina, sin embargo su exceso de dosificacin puede actuar sobre el sistema nervioso simptico, que causa una tasa de incremento de enfermedades del corazn y aumento de la presin arterial.Pocos mtodos basados en la modificacin qumica de materiales de los electrodos tradicionales han sido reportados para la determinacin de DA (por ejemplo , la determinacin electroqumica de DA en presencia de cido ascrbico usando micelas de dodecil sulfato de sodio como agente de enmascaramiento , 2B poli-cromotropo modificado electrodo de GC, Nafion (pelcula de material compuesto de hierro revestida de carbono en un electrodo modificado con nano partculas de quitosano), electrodo modificado con una pelcula hbrida Pt/Au, electrodo modificado con pelculas de nano partculas de oro auto-ensambladas y pasta de carbono con pelculas de polipirrol/ferrocianuro . Sin embargo, la mayora de estos mtodos se enfrentan a la oxidacin de las biomolculas en el electrodo, el ensuciamiento del electrodo (debido a la adsorcin de los productos de oxidacin), la seal analtica inestable, requiere alta sobre potencial, lmite de deteccin alta, una respuesta lenta y sobre todo son complejos. (Bakhsh Raoof & Kiani, 2011)

Polifenol oxidasaLa Polifenol oxidasa, PPO, es una de las enzimas mas estudiadas en la industria de los alimentos ya que es la responsable de las reacciones de pardeamiento enzimtico en frutas y verduras. Una de las razones por las cuales es importante su estudio es porque comercialmente es indeseable, ya que modifica las propiedades sensoriales, nutricionales y en general de calidad que perjudica la comercializacin de un producto. El banano que pertenece al gnero Musa, con sus innumerables variedades, es una fruta tropical de importancia comercial que sufre cambios en su textura, color a travs del proceso de maduracin. Los cambios asociados a la maduracin como bioqumicas, fisiolgicos y de composicin y el ablandamiento de los pltanos se han estudiado y reportado ampliamente durante las distintas fases de desarrollo en las cuales la polifenol oxidasa cumple un papel importante. (Guerrero Eraso, 2009)

El primer plano del sitio activo de la polifenol oxidasa muestra que utiliza seis aminocidos para quelar dos iones de cobre. Estos son histidinas, que tienen un grupo R cclico polar con tomos de nitrgeno con electrones no compartidos para proporcionar el poder quelante. Una de ellas se caracteriza porque est conectada por un enlace sulfuro a una cistena en otra parte de la protena. El diagrama muestra tambin el tomo de oxgeno de una molcula de agua a los asociados con los iones de cobre en el sitio activo. Otra caracterstica a tener en cuenta es la forma en que los iones de cobre en el sitio activo son en un bolsillo con dos lados que tienen los quelantes de histidina a partir de dos lugares distantes de la secuencia primaria. (Plant Physiology Information Website, 1998)4. Metodologa experimentalMateriales y reactivosMaterialesReactivos

Puntas de micropipetasDopamina (hidroclorato) 200 mg

Alambre de cobre rgido #4Cscara de pltano

Alambre de cobre delgadoSoluciones buffer de pH conocido

LagartosAgua destilada

Adaptadores

Pistola de silicona

EquipoMultmetro marca TruperProcedimientoPreparacin de los microelectrodos Cortar dos pedazos de alambre de cobre rgido #4 de aproximadamente 15 cm Lijar los alambres y limpiarlos con un algodn empapado ligeramente de alcohol En cada una de las puntas de micropipeta, colocar uno de los alambres hasta que atraviese la punta de la micropipeta e inmovilizar con silicona Para el electrodo de referencia, colocar una pequea cantidad de algodn en el extremo ms pequeo de la punta de micropipeta y llenarla con agua destilada, colocar uno de los alambres preparados anteriormente dentro de esta punta y cerciorarse de que no exista fuga de lquido. Inmovilizar el electrodo con silicona y colocarlo en un soporte. Para el electrodo de trabajo, colocar una pequea cantidad de la parte interna de la cscara de pltano en el extremo ms pequeo de la punta de micropipeta, colocar uno de los alambres preparados anteriormente dentro de esta punta y cerciorarse de que la punta del alambre y el interior de la cscara de pltano hagan contacto. Inmovilizar el electrodo con silicona y colocarlo en un soporte.

