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Publicada por | Published by: Cooperación Latinoamericana y Caribeña en Plantas Medicinales y Aromáticas Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas BLACPMA ISSN 0717 7917 Fragaria vesca Volumen 8, Número 6, Noviembre de 2009 Editorial Edgar Pastene (Chile) Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante. Revisiones Ramirez et al. (Brasil) Efectos beneficiosos del extracto de frutas rojas y de sus antocianos. Fredes (Chile) Antioxidantes en berries nativos chilenos. Artículos Avello et al. (Chile) Extractos antioxidantes y antimicrobianos de Aristotelia chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosméticos. Letelier et al. (Chile) Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation. Rojo et al. (Chile) Antioxidant capacity and polyphenolic content of twelve traditionally used herbal medicinal infusions from the South American Andes. Gorriti Gutiérrez et al. (Perú) Antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas del maíz morado (Zea mays L.): Método de extracción. Gaviria Montoya et al. (Colombia) Actividad antioxidante e inhibición de la peroxidación lipídica de extractos de frutos de mortiño (Vaccinium meridionale SW). Dadé et al. (Argentina) Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21 aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina). Indexada por | Indexed by: Science Citation Index Expanded (SCISEARCH), Journal Citation Reports/Science Edition, Biological Abstracts y BIOThomson Reuters Master Journal List, SCOPUS, Chemical Abstracts (CAS), NAPRALERT, CAB International (CAB Abstracts), GlobalHEALTH, Index Copernicus, IMBIOMED, LATINDEX, QUALIS, REDALYC, Biblioteca Virtual da Saude (BVS).

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Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas

BLACPMA ISSN 0717 7917

Fragaria vesca Volumen 8, Número 6, Noviembre de 2009 Editorial

− Edgar Pastene (Chile) Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante. Revisiones

− Ramirez et al. (Brasil) Efectos beneficiosos del extracto de frutas rojas y de sus antocianos. − Fredes (Chile) Antioxidantes en berries nativos chilenos.

Artículos − Avello et al. (Chile) Extractos antioxidantes y antimicrobianos de Aristotelia chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosméticos. − Letelier et al. (Chile) Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation. − Rojo et al. (Chile) Antioxidant capacity and polyphenolic content of twelve traditionally used herbal medicinal infusions from the South American Andes. − Gorriti Gutiérrez et al. (Perú) Antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas del maíz morado (Zea mays L.): Método de extracción. − Gaviria Montoya et al. (Colombia) Actividad antioxidante e inhibición de la peroxidación lipídica de extractos de frutos de mortiño (Vaccinium meridionale SW). − Dadé et al. (Argentina) Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21 aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina).

Indexada por | Indexed by: Science Citation Index Expanded (SCISEARCH), Journal Citation Reports/Science Edition, Biological Abstracts y BIOThomson Reuters Master Journal List, SCOPUS, Chemical Abstracts (CAS), NAPRALERT, CAB International (CAB Abstracts), GlobalHEALTH, Index Copernicus, IMBIOMED, LATINDEX, QUALIS, REDALYC, Biblioteca Virtual da Saude (BVS).

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Comité Editorial | Editorial BoardFundadores

José L. Martínez (Chile) - Jorge Rodríguez (Cuba)

Editores José L. Martínez

Escuela de Kinesiología, Universidad Santo Tomas, Talca, Chile. José M. Prieto

School of Pharmacy, London University, Reino Unido. Gabino Garrido

Facultad de Ciencias, Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile.

Editores Ejecutivos Damaris Silveira

Facultade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, Brasil. Peter Taylor

Centro de Medicina Experimental, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela.

Carla Delporte Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de

Chile.

Editores de Eventos María Inés Isla

Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional de Tucumán, Argentina.

Marcelo Wagner Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires,

Argentina.

Co - Editores Bárbara Arias

Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.

Rosa Degen Universidad Nacional de Asuncion, Instituto de Investigaciones

Interdisciplinarias, Paraguay. Jeannette Gavillan

Universidad de Puerto Rico. Harold Gómez

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Cartagena, Colombia.

Vicente Martínez Escuela de Agricultura, Universidad de San Carlos, Guatemala.

Edgar Pastene Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Chile.

Janet Piloto Ferrer Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

La Habana, Cuba, Edison Osorio

Universidad de Antioquia, Colombia Edgar Puente

Centro de Toxicología y Biomedicina, Santiago de Cuba, Cuba, Gabriela Ricciardi

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes, Argentina,

Gloria Saavedra Centro de Tecnología Agroindustrial, Universidad Mayor de San

Simón, Cochabamba, Bolivia. Luiz Simeoni

Universidad de Brasilia, Brasil

Editores Asesores Arnaldo Bandoni

Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

Armando Cáceres Universidad de San Carlos, Guatemala,

Norman Farnsworth College of Pharmacy, University of Illinois at Chicago, Estados

Unidos. Michael Heinrich

The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido.

Peter Houghton Pharmaceutical Sciences Research Division, King's College,

London, Reino Unido. Leonora Mendoza

Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Francisco Morón

Laboratorio Central, Universidad de Ciencias Médicas de La Habana, Cuba. Patrick Moyna

Facultad de Química, Universidad La República, Montevideo, Uruguay.

Pulok K. Mukherjee School of Natural Product Studies, Jadavpur University, Kolkata,

India. Lionel Robineau

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de las Antillas y Guyana (UAG), Pointe à Pitre, Guadalupe.

Elisabeth Williamson School of Pharmacy, University of Reading, Reino Unido.

Consejo Editorial Talal Aburjai, Faculty of Pharmacy, University of Jordan, Amman, Jordan Christian Agyare, College of Health Sciences, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutics, KNUST, Kumasi, Ghana. Julio Alarcón, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad del Bio Bio, Chillán, Chile. Rocío Alarcón, The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Jorge Alonso, Asociación de Fitoterapia de Argentina, Buenos Aires, Argentina. Giovanni Apendino, DISCAFF, Universidad del Piemonte Oriental, Novara, Italia. Elizabeth Barrera, Sección Botánica, Museo Nacional de Historia Natural, Santiago, Chile. Bhaskar Behera, Agharkar Research Institute, Plant Science Division, Pune, India

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Salvador Cañigueral, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, España. Sergio Castro, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Geofrey Cordell, College of Pharmacy, Illinois University at Chicago, Estados Unidos. Rene Delgado, Centro Nacional Coordinador de Ensayos Clínicos, La Habana, Cuba. Saikat Dewanjee, Department of Pharmaceutical Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Jenny Duran, Facultad de Ciencias Químico Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor Real y Pontificia de San Francisco Xavier de Chuquisaca, Sucre, Bolivia. Josean Fechine Tavares, Laboratorio de Tecnología Farmacéutica, Universidade Federal da Paraiba, Brasil. Elena Fornet, Instituto Cubano de Meteorología, Holguín, Cuba. Mildred García, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica. Martha Gattusso. Área de Biología Vegetal, Universidad Nacional de Rosario, Argentina. Alejandra Gil, Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Ileana González, Universidad Católica del Maule, Talca, Chile. Rodolfo Juliani, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers University, New Jersey, Estados Unidos. Luis Kanzaki, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidade de Brasilia, Brasil. Ana Ladio, Departamento de Ecología, Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Argentina. Patricia Landazuri, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad del Quindio, Armenia, Colombia. Claudio Laurido, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Suzana Leitao, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. Olga Lock de Ugaz, Departamento de Ciencias, Pontificia Universidad Católica del Perú. Victor López, Facultad de Farmacia, Universidad de Navarra, España. Subhash C. Mandal, Faculty of Engineering and Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Abdul Manan Mat-Jais, Department of Biosciences, University of Putra, Putra, Malasia.

