Biotecnolog a Auspicios y!Mejoramiento!Vegetal!IIecaths1.s3.amazonaws.com/geneticafacena/964557477.Biotecnologia y... · y!Mejoramiento!Vegetal!II Consejo Argentino para la Información

Instituto Nacional de Tecnologa AgropecuariaEdiciones

Biotecnologay Mejoramiento Vegetal IIConsejo Argentino para la Informacin

y el Desarrollo de la Biotecnologa

Editores: , Viviana Echenique,Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis MroginskiGabriela Levitus

Auspicios

www.argenbio.org

INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGA AGROPECUARIAARGENBIO -

1Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

Editores:Dra. Gabriela Levitus,

Dra. Viviana Echenique,

Dra. Clara Rubinstein,

Dr. Esteban Hopp

Ing. Agr. Luis Mroginski.

2 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II


ndice

Prefacio ...............................................................................................................................

Agradecimientos ................................................................................................................

Lista de Autores ..................................................................................................................

Prlogo a la Primera Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo .............................................

Prlogo a la Segunda Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ...........................................

Parte I: Herramientas Bsicas ...........................................................................................

Captulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland .

Captulo 2: Morfognesis. Silvia Radice ...

Captulo 3: La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas ve-getales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germn Robledo, Aveliano Fernndez y Viviana G. Sols Neffa. ..................................................................................................................................................

Captulo 4: Herramientas bsicas de ingeniera gentica. Ingrid Garbus, Marisa Gmez y Vi-viana Echenique. ................................................................................................................................

Captulo 5: Marcadores moleculares. Mara Carolina Martnez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera.

Captulo 6: Construccin de mapas de ligamiento gentico, localizacin de genes y regiones cromosmicas asociadas a caracteres de inters en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pa-blo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. .........................................................................................................

Captulo 7: Genmica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y Gustavo Schrauf. ..............................................................................................................................................

Captulo 8: Transcriptmica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. ..........................................................

Captulo 9: Protemica. Paula Casati y Mara F. Drincovich .............................................................

Captulo 10: Metabolmica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J. Vila y Estela M. Valle. .........................................................................................................................

Captulo 11: Metagenmica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ...................................................

Captulo 12: Bioinformtica aplicada a la biotecnologa vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz, Paula Fernndez, Vernica Lia, Corina Fusari. ...................................................................................

Parte II: Mtodos para generar y analizar diversidad

Captulo 1: Polinizacin y fertilizacin in vitro. Susana Cardone, Gladys Prez Camargo y Aurora Picca. ..................................................................................................................................................

Captulo 2: Hibridacin somtica. Pablo Polci y Pablo Friedrich. ....................................................

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Captulo 3: Epigentica y evolucin!"#$%&'()"*!"+&,-.//$"0"1&'/),"2!"+&'3/""!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Captulo 4. Mutagnesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, Mara Gabriela Pacheco y Esteban Hopp ...................................................................................................................

Captulo 5: Variacin somaclonal. Susana Cardone, Sofa Olmos y Viviana Echenique. ...............

Captulo 6: Aplicacin de la transformacin gentica al mejoramiento vegetal. Marina L. Daz,

Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Ral D. Ros ...............................................................

Captulo 7: Usos del silenciamiento gnico para el anlisis funcional de genes candidatos. Cecilia Vzquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodrguez, Natalia Almasia y Sebastin Asurmendi ..

Captulo 8: Anlisis de experimentos biolgicos. Sofa Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ib-ez, Nlida Winzer ..............................................................................................................................

Captulo 9: Mtodos multivariados para estimar variabilidad gentica. Nlida Winzer, Miguel DiRenzo, Sofa Olmos y Mercedes Ibez. .........................................................................................

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Captulo 1: Obtencin de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Vernica Conti y Rubn Miranda y Nicols Gear. ....................................................................................................................................

Captulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, An-tonio Garayalde y Marcelo Helguera. ..................................................................................................

Captulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento gentico de cultivos. Carlos Sala, Maria-no Bulos, Anala Fresco y Emiliano Altieri. ..........................................................................................

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Captulo 5: Aplicacin de la biotecnologa en la mejora y conservacin de especies forestales. Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry ....................

Captulo 6: Tcnicas de ingeniera gentica para conferir resistencia a virus en plantas. Maria-na del Vas, Ana Julia Distfano, Cecilia Vzquez-Rovere, Esteban H. Hopp. .....................................

Captulo 7: Obtencin de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrin Vojnov, Mer-cedes Rivero y Diego Zappacosta .......................................................................................................

Captulo 8: Aproximaciones biotecnolgicas para un manejo sustentable del estrs fngico en la agricultura. Juan Carlos Daz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martnez-Zamora; Sergio Sala-zar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontivero

y Atilio Pedro Castagnaro. ...................................................................................................................

Captulo 9: Utilizacin de cultivos de tejidos para la obtencin y conservacin de plantas li-bres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................

Captulo 10: Obtencin de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ...............

Captulo 11: Aplicaciones biotecnolgicas al manejo de malezas. Germn Ferrari y Julio E. De-lucchi. ..................................................................................................................................................

Captulo 12: Obtencin de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abiticos. Florencia del Viso, Andrea F. Puebla, Nstor Carrillo y Raquel L. Chan .............................................................

Captulo 13: Manipulacin gentica del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Ma-ra Binaghi ...........................................................................................................................................

Captulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus .............................

Captulo 15: Fitorremediacin. Mara Eugenia Segretn, Paula Bey y Alejandro Mentaberry .............

Captulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, Mara Eugenia Segretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matas Lentz. .........................................................................

Parte VI: Manejo responsable de la tecnologa

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Captulo 3: Biotecnologa en la mira: el problema de la percepcin. Valeria Durand ...............

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PREFACIO

En oportunidad de la Primera Edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, nos habamos

propuesto responder a la necesidad de un texto en idioma espaol, dirigido a docentes y estudian-

tes de los cursos de Agronoma y de otras formaciones relacionadas con las tecnologas aplicadas

al mejoramiento vegetal, as como brindar un recurso de informacin general y consulta para no

especialistas. Esta Segunda Edicin, intenta actualizar, profundizar y extender estas temticas,

atendiendo a la rpida evolucin en este campo del conocimiento.

En el contexto de los principios bsicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad genti-

ca y seleccionar caractersticas deseables, las tecnologas evolucionan rpidamente y, del mismo

modo, se acelera la transferencia del conocimiento bsico a las aplicaciones. Esta edicin intenta

'.4.5&'".,6."7')%.,)"($89:$%)"0"&7)'6&'" $8;)':&%$%8$%&,"&"%&,),".,7.%?3%),@",."A'$8(&8".5.:7/),"(.":.5)'&:$.86)"/)B'&()"

en diferentes especies.

La tecnologas omicas (genmica, transcriptmica, metabolmica) constituyen una de las herra-

mientas ms importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campo

(."/&"$8C.,6$B&%$


AGRADECIMIENTOS

A todos y cada uno de los 141 autores, en su mayora investigadores y profesionales de institu-

ciones argentinas, que han contribuido con sus aportes.

Al Dr. Francisco Garca Olmedo, reconocido investigador y catedrtico espaol, por regalarnos

tambin el prlogo de esta segunda edicin.

Al Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa (ArgenBio), por aus-

piciar la publicacin del libro.

A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar este

proyecto.

Los Editores

!"#$%'(#)$(*+(%#,#*&-./(%#0&-(/012"(%#(*#(%+(#'&0$-(*+(%#%3"*/2#5*(%#'(#1'(*+1502013*#

y no implica ningn aval ni recomendacin. Adems, los contenidos u opiniones expresadas en

esta publicacin son de exclusiva responsabilidad de los autores.

LISTAS DE AUTORES (por orden alfabtico)

Abriata Luciano A. Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Aguilar O. Mario IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP

Almasia Natalia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Altieri Emiliano Nidera Semillas

Asurmendi Sebastin Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Bazzini Ariel Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Bey Paula INGEBI, CONICET

Binaghi Mara Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

Bravo Almonacid Fernando INGEBI, CONICET

Bulos Mariano Nidera Semillas

Burachik Moiss Dir. de Biotecnologa, Min. de Agricultura, Ganadera y Pesca

Cardone Susana Facultad de Agronoma, UBA

Carrari Fernando Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Carrera Alicia Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur

Carrillo Nstor IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR

Casati Paula CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario

Castagnaro Atilio Pedro EEAOC, Tucumn

Cervigni Gerardo D. CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario

Chalfoun Nadia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn

Chan Raquel L. Universidad Nacional del Litoral

Chantre Guillermo CERZOS, CONICET, Universidad del Sur

Conci Vilma INTA IFFIVE

Confalonieri Viviana Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA)

Conti Vernica INTA-EEA Bordenave

del Vas Mariana Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

del Viso Florencia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Delucchi Julio E. Monsanto Argentina


Daz Marina L. CERZOS, CONICET, Universidad del Sur

Daz Ricci Juan Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn

DiRienzo Miguel Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de Crdoba

Distfano Ana Julia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Drincovich Mara F. CEFOBI, Universidad Nacional de Rosario

Durand Valeria Ketchum Argentina - ArgenBio

Echenique Viviana Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur

Escandn Alejandro S. Instituto de Floricultura, INTA Castelar

Feingold Sergio E. INTA - EEA Balcarce

Felitti Silvina Universidad Nacional de Rosario

Fernndez Aveliano Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONE

Fernndez Paula Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Ferrari Germn Monsanto Argentina

Ferrari Mara Rosa Universidad Nacional de Buenos Aires

Filippone Paula EEAOC, Tucumn

Flaschland Eduardo Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE

Franzone Pascual M. IGEAF INTA Castelar

Fresco Anala Nidera Semillas

Friedrich Pablo Universidad Nacional del Sur

Fusari Corina Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Galdeano Ernestina Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE

Gallo Leonardo INTA - EEA Bariloche

Garayalde Antonio CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Garbus Ingrid CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Garca Ana Mara Facultad de Agronoma, UBA

Garca Olmedo Francisco Universidad Politcnica de Madrid

Gear Nicols Syngenta

Gmez Marisa CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Gonzlez Graciela Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

Grasso Daniel H. Instituto de Suelos, INTA Castelar

Greizerstein Eduardo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

Grellet Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn

Gutirrez Agustina Universidad Nacional del Sur

Heinz Ruth Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Helguera Marcelo INTA EEA Marcos Jurez

Hopp Esteban Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Ibez Mercedes Universidad Nacional de Ro Cuarto

Labarta Marcelo Instituto Nacional de Semillas INASE

Landau Alejandra Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Lavia Graciela I. Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE

Lentz Ezequiel M. INGEBI, CONICET

Levitus Gabriela ArgenBio

Lewi Dalia IGEAF INTA Castelar

Lia Vernica Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Longo Florencia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Loray Mara Alicia Direccin de Calidad - INASE

Luciani Gabriela CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Mamani Alicia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn

Marcucci Poltri Susana Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

+&'3/ Carlos F. INTA - EEA Mendoza

Marinangeli Pablo A. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Martnez Ma. Carolina Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar


Martnez-Zamora Gustavo INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn

Masuelli Ricardo W. INTA - EEA Mendoza

Meier Mauro CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Mentaberry Alejandro Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

