BIOSÍNTESIS DE RNA - UNR

03/05/2019

1

Biología Molecular

BIOSÍNTESIS DE RNA

Dra. Elena G. Orellano

2019

Contacto: [email protected] de consulta: Martes 16.30 hs

Clases de biosíntesis de RNA

1‐Mecanismo de la transcripción. RNA polimerasas I, II y III.

Inicio de la transcripción. Elongación y terminación. Capping

y poliadenilación.

2‐ Procesamientos post‐transcripcionales‐ Splicing. Tipos de

intrones.

3‐ Técnicas empleadas en el estudio de la transcripción.

4‐ Regulación de la expresión génica.

03/05/2019

2

Mecanismos de transcripción en eucariotas

• RNA Polimerasas.

• RNA polimerasa II

Iniciación: Elementos cis y trans. Factores

generales de la transcripción.

Elongación y terminación.

TEMAS A DESARROLLAR

Dogma central de la Biología Molecular

“La información fluye del DNA a las proteínas”

Replicación

Transcripción Traducción

Retro‐transcripción

03/05/2019

3

Transcripción en células eucariotas

H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004

Secuencia de DNA necesaria para codificar un producto génico: RNA maduro funcional o proteína.

Región del genoma que contiene la información necesaria para sintetizar una molécula de polipéptido, miRNA (RNA pequeños no codificantes, microRNA) o

tRNA, rRNA ribosomal.

Existen 2 regiones con funciones diferentes en un gen

Región estructuralRegión regulatoria

Concepto de gen

03/05/2019

4

Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

Regiones promotora, codificante y terminadora de un gen típico

‐‐‐(‐) nt upstream (corriente arriba)‐‐‐+1‐‐‐‐(+) nt downstream (corriente abajo)

Hebra molde

Hebra no-molde Hebra sentido

Hebra antisentido

-200bp +200bp

TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS

n1ATP + n2GTP + n3CTP + n4UTP RNA + (n1+n2+n3+n4) PPi

PPi 2(n1,2,3,4) PiPPasa

DNA molde

RNA polimerasa

• Es el primer paso de la expresión génica.

• Síntesis de RNA dirigida por DNA (molde).

• El RNA es complementario a la hebra del DNA molde.

• RNA polimerasa: enzima que cataliza el proceso de transcripción.

• La polimerización no requiere cebador ni energía.

03/05/2019

5

Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

Fig. 5.2 Chemical reaction involved in the RNA polymerase-catalyzed synthesis of RNA on a DNA template strandTranscripción: síntesis de RNA

polimerasa

Cadena de RNA Cadena de DNA molde

RNA

Dirección de síntesis5´a 3’

TIPOS DE RNAs

miRNA(micro)

DNA

TRANSCRIPCIÓN

snRNA(pequeño no codificante)

rRNA(ribosomal) mRNA

(mensajero)

tRNA(de transferencia)

LncRNA(largo no

codificante)

03/05/2019

6

RNA polimerasas

RNA pol I RNA pol II RNA pol III

Nucléolo: genes 5.8S, 18S y 28S rRNA

Nucleoplasma: genes que codifican proteínas, siRNAs, snRNAs, microRNAs

Nucleoplasma: genes tRNAs, 5S rRNA, snRNAsU6, 7S RNAs, otros RNA pequeños

rRNA precursores mRNA precursores

mi‐RNA

5S rRNA, tRNA, snRNAs

EUCARIOTAS: 3 TIPOS

RNA pol IV y V en plantas siRNAs

Subunidades de las RNA polimerasas

*

* Cola CTD (Carboxy terminal domain)

J.D. Watson, et al. Molecular Biology of the Gene (5th. Edition), 2004.

03/05/2019

7

’

RPB3

RPB11

RPB2

RPB1

RPB6

RNA Pol. PROCARIOTARNA Pol.

PROCARIOTA

RNA pol. II EUCARIOTARNA pol. II EUCARIOTA

SITIO ACTIVO


RNA polimerasa II: Síntesis de mRNA

03/05/2019

8

Gen eucariota: estructura

Promoter/Enhancer 5’ UTR

Cis-Regulatory Elements

Start Codon ATG

Exon1 Exon2 Exon3

Stop CodonTAA, TAG, TGA

3’ UTR

Exon1 Exon2 Exon3

AAAAAAAAExon1 Exon2 Exon3

5’ UTR 3’ UTR

Start Codon Stop Codon

polyA tail

03/05/2019

9

Región promotora de genes transcriptos por la RNA polimerasa II: elementos cis

H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th‐ 7th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004, 2012

Gen de mamífero con TATA box

Gen de mamífero con isla CpG

Gen de levaduras

Caja TATA genes nucleares con alta tasa de transcripciónIslas CpG (60‐70%) de los genes de mamíferos 100‐1000pb‐ transcripción bidireccional

03/05/2019

10

Iniciación de la transcripción focalizada y dispersa

Focused versus dispersed transcription initiation.In focused transcription, there is either a single major transcription start site or several start siteswithin a narrow region of several nucleotides. Focused transcription is the predominant mode oftranscription in simpler organisms.In dispersed transcription, there are several weak transcription start sites over a broad region ofabout 50 to 100 nucleotides. Dispersed transcription is the most common mode of transcription invertebrates. For instance, dispersed transcription is observed in about two thirds of human genes. Invertebrates, focused transcription tends to be associated with regulated promoters, whereasdispersed transcription is typically observed in constitutive promoters in CpG islands.