Pedro Melillo de Magalhaes, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas e Biológicas, UNICAMP, Campinas, Brasil. Fabian Michelangeli, Centro de Biofisica y Bioquimica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela. Brenda Modak, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Miguel Morales, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. John A.O. Ojewole, Faculty of Health Sciences, University of KwaZulu-Natal, Sudáfrica. Horacio Olivo, Division of Medicinal and Natural Products Chemistry, Iowa University, Estados Unidos. Mahendra Rai, Department of Biotechnology, Amravati University, Maharashtra, India. Luca Rastrelli, Dipartamento di Scienze Farmaceutiche, Universita de Salerno, Salerno, Italia. Elsa Rengifo, Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana, Iquitos, Perú. José Luís Ríos, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, España. Alicia Rodríguez, Universidad de La Habana, Cuba. Chaiyong Rujjanawate, School of Health Science, Mae Fah Luang University, Chiangrai, Tailandia. Aurelio San Martín, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. Guillermo Schinella, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Andrew Scholey, Brain Sciences Institute, Melbourne, Australia. Natasa Skalko-Basnet, Department of Pharmacy, University of Tromsø, Noruega. Nilka Torres, Centro Regional Universitario de Azuero, Universidad de Panamá. René Torres, Facultad de Química y Biología, Universidad de Santiago de Chile. Angélica Urbina, Facultad de Agronomía, Universidad de Concepción, Chile. Beatriz Varela, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Carlos Vicente, Editor Revista Biodiversidad, Argentina. Mohammad Zafarullah, University of Montreal, CHUM-Notre-Dame Hospital, Montreal, Canada. Talal Zari, Faculty of Science, King Abdulaziz University, Arabia Saudita.

BLACPMA es una publicación de la Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia “Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional” (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

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Editorial

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This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ )

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aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante

[Current state of the search for plants with antioxidant activity]

Edgar R. PASTENE*1

1Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Casilla 237, Barrio Universitario s/n, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

Abstract

Research on the antioxidant properties of edible and medicinal plants is marking sustained growth o decades. A significant number of products obtained

from the plant Kingdom like essential oils, alkaloids and polyphenols have antioxidant effects which are evidenced by different in vitro and in vivo assays.

However, it is difficult to harmonise and extrapolate the reported results, given the variety of available assays and constraints associated with each of them. The potential of polyphenols as antioxidant agents has been the most popular subject due to its high consumption in the diet and their ubiquitous presence in

many plant species. The current state of knowledge shows us that their potential benefits as prophylactic and therapeutic agents are still not fulfil but their

applications in the fields of nutraceutics and functional ingredients have been more immediate. In such products, besides their antioxidant capacity, other properties such as the anti-microbial and gastro and cardio-protective activities should be considered. Their use in isolated form is controversial with some

authors questioning the real contribution of polyphenols as responsible for the benefits of plants and foods because many polyphenols do not achieve the

systemic concentrations required to exert their effects. Therefore, there is an urgent necessity to shed some light about other plant components, a concern which should be shared by the scientific community involved in this area of expertise. Latest evidence points towards a primary action of these compounds in

the digestive tract rather than a systemic one, where not only they could display antioxidants properties but that also act as pro-oxidants and/or free radical

generators. Thereby, researchers are encouraged to expand the vision currently ascribed to the polyphenolic antioxidants, by proposing new models and experimental protocols, according to the final destination of these compounds.

Keywords: Antioxidants; Free radicals; Medicinal plants; polyphenols; essential oils; functional food

Resumen

La investigación de las propiedades antioxidantes de las plantas medicinales y alimenticias lleva décadas marcando un crecimiento sostenido. Un número importante de productos obtenidos del reino vegetal, como los aceites esenciales, alcaloides y los polifenoles, posee efectos antioxidantes los cuales

son evidenciados mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo. Sin embargo, resulta difícil armonizar y extrapolar los resultados reportados, dada la gran

variedad de ensayos disponibles y las limitaciones asociadas a cada uno de ellos. Por su elevado consumo a través de la dieta y la presencia ubicua en muchas especies vegetales, el potencial de los polifenoles como agentes antioxidantes ha sido el más estudiado. El estado actual del conocimiento nos muestra que

además de sus beneficios como agentes profilácticos/terapéuticos, para dichos compuestos debemos visualizar aplicaciones en el campo de las formulaciones

nutracéuticas e ingredientes funcionales. En tales productos, a la capacidad antioxidante se sumarían otras propiedades como las antimicrobianas, gastro y cardio-protectoras. Aunque en forma aislada, algunos autores han puesto en duda el aporte de los polifenoles como entidades únicas que expliquen los

beneficios de las plantas y alimentos. Particularmente, se sabe que muchos no logran las concentraciones sistémicas necesarias para ejercer sus efectos, lo que

plantea la necesidad de buscar explicaciones en otros componentes vegetales. Dicha preocupación debiera ser compartida por toda la comunidad científica involucrada en el área. En virtud de lo anterior, se han planteado que el sitio de acción primordial de estos compuestos estaría en el tubo digestivo donde no

sólo podrían actuar como antioxidantes sino que también como pro-oxidantes e incluso generadores de radicales libres. Por todo lo dicho, se llama a los

investigadores a ampliar la mirada que hasta ahora se tiene de los antioxidantes, proponiendo nuevos modelos y protocolos experimentales, más acordes con el destino final de estos compuestos.

Palabras Clave: Antioxidantes; radicales libres; plantas medicinales; polifenoles; aceites esenciales; alimentos funcionales.

Recibido | Received: October 22, 2009.

Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: November 12, 2009.

Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009.

Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests.

Financiación | Funding: This work was supported by a grant from the Universidad Nacional de La Plata (Programa de Incentivos X 446)

This article must be cited as: Edgar R. Pastene. 2009. Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):449 – 455.

{EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Edgar R. PASTENE. E-mail: [email protected] .