Miranda Rubn Asociacin Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del Sur

Morgenfeld Mauro INGEBI, CONICET

Mroginski Luis Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE

Nisensohn Luisa Universidad Nacional de Rosario

Olmos Sofa Laboratorio de Biotecnologa, INTA Pergamino

Ontivero Marta INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn

Ortiz Juan Pablo Facultad de Ciencias Agrarias, UNR

Pacheco Ma. Gabriela IGEAF INTA Castelar

Paniego Norma Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Prez Camargo Gladys Facultad de Agronoma, UBA

Prez de la Torre Mariana Instituto de Floricultura, INTA Castelar

Pessino Silvina C. Facultad de Ciencias Agrarias, UNR

Picca Aurora Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur

Poggio Lidia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

Polci Pablo Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur

Poverene Mnica Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur

Prina Alberto IGEAF INTA Castelar

Puebla Andrea F. Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Radice Silvia INTA Castelar

Rey Hebe Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE

Ros Ral D. IGEAF INTA Castelar

Rivero Mercedes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

Robledo Germn Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE

Roca Cecilia Dow Agrosciences

Rodrguez Cecilia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar

Roncallo Pablo CERZOS, CONICET

Rubinstein Clara Monsanto Argentina ILSI

Sabbatini Mario R. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Sala Carlos Nidera Semillas

Salazar Sergio INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn

Sansberro Pedro Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE

Scarpeci Telma E. IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNR

Schrauf Gustavo Facultad de Agronoma, UBA

Scocchi Adriana Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONE

Segretin Ma. Eugenia INGEBI, CONICET

Seijo Guillermo Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONE

Selva Juan P. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Sharry Sandra Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de La Plata

Sols Neffa Viviana G. Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONE

Spangenberg Germn Victorian Department of Primary Industries (DPI)

Tomas Pablo FCA, Universidad Nacional del Litoral

Tonello Ursula INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de Tucumn

Torales Susana IRB, INTA Castelar

Tranquilli Gabriela IRB, INTA Castelar

Tuesca Daniel Facultad de Ciencias Agrarias, UNR

Ureta Soledad CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del Sur

Valle Estela M. IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR

Vzquez Rovere Cecilia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar


Vellicce Gabriel EEAOC, Tucumn

Vicario Ana Laura Direccin de Calidad INASE

Vicin Carmen Facultad de Agronoma, UBA

Vila Alejandro J. IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNR

Vojnov Adrin Fundacin Pablo Cassar

Winzer Nlida Universidad Nacional del Sur

Wirth Sonia INGEBI, CONICET

Wulff Arturo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

Zappacosta Diego C. Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del Sur

Zelada Alicia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

Zelener Noga IRB, INTA Castelar

PRLOGOS

Prlogo a la primera edicin

Recientemente, un periodista, que comparta una ensalada con un bilogo, exclam: Si yo

slo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el bilogo le

explic que al comer sta no haba ms opcin que engullir unos 25.000 genes del genoma de

Lactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los mi-

%'))'B&8$,:),"D-."N&A$6-&/"0"%8$-

cos, ingeniera gentica, ADN recombinante, transferencia gnica, clonacin, alimentos natura-

les, mejora gentica e, incluso, biotecnologa, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin orden

ni concierto. A estas alturas empieza a ser difcil normalizar la situacin, pero tratemos de con-

tribuir a ello.

R&"(.38$%$/@",.&8">,6&,"%>/-/&,")".8=$:&,"&$,/&(&,!"S&5)".,6&"(.38$%$


insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el trmino de forma restringida para referirse

exclusivamente a los ltimos avances basados en la biologa molecular. Para esto ltimo resulta

ms adecuado el uso de la expresin biotecnologa molecular.

T'9%6$%&:.86."/&"6)6&/$(&("(."/)"D-."7)8.:),".8"8-.,6'&":.,&"N&",$()"B.8>6$%&:.86.":)($3-

cado. La domesticacin de plantas y animales supuso una alteracin muy drstica de sus geno-

:&,"0"/&":.5)'&"B.8>6$%&",-A,$B-$.86."N&"$()"&U&($.8()":)($3%&%$)8.,".V6.8,&,"0",-,6&8%$&/.,!"

Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los mtodos empleados para

ello. De hecho, la ingeniera gentica es slo uno de esos mtodos - una modalidad ms de me-

5)'&"B.8>6$%&"O"0",6)(),@")A5.6$C),"0"/)B'),"(."/&"&/6.'&%$


Prlogo a la segunda edicin

La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedan

encadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segunda

edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, un texto que, hace seis aos, supuso una es-

7/>8($(&"0"&;)'6-8&(&"&7)'6&%$%8$%)".8"/&"(.'')6&"(."/&"&:.8&=&":&/6-,$&8&@"0&"D-."/&",-7.'3-

cie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto conciencia

de que no se sabe bien cmo se va a conseguir el aumento de la produccin de alimentos en un

70-100 % para el ao 2050, necesidad que se considera mnima para alimentar una poblacin pro-

yectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, adems, tendrn una demanda per cpita

,$B8$3%&6$C&:.86.",-7.'$)'"&"/&"&%6-&/!"M$",."D-$.'."/)B'&'"($%N)")A5.6$C)@"N&A'.:),"(.",.'"&Y8":9,"

.3%&%.,".8"/&,"7'


PARTE I

Herramientas bsicas


I - CAPTULO 1

Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales

Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland

1 Introduccin

El cultivo de tejidos en su acepcin amplia !"#$#%'%$#()*$+%,+-+%")%,+).")/+%-"0%1#/#-rogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte sepa-rada del vegetal que pueden ser protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u rganos) se cultiva aspticamente en ")%-#$*+%2'/*(,*23%$#%,+-!+&*,*4)%5"6-*,2%$#-()*$2%0%%*),"72%#)%,+)$*,*+)#&%2-7*#)/23#&%,+)/'+32$2&8%92% *-!'#,*&*4)%$#%#&/2%$#()*,*4)%puede generar muchas polmicas, pero es ac-tualmente aceptada. Generalmente es comn dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semis-3*$+&%0%7:%,"3/*;+&%#)%-#$*+&%365"*$+&'2)%*-!+'/2),*2%#)%32%-20+'62%de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura.

2 Explante

Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:

1. Objetivo del cultivo:%&*%7*#)%#&%$*?6,*3%/'2/2'%$#%,32&*(,2'%32&%2!3*,2,*+)#&%5"#%%!#'&*>"#)%%,+)%#3%,"3/*;+%$#%/#.*$+&


de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes.@% !"#$%&'(%) *$) +,"-'*./) '%#$-$/0$&,1&./.

Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo ,+-+%20"$2%!2'2%32%+7/#),*4)%$#%167'*$+&%$#'*-;2$+&%$#%,'"I2-*#)/+&%*)/#'#&!#,6(,+&+% !32I+% D,'6+L,+)';2,*4)% ,+)%)*/'4>#)+% 365"*$+:% 0%!2'2%#3%intercambio de material gentico.

@% Establecimiento de suspensiones celula-res. En este caso se recomienda iniciar los cul-/*;+&%2%!2'/*'%$#%#B!32)/#&%#B/'26$+&%$#%-*332&%en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledo-)#&C)#&*&8%J+-+%'#>32%general se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cul-tivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plan-tas leosas, la edad del explante es un factor ,'6/*,+8%P*%3+&%/#.*$+&%&+)%.4;#)#&


grado de dormicin que presentan ciertos ex-plantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos.

3 Asepsia

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mis-mos con diversos tipos de microorganismos D1+)>+&2)%;*'"&%0%(/+!32&-2&


En los casos en que no se utilice etanol, la adicin de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una prctica recomendada. K)/'#% 3+&%-R&%"&2$+&%(>"'2)%TU##)LHV% DV2)*&-+&%#)$4(/+&8%X)+% % $#% #&/+&%compuestos es el PPM (Plant Preaservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la ,2Q2%$#%2IA,2'8%K&/#%,+-!"#&/+


infecten con etanol al 70 %. La utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras $#%32%7+,2%0%$#%32%)2'*I+''+&%protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminacin.

Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de es-tos instrumentos pueden ser colocados en eta-nol al 95% y, antes de ser usados, se deben O2-#2'%,"*$2$+&2-#)/#%#)%%32%332-2%$#%")%-#-,1#'+8%T2-7*C)%#&%)#,#&2'*+%%O2-#2'%32%7+,2%de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante.

6) Incubar los cultivos en cmaras o cuar-tos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulacin de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos culti-vos sean esterilizados.

4 Medios de cultivo

X)% -#$*+% $#% ,"3/*;+% !"#$#% '% $#()*$+%%como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nu-tricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formu-laciones disponibles, George y col., luego de '#;*&2'%-R&%$#%S8VVV%/'272.+&%,*#)/6(,+&%%$#&-criben en dos tomos (casi 1.000 pginas en to-tal) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropa-gacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad.

Bsicamente, los medios de cultivo se com-ponen de compuestos que suministran: @%X)2%?"#)/#%$#%,2'7+)+%@%Y"/'*#)/#&%-*)#'23#&@%ZP"&/2),*2&%;*/2-6)*,2&%@%P"&/2),*2&%'#>"32$+'2&%$#3%,'#,*-*#)/+%%@%=>#)/#% >#3*(,2)/#% D#)% #3% ,2&+% $#%-#$*+&%%

semislidos)

@%[/'+&%,+-!"#&/+&8

Fuente de carbono: Prcticamente todos los cultivos son hetertrofos (comparativamente unos pocos son auttrofos) y por ende necesi-tan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azcar ms utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particu-lares se cita el empleo de maltosa o galacto-sa. Tambin myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos.

Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y micro-nutrientes que son esenciales para el creci-miento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente

Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos usados en el cultivo in vitro de tejidos.

NH4NO3 1.650 ----- -----KNO 3 1.900 2.830 2.500KH2PO4 170 400 -----CaCl2.2H2O 440 166 150(NH4)2SO4 ----- 463 134MgSO4.7H 2O 370 185 250NaH2PO4.4H2O ----- ----- 150KI 0,83 0,80 0,75MnSO4.H2O ----- ----- 10,00H3BO3 6,20 1,60 3,00MnSO4.4H2O 22,30 4,40 -----ZnSO4.7H2O 8,60 1,50 2,00Na2MoO4.2H2O 0,25 ----- 0,25CuSO4.5H2O 0,025 ----- 0,025FeSO4.7H2O 27,80 27,85 27,80Na2EDTA 37,30 37,25 37,30CoCl2.6H2O 0,025 ----- 0,025Glicina 2,00 2,00 -----Tiamina -HCl 0,10 1,00 10,00Piridoxina-HCl 0,50 0,50 1,00cido Nicotnico 0,50 0,501,00Mioinosito l 100,00 ----- 100,00Sacarosa 30.000,00 50.000,00 20.000,00

PH 5,7 5,8 5,5

1) Composicin en mgL-1

- 1.

MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97.1962)

N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C.,y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975)

B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.CellRes. 50: 151 - 158. 1968)

Medio bsico1

Compuestos

MS N6 B5


altas de nitrgeno y potasio. El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y ,2)2%1*$'+3*I2$28%K&%?")$2-#)/23%5"#%#3%1*#-rro sea incorporado juntamente con un agente 5"#32)/#%DY2HK\T=:")2&%ocasiones para el cultivo de meristemas o para 32%#3+)>2,*4)%$#%7'+/#&8%K3%=^=


sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfolgicas, anat--*,2&% 0% (&*+34>*,2&% % 5"#% 32&% !32)/2&% $#7#'R)%corregir cuando son transferidas al ambiente #B/#')+8%K&/#%!#'6+$+%$#%2$2!/2,*4)%23%)"#;+%hbitat es llamado fase o etapa de aclimata-cin. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber contemplar el control minucioso de los parmetros ambientales (hu-medad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratacin y, al mismo /*#-!+2'% #3% ?+/+!#'6+$+8%=&*-*&-+


La humedad relativa de la fase area es con-trolada por un sensor (6) ubicado por encima $#%32%/"7#'62%$#%'*#>+%D]:8%K3%&*&/#-2%1"-*$*(-cador est compuesto por picos tipo fog y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta presin (13). Con el propsito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua rema-)#)/#% #)% 32&% ,2Q#'62&


7. Agradecimientos.

9+&%2"/+'#&%2>'2$#,#)%23% F)>8%E273+%=8% 9")2%!+'%32%!32)*(,2,*4)%$*>*/23%$#%32%,R-2'2%$#%2,3*--2/2,*4)8%=% 32%P#,'#/2'62%b#)#'23%$#%J*#),*2%y Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La Ca-,1"#'2% !+'% #3% 2!+'/#% ()2),*#'+% '#,*7*$+% !2'2%construir la misma.

8. Lecturas Recomendadas

bK[ibK62%$#%%E32)/2&8P2)/2%J32'28%J"728%ShV%pg.

E[PE[PF9[G=


I - CAPTULO 2

Morfognesis

Silvia Radice

1.- Introduccin

La embriognesis somtica y la organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuen-tes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrin cigtico sin que medie la fertilizacin de las gametas, mientras que por organog-)#&*&%!"#$#)%+7/#)#'%/233+&"32$+'#&%$#3%,'#,*-*#)/+%$#7*$+%2%que esos compuestos eran an desconocidos. Los avances en el cultivo de tejidos vegetales ?"#'+)%-"0%3#)/+&%#)%&"&%*)*,*+&8%K)%WhS]"32,*4)%5"6-*,2%#)%32%!2'/#%2C'#2%0%#)%32%'26I8%T'272.+&%!+&/#'*+'#&%#)%,233+&%$#%32%misma especie, con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta, permitieron $#-+&/'2'%5"#%32%$*?#'#),*2,*4)%$#%7'+/#&2)+>C)*,+%!#'+%2$5"*#'#)%esa competencia durante una fase de desdi-ferenciacin. En la segunda fase o fase de in-$",,*4)


2%!2'/*'%$#%")2%,C3"32%#!*$C'-*,2%+%$#3%-#&4(3+%?+3*2'


Las clulas embriognicas son similares a las clulas meristemticas debido a que no son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo agrandado y pequeos granos de almidn. Es-tas clulas, que en general se agrupan, pueden variar en tamao y nmero. Dentro de un gru-

po de clulas embriognicas, el desarrollo de las mismas no est sincronizado. Estas clulas son capaces de dividirse o de transformarse en embriones segn las condiciones del medio $#%,"3/*;+8%=5"#332&%,C3"32&%5"#%)+%$#&2''+332)%proembriones comienzan el proceso de dife-renciacin, es decir se vacuolizan, disminuye

Figura 2: A-E Organognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A, callo organognico obtenido en Abelia sp8%D=)$'C:%i#1$#'%,"3/*;2$2%#)%mP%s%W%->%3-1 de picloran. B


el volumen de ncleo y nucleolo y desaparecen los grnulos de almidn.Las experiencias demuestran que las clulas embriognicas se desarrollan slo cuando se -+$*(,2)%32&%,+)$*,*+)#&%$#%,"3/*;+8%K)%>#)#-ral, cuando se reducen las cantidades de auxi-na y citocinina o se elimina la auxina.Las clulas embriognicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimen-tales permiten que estas expresen su poten-cial. Pueden ocurrir dos condiciones ontog-nicas diferentes, es decir que el origen de los embriones sea unicelular o pluricelular.En el caso de iniciarse a partir de una clula, la -*&-2%%26&32%$#%32&%$#-R&%!+'%")2%*-!+'/2)-/#%-+$*(,2,*4)%#)%&"%!2'#$%,#3"32'% W% =


de los estratos procambiales y de manera su-cesiva el desarrollo del pice radical. El pice de tallo se desarrolla ms tarde, durante la eta-pa cotiledonar. En los embriones somticos de algunas especies hay una etapa intermedia en-tre la globular y corazn llamada oblonga, que corresponde a la individualizacin del pice de

32%'26I%0%23%!'+,2-7*"-%#)%'#&!"#&/2%2%32%#3+)-gacin axial del embrin somtico debido al transporte de auxinas (Fig 1 C).Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que 3+&%,*>4/*,+&%3-1%$#%^=E%WV%B8%B, yemas 2$;#)/*,*2&%DO#,12&:%#)%R!*,#&%$#%Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1%$#%F^=%s%V8e%mg l-1%$#% =E%s%V%3-1%$#%b=

3 4 x. C'"!+%$#%,C3"32&%#-7'*+>C)*,2&%DO#,12&:%#)%Codiaeum variegatum

(L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn. 20 x. D, embriones somticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x. E, embriognesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x.


Sin el seguimiento histolgico detallado, la for-macin del embrin somtico slo puede ser ,+)('-2$2% !+'% 32% >#'-*)2,*4)% Dj*>% W% j:8% P*)%embargo, debido al bajo porcentaje de embrio-nes que llegan a esta etapa, esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluacin de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. Comparados con los embriones cigticos de la misma especie, los embriones somticos fre-cuentemente desarrollan de manera anormal +%&+)% *)-2$"'+&8%92%2)+-2362%-R&% ?'#,"#)/#-mente encontrada es la formacin doble o tri-ple del sistema vascular, causada por la pobre polarizacin del transporte de auxinas. Tambin se puede encontrar un contenido excesivamen-te alto, reducido o ausente de las reservas de almidn y/o proteicas, que el meristema apical o radical no estn desarrollados o que la embrio-gnesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E).La falta del meristema apical o una escasa deposicin de sustancias lipoproteicas en los embriones somticos de algunas especies no $#7#% '% /+-2$2% ,+-+% ")2% 2)+'-23628% K&/+%!"#$#% '% ")% &6)/+-2% $#% *)-2$"'#I% $#7*$+%a la rpida formacin de los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la ma-duracin de las estructuras formadas permitir incrementar el porcentaje de embriones som-ticos capaces de germinar.

4.- Factores que afectan los procesos morfognicos

Los cuatro principales factores que condicio-nan la obtencin y el crecimiento de nuevos rganos in vitro son:

4.1.- el genotipo 4.2.- las ,+)$*,*+)#&% 5"6-*,2& seleccionadas para realizar el cultivo.4.3.- las ,+)$*,*+)#&% ?6&*,2& seleccionadas para realizar el cultivo.4.4.- el explante.

4.1.- El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfognicos, desde la ca-pacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro a la proliferacin de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rga-

nos. Por esta causa, no es posible generalizar -#/+$+3+>62&%+%!'+/+,+3+&%$#%/'272.+%$#7*$+%2%5"#%3+&%-#$*+&%$#%,"3/*;+'#>2$+%$#%thidiazurn. El genotipo y el tipo y concentra-cin de reguladores del crecimiento empleados estn estrechamente relacionados. 4.2.3.- antibiticos. En procesos de transfor-macin con Agrobacterium tumefaciens es muy comn el agregado de antibiticos del tipo cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminacin de la bacteria. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domes-tica se encontr que 250 mg L1 de cefotaxime 2"-#)/2)% &*>)*(,2/*;2-#)/#% 32% '#>#)#'2,*4)%de brotes mientras que 500 mg L1 de carbe-nicilina promueven la formacin de callo y la


kanamicina inhibe los procesos morfognicos.4.2.4.- carbn activado. En general se usa para adsorber compuestos txicos de la micro atms-fera gaseosa o el exceso de reguladores del cre-cimiento presentes en el medio de cultivo pero K8`8%E#//#'&&+)%0%&"%#5"*!+%$#%,+327+'2$+'#&%$#%32%PU#$*&1%X)*;#'&*/0%+?%=>'*,"3/"'##)/#% >#3*(,2)/#%-R&%"/*3*I2$+%#)% #3% ,"3/*;+% in vitro%#&%#3%2>2'2&%-2-rinas. Las diferentes calidades existentes en el -#',2$+% -+$*(,2)% 32% #B!'#&*4)% -+'?+>C)*,2%debido a que pueden contener sustancias inhi-bitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis (en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de =F=%s%W%->_9%$#%^=E:%,"02%'#&!"#&/2%-+'?+>C)*-ca vari segn el tipo de agar utilizado. Cuando #3%>#3*(,2)/#%#-!3#2$+%?"#%J1"7"/L2>2'2$+%$#%2>2'%PFbm=%R slo se indujo la proliferacin de callo.K)%,2&+%$#%#,,*+)2'%-#$*+&%$#%,"3/*;+%365"*-

$+&C)*,2% +7';2$2% ;2'62%$#%-2)#'2%,+)&*$#'273#8%K3%,"3/*;+%365"*$+%#&%*--prescindible cuando se busca promover la mor-fognesis indirecta a travs de suspensiones ce-lulares. Para ello es necesario cultivar los callos #)%-#$*+%365"*$+%,+)%2>*/2,*4)%!2'2%!#'-*/*'%5"#%las clulas se disgreguen y puedan diferenciar '26,#*(,2$+8%=%&"%;#IA)%32%'#&-piracin y la actividad fotosinttica de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO

2 incrementa

mientras que en condiciones de luz, disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables, entre 0,5 % y 8,5 %, segn el tipo de sello o tapa emplea-dos. Concentraciones superiores al 1 %, que son generalmente txicas en condiciones in vivo, pro-bablemente no fueron limitantes para la actividad fotosinttica.La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Su acumulacin tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de c-lulas, callos y anteras, La cantidad de etileno producida in vitro%;2'62%,+)%32%#&!#,*#


]8S8L%K)/'#%32&%,+)$*,*+)#&%?6&*,2&%!+$#-+&%-#)-cionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz.4.3.1.- La temperatura de incubacin de los cul-tivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en condiciones naturales las plantas ex-!#'*-#)/2)%$*?#'#),*2&%/C'-*,2&%$"'2)/#%#3%$62%0%la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante sealar que cuanto ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor ser la respuesta obtenida. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas se observ que la rege-)#'2,*4)%-20+'% $#% 7'+/#&% % !'+$",62% 2% WH% tJ%mientras que por encima de los 30 C, prctica-mente no se observ diferenciacin.4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmsfera gaseosa, es otro de los parmetros ?6&*,+&%2%/#)#'%#)%,"#)/28%92%ni%$#!#)$#'R%$#3%sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un intercambio gaseoso la humedad interna pue-de descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso de la HR puede promover una prdida veloz de agua del medio de cultivo variando la concentracin de sus compuestos hasta llegar a niveles txicos (Debergh, comuni-cacin personal). 4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad 0%!#'6+$+%$#%&"-*)*&/'+8%92%'#&!"#&/2%-+'?+>C-nica de un explante puede variar segn si se le proporciona luz o no. Para estimular la formacin $#%,233+2)+>C)*,+8

Lecturas recomendadas

^"$$#)$+'?Ll++&/#)% l8m8J8% 2)$% o+3/#'*)>% K8l8%1994. Components of the gaseous environment 2)$% /1#*'% #??#,/&% +)% !32)/% >'+U/1% 2)$% $#;#3+!--#)/%*)%;*/'+8%E32)/%b'+U/1%i#>"32/*+)%Weg%WLWc8

\#%`3#'q%b8l8%,++'$*)2/#$%7#-12;*+'% +?% ,#33&% 2&% 2)% #-7'0+>#)*,% >'+"!8%=))8%Bot. 57: 443-597.