Modos focalizados y dispersos de iniciación de la transcripción.En la transcripción focalizada, existe un único sitio de inicio de la transcripciónpredominante o un grupo de sitios de inicio en una pequeña región de variosnucleótidos.En la transcripción dispersa, hay múltiples sitios de inicio débil que se distribuyen en unaregión más grande de aproximadamente 50‐100 nucleótidos.Los promotores concentrados generalmente se asocian con genes regulados, mientrasque los promotores dispersos se encuentran típicamente en genes de mantenimiento,que mantienen niveles constantes de transcripción.

03/05/2019

11

Mecanismos hipotéticos para la transcripción de promotores focalizados y dispersos.(a) En el modelo para promotores focalizados, el complejo de preiniciación de transcripción(PIC) se ensambla en una única ubicación en el promotor central, y la selección del sitio deinicio se determina por la preferencia de la RNA polimerasa II para iniciar la transcripción ennucleótidos cercanos. En algunos casos, puede haber un nucleótido fuertemente favorecido yse observa un solo sitio de inicio predominante. En otros casos, la transcripción puede iniciarseen múltiples nucleótidos que no son necesariamente adyacentes entre sí.(b) En el modelo de transcripción dispersa, existen múltiples promotores débiles que se creanmediante la combinación de un sitio de unión de un factor de unión a DNA específico desecuencia, como Sp1 o NF‐Y, y un iniciador (Inr) ‐ como secuencia. Por lo tanto, una únicaunidad promotora sería un sitio de unión de factor específico de secuencia y una secuencia detipo Inr. Estas unidades promotoras se pueden organizar tanto en tándem como intercaladas.

Promotor central y Elementos proximales


03/05/2019

12

Promotor central Promotor central Caja TATA


03/05/2019

13

Elementos Regulatorios que actúan en trans


Proteínas que actúan en transFactores de transcripción

• Factores Basales se unen al

promotor. Proteínas:

– TBP (TATA binding protein)

– TAF (Factores asociados a la

transcripción)

• RNA polimerasa II interacciona

con los factores basales


03/05/2019

14

Factores generales de la transcripción (GTFs)Factores generales de la transcripción (GTFs)


Proteínas Activadoras

• Se fijan a las regiones amplificadoras o “enhancer” del

DNA de manera específica

• Interaccionan con otras proteínas y/o con el DNA para

activar e incrementar la transcripción (~100‐veces los

niveles basales)

• Dos dominios estructurales que median estas funciones:

– Dominio de unión a DNA

– Dominio de unión a proteínas

03/05/2019

15

Activadores

Transcripcionales

Se unen a enhancers

específicos en tiempos

determinados para

incrementar los niveles

transcripcionales


Canales de la RNA polimerasa II

Sitio de corrección‐edición del RNA

03/05/2019

16

Funciones de la RNA polimerasa IIFunciones de la RNA polimerasa II

Desenrolla el DNA por delante

Renaturaliza el DNA por detrás

Polimeriza/sintetiza el RNA

Disocia la cadena de RNA del DNA

Revisa y corrige el RNA

Desenrolla el DNA por delante

Renaturaliza el DNA por detrás

Polimeriza/sintetiza el RNA

Disocia la cadena de RNA del DNA

Revisa y corrige el RNA

Funciones de la RNA polimerasa IIFunciones de la RNA polimerasa II

RNA polimerasa realiza dos funciones de corrección de pruebas

Edición pirofosforolítica. La enzima utiliza su sitio activo, en un back‐reacción simple, para catalizar la eliminación de un ribonucleótido incorrectamente insertado, mediante la incorporación de PPi. La enzima puede entonces incorporar otro ribonucleótido en su lugar en la cadena de RNA en crecimiento (puede eliminar bases correctas o incorrectas).

En el segundo mecanismo de corrección de pruebas, llamado de edición hidrolítica, la polimerasa retrocede por uno o más nucleótidos y escinde el producto de RNA, la eliminación de la secuencia que contiene errores.

RNA polimerasa realiza dos funciones de corrección de pruebas

Edición pirofosforolítica. La enzima utiliza su sitio activo, en un back‐reacción simple, para catalizar la eliminación de un ribonucleótido incorrectamente insertado, mediante la incorporación de PPi. La enzima puede entonces incorporar otro ribonucleótido en su lugar en la cadena de RNA en crecimiento (puede eliminar bases correctas o incorrectas).

En el segundo mecanismo de corrección de pruebas, llamado de edición hidrolítica, la polimerasa retrocede por uno o más nucleótidos y escinde el producto de RNA, la eliminación de la secuencia que contiene errores.

03/05/2019

17

CTD: 52 repeticiones de Tyr‐Ser‐Pro‐Thr‐Ser‐Pro‐Ser

Core de la RNA polimerasa y cola CTD

2 5 7

Subunidad RPB1

1 4

Etapas de la transcripción

• El proceso de transcripción consta de tres etapas:

• Iniciación

• Elongación

• Terminación

• El RNA es transcripto desde un DNA molde después que las

bases del DNA son expuestas por desenrollado de la doble

hélice.

• En una dada región del DNA, solamente una de las dos hebras

puede actuar como molde para la transcripción del RNA.

Documents

BIOSÍNTESIS DE RNA - UNR