Introducción:

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INTRODUCCIÓN

En la presente edición de BLACPMA se presenta

una serie de artículos científicos que cubren varios

aspectos de la investigación en plantas medicinales

con propiedades antioxidantes. En dichos trabajos, el

lector puede encontrar esfuerzos destinados a generar

datos sobre la capacidad antioxidante de plantas

medicinales de uso regional, y cómo ésta se asociaría

con algunas de las propiedades terapéuticas

reportadas por la etnomedicina (Rojo et al., 2009;

Dadé et al., 2009, éste número). Desde hace varias

décadas se ha venido reconociendo que el consumo

regular de antioxidantes contribuye a disminuir el

riesgo relativo de desarrollar enfermedades crónicas

degenerativas no-transmisibles. Al respecto, gran

parte de esta literatura hace referencia a fuentes

alimentarías ricas en antioxidantes, principalmente

del tipo polifenólico. En este número, la necesidad de

profundizar en la química y actividad biológica de los

pigmentos antociánicos de berries nativos y granos,

es abordada en tres trabajos (Ramírez et. al., 2009;

Fredes, 2009, Gorrini et al., 2009, éste número). Las

propiedades antioxidantes no sólo deben ser

enfocadas desde el punto vista de las interacciones

químico-biológicas señaladas anteriormente, además,

pudieran verse como una oportunidad para frenar el

deterioro oxidativo que ciertamente afecta a los

alimentos y los productos de uso cosmético. Dichos

aspectos, en conjunto con la determinación de sus

propiedades antimicrobianas sobre patógenos

relevantes a la piel, son reportados para extractos de

las hojas de Ugni molinae y Aristotelia chilensis

(Avello et al., 2009, éste número). Dadas sus

características fisicoquímicas, los aceites esenciales

pueden ejercer interesantes efectos antioxidantes

tanto en matrices alimentarias como en sistemas

biológicos. Hasta hace poco, era infrecuente

encontrar trabajos que describieran otros efectos de

los antioxidantes, particularmente aquellos que

potencialmente pueden modular la biotransformación

de xenobióticos. Por tal motivo, resulta altamente

relevante el enfoque planteado por Letelier et al.,

(2009, éste número) y sus observaciones relativas al

efecto de un extracto de Romero sobre las reacciones

de biotransformación. Los ensayos utilizados en éste

y otros estudios realizados con células, se podrían

clasificar en un nivel más avanzado, debido a su

mayor cercanía con sistemas biológicos complejos.

Al existir un mayor número de sustratos biológicos

oxidables y sistemas antioxidantes endógenos

(enzimáticos o no), éstos ensayos permiten

determinar con mayor claridad aspectos mecanísticos

y concentraciones necesarias para logar los efectos

pesquisados. Sin embargo, cabe señalar que aún se

esta muy lejos de entender cómo las plantas

contribuyen a prevenir o mejorar enfermedades

ligadas a la producción de radicales libres. Lo

anterior representa una tarea pendiente que

necesariamente requiere de una mirada diferente. Al

respecto, en el mundo científico existe una tendencia

sostenida a considerar los aspectos siguientes:

RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES,

CAMBIO DE PARADIGMAS.

Aspectos metodológicos: ¿Usamos uno o más

ensayos antioxidantes?

La importancia de los polifenoles en salud

humana ha sido ampliamente revisada (Ross, 2002;

Kim et al., 2003; Kris-Etherton et al., 2004;

Raumussen et al., 2005; Ramassamy, 2006; Lira

Mora et al., 2009). No obstante, uno de los aspectos

críticos de la investigación sobre la capacidad

antioxidante de productos naturales se relaciona con

la elección de las herramientas de medición. El

estado del arte nos indica que cada vez es necesario

contar con una batería de ensayos que nos permitan

obtener información complementaria. Al respecto, en

esta edición se incluye un trabajo donde el potencial

antioxidante de los pigmentos antociánicos de frutos

de Mortiño fue evaluado mediante varios ensayos

(Montoya el al., 2009, este número), destinados a

revelar el potencial de este fruto como agente

antioxidante de matrices oleosas. Al respecto, el uso

de radicales estables coloreados como el DPPH,

ABTS, DMPD, o reactivos como el FRAP; se

recomiendan como criterio preliminar para

jerarquizar las distintas plantas, extractos o fracciones

de éstos, de acuerdo a su poder antioxidante. Dado

que en los ensayos mencionados ocurren reacciones

de transferencia de electrones y/o hidrógeno, el

adecuado conocimiento de la química de tales

sistemas es condición sine qua non para interpretar

correctamente los resultados, particularmente cuando

estos ensayos se aplican a muestras de fluidos

biológicos.

Como se puede apreciar en muchos estudios, los

datos a menudo son cruzados con el contenido de

polifenoles totales de las muestras, determinados

como equivalentes de ácido gálico (GAE). Sin

embargo, cada vez es más frecuente recurrir a

técnicas de separación acopladas a sistemas de

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detección como el arreglo de diodos (DAD) o la

espectrometría de masas (LC-MS). Dichas técnicas

permiten diseccionar de mejor manera la actividad

antioxidante y asignarla a un grupo específico de

compuestos. Si bien es cierto, no existe una

metodología que pueda ser considerada como un

“Gold Standard”, numerosos estudios consideran que

ciertos ensayos como el ORAC (Oxygen Radical

Absorbance Capacity), poseen ventajas comparativas

en relación al resto (Ou et al., 2001). El índice ORAC

permite combinar en un solo parámetro, información

sobre la cinética de oxidación utilizando el área bajo

la curva de decaimiento de la fluorescencia o

absorbancia de una sonda como la fluoresceína

(ORAC-FL) o el rojo de pirogalol (ORAC-PGR), la

cual es desafiada por radicales peroxilo (AAPH). En

el ensayo ORAC-FL los tiempos de inducción están

fuertemente influenciados por el número de grupos

fenólicos presentes en la muestra mientras que, en el

ensayo ORAC-PGR, dichos tiempos prácticamente

no se observan y el decaimiento de la absorbancia se

ve influenciado principalmente por la reactividad de

los fenoles de la muestra. Recientemente, se ha

planteado que ambos índices ORAC (FL y PGR) son

complementarios y su relación es un mejor indicador

de la calidad promedio de los antioxidantes de una

muestra (Poblete et al., 2009). El mismo grupo de

investigadores, ha propuesto el ORAC-PRG como

una forma rápida de determinar el contenido

específico de vitamina C en extractos y fluidos

biológicos, dado que esta sustancia es una de las

pocas que genera tiempos de inducción en forma

concentración-dependiente (Atala et al., 2009; Torres

et la., 2008). En busca del “Santo Grial

metodológico”, y con el objetivo de ampliar su

espectro de aplicación, varios refinamientos han sido

introducidos a este ensayo. Por ejemplo, el uso de

ciclodextrina metilada permite obtener el índice

ORAC lipofílico en distintas muestras vegetales o

fluidos biológicos (Huang et al., 2002).