I - CAPTULO 3

La citogentica molecular e inmu-nocitogentica en el estudio de los genomas vegetales

Guillermo Seijo; Graciela I. Lavia; b#'-R)%i+73#$+k%=;#3*2)+%j#')R)$#Ik%G*;*2)2%b8%P+36&%Y#??2%

1 Introduccin

La comprensin de la organizacin de los genomas lograda a travs del anlisis citoge-ntico ha tenido un gran impacto en la evalua-,*4)%0%"/*3*I2,*4)%$#%32%7*+$*;#'&*$2$#-ntica, en particular, desde el desarrollo de las tcnicas de citogentica molecular. El empleo &+)$2&%$#%=\Y%0%$#%2)/*,"#'!+&%,+).">2$+&%,+)% O"+'+,'+-+&%#)% ")% )A-#'+% ,'#,*#)/#% $#%especies vegetales ha permitido, entre otros lo->'+-neralmente se emplean tejidos meristemticos porque presentan un alto ndice mittico (i.e. la razn entre el nmero de clulas en divisin y el nmero total de clulas observadas). Los rganos (pices radicales o caulinares, vulos, etc.) son pre-tratados con diversas sustancias que inhiben la formacin del huso mittico (col-,1*,*)2


cleolos (NORs) y los ltimos a las porciones cromosmicas distales delimitadas por la cons-triccin secundaria y el telmero de los brazos que los portan. Los cromosomas que presen-tan satlites se denominan cromosomas SAT Dj*>8%W='*&%%'#!'#)/2)%3+&%&2/C3*/#&%$#%3+&%,'+-+&+-2&%P=T8%92%72''2%'#!'#)/2%WV%-*,'2&%#)%=%0%B, 5 micras en C y D y 2,5 micras en E y F.


grupo de cromosomas se indica mediante un nmero y, mediante una letra, el tipo cromos-mico al que pertenece de acuerdo a su morfo-3+>628%92%'#!'#)/2,*4)%>'R(,2%$#3%,2'*+/*!+%%denomina idiograma (Fig. 1E y F). La compo-sicin de un complemento cromosmico tam-bin se puede expresar mediante una frmula cariotpica, en la que se indica el nmero de cada tipo morfolgico de cromosomas que pre-senta el material analizado (ej. 16 m + 10 sm + 2 st + 2 t). Entre los parmetros cuantitativos ms utilizados para caracterizar los cariotipos se encuentra el grado de asimetra que pre-sentan los mismos. Para ello, se emplean ca-tegoras o ndices de asimetra cromosmi-ca que consideran las diferencias de tamao entre los cromosomas del cariotipo (asimetra intercromosmica), y las diferencias morfol-gicas de los cromosomas derivadas de la pro-porcin entre sus brazos (asimetra intracro-mosmica). Un cariotipo simtrico es aquel cuyos cromosomas son aproximadamente del -*&-+%/2-2Q+%0%#)%&"%-20+'62%-#/2,C)/'*,+&8%H=:8%=$#-R&"2)*)2%0%,*/+&*)2%3+%&+)%,+)%Jm=

3

D,'+-+-*,*)2%=3). Las bandas pueden ser de

tamao e intensidad diferentes y presentar una distribucin particular sobre los cromosomas de un complemento generando un patrn de bandeo ,2'2,/#'6&/*,+%Dj*>8%H^:8%K&/2&%/C,)*,2&%de bandeo cromosmico han permitido, en -",1+&%,2&+&'#&*4)8

La diferenciacin lineal de los cromosomas por tcnicas de bandeo no siempre es eviden-te en todos los grupos de plantas y, an en aquellas especies que presentan buenos pa-trones de bandas, a menudo no se cuenta con ")% )A-#'+% &*>)*(,2/*;+% $#%-2',2$+'#&% ,+-+%para integrar los mapas de ligamiento con los -2!2&%?6&*,+&8%92%!+&*7*3*$2$%$#%!+&*,*+)2'%-cuencias particulares sobre los cromosomas y, de esta forma, generar un gran nmero de mar-cadores cromosmicos ha sido posible gracias al desarrollo de las tcnicas de hibridacin in situ, cuyo uso se ha generalizado a partir del desarrollo de sistemas de marcado y de detec-cin de sondas no radiactivas.

9$:';4'"#,'*7$'7$&'=(42&,27-#)/+% $#3% =\Y% ,'+-+&4-*,+% Dsecuen-cia blanco) y una secuencia complementaria marcada (sonda). La misma se aplica a pre-paraciones de clulas somticas o germinales, previamente incubadas con enzimas (celulasa, pectinasa y citohelicasa) que remueven las paredes celulares. Las preparaciones son tra-/2$2&%,+)%=iY2&2%=%!2'2%#;*/2'%1*7'*$2,*+)#&%*)#&!#,6(,2&%$#% 32%&+)$2%,+)%=iY&%0


ser marcadas con nucletidos unidos a hapte-)+&% D$*>+B*>#)*)2'2?62%-+)+,'+-R/*,2%por cada sonda utilizada y una del complemen-/+%,'+-+&4-*,+% /#Q*$+%,+)%\=EF%+% *+$"'+%$#%!'+!*$*+8% K&/2&% -*,'+?+/+>'2?62&% &+)% &"!#'-puestas e integradas en una sola imagen. El posicionamiento relativo de las seales con respecto al centrmero, los telmeros u otros marcadores cromosmicos permite mapear con precisin cada sonda sobre el complemen-to cromosmico y representarlas en un idiogra--28%=%$*?#'#),*2%$#% 32%,*/+>#)C/*,2%,3R&*,262%,'+-+-smica y, por lo tanto, es posible reconocerlos en diferentes estados del ciclo celular.

Desde el desarrollo inicial de la tcnica de FISH, se han mejorado sustancialmente tanto la sensibilidad%D*8#8%#3%/2-2Q+%-6)*-+%$#%")2%secuencia que puede ser detectada bajo el mi-croscopio) como el poder de resolucin es-pacial%D*8#8% 32%$*&/2),*2%?6&*,2%-6)*-2%2%32%5"#%$+&%,"#),*2&%!"#$#)%'%*$#)/*(,2$2&%,+-+%independientes). Bajo condiciones ptimas de hibridacin y de deteccin, la sensibilidad de esta tcnica depende de la accesibilidad de la sonda a la regin complementaria sobre el =\Y8% 92%-*&-28%2C). Otra de las sondas de secuencias conser-vadas y repetidas en tndem que se emplean habitualmente en experimentos de FISH son las telomricas (Fig. 2D). Las mismas son utilizadas tanto para establecer con precisin 3+&%36-*/#&%,'+-+&4-*,+&%,+-+%!2'2%'#;#32'%*)-versiones que comprenden los segmentos cro-mosmicos distales y la ocurrencia de fusiones


cromosmicas. Las sondas de secuencias no conservadas repetidas en tndem son muy A/*3#&%!2'2%#3%$#&2''+33+%$#%-2',2$+'#&%#&!#,6-(,+&%$#%,'+-+&+-2&%0%$#%,+-!3#-#)/+&%,'+-

FIGURA 2. Ag%^2)$#+%=>LY[i%#)%")2%-#/2?2%$#%Arachis hypogaea%$+)$#%%*$#)/*(,2)%32&%'#>*+)#&%+'>2)*I2$+'2&%$#3%)",3#+3+%#)%-2''4)%+&,"'+%DO#,12&:8%B: bandeo con quinacrina que distingue las regio-)#&%1#/#'+,'+-R/*,2&%'*,2&%#)%=T%D#)%2-2'*33+%*)/#)&+:%$#%32&%'#>*+)#&%#",'+-2/*,2&%D2-2'*33+%!R3*$+:%#)%los cromosomas prometafsicos de Oziroe argentinensis. C: FISH doble en una metafase de A. batizocoi en donde se localizan los genes ribosomales 5S (en verde) y 45S (en rojo), la contratincin realizada con \=EF%$*?#'#),*2%72)$2&%1#/#'+,'+-R/*,2&%,#)/'+-C'*,2&%'*,2&%#)%=T%D#)%732),+:%$#%32&%!+',*+)#&%,'+-+-smicas eucromticas (en azul). D: FISH que revela las regiones telomricas (verde) de A. hypogaea. E: jFPn%5"#%'#;#32%32%$*&/'*7",*4)%!'#?#'#),*23%$#%")%'#/'+#3#-#)/+%#)%#3%>#)+-2%=%$#%A. hypogaea. F: GISH doble sobre una metafase de A. hypogaea%"/*3*I2)$+%,+-+%&+)$2&%=\Y%>#)4-*,+%$#%A. ipaensis (rojo) y de A. duranensis%D;#'$#:%5"#%$#-"#&/'2%32%,+)&/*/",*4)%23+!+3*!3+*$#%$#3%,"3/6>#)+%0%32&%#&!#,*#&%$*!3+*$#&%progenitoras ms probables. G y Hg%=iYLjFPn%#)%2)/#'2%0%+;2'*+%$#%Paspalum notatum utilizando como &+)$2%")%=iY%-2',2$+%$#%#B!'#&*4)%$*?#'#),*23%0%/#.*$+L#&!#,6(,2%#)%!32)/2&%2!+-6,/*,2&%!#'+%)+%B"2-3#&8%92%*)/#)&*$2$%$#3%,+3+'%;*+3#/2%*)$*,2%,2)/*$2$#&%'#32/*;2&%$#3%=iY%2)23*I2$+%!'#)/#%#)%3+&%$*?#'#)/#&%/#.*$+&%$#%!32)/2&%2!+-6,/*,2&8%92%72''2%'#!'#)/2%e%-*,'2&%#)%=


167'*$+&% *)/#'#&!#,6(,+&% 0% #)% 3+&% 23+!+3*!3+*-$#&% Dj*>8%HK:8%=-7+&% /*!+&%$#%,"#),*2&% '#-petidas pueden mostrar diferencias notorias en 3+&%-+/*;+&%5"#%32&%,+-!+)#)#)4-*,+%,3+)2$+%#)%;#,/+'#)#'2%!2/'+)#&%$#%Q23#&%$*&!#'&2&%+%*)#&!#,6(,2&%D72,q>'+")$:8%=%!#&2'%$#%#&/2%$*(,"3/2$*)23%$#3%O"+'+,'+-+


72,+


$#% ,"#),*2&% &*-!3#&% #)% 32% -20+'62% $#% 3+&%,2&+&3"/2'23$#16$+%D#&/#%A3/*-+%#)%72.2%!'+-!+',*4)% 02%5"#%!"#$#% *)$",*'% 2"/+O"+'#&,#)-cia), luego se cortan con micrtomo y los cortes se montan directamente sobre un portaobjetos. Debido a que la sonda necesita penetrar en el tejido para alcanzar el interior del ncleo, se realizan diversos pre-tratamientos tendientes a incrementar la permeabilidad de los tejidos y, adems, se emplean como sondas frag-mentos marcados cuyo tamao no supera los 100-500 pb. El anlisis de las hibridaciones se realiza con un microscopio confocal, debido a que este tipo de microscopio permite visuali-zar las estructuras mediante la reconstruccin tridimensional de las secciones pticas de la muestra.