Calibracin del electrodo de referencia Tomar el electrodo de referencia y colocarlo junto a otro pedazo de alambre de cobre lijado dentro de un tubo eppendorf que contenga una solucin buffer de pH 4 Repetir el proceso con las soluciones buffer de pH 7 y pH 10 Realizar una curva y determinar la correlacin del microelectrodoPreparacin de la curva de calibracin de dopamina Preparar estndares de concentracin conocida a partir de la dopamina de 200 mg aforada a 25 mL Determinar el potencial de cada solucin Trazar la curva respectivaDeterminacin de una muestra de concentracin desconocida Determinar el potencial de la muestra Interpolar el dato de potencial en la curva de calibracin Anotar los resultados obtenidos5. Registro de datos experimentalesCalibracin del electrodopHV

4,000,04

7,010

10-0,07

Curva de calibracin de dopaminaC (mg)V (mV)

2008,43

1002,89

500,77

250,29

1-0,1

0-0,08

Muestra0,17

6. Clculos y resultadosGrfico de la curva de calibracin del microelectrodo de referencia

Grfico de la determinacin de dopamina

Clculo aproximado de la concentracin de dopamina en la muestraPotencial=0.0425C-0.6293

C=18.81 mg7. Observaciones La parte blanca de la cscara, ubicada dentro del microelectrodo, se tornaba marrn claro al cabo de dos determinaciones Se reemplaz la cscara de pltano, una vez que esta se tornaba marrn La punta de cobre del electrodo de referencia se torn ligeramente oscura luego de las determinaciones8. Conclusiones Se elabor un biosensor de dopamina a partir de la cscara de pltano Se determin la concentracin de una muestra de dopamina desconocida, correspondiente a 18.81 mg9. Discusiones La polifenol oxidasa trabaja de manera apropiada a un pH de 7 por lo que se debe controlar este factor si se quiere que el biosensor trabaje apropiadamente Puede existir interferencia de iones cobre con el centro reactivo del biosensor, por lo que se recomienda elaborar este tipo de microelectrodos con grafito (Wang & Shang Lin, 1988) El ndice de correlacin del biosensor no es apropiado debido a que estos equipos deben tener una alta sensibilidad a lo largo de las determinaciones El reemplazar la cscara de pltano a medida que se realizaron las determinaciones ayud a que el biosensor no se saturase y las determinaciones no se vieran afectadas Para elaborar este tipo de biosensores se debe inhibir las enzimas de inters para evitar su rpida degradacin y prolongar el uso del biosensor A pesar del ndice de correlacin aceptable, este biosensor no es de gran utilidad debido a que se debe reemplazar la cscara de pltano con demasiada frecuencia y eso supone molestias para el analista y aumento del error 10. BibliografaBakhsh Raoof, J., & Kiani, A. (28 de Febrero de 2011). Analytical & Bioanalytical Electrochemistry. Electrochemical Determination of Dopamine Using Banana-MWCNTs Modified Carbon Paste Electrode. Iran. Recuperado el 27 de Enero de 2014Guerrero Eraso, C. A. (2009). Recuperado el 27 de Enero de 2014, de Biblioteca Digital de repositorio Institucional: http://www.bdigital.unal.edu.co/1820/Instituto de Microelectrnica de Madrid. (s.f.). Recuperado el 27 de Enero de 2014, de Bio-Sens: http://www.imm.cnm.csic.es/RedBiosensores/tecnologia-de-biosensores.htmlPlant Physiology Information Website. (1998). Recuperado el 27 de Enero de 2014, de Enzyme Basics: http://plantphys.info/plant_physiology/enzymebasics.shtmlWang, J., & Shang Lin, M. (15 de Agosto de 1988). Mixed Plant Tissue-Carbon Paste Bioelectrode. Analytical Chemistry, 1545-1548.