Adicionalmente, el ensayo ha demostrado ser

altamente versátil, debido a que en él se han

introducido modificaciones que permiten medir el

efecto de antioxidantes sobre otras especies reactivas

del oxígeno y nitrógeno dando origen a variantes para

el radical hidroxilo (HORAC), peroxinitrito

(NORAC), anión superóxido (SORAC), (Ou et al.,

2002; http://www.brunswicklabs.com/).

Paralelamente, otros investigadores han desarrollado

un ensayo denominado CUPRAC (Cupric ion

reducing antioxidant capacity), el cual se ha

empleado para la determinación de la capacidad

antioxidante de polifenoles, ácido ascórbico y tioles

(Apak et al., 2004; Cekic et al., 2009). El ensayo

también se ha adaptado para al análisis de

antioxidantes hidrofílicos como lipofílicos (Celik et

al., 2007) y en la determinación de la capacidad

captadora de radical hidroxilo (Bektasoglu et al.,

2008). Hace poco, el uso del índice ORAC como

criterio de poder antioxidante ha sido empleado por la

USDA (United States Department of Agriculture), la

cual ha publicado una serie de tablas con la

composición antioxidante de alimentos y plantas

medicinales de uso en Norteamérica.

(http://www.ars.usda.gov/nutrientdata/ORAC).

Recientemente, dicha experiencia ha sido tomada

como ejemplo por el Laboratorio de Antioxidantes

del Instituto de Nutrición y Tecnología de los

Alimentos de la Universidad de Chile (INTA,

CORFO-Innova, http://www.inta.cl). Ellos se han

embarcado en un ambicioso proyecto para analizar el

contenido de antioxidantes de gran parte de los frutos

consumidos en Chile, convirtiéndose en el segundo

país del mundo en contar con una base de datos de

similares características a la de la USDA.

Cambiando paradigmas: Uso de las plantas

medicinales y alimenticias como fuente de sistemas

generadores de especies reactivas del oxígeno y

nitrógeno.

Cada vez es más evidente que los polifenoles son

moléculas promiscuas que pueden afectar distintas

funciones biológicas para bien o para mal. Al

respecto, existe creciente evidencia que éstos

compuestos en determinadas condiciones pueden

actuar como pro-oxidantes. La forma en que los

polifenoles podrían actuar como generadores de

especies reactivas del oxígeno (ERO) ha sido

abordada por varios investigadores (Aragawa et al.,

2003; Arakawa et al. 2002, 2004; Aoshima et al.

2005). Utilizando como modelo de polifenol,

catequinas de té verde (cuya propiedad bactericida es

conocida), los autores demostraron que a pH 7-8 (o

superiores), tal tipo de estructura es capaz de generar

cantidades significativas de peróxido de hidrógeno.

De acuerdo a los autores, la generación de peróxido

de hidrógeno podría explicar el efecto bactericida de

los flavan-3-oles. La habilidad de las catequinas para

generar peróxido de hidrógeno sería favorecida por el

arreglo de grupos hidroxilo en este tipo de moléculas,

lo que permitiría la disociación del H+ en solución y

un electrón en el fenol que reduce al oxígeno,

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generándose en consecuencia anión superóxido. El

anión superóxido posteriormente sufre reducción por

la catequina (ej. EGCG), lo que lleva a la formación

de O2 2-

; adicionalmente, el protón se combina con el

superóxido generando H2O2. Este mecanismo no sólo

explicaría la generación de H2O2 producida por

catequinas puras sino también por parte de infusiones

de té negro, té verde y té Oolong conteniendo del

orden de 1-2.4 x 10-4

mol/L de catequinas. Estas

concentraciones de H2O2 serían suficientes para

ejercer una acción bactericida en cepas Gram

positivas y negativas (Arakawa et al., 2004). La

generación de H2O2 por parte de las catequinas del té

verde no sólo es un fenómeno concentración-

dependiente sino también dependiente del contexto

celular (Yamamoto et al., 2004). Llama la atención

que en estos modelos se observe una capacidad de

inducir muerte y/o arresto de la proliferación en

líneas celulares inmortalizadas derivadas de tumores

(Wang, 2000; Lu et al., 2002). Esta poli-

funcionalidad por parte de algunos compuestos

fenólicos (EGCG, por ejemplo), es evidente si se

considera que además, éstos podrían generar

ambientes oxidativos diferenciales que permitan

proteger a las células del huésped de las ERO y por

otro lado promover la apoptosis de las células

tumorales (Yamamoto, et al., 2003).

En otro ámbito, la investigación de las

propiedades antioxidantes in vivo, habitualmente está

expuesta a las vicisitudes propias de los sistemas

biológicos. Resulta emblemático el caso de la

elevación de la capacidad antioxidante plasmática

post-consumo de manzanas, la cual finalmente fue

asociada a un aumento del ácido úrico derivado del

metabolismo de la fructosa (Lotito y Frei, 2004). Aún

más sorprendente resultan los hallazgos

recientemente publicados en la revista Hypertension

(Webb et al., 2008), en la cual se reporta que los

efectos anti-hipertensivos, vasoprotectores y anti-

agregantes plaquetarios de muchos frutos estarían

más bien asociados a su concentración de nitratos. En

efecto, en voluntarios sanos, la administración de

500mL de jugo de betarraga (remolacha) produjo una

disminución significativa de la presión sanguínea, la

cual coincidió con un pico plasmático de nitrito. La

disfunción endotelial también fue contrarestada por el

consumo de jugo de betarraga. Los autores proponen

que la reconversión entero-salival de nitrato a nitrito

(facilitada por bacterias anaerobias situadas en la

superficie de la lengua), facilita la posterior

producción de óxido nítrico (NO) en las condiciones

ácidas del estómago. El NO, puede ser oxidado a

nitrito nuevamente a nivel portal y finalmente ser

convertido en NO en aquellos vasos sanguíneos que

presentan resistencia. El aumento de la producción de

NO a nivel gástrico también puede ser beneficioso,

protegiendo la mucosa en aquellos pacientes

sometidos a tratamientos con anti-inflamatorios no

esteroidales (AINE) o infectados por Helicobacter

pylori. Más aún, se ha observado que ciertos

polifenoles promueven la formación no enzimática de

NO en el estómago, lo que consecuentemente

produce una relajación del músculo liso vascular in

vivo (Silva Rocha, 2009). Así, para las manzanas

(cuya pulpa es rica en ácido clorogénico), ya se había

reportado un aumento de la producción gástrica de

NO a partir del nitrito previamente generado por las

bacterias de la lengua (Peri et al., 2005). De esta

manera, se han ido sumando reportes de efectos de

los polifenoles que no requieren concentraciones

plasmáticas elevadas de éstos y que nos llevan a

pensar que el sitio más importante de acción de ellos

es el tracto digestivo (vide infra).

¿EL TRACTO GASTROINTESTINAL COMO

PRINCIPAL SITIO DE ACCIÓN DE LOS

ANTIOXIDANTES?