Para el anlisis de ncleos aislados, los tejidos se disgregan en un buffer de estabiliza-cin apropiado y la fraccin de inters se ob-tiene por centrifugacin y tamizado en mallas con diferentes dimetros de poro. Los ncleos aislados se colocan directamente sobre un por-taobjetos y se secan al aire y deshidratan en serie alcohlica. Este procedimiento, que tam-bin puede ser aplicado a suspensiones celu-lares, no presenta mayores problemas de per-meabilidad para las sondas. Las regiones de hibridacin de las sondas sobre las secuencias de copia simple se observan como seales in-dividuales dentro del ncleo (dos seales en los ncleos diploides), cada una de ellas co-rrespondiente a cada uno de los cromosomas homlogos.

Mediante estas tcnicas tambin se ha es-tudiado la organizacin y la disposicin de los centrmeros, de los telmeros y de los cro-mosomas en ncleos interfsicos de diferen-tes rganos y tejidos de trigo, arroz, tabaco y Arabidopsis thaliana. En particular, las mismas resultan muy tiles para el anlisis de los cam-bios que se producen durante el ciclo celular en las diferentes estructuras cromosmicas dependientes de secuencias. Tambin se em-plean para el mapeo de secuencias separadas por distancias menores a 500-1000 kb, ya que en los cromosomas metafsicos las seales de las sondas separadas por estas distancias se superponen.

- @AB:$27$%;4#&$"2$L8M$2N


de los ndulos de recombinacin en complejos sinaptonmicos han revelado que la discrepan-,*2% #)/'#% 3+&%-2!2&% ?6&*,+&% 0% >#)C/*,+&% #&% #3%resultado de la distribucin no al azar de los eventos de crossing-over a lo largo de los cro-mosomas. En este marco, el desarrollo de los mapas cromosmicos ha cobrado importancia debido a que, dependiendo de las regiones cromosmicas que se analicen y a la frecuen-cia de recombinacin propia de cada una, los mapas genticos pueden ser mejores o peores #&/*-2$+'#&%$#%32&%$*&/2),*2&%?6&*,2&%'#23#&8%

Por tal motivo, en varias especies modelo se ha puesto especial nfasis en el desarrollo de marcadores cromosmicos por las tcnicas de FPn%D!'*),*!23-#)/#%^=JLjFPn2$2%,+)%23>A)%12!/#)+%+%O"+'+-cromo, la cual es precipitada masivamente por la HRP y unida en forma covalente al sitio de deteccin inicial. El sistema resultante es de-tectado mediante anticuerpos conjugados con fosfatasas alcalinas (para detecciones cromo-gnicas estndares) o directamente con mi-,'+&,+!62%$#%#!*O"+'#&,#),*28%\#7*$+%2%5"#%32%tiramida adicionada slo se deposita en las re-giones prximas a la enzima, se logra aumen-/2'%&*>)*(,2/*;2-#)/#%32%)&*7*3*$2$%&*)%!#'$#'%'#&+3",*4)8% 92% !'*),*!23% 3*-*/2)/#% $#%=iYLFPn%radica en que, generalmente, se puede anali-zar una sola sonda por cada hibridacin. No obstante, esta tcnica se ha utilizado para comparar los niveles y sitios de expresin de secuencias en numerosas especies de plan-tas. Uno ejemplo de ello, es el anlisis espacial de transcritos expresados diferencialmente en !32)/2&%,+)%'#!'+$",,*4)%B"23%0%2!+-6,/*,2&%de Paspalum notatum (Fig 2 G y H).

9 FISH cuantitativo para estimar la expre-sin gnica (QUISH)

=%$*?#'#),*2%$# 32%/C,)*,2%$#%=iYLjFPn


gnica utilizando como estndar a los genes de mantenimiento celular (genes housekeeping, b=E\n%0%WpP%=iY':8%K3% #-!3#+%$#%#&/#%#&-tndar permite corregir la variacin de la razn citoplasma/vacuola en los diferentes tipos ce-lulares, los efectos pticos de los tejidos y las Q23#&%)+%#&!#,6(,2&8%92%)2/"'23#I2%,"2)/*/2-tiva de esta tcnica hace posible el anlisis de la expresin gnica en rganos, a nivel tisular o celular, independientemente de las diferen-cias debidas a la edad o a los tipos de tejidos. Este mtodo es mas rpido que los mtodos tradicionales y puede utilizarse para estudiar la localizacin celular de la expresin de uno o ;2'*+&%>#)#&%#)%")%!#'6+$+%'#32/*;2-#)/#%,+'/+%$#%/*#-!+8%=&*-*&-+2)*I2,*4)% $#3%=\Y% #)%la cromatina regula la expresin y el manteni-miento de la informacin gentica (replicacin, reparacin, recombinacin y segregacin) en forma dinmica. Las colas N-terminales de las histonas que conforman el ncleo de los nucleosomas estn sujetas a diferentes modi-(,2,*+)#&%!+&L/'2$",,*+)23#&%D2,#/*32,*4)


11 Anlisis de la posicin de la insercin de los transgenes

Diferentes ensayos han demostrado que la expresin de los transgenes puede variar &*>)*(,2/*;2-#)/#% #)/'#% #&!#,*#&% $*!3+*$#&%'#32,*+)2$2)#&% #;*-$#),#&%/12/%='2,1*&%$"'2)#)&*&%2)$%=8%*!2#)&*&%2'#%/1#%U*3$%$*!3+*$%&!#,*#&%*);+3;#$%*)%/1#%+'*>*)%+?%=8%10!+>2#2%D9#>"-*)+&2#:8%=-#'*,2)%l+"'-nal of Botany, 91, 1294-1303.

P#*.+% l8b8


dies in Turnera sidoides complex (Turneraceae, 9#*+,2'!2#:8%HVVH8%=-#'*,2)%l+"')23%+?%^+/2)0*+)L&!#,*(,% 3*7'2'*#&% ?'+-% !2,10/#)#%chromosomes of maize (Zea mays L.). The Plant Journal, 13, 281289.

T#'q#3)%J8


I.-CAPTULO 4

Herramientas Bsicas de Ingeniera Gentica

Ingrid Garbus, Marisa Gmez y Viviana Echenique

Introduccin

n2&/2% !'*),*!*+&% $#% 3+&% 2Q+&% rV'2$2%!+'%$*;#'&2&%estrategias metodolgicas, muchas de las cua-les son adaptaciones de procesos naturales de la gentica microbiana que han sido estudia-dos y se conocen en profundidad.

LA CLONACIN MOLECULAR O CLONACIN DE GENES

92%()23*$2$%$#%32%,3+)2,*4)%-+3#,"32'%#&%32%obtencin de un determinado fragmento de =\Y62% $#3%=\Y% '#-

combinante y la clonacin molecular han apor-/2$+%&+(&/*,2$+&%!'+,#$*-*#)/+&%5"#%!#'-*/#)%#3% 2*&32-*#)/+


!2'/*$2%#&%#3%=\Y%>#)4-*,+'2)$#&23%%*),+'!+'2%23%-#$*+%$#%,"3/*;+%#)%!32,2%de Petri donde desarrollarn las clulas hospe-$2$+'2&%$#3%=\Y%'#,+-7*)2)/#8%P*%#3%=\Y%,3+-


nado se insert en el polylinker y desactiv la !-galactosidasa, no se producir pigmento azul y las clulas formarn colonias que se vern blancas en la placa de Petri. Caso contrario las colonias de las clulas hospedadoras se vern de color azul. Cuando el marcador es un gen de resistencia a los antibiticos, las clulas se *)+,"32)%#)%-#$*+%2>2'*(,2$+%5"#%,+)/*#)#%#3%2)/*7*4/*,+%,"02% '#&*&/#),*2%,+)(#'#%#3% ;#,/+'62&% #B!#'*-#)/23#&%que estn involucradas en su desarrollo. El objetivo de esta parte del capitulo es introducir

al lector en las herramientas metodolgicas de 7*+3+>62%-+3#,"32'%-R&%2-!3*2-#)/#%"/*3*I2$2&8

1. VECTORES DE CLONACIN Como hemos mencionado, un vector es una

-+3C,"32%$#%=\Y%2%32%5"#%%")*'R%#3%?'2>-#)-/+% $#% *)/#'C&% '#&"3/2)$+% #)% #3%=\Y% '#,+-7*-nante y, debido a su capacidad de autorrepli-,2,*4)


mayores de 10 kb, el plsmido se hace gene-ralmente inestable. =")5"#%#)%#3%2-7*#)/#%)2/"'23%3+&%!3R&-*$+&%

,+).">2/*;+&% >#)#'23-#)/#% % /'2)&(#'#)% !+'%contacto clula a clula, los plsmidos vecto-res de clonacin generalmente han sido modi-(,2$+&%2%()%$#%#;*/2'%&"%/'2)&?#'#),*2%!+'%,+)-.">2,*4)% 0%2&6% 3+>'2'% &"% ,+)/#),*4)%7*+34>*,28%Sin embargo, en el laboratorio es posible rea-lizar la transferencia a la clula hospedadora por transformacin, utilizando choque trmico en presencia de cloruro de calcio o mediante electroporacin.=")5"#% 3+&% !'*-#'+&% !3R&-*$+&% "/*3*I2$+&%