Sabemos que la actividad antioxidante parece

estar asociada a determinadas especies vegetales de

uso médico y/o alimenticio, y por consiguiente

pudiera estar limitada a sólo algunas familias de

metabolitos secundarios. Ejemplos de esto lo

constituyen diferentes bayas (berries ricos en

polifenoles), algunas crucíferas (brócoli rico en

glucosinolatos), propóleos y especies con aceites

esenciales. Al respecto, dentro de los grupos de

metabolitos secundarios más estudiados destacan los

polifenoles. Sin embargo, como ya adelantamos, lo

disperso de la información relativa con su absorción,

metabolismo, distribución y excreción ha llevado a

muchos investigadores a poner en duda los efectos de

los polifenoles a nivel sistémico. De esta forma, se ha

sugerido que el primer y tal vez principal sitio donde

éstos compuestos podrían ejercer su acción

antioxidante, sería el tracto gastrointestinal (Revisado

por Clifford, 2004). Muchos estudios en humanos

destacan que sólo algunos polifenoles son absorbidos

en el intestino delgado. Cabe destacar que la mayor

parte de los que logran llegar a nivel sistémico lo

hacen conjugados por glucuronidación, sulfo-

conjugación y metilación, y siempre en

concentraciones plasmáticas extremadamente bajas.

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Sólo entre un 5 y un 10% de los polifenoles

absorbidos circulan en forma no-conjugada. Por lo

tanto, es muy difícil realizar estudios reales de

farmacocinética, y las muestras de plasma u orina

habitualmente deben ser sometidas a hidrólisis con -

glucoronidasa y/o sulfatasa para liberar las agliconas.

Tales estudios pseudos-farmacocinéticos han llevado

a concluir que las concentraciones de polifenoles en

plasma son bajos, muy variables y con máximos

transitorios (Tmáx 1 - 2.5 horas). Es improbable que

los conjugados sobrepasen concentraciones de 10 M

en total, o de 1 M en el caso de las agliconas. Puesto

que es un hecho que gran parte de los polifenoles no

se absorben, entonces es válido formular la pregunta

¿qué funciones pueden cumplir esta gran masa de

antioxidantes en las diferentes porciones del tubo

digestivo? Recientemente, Selma et al., (2009), han

publicado una impecable revisión que da cuenta del

universo de potenciales interacciones y reacciones

entre los polifenoles y la biota intestinal. En este

trabajo se sugiere que el efecto sistémico de los

polifenoles seria atribuible a la modulación del

equilibrio bacteriano intestinal y a los metabolitos

intestinales generados a partir de éstos.

El estrés oxidativo asociado a la respuesta inmune

que sucede a la presencia de algunos patógenos como

Helicobacter y Salmonella, representa uno de los

principales mecanismos de defensa pero que, a su vez

ocasiona daño colateral a la mucosa gástrica e

intestinal. Por lo tanto, parece muy relevante disponer

de eficientes sistemas antioxidantes (tanto endógenos

como dietarios) en la zona de infección. Sin

embargo, algunos patógenos como H. pylori poseen

estrategias de supervivencia contra el estrés oxidativo

que hacen surgir la interrogante de cuán beneficiosa

puede ser la administración o ingesta de

antioxidantes. Los antecedentes sugieren que estos

compuestos podrían tener un efecto protector, no sólo

para el huésped (citoprotegiendo el epitelio), sino

también sobre el H. pylori (contribuyendo a sus

defensas antioxidantes). Teóricamente, al aumentar la

capacidad de las bacterias para “lidiar” con las ERO

generadas por el sistema inmune del huésped, se

aumentaría también la posibilidad de que la infección

se consolide. No obstante, estudios en los cuales se

han testeado extractos de plantas ricos en compuestos

antioxidantes dan cuenta de efectos anti-H. pylori

tanto in vitro como in vivo (Nostro et al., 2005;

Mahady et al., 2005; Ustun at al., 2006). De acuerdo

a antecedentes preliminares, los compuestos

polifenólicos poseen reconocida actividad

bactericida, asociada probablemente a mecanismos

inespecíficos que no necesariamente guardan relación

con su actividad antioxidante (citoprotectora) sobre

las células del epitelio gástrico (Puupponen-Pimia et

al., 2001, 2008). Una de las hipótesis que se ha

aceptado como paradigma, es que los polifenoles

ejercen parte de su actividad antimicrobiana mediante

una interacción no específica con componentes de la

membrana plasmática (Mori et al., 1987; Haraguchi

et al., 1998; Funatogawa et. al., 2004). Otro enfoque

que resulta altamente atractivo, es cómo los

polifenoles pueden modular la adhesión tanto de

bacterias patógenas como de aquellas con función

probiótica (Lactobacilos). Mientras la mayoría de los

polifenoles muestra capacidad antimicrobiana en

distintos rangos, sólo algunos como la floridzina

(chalcona) y la rutina (flavonol), aumentan la

adherencia de Lactobacillus rhamosus a células

Caco-2 (Parkar et al., 2008). Interesantemente, la

propiedad adhesiva de las bacterias prebióticas es uno

de los tantos obstáculos que se deben sortear para

lograr un efecto beneficioso en el intestino (Revisado

por Prakash et al., 2008)

En virtud de lo anterior, ¿En qué medida se

vinculan mecanísticamente la actividad antibacteriana

con la actividad antioxidante de los polifenoles? Al

respecto, dependiendo del grupo de metabolitos

secundarios presentes en la especie estudiada,

existiría una asociación “no-obligada” entre la

actividad antioxidante de algunos polifenoles y su

actividad anti-microbiana (Correia et al., 2004; Shin

et al. 2005). Por ejemplo, se sabe que las

antocianidinas contribuyen en forma importante a la

capacidad antioxidante del arandano, no obstante,

recientemente se ha demostrado que la inhibición de

la adhesión de H. pylori, a la mucosa gástrica humana

se debería, más bien, a sus constituyentes de alto peso

molecular (procianidinas) (Burger et al., 2000).

PALABRAS FINALES.

Durante años, diversas sub-disciplinas de la

química y la biología nos han enseñado y revelado

aspectos sesgados, que sólo permiten una visión

parcial de la complejidad de los procesos oxidativos.

Claramente se requiere complementar las

herramientas de medición existentes e incorporar

paulatinamente tecnologías de punta así como

consensuar metodologías entre academia e industria.

Lejos aún de entender como se mueven los delicados

engranajes que sub-yacen al equilibrio redox celular,

en algún punto se hace absolutamente necesario que

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la investigación de antioxidantes tienda hacia

modelos celulares. En ellos se podría refinar y

comprender el comportamiento de estas sustancias en

un escenario real, lo que finalmente nos permitirá

diseñar por ejemplo, mejores estrategias de

prevención y tratamiento de las enfermedades o crear

nuevos alimentos funcionales. Para que la tarea sea

exitosa, se requiere de un esfuerzo mancomunado de

colaboración entre todos aquellos investigadores que

deseen ampliar la frontera del conocimiento. En otras

palabras, a ratos los científicos debiéramos abandonar

paulatinamente los demiurgos propios del

Hegelianismo, que ponen al pensamiento por sobre la

realidad.

REFERENCIAS

Ahoshima H, Okita Y, Hossain SJ, Fukue K, Mito M,

Orihara Y, Yokoyama T, Yamada M, Kumagai A,

Nagaoka Y, Uesato S, Hara Y. 2005. Effect of 3-O-

octanoyl-(+)-catechin on responses of GABAA

receptors and Na+/glucose cotransporters expressed in

Xenopus Ooocytes and the oocyte membrane

potential. J. Agric. Food Chem. 53: 1955-1959.

Apak R, Guclu K, Ozyurek, M, Karademir, SE. 2004.

Novel Total Antioxidant Capacity Index for Dietary

Polyphenols and Vitamins C and E, Using Their

Cupric Ion Reducing Capability in the Presence of

Neocuproine: CUPRAC Method. J. Agric. Food

Chem. 52: 7970-7981.

Arakawa H, Kanemitsu M, Tarima N, Maeda M. 2002.

Anal. Chim. Acta. 472: 75-82.

Arakawa H, Maeda M, Okubo S, Shimamura T. 2004.

Role of hydrogen peroxide in bactericidal action of

catechin. Biol. Pharm. Bull. 27: 277-281.

Atala E, Vásquez L, Speisky H, Lissi E, López-Alarcón C.

2009. Ascorbic acid contribution to ORAC values in

berry extracts: An evaluation by the ORAC-pyrogallol

red methodology. Food Chem.113: 331-335.

Bektasoglu B, Ozyurek M, Guclu K, Apak R. 2008.

Hydroxyl radical detection with a salicylate probe

using modified CUPRAC spectrophotometry and

HPLC. Talanta 77: 90-97.

Burger O, Ofek, I, Tabak M, Weiss E, Sharon N, Neeman

I. 2000. A high molecular mass constituent of

cranberry juice inhibits Helicobacter pylori adhesion

to human gastric mucus. FEMS Immunol Med.

Microbiol 29: 295-301.

Cekic SD, Baskan KS, Tutem E, Apak R. 2009. Modified

cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC) assay

for measuring the antioxidant capacities of thiol-

containing proteins in admixture with polyphenols.

Talanta 79: 344-351.

Celik SE, Ozyurek M, Guclu K, Apak, R. 2007. CUPRAC

total antioxidant capacity assay of lypophilic

antioxidants in combination with hydrophilic

antioxidants using macrocyclic oligosaccharide

methyl -cyclodextrin as the solubility enhancer.

Reactive & Functional Polymers 67: 1548-1560.

Clifford MN. 2004. Diet-Derived Phenols in Plasma and

Tissues and their Implications for Health. Planta Med.

70: 1103-1114.

Correia RTP, Mccue P, Vattem DA, Magalhaes MMA,

Macedo GR, Shetty K. 2004. Amylase and

Helicobacter pylori inhibition by phenolic extracts

pineapple wastes bioprocessed by Rhizopus

oligosporus. Journal of Food Biochemistry 28: 419-

434.

Funatogawa K, Hayashi S, Shimomura H, Yoshida T,

Hatano T, Ito H, Hirai Y. 2004. Actibacterial activity

of hydrolyzable tannins derived from medicinal plants

against Helicobacter pylori. Microbiol. Immunol. 48:

251-261.

Haraguchi H, Tanimoto K, Tamura, Y, Mizutani, K,

Kinoshita, T. 1998. Mode of antibacterial action of

retrochalcones from Glycyrrhiza inflata.

Phytochemistry 48: 125-129.

Huang D, Ou B, Hampsch-Woodhill M, Flanagan JA,

Deemer EK. 2002. Development and Validation of

oxygen radical absorbance capacity assay for

lypophilic antioxidants using randomly methylated b-

cyclodextrin the solubility enhancer. J. Agric. Food

Chem. 50: 1815-1821.

Kim H-W, Kim O-H, Sung M-K. 2003. Effects of Phenol-

Depleted and Phenol-Rich Diets on Blood Markers of

Oxidative Stress, and Urinary Excretion of Quercetin

and Kaempferol in Healthy Volunteers. Journal of the

American College of Nutrition 22: 217-223.

Lotito S, Frei B. 2004. The increase in human plasma

antioxidant capacity after apple consumption is due to

the metabolic effect of fructose on urate, not apple-

derived antioxidant flavonoids. Free Radical Biology

and Medicine 37: 251-258.

Lu YP, Lou YR, Xie JG, Peng QY, Liao I, Yang CS,

Huang MT, Conney AH. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 99: 12455-12460.

Mahady GB, Pendland SL, Stoia A, Hamill FA, Fabricant

D, Dietz BM, Chadwick LR. 2005. In vitro

susceptibility of Helicobacter pylori to botanical

extracts used traditionally for the treatment of

gastrointestinal disorders. Phytother. Res. 11: 988-91.

Mori A, Nishino C, Enoki N, Tawata S. 1987.

Antibacterial activity and mode of action of plant

flavonoids against Proteus vulgaris and

Staphylococcus aureus. Phytochemistry 26: 2231-

2234.

Nostro A, Cellini L, Bartolomeo SD, Cannatelli MA,

Campli ED, Procopio F, Grande R, Marzio L, Alonzo

V. 2005. Effects of combinating extracts (from

propolis or Zingiber officinale) with clarythromycin

Page 10: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Pastene Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad antioxidante

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 455

on Helicobacter pylori. Phytother. Research. 20:187-

190.

Ou B, Hampsch-Woodhill M, Flanagan JA, Deemer EK,

Prior RL, Huang D. 2002. Novel Fluorometric assay

for hydroxyl radical prevention capacity using

fluorescein as the probe. J. Agric. Food Chem. 50:

2772-2777.

Ou B, Hampsch-Woodhill M, Prior RL. 2001.

Development and validation of an improved oxygen

radical absorbance capacity assay using fluorescein as

the fluorescence probe. J. Agric. Food Chem. 49,

4619-4626.

Parkar SG, Stevenson DE, Skinner MA. 2008. The

potential influence of fruit polyphenols on colonic

microflora and human gut health. International Journal

of Food Microbiology 124: 295-298.

Prakash S, Malgorzata Urbanska. 2008. Colon-targeted

delivery of live bacterial cell biotherapeutics including

microencapsulated live bacterial cells. Biologics:

Targets & Therapy 3: 355-378.

Peri L, Pietraforte D, Scorza G, Napolitano A, Fogliano V,

Minetti M. 2005. Apples increase nitric oxide

production by human saliva at the acidic pH of the

stomach: a new biological function fro polyphenols

with a catechol group? Free Rad. Biol. & Med. 39:

668-681.

Poblete A, López-Alarcón C, Lissi E, Campos AM. 2009.