#B*&/62)%#)%?+'-2%)2/"'232%2%")%=\Y


E"#$#%*)'/2'%-20+'%,2)/*$2$%$#%=\Y%5"#%32%-20+'62%$#%3+&%!3R&-*$+&%D#)/'#%WV%0%HV%q7:K3%=\Y%!"#$#%'%#(,*#)/#-#)/#%#-!25"#-

tado in vitro%$#)/'+%$#%32&%!2'/6,"32&%$#3%?2>+92&%!2'/6,"32&%$#3%?2>+%&+)%-",1+%-R&%#(-

cientes en la infeccin de las clulas hospeda-doras (transfeccin) que la transformacin.K3% ?2>+% |% /*#)#% ")%-2!2% >#)C/*,+% ,+-!3#-

jo. El tercio central del cromosoma, que con-tiene genes requeridos para la lisogenia pero )+%!2'2%#3%,*,3+%36/*,++%|%&*3;#&/'#% /*#)#%#B,#&*;2%

cantidad de sitios de restriccin, no es indica-do como vector de clonacin por lo que se han ,+)&/'"*$+% ?2>+&% |% -+$*(,2$+&% DJ12'+):+% |% 0%combinan las ventajas de ambos como vecto-res. Poseen la habilidad del plsmido para re-plicarse autnomamente en las clulas de E.

coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro $#3%,'+-+&+-2%$#%|%0%,+)/*#)#)%#3%+'*>#)%$#%replicacin y los genes de resistencia a los anti-biticos de su plsmido parental. Cos proviene de sitio cohesivo (cohesive site) en referen-cia a la terminal de simple cadena de 12 bases ,+-!3#-#)/2'*2%#)%#3%,'+-+&+-2%$#%|%-2$"-ro. El sitio cos es reconocido por el sistema $#%#-!25"#/2-*#)/+%$#%=\Y%$#%|+%m%WS% 0%

#3% !3R&-*$+% !^iSHS% 5"#% ,+)/*#)#)% 3+&% +'6>#-nes de replicacin de ambos. Normalmente la replicacin depende del plsmido, pero cuando una clula que contiene un fsmido se infecta con un fago de tipo salvaje, el origen del fago es responsable de la replicacin y se generan ,+!*2&% -+)+,2/#)2'*2&8% K&/#%=\Y%-+)+,2/#-nario es empaquetado en viriones y puede ais-larse fcilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente los fsmidos pueden transportar $#%?+'-2%#&/273#%")%?'2>-#)/+%$#%=\Y%,3+)2$+%-20+'%5"#%")%;#,/+'%/6!*,+%$#'*;2$+%$#%M13.

!C$S4(3(&(3#&$#4"#)%!+',*+)#&%$#%=\Y%$#%-20+'%/2-2Q+%!2'2%efectuar el anlisis genmico y obtener mapas ?6&*,+&%$#% ,'+-+&+-2&8%K3%primer sistema de ,3+)2$+% $#% >'2)$#&% ?'2>-#)/+&% $#%=\Y% ?"#%informado en 1987 por Burke y colaborado-'#&


habitual. El marcador seleccionable suele ser ")%>#)%$#%/*!+%&*3;#&/'#%5"#% 3#%,+)(#'#% 32%,2-!2,*$2$% !'+/+/'4(,2% 2% 32% ,C3"32% 1+&!#$2$+'28%K3%-2&%,+-A)-#)/#%"/*3*I2$+%#&%Xi=Ss+%!'#)/#2)*I2%$#%2,"#'$+%,+)%32&%!'+/#6)2&%,+$*(,2$2&%!+'%3+&%>#)#&g%J~Jg%,27#I2%0%,+32#)#&%$#%!'+/#6)2&%$#%32%,R!&*$#*+)#&%esenciales que le otorgan estabilidad y bajo nmero de copias en cada bacteria, parA, parB y parC. oriS: origen de replicacin unidireccional. CMr: gen marcador seleccionable en medio con cloranfenicol, repE: >#)%$#%!'+/#6)2%2"/+'#>"32/+'*2%#),*23%!2'2%32%'#!3*,2,*4)%$#&$#%oriS8%!^#3+^=JWW2'2)/*I2)$+%")2%'#,+-7*)2,*4)%-6)*-2%#)/'#%$*?#'#)/#&%?'2>-#)/+&%$#%=\Y%0%&+)%$#%),*332%manipulacin. Los BACs se basan en el pls-mido F de 7kb de E. coli y pueden llevar inser-tos de 300 kb aunque el promedio es de 100


kb (Fig. 3c). Contienen como elementos esen-ciales una copia del origen de replicacin de E. coli, un marcador de seleccin que suele ser un gen de resistencia a antibiticos y un siste--2%$#%'#,+-7*)2,*4)%&*/*+L#&!#,*(,+%D,'#L3+B:'2)$#&% *)'/+&8%9+&%,'+-+&+-2&%2'/*(,*23#&%derivados del fago P1 (PACs) permiten la clo-)2,*4)%$#%?'2>-#)/+&%$#%pVLWVV%`!7%0"23%5"#% 3+&% ^=J)C/*,+8%X)2%,2$#)2%$#%#&/#%=\Y%libre, llamado donador, es captada y puede transformar genticamente la clula receptora por recombinacin con una regin homloga del cromosoma. El movimiento de las molcu-32&% $#%=\Y%2% /'2;C&% $#% 32%-#-7'2)2% 0% $#)-tro del citoplasma de la clula receptora es un !'+,#&+%2,/*;+628%92&%,C-lulas que son capaces de tomar una molcu-

32%$#%=\Y%0%'%/'2)&?+'-2$2&%%$#)+-*)2)%competentes. Estas clulas secretan el factor $#%,+-!#/#),*2'2)%!2'/#%$#3%=\Y%?R>*,+8%P*%3+&%>#)#&%$#3%donador no sufren recombinacin homloga con el cromosoma de la bacteria de la clula receptora se perdern.

b) transduccin especializada (restringi-da): ocurre slo en algunos virus atempera-dos, es decir, aquellos que se integran en el genoma como parte de su ciclo biolgico. En #&/#%-#,2)*&-+%#3%=\Y%$#%")2%'#>*4)%#&!#,6-(,2%$#3%,'+-+&+-2%$#3%1+&!#$2$+'%%*)/#>'2%directamente en el genoma del fago, reempla-zando algunos de sus genes. El genoma fgi-co recombinante puede empaquetarse segui-damente en una cabeza de fago y el resto del fago puede ensamblarse normalmente. Este fago puede carecer de la capacidad de repli-,2''#% #)% #3% ,'+-+&+-2% $#3%hospedador durante la lisogenizacin, o que el =\Y%%'#!3*5"#%#)%#3%'#,#!/+'%,+-+%!2'/#%$#%


")2%*)?#,,*4)%36/*,28%K)%2-7+&%,2&+)#&%;6'*,+&%12)%sido reemplazados. Si bien no todos los fagos tienen la capacidad de transducir, ni todas las bacterias son transducibles, el fenmeno est 3+% &"(,*#)/#-#)/#% #B/#)$*$+% ,+-+% !2'2% 2&"-mir que desempea un importante papel en las transferencias genticas que se producen en la naturaleza.

Conjugacin: mecanismo de transferencia gentica mediada por un plsmido que requiere contacto de clula a clula. Ciertos plsmidos y /'2)&!+&+)#&%,+).">2/*;+&%,+)(#'#)%2%&"&%,C-lulas hospedadoras la capacidad de transferir =\Y%2%+/'2&%,C3"32&%!+'%,+).">2,*4)8%92%,+)."-gacin requiere una clula donadora, que con-tiene un tipo particular de plsmido conjugativo, y una clula receptora que carece de l. El pro-,#&+%$#%,+).">2,*4)


Figura 4. J+'/#%$#3%=\Y%!+'%#)I*-2&%$#%'#&/'*,,*4)8%i#,+)+,*-*#)/+%0%#&,*&*4)%$# secuencias palindr-micas originando: a) extremos cohesivos o b) extremos romos. En este caso puede utilizarse la enzima transferasa terminal para la incorporacin de extremos cohesivos. c) reconocimiento y corte de secuencias )+%!23*)$'4-*,2&8%92&%O#,12&%*)$*,2)%3+&%&*/*+&%$#%,+'/#%-*#)/'2&%5"#%32&%,"#),*2&%'#,+)+,*$2&%%-alan en negrita.

aislada en el gnero Escherichia, especie coli, cepa RV 13. Se utiliza el trmino isoqui-zmeros para las enzimas que reconocen la -*&-2%,"#),*2%$#%=\Y%!#'+%12)%&*$+%+7-tenidas de diferentes especies de bacterias.

Pueden diferenciarse tres tipos de enzi-mas de restriccin. Las de tipo I y III escin-den en sitios alejados de la secuencia de re-,+)+,*-*#)/++


3. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE ADN: ELECTROFORESIS EN GEL

La electroforesis es una tcnica que permite la separacin de molculas en funcin de su di-ferente movilidad en un campo elctrico, sien-do el parmetro esencial su diferencia en carga elctrica. Sin embargo, determinados soportes como los geles de agarosa o poliacrilamida, ofrecen una resistencia notable al avance de 32&%-+3C,"32&8%=")5"#% #3% !2'R-#/'+% 5"#% '*>#%el avance es la relacin carga/masa, como en los cidos nucleicos la carga elctrica es pro-porcional a la longitud en nucletidos, la rela-cin carga/masa es la misma para todas las molculas. Como resultado, el efecto de retar-do del gel depende del tamao molecular por lo que la electroforesis separa los fragmentos de cido nucleico segn su tamao o longitud. La agarosa es un polisacrido, cuyas disolu-

Endonucleasas de tipoII

Clivaje sitio-especifico del ADN Generacin de fragmentos de

ADN

Ligasa de ADN Unin de dos fragmentos deADN con extremos romos, en

presencia de ATP.

Forma enlaces covalentesentre el extremo 5 de una

cadena polinucleotdica y elextremo 3 de otra cadena

Transcriptasa reversa Sntesis de una hebra de ADNc

utilizando como molde ARN.

Construccin de bibliotecas de

cDNA. Amplificacin por PCR

Polinucleotido kinasa Incorporacin de un grupo

fosfato al e xtremo 5de unpolinucletido.

Permite ligado con otro

polinucletido o incorporacinde fosfato marcado.

Transferasa Terminal Adicin de colas

homopolimricas al extremo3OH de ADN doble hebra

lineal

Genera extremos cohesivos

oligo dT u oligo dA

Exonucleasa III Remocin de nucletidos delextremo 3 de un ADN doble

hebra.

Expone los extremos 5.

Exonucleasa del fago l Remocin de nucletidos delextremo 5 de ADN doble

hebra.

Expone los extremos 3.

Fosfatasa alcalina Remocin de fosfatosterminales de extremos 5

Impide autoligado de vectores.Permite la incorporacin de

fosfato 5 marcado.

Fragmento klenow Fragmento de una enzima ADN

polimerasa, con actividad DNApolimerasa y exonucleasa endireccin 3'?5'.

Genera extremos romos desde

el ext remo 3, por sntesiscomplementaria o clivaje denucletidos desapareados.

Enzima Accin Aplicacin

Tabla 1.%=3>")2&%#)I*-2&%"/*3*I2$2&%#)%32%/#,)+3+>62%$#3%=\Y%'#,+-7*)2)/#

ciones (0,5 - 2%) forman un gel semislido al enfriarse, constituido por una matriz o trama tri-$*-#)&*+)23%$#%(7'2&%!+3*-C'*,2&


=\Y%$#%/2-2Q+%,+)+,*$+"#% 32% 3*)#23*$2$%>'2(,2)$+%#3%tamao en funcin de la inversa de la movili-dad o el logaritmo del tamao respecto de la movilidad.