Oxygen Radical Antioxidant Capacity (ORAC) values

of herbal teas obtained employing different

methodologies can provide complementary data. J.

Chil. Chem. Soc. 54: 154-157.

Puupponen-Pimia R, Nohynek L, Meier C, Kahkonen M,

Heinonen M, Hopia A, Oksman-Caldenty, KM. 2001.

Antimicrobial properties of phenolic compounds from

berries. Journal of Applied Microbiology 90: 494-507.

Ramassamy C. 2006. Emerging role of polyphenolic

compounds in the treatment of neurodegenerative

diseases: A review of their intracellular targets.

European Journal of Pharmacology 545: 51-64.

Rausmussen, SE, Frederiksen H, Krogholm KS, Poulsen L.

2005. Dietary proanthocyanidins: Occurrence, dietary

intake, bioavailability, and protection against

cardiovascular disease. Mol. Nutr. Food. Res. 49: 159-

174.

Ross JA, Kasum CM. 2002. Dietary Flavonoids:

Bioavailability, Metabolic Effects, and Safety. Annu.

Rev. Nutr. 22: 19-24.

Selma MV, Espín JC, Tomás Barberán FT. 2009.

Interaction between Phenolics and Gut Microbiota:

Role in Human Health. J. Agric. Food Chem. 57:

6485–6501.

Shin J-E, Kim J-M, Bae E-A, Hyun Y-J, Kim D-H. 2005.

In vitro inhibitory effect of the flavonoids on growth,

infection and vacuolation of Helicobacter pylori.

Planta Med. 71: 197-201.

Silva-Rocha B. 2009. Dietary nitrite interacts with

polyphenols in the stomach, inducing smooth muscle

relaxation via production of nitric oxide. Free Radicals

and Antioxidants in Chile. VI Meeting of SFRBM

South American Group., 27-30 september, O14, 44.

Torres P, Galleguillos P, Lissi E, López-Alarcón C. 2008.

Antioxidant capacity of human blood plasma and

human urine: Simultaneous evaluation of the ORAC

index and ascorbic acid concentration employing

pyrogallol red as probe. Bioorg. Med. Chem.16: 9171-

9175.

Ustun O, Ozcelik B, Akyon Y, Abbasoglu U, Yesilada E.

2006. Flavonoids with anti-Helicobacter pylori

activity from Cistus laurifolious leaves. Journal of

Ethnopharmacology 108: 457-461.

Wang HK. 2000. The therapeutic potential of flavonoids.

Exp. Opin. Invest. Drugs. 9: 2103-2119.

Webb AJ, Patel N, Luokogeorgakis S, Okorie M, Zainab

A, Misra S, Rashid R, Miall P, Deanfield J, Benjamín

N, MacAllister R, Hobbs AJ, Ahluwalia A. 2008.

Acute Blood Pressure Lowering, Vasoprotective, and

Antiplatelet Properties of Dietary Nitrate via

Bioconversion to Nitrite. Hypertension 51: 784-790.

Yamamoto T, Hsu S, Lewis J, Huata J, Dickinson D, Singh

B, Bollag WB, Lockwood P, Ueta E, Osaki T,

Schuster G. 2003. Green tea polyphenol causes

differential oxidative environments in tumor versus

normal epithelial cells. The Journal of Pharmacology

and Experimental Therapeutics 307: 230-236.

Yamamoto T, Lewis J, Wataha J, Dickinson D, Singh B,

Bollang W, Ueta E, Osaki T, Athar M, Schuster G,

Hsu S. 2004. Roles of catalase and hydrogen peroxide

in Green Tea Polyphenol-Induced Chemoprotective

effects. The Journal of Pharmacology and

Experimental Therapeutics 308: 317-323.

Page 11: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

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BLACPMA ISSN 0717 7917

Revisión | Review

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Efectos beneficiosos de extractos de frutas rojas y de sus antocianos

[Beneficial properties of red berries extracts and their anthocyanins]

Maria Rosana RAMIREZ1*, Laura GERACITANO 2, Daniela MARTI BARROS 2, Amelia Teresinha HENRIQUES1*

1Universidade Federal de Rio Grande do sul (UFRGS). Av. Ipiranga 2752, PoA, RS, Brasil;

2Fundação Universidade Federal de Rio Grande (FURG), Av. Itália Km 8, CEP 96.201-900, RS, Brasil.

Abstract

Epidemiological reports have indicated that individuals who consume diets containing large amounts of fruits and vegetables may reduce their risk for developing age-related diseases. These reductions might be expressed as improvements in motor and cognitive behavior. This review summarized data related

to in vitro and in vivo antioxidant activity of polyphenols, emphasizing the main role of anthocyanins. In particular, their physiological effects, their

metabolism, bioavailability as well as their direct interaction with lipids and DNA.

Keywords: Red berry; Antioxidant activity; Anthocyanins; DNA.

Resumen

Los polifenoles constituyen un grupo de sustancias químicas considerados metabolitos secundarios de las plantas. Actualmente existe un renovado

interés por estos compuestos en virtud de su actividad antioxidante y sus posibles implicaciones beneficiosas en la salud humana, tales como prevención de

enfermedades crónico-degenerativas. En esta revisión, resumimos los datos relacionados con la actividad antioxidante de in vitro e in vivo de los polifenoles,

particularmente los antocianos. Concretamente, sus efectos fisiológicos, su metabolismo, biodisponibilidad así como su interacción directa con moleculas de relevancia biológica como la molécula de ADN y los lípidos.

Palabras Clave: Frutas rojas; Antocianos; Actividad antioxidante; ADN.

Recibido | Received: December 9, 2008.

Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: May 12, 2009.

Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009

Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests.

Financiación | Funding: This work was not financed.

This article must be cited as: Maria Rosana Ramirez, Laura Geracitano, Daniela Marti Barros , Amelia Teresinha Henriques. 2009. Efectos beneficiosos de extractos de frutas rojas

y de sus antocianos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):456 – 468. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email [email protected]; [email protected] Tel: 0055-51-3308-5258 Fax: 0055-51-3308-5437.

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INTRODUCCIÓN

Durante el año 1989 la Organización Mundial de

la Salud realizó un trabajo de investigación

denominado proyecto Mónica, el mismo suscitó

interés debido a los resultados obtenidos que

demostraron que las tasas de mortalidad por

enfermedades cardiovasculares en Francia eran

menores que en otros países industrializados como

por ejemplo el Reino Unido y los Estados Unidos y

que esa reducción significativa en las mismas estaba

relacionada con el consumo de vino en esos países.

Este trabajo de investigación fue realizado en la

ciudad de Burdeos (Francia) en el cual se

seleccionaban individuos que tenían el hábito de

consumir una dieta rica en grasas y

consecuentemente presentaban un riesgo elevado de

padecer enfermedades cardiovasculares entre otras.