Dentro de las aplicaciones ms comunes de 32%#3#,/'+?+'#&*&%#)%>#3%#)%7*+3+>62%-+3#,"32'-#)/+&%$#%EJi#'*-das por endonucleasas de restriccin y separa-das por electroforesis en gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se $#)+-*)2%P+"/1#')%^3+/


de nucletidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada se elimina mediante repetidos lavados de la membrana. Las sondas pueden marcarse por diferentes mtodos: con elementos radioactivos, o com-puestos que producen color o luminiscencia, etc. Luego de la hibridacin, la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al mtodo con el que haya sido marcada.

B) Anlisis de ARN por transferencia e hi-bridacin: Northern Blot

De manera similar al tratamiento realizado ,+)% 32&%-+3C,"32&% $#%=\Y#)/#%$#&)2/"'23*I2)/#%$#% 32&%!'+/#6)2&8%9+&%polipptidos separados por electroforesis tam-bin pueden ser transferidos del gel a una mem-brana de nitrocelulosa y pueden ser detectados "/*3*I2)$+%2)/*,"#'!+&%#&!#,6(,+&8%K&/2%/'2)&-?#'#),*2% $#% !'+/#6)2&% % $#)+-*)2% o#&/#')%blotting y se realiza utilizando una corriente #3C,/'*,2%!2'2%/'2&32$2'%32&%!'+/#6)2&%$#&$#%#3%>#3% 2% 32% &"!#'(,*#%$#% 32%-#-7'2)28%\#&!"C&%$#% 32% /'2)&?#'#),*2%c:8%Estos oligonucletidos funcionan como inicia-dores o cebadores (primers) que delimitan la ,"#),*2%2%'%2-!3*(,2$28%92%!'*-#'2%#/2!2%de la reaccin involucra la desnaturalizacin $#3% =\Y% $#% $+73#% ,2$#)2


Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada polimeri-zacin sirve como molde para el siguiente, en cada ciclo se duplica la cantidad de producto sintetizado. Es necesario tener en cuenta que, 2$#-R&%$#%32%#)I*-2)*(,2/*;2-#)/#%2% 32%-2&2%()23%de secuencia blanco.

Despus de apenas 20 ciclos se logra ms de un milln de veces la cantidad inicial de la ,"#),*2% $#% *)/#'C&8% K&/2% #&,232% $#% 2-!3*(-cacin permite, por lo tanto, iniciar el proceso ,+)%,2)/*$2$#&%-6)*-2&%$#%=\Y%D$#3%+'$#)%$#%pico o nanogramos) y terminar la reaccin con grandes cantidades de una secuencia de inte-rs. La versatilidad de esta reaccin es enorme y la combinacin de la PCR y la secuenciacin constituye una poderosa herramienta para el anlisis de genes.

Como hemos mencionado, la tcnica de EJi%#&%$#%&"-2%"/*3*$2$%!2'2%2-!3*(,2'%=\Y%a partir de fragmentos clonados en distintos vectores, donde los cebadores son comple--#)/2'*+&%2%3+&%&*/*+&%$#3%;#,/+'%5"#%O2)5"#2)%el fragmento inserto. La versatilidad de la PCR *),3"0#%32%2-!3*(,2,*4)%2%!2'/*'%$#%=\Y%$#%-2-/#'*23% #-7#7*$+% #)% !2'2()2% !+'% ;2'*+&% 2Q+&


de material -+-*(,2$+


nen bloqueado el centro activo de la enzima has-/2%5"#%&+)%$#&)2/"'23*I2$+&%!+'%,23+'8%=$#-R&-#)/+8% 92&% &+)$2&% $#%,"#),*2% #&!#,6(,262%#)/'#%&68%92%23/2%#(,*#),*2%$#%3+&%,#72$+'#&%en la PCR individual, no asegura el xito en la PCR mltiple, pero aumenta considerablemente las posibilidades de obtenerlo. La combinacin $#%O+"'4?+'+&%2%"/*3*I2'%#)%3+&%$*?#'#)/#&%,#72$+-res tambin debe elegirse de manera cuidadosa, para que no exista superposicin entre los es-pectros absorcin y emisin entre ellos.

Anlisis de curvas de disociacin. Se basa en la aplicacin de un gradiente de temperatu-ras creciente despus de la PCR para monitori-zar la cintica de disociacin de los fragmentos 2-!3*(,2$+&


6. GENOTECAS

Una genoteca (gene library) es una colec-,*4)%$#% ?'2>-#)/+&%$#%=\Y%,3+)2$+&%5"#%'#-!'#)/2)% #)% &"% ,+).")/+% #3%=\Y% /+/23% $#% ")%+'>2)*&-+%$#% *)/#'C&%+%7*#)%#3%=\Y,#)%buscados, que puede ser conocida o deducirse a partir de la secuencia de aminocidos de la !'+/#6)2%!"'*(,2$28%X)2%$#%32&%!'*),*!23#&%$*(,"3/2$#&%#)%#3%,3+-

)2$+% $#%=\Y% >#)4-*,+% #&% 5"#% 23>")2&% -cuencias estn representadas una sola vez en #3% >#)+-2% 0% #&% $*?6,*3% 12332'32&8% E2'2% &"!#'2'%#&/2% 3*-*/2,*4)% $#% 32%-#/+$+3+>62


)#'2%-+3C,"32&%$#%=\Y,%-R&% 32'>2&%0% 32% -gunda es que contiene prcticamente toda la secuencia correspondiente al extremo 5. Se basa en la utilizacin de la enzima RNasaH, 5"#%'#,+)+,#%-+3C,"32&%167'*$2&%=iYL=\Y%0%$*>*#'#% 32%,2$#)2%$#%=iY%$#.2)$+% /'+I+&%!#-queos que permanecen unidos a la primera ,2$#)2%$#3%=\Y,%0%&*';#)%,+-+%primers para 32%=\Y%!+3*-#'2&2%F")+&%,/+'#&%)+%")*-$+&%5"#%&+)%Ō$+&%!+'%")2%3*>2&2%$#%=\Y8K&/2&%-+3C,"32&%$#%=\Y,%$#%$+73#%,2$#)2%

estn listas ahora para ser insertadas en un vector, que puede ser un plsmido o un deriva-

do del fago . Para ello se utiliza la transferasa /#'-*)23+8%K3%=\Y%$#3%?2>+%,+)/*#)#%$+&%&*/*+&%$#%'#&/'*,,*4)%EcoiF8%K3%=\Y%$#%32%'#>*4)%,#)/'23%)+%#),*23%$#3%?2>+%%'##-!32I2%!+'%=\Y%?+'R)#++8%P#%>#)#'2%2&6%")2%'*#%$#%-+3C,"32&%'#,+-7*)2)/#&%$*&!"#&/2&%#)%/2)$#-


!2'/6,"32&%;6'*,2&*2*4)%$#%32%!'+/#6)2%que contenga el menor nmero posible de co-dones degenerados, utilizando el conocimiento de los codones ms probables para la especie en estudio.

Existen otras tcnicas para localizar genes #)% 32&%>#)+/#,2&%$#%=\Y,*+)#&%,+)';2$2&%#)%?2-*3*2&%$#%!'+/#6)2&%para encontrar genes relacionados o bien la utilizacin de vectores de expresin.

B) Genotecas Genmicas

Un genoteca genmica puede obtenerse de cualquier tejido ya que todas las clulas de un organismo tienen la misma constitucin genti-ca. Se encuentran en ella, no solo las secuen-cias expresadas sino tambin las correspon-dientes secuencias regulatorias. Pueden utili-zarse fagos como vectores, pero sucede que muchos de los genomas eucariotas son muy >'2)$#&


tural, funcional y comparativa de organismos complejos. Las primeras genotecas genmicas fueron construidas utilizando como vectores los }=J)+-2'2)%#&,2328%

Preparacin de una genoteca de BACs.

Como todo proceso de clonacin, consiste en la preparacin del vector, aislamiento y diges-/*4)%$#3%=\Y#38%K&/+%!#'-*/#%construir genotecas con fragmentos de tama-os similares, de aproximadamente 150 kb.

Estas genotecas de grandes insertos son consideradas recursos de largo plazo para in-vestigacin genmica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando son uti-lizadas para proyectos de secuenciacin y ma-peo a gran escala. En general, cuando se va a construir una genoteca debe elegirse cuida-dosamente el genotipo de la especie utilizada ,+-+% ?"#)/#% $#%=\Y


!"# $%&'(%)*+# ,%# )-'.'+'.*+# %+/%)01-

cos o de segmentos de cromosomas

Cuando se busca un gen que se sabe est "7*,2$+%#)%")%,'+-+&+-2%#&!#,6(,+%&*-!3*(,2%mucho el trabajo hacer una genoteca de ese cromosoma solamente. Se trata de una tcnica que permite separar cromosomas metafsicos /#Q*$+&%,+)%#3%,+3+'2)/#%O"+'#&,#)/#%n+#,1&/%SSHep%!2'2%'#>*+)#&%'*,2&%#)%=T%0%,'+-+-*,*)2%=*+)#&%'*,2&%#)%bJ8%9+&%,'+-+&+-2&%/#Q*$+&%O"+'#&,#'R)%,"2)$+%%#B!+)>2)%2%3"I%UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm Dn+#,1&/% SSHep:% +% ]ep% )-% D,'+-+-*,*)2%=:8%Las cantidades y proporciones de colorantes ;2'62)%!2'2%,2$2%,'+-+&+-2%0%")2%,+-!"/2-

$+'2%'#,+)+,#%#3%!2/'4)%O"+'#&,#)/#%/6!*,+%$#%,2$2% ,'+-+&+-28% =3>")+&% ,'+-+&+-2&% &+)%muy similares por lo que no pueden ser sepa-rados. Se necesita un milln de cromosomas para hacer una genoteca. Equipos automti-cos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas.

Tambin puede microdisectarse un cromo-soma, tomando un segmento del mismo que tenga la regin de inters. En principio se uti-liz esta tcnica para cromosomas grandes, ?R,*3-#)/#% $*&/*)>"*73#&% !+'% -*,'+&,+!62% $#%,+)/'2&/#%$#%?2%=,/"23-#)/##)%#&!#,6(,+%#)%%")2%>#)+/#,2%$#%^=J&%-#$*2)/#%EJi8%92&%WpV%!32,2&%$#%cultivo, de 96 pocillos cada una, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, agru-!2$2&%$#%2%]#/23%/+/23#)%#)%#3%=\Y%>#)4-*,+%$#3%;#>#/23%0%/2-7*C)%#)%")+%$#%3+&%/"7+&


Giemsa-tripsina y las bandas deseadas son ,+'/2$2&%,+)%2>".2&%$#%;*$'*+%"3/'2()2&%0%,3+-nadas. Cebadores posicionados en el vector !#'-*/#)%2-!3*(,2'%,"#),*2&%$#&,+)+,*$2&8%K3%=\Y%2-!3*(,2$+%%,3+)2%#)%")%;#,/+'%2!'+-piado y la localizacin cromosmica de cada clon se determina utilizando hibridacin in situ (ver III.5)

7. SECUENCIACIN DEL ADN CLONADO

Una vez que se ha obtenido el clon con el frag-mento de inters, el paso siguiente es secuen-ciarlo. La determinacin de la secuencia puede '#23*I2'% !+'% #3% -C/+$+% 5"6-*,+% $#% m2B2-% 0%Gilbert o por el mtodo enzimtico de Sanger. El primero consiste en la utilizacin de compuestos que destruyen selectivamente una o dos de las 72&%5"#%,+)&/*/"0#)%#3%=\Y-#)/+&%$#%=\Y%1*-$'+3*&2$+&%2%32%23/"'2%$#%32&%72&%b-#)/+%5"#$2%determinada por el patrn de bandas.

El mtodo de Sanger, se basa en la interrup-cin controlada de la replicacin enzimtica del =\Y'2?62


cia$+g%32%$#/#,,*4)%$#%32&%72)$2&%$#%=\Y%0%32%traduccin de un patrn de bandas en uno de secuencia. Estos equipos utilizan nucletidos -2',2$+&%,+)%O"+'+,'+-+&8%P#%"/*3*I2)%]%,+-lorantes diferentes, que al ser exitados por l-ser emiten luz de diferente longitud de onda. Los colorantes pueden utilizarse para marcar el primer universal de secuenciacin de M13 o cada uno de los 4 terminadores de cadena didesoxi. En este caso, cada mezcla de reac-cin con un terminador diferente se marca con un colorante diferente. Cuando la reaccin es

completada los productos de las 4 reacciones se mezclan y se corren en una sola calle de un >#3


Lecturas Recomendadas

Madigan M. T., Martinko J. M. and Parker J. 1999 ^'+,q62% $#% 3+&%m*,'++'>2)*&-+&8%[,/2-va edicin revisada. Prentice Hall Iberia. Madrid, Espaa.

%P*)>3#/+)%E8%HVV]8%^2,/#'*2&%#)%^*+3+>6262%0%m#$*,*)28%e/2%K$*,*4)8%=,'*7*28

Sambrook J., Fmitsch E. F. and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor.

P+"/1#')%K8%m8%Whre%\#/#,/*+)%+?%&!#,*(,%"#)-,#&% 2-+)>% \Y=% ?'2>-#)/&% !2'2/#$% 70% >#3%electrophoresis. J. Mol. Biol., 98, 503-517

jx//#'#'% l8


I. CAPTULO 5.

Marcadores Moleculares

m2'62% J2'+3*)2% m2'/6)#I#)C/*,+)C/*,+&


micos produjo una revolucin en los estudios genticos en plantas, que hasta el momento 12762)% ,+)/2$+% ,+)% ")% 3*-*/2$+% )A-#'+% $#%-2',2$+'#&%-+'?+34>*,+&8%92% /C,)*,2%!#'-*/62%incluir potencialmente a todas las especies de !32)/2&8%K)%#&/2%!2'/#%$#3%,2!6/"3+%)+&% '#?#'*-'#-+&%2% 32&% F&+#)I*-2&% 0%2% 32&%E'+/#6)2&%$#%reserva.

5.3.1 Isoenzimas92&% *&+#)I*-2&%%$#()#)%,+-+%$*?#'#)/#&%

formas moleculares de una enzima, que po-#)%")2%2,/*;*$2$% ,2/236/*,2% ,+-A)'2,*4)%#3#,/'+?+'C/*,2%de las formas iso-enzimticas. Varios factores $#()#)% #3% !2/'4)% $#% 72)$2&% +% I*-+>'2-2g% *:%YA-#'+% $#% >#)#&% 5"#% 32&% ,+$*(,2)g% 32% !'#-),*2% $#% ;2'*+&% >#)#&% ,+$*(,2)$+% !2'2% ")2%misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicacin gnica y subsecuente divergen-cia a travs de mutaciones diferentes en cada caso; ii) Estados allicos: el proceso ms sim-ple de generacin de nuevas formas enzim-ticas es la mutacin de un gen estructural, las variantes allicas se denominan aloenzimas. Estos marcadores muestran codominancia (en un individuo diploide ambos alelos de un 3+,"&%&+)%#B!'#&2$+&%0%;*&"23*I2$+&:8%=%-+$+%de ejemplo, la enzima alcohol dehidrogenasa D=\n:


las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo cual afecta la reproduci-bilidad de los zimogramas. No obstante, estos loci representan importantes marcas de refe-rencia para relacionar mapas obtenidos a partir $#%$*&/*)/+&%-2',2$+'#&%$#%=\Y8

5.3.2 E'+/#6)2&%$#%'#';292&%!'+/#6)2&%$#% '#';2%&+)%")%>'"!+%1#-

/#'+>C)#+%$#%!'+/#6)2&%!'#)/#&%#)%32%-*-lla de planta que tienen por funcin proveer #)#'>62%23%#-7'*4)%#)%3+&%!'*-#'+&%#&/2$*+&%$#%,'#,*-*#)/+8%K&/2&%!'+/#6)2&%12)%&*$+%#B/#)&2-mente estudiadas en cereales y oleaginosas y se relacionan directamente con la calidad del grano. 92&% !'+/#6)2&% $#% '#';2% % #B/'2#)% -#-

diante procedimientos sencillos a partir de las semillas y se separan mediante electrofore-sis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con detergentes). No se requiere detectar actividad enzimtica, las pro-/#6)2&% % ;*&"23*I2)% $*'#,/2-#)/#% !+'% /*),*4)%,+)% =I"3% $#% J++-2&&*#% #;*$#),*R)$+% 3+&%!+3*-+'(&-+&%,+-+%$*?#'#),*2&%#)%32%-+;*3*$2$%electrofortica. K)%32%-20+'62%$#%3+&%,#'#23#)#'2'% ")% 23/+% )*-;#3%$#%!+3*-+'(&-+%!'+/C*,+%#)/'#%0%$#)/'+%$#%especies.

Por ejemplo, en el caso del trigo, las principa-3#&%!'+/#6)2&%$#%'#';2%$#3%>'2)+%%$#)+-*-)2)%>3"/#)*)2&%0%>3*2$*)2&


gluteninas y han sido utilizadas en la descrip-,*4)%$#%>#'-+!32&-2%#%*$#)/*(,2,*4)%$#%;2'*#-dades. Como en el caso de las isoenzimas, la 2!3*,2,*4)%$#%!'+/#6)2&%$#%'#';2%#)%32%,+)&-truccin de mapas genticos es limitada por el nmero de marcadores genticos disponibles, sin embargo estos loci representan importantes marcas de referencia, por ejemplo, para los cro-mosomas 1 y 6 de trigo, donde estn presentes los principales genes de gluteninas y gliadinas.

Para ms informacin sobre estructura, pro-!*#$2$#&%0% '+3%$#% 32&%!'+/#6)2&%$#% '#';2%#)%grano se recomienda la lectura de la revisin de Branlard et al. (2001).

La principal ventaja de los marcadores bio-5"6-*,+&%#&%&"%?R,*3%*-!3#-#)/2,*4)%#)%#3%327+-'2/+'*+% 02% 5"#% *);+3",'2)%-#/+$+3+>62&% ),*-llas, rpidas y de bajo costo. Como desventajas se pueden citar: baja cobertura del genoma, di-(,"3/2$#&%#)%32%*)/#'!'#/2,*4)%$#%3+&%'#&"3/2$+&%(principalmente para las Isoenzimas) y, en el ,2&+%$#%32&%!'+/#6)2&%$#%'#';2#)#&%,+$*(,2)/#&%&"#3#)%#&/2'%#&-trechamente ligados (familias multignicas), no se puede asumir independencia entre los loci.

5.4 Marcadores molecularesUn marcador molecular es simplemente un

>-#)/+%$#%=\Y%,+)%")2%"7*,2,*4)%#&!#,6-(,2% #)% ")% ,'+-+&+-2% D!")/+% $#% '#?#'#),*2:%cuya herencia puede seguirse en individuos de una poblacin. La secuencia puede pertenecer 2% '#>*+)#&% ,+$*(,2)/#&% D>#)#&:% +% &*)% ?"),*4)%conocida.

Con el advenimiento de las tcnicas moder-)2&%$#%7*+3+>62%-+3#,"32'%D!2'2%-R&%$#/233#%;#'%I.- 4), surgieron diversos mtodos de deteccin $#%!+3*-+'(&-+%>#)C/*,+%$*'#,/2-#)/#%2%)*;#3%$#%=\Y8%K)%32%2,/"23*$2$#)#'2$+&%2%!2'/*'%$#3%=\Y%de distintos individuos por digestin con enzi-mas de restriccin. Los fragmentos obtenidos se separan por su tamao mediante electrofore-&*&%0%%/'2)&(#'#)%2%")2%-#-7'2)2%$+)$#%&+)%desnaturalizados y luego hibridados con una &+)$28%K&/2%&+)$2%#&%")%?'2>-#)/+%$#%=\Y%$#%cadena simple (de secuencia conocida o no) que est marcado radioactivamente. La sonda se unir a aquellos fragmentos de restriccin con secuencia complementaria a la misma (ver enzimas de restriccin y mtodo de Southern Blot%#)%E2'/#%F2)#32&% D-*-tocondrias o cloroplastos). Pueden emplearse sondas aisladas de especies relacionadas (por ejemplo, sondas aisladas de tomate pueden emplearse en papa y viceversa).

La variabilidad gentica presente en el mar-cador molecular proviene de diferencias en la ,"#),*2% $#3%=\Y% >#)4-*,+% $#7*$2&% 2%-"-taciones puntuales en los sitios de restriccin, a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc., 5"#%-+$*(,2)% 32% $*&/2),*2% #)/'#% !2'#&% $#% &*-tios de restriccin generando fragmentos po-3*-4'(,+&% D$#% $*?#'#)/#&% /2-2Q+&:% Dj*>"'2% S:8%X)% 3+,"&%ij9E%#&/R%$#()*$+%!+'% 32%,+-7*)2-cin de una enzima de restriccin y una sonda. Individuos homocigotas poseen el mismo pa-


trn de restriccin en ambos cromosomas ho-mlogos y por lo tanto producen una sola ban-da. Ejemplos de nomenclatura utilizada para loci RFLP son XNpb136 de arroz o Xpsr912-2A de trigo, que hacen referencia al laboratorio de origen y a las sondas utilizadas.

Las ventajas de los RFLPs radican en que son altamente reproducibles, codominantes y multiallicos. Por otro lado, cuentan con las $#&;#)/2.2&%$#%'%-"0%327+'*+&+)+-2*/"$% $#%los fragmentos de restriccin en cada locus hi-!#';2'*273#


5.4.2.1 i=E\&% D"23%5"#%3+&%&*/*+&%$#%1*7'*$2,*4)%#)%#3%=\Y-#)/+&%$#%=\Y%2-!3*(,2$+%debido a mutaciones en el sitio de reconoci-miento del iniciador, deleciones, inserciones. Este marcador no permite diferenciar indivi-duos heterozigotas

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