También fueron considerados otros factores como el

hábito de fumar y la presión arterial, comprobándose

que a pesar de practicar hábitos alimentares

perjudiciales la población exhibía un bajo índice de

enfermedades cardiovasculares, de colesterol

sanguíneo así como una baja frecuencia de ataques

cardiacos, esta particular situación fue denominada

como “paradoja francesa”. La explicación a los

resultados obtenidos fue fundamentada en el tipo de

dieta basada en frutas, verdura e vino, alimentos

particularmente ricos en compuestos fenólicos

(Criqui y Riegel, 1994; Renaud y Ruf, 1994).

En el mismo sentido, otros autores demostraron

que los consumidores moderados de vino tinto,

cuando comparados con los abstemios presentan

menor riesgo de padecer tanto la enfermedad de

Alzheimer, como demencia senil. De acuerdo con

otros autores la reducción del riesgo en los

consumidores de vino de contraer Alzheimer es de

aproximadamente 25% y menor del 20% de padecer

demencia senil (Orgogozo et al., 1997).

En Brasil se considera que las enfermedades

cardiovasculares son la principal causa de muerte

(32%), se calculan aproximadamente 820 casos por

día y aproximadamente 300 mil muertes por año, es

decir por cada cien mil habitantes ocurren en torno de

160 muertes, éste índice cuando comparado con otros

países como el Japón donde se registran 42 muertes

por cada cien mil habitantes, el índice brasilero es

extremadamente elevado. De acuerdo con los datos

divulgados por la Sociedad Brasilera de Cardiología

(FUNCOR) aproximadamente 42% de los individuos

adultos brasileros presentan un índice elevado de

colesterol y el 15% son hipertensos. No obstante,

existe una ciudad denominada Veranópolis, la misma

está situada en el estado de Rio Grande do Sul, la

cual se destaca por presentar el mayor índice de

expectativa de vida del país y el tercero en el mundo.

Los trabajos de investigación realizados en ésta

ciudad también relacionaron el elevado índice de vida

con el consumo moderado de vino tinto así como de

alimentos producidos en la región.

Del mismo modo, los estudios epidemiológicos

realizados en poblaciones orientales, demostraron que

existe una relación entre la disminución en la

incidencia de cáncer de mama, el consumo elevado

de soja, así como de alimentos derivados de la misma

los cuales son particularmente ricos en isoflavonas.

De acuerdo con los estudios se calcula que la

población japonesa ingiere una cantidad diaria

aproximada de 30 a 40 mg/día de isoflavonas. Siendo

el consumo en los países occidentales inferior debido

al menor consumo de soja y de productos derivados

de la misma (Kimira et al., 1998).

Considerando que la mayor parte de esos estudios

fueron realizados teniendo como base una

determinada práctica dietaria (rica en alimentos

funcionales), y no en los compuestos individuales

presentes en éstos alimentos, se considera necesario

llevar a cabo rigurosos estudios de caracterización

química para determinar los compuestos individuales

y las cantidades, que están presentes en éstos

alimentos con propiedades beneficiosas. Utilizando

para esto métodos correctamente estandarizados,

intentando establecer la eficiencia de absorción en el

tracto gastrointestinal, su biodisponibilidad y sus

mecanismos de acción para posteriormente realizar

recomendaciones para el consumo humano.

Hasta el momento las evidencias científicas son

insuficientes y la mayor parte de la información

proviene, con excepción de los estudios

epidemiológicos, de estudios experimentales

realizados en condiciones in vitro, además poco se

conoce sobre su metabolismo, distribución en tejidos

específicos, así como de la interacción con

metabolitos de relevancia biológica como por

ejemplo la molécula de ADN, los lípidos, las

proteínas, bien como las lipoproteínas (plasmáticas o

celulares) son objetivos poco explorados que

requieren de mayores estudios para así comprender el

efecto biológico ejercido.

En ésta revisión se resumen los datos relacionados

con los efectos antioxidantes de las frutas rojas

particularmente ricas en antocianos, su metabolismo,

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biodisponibilidad y distribución tecidual. La

propuesta radica en comparar de forma crítica la

significancia biológica de los resultados obtenidos en

condiciones in vitro en relación a los observados in

vivo, particularmente, nos centraremos en la

interacción con la molécula de ADN y con los

lípidos, como ejemplos ilustrativos de las complejas

interacciones entre las moléculas alimenticias y la

respuesta de la célula/tejido.

Metabolitos secundarios

Las plantas producen una serie de compuestos

orgánicos que no participan de forma directa en el

desarrollo y crecimiento de las mismas. Esas

substancias fueron tradicionalmente denominadas

como metabolitos secundarios. De acuerdo con la

nomenclatura adoptada por la British Nutrition

Foundation, los metabolitos secundarios pueden ser

divididos en 4 grupos mayoritarios: los compuestos

polifenolicos e fenolicos los cuales corresponden

aproximadamente a 8000 compuestos, los terpenoides

éste grupo comprende cerca de 25000 compuestos,

los alcaloides alrededor de 12000 (Goldberg, 2003).

Los polifenoles, se caracterizan por presentar un

anillo aromático y un anillo benceno con uno o más

grupos hidroxilados incluyendo derivados

funcionales, como por ejemplo ésteres, metilésteres,

glucósidos, etc. Entre los mismos, se pueden

distinguir dos grandes grupos los no flavonoides

(acidos fenólicos, estilbenos, taninos hidrolizables) y

los flavonoides (flavonas, Isoflavonas, flavonoles,

flavanoles, antocianos, flavanonas, taninos

condensados) (Manach et al., 2005).

Los polifenoles en general son capaces de

eliminar O2, O2·–, OH·, NO· y radicales libres

alquilos y peroxilos, a través de su capacidad de

donar electrones, generando un radical fenoxilo

estable. Los flavonoides que poseen un grupo O–

dihidroxifenilo como anillo B y un anillo C saturado,

como las catequinas y algunas procianidinas, poseen

el lugar de contacto con los radicales libres en el

anillo B, y la sustitución del anillo A solamente

presenta una influencia limitada en los potenciales de

reducción del radical semiquinona formado, que se

muestra relativamente estable. Las galocatequinas,

con un anillo B 3’, 4’, 5’–trihidroxifenilo, eliminan

radicales libres de una forma más eficaz que las

catequinas. También, la galoilación junto con el

grupo 3, 4, 5–trihidroxifenilo en la molécula,

favorece la capacidad de eliminación de radicales

(Rice–Evans et al., 1997).

Esa propiedad antioxidante es de interés tanto

tecnológico como nutricional debido a que estos

compuestos son antioxidantes naturales presentes en

los alimentos de origen vegetal, por tanto la

elaboración de alimentos con una elevada

concentración de compuestos fenolicos supone una

reducción en la utilización de aditivos antioxidantes y

de esa forma se obtendrían alimentos más saludables,

que inclusive podrían ser considerados como

alimentos funcionales (Martínez–Valverde, 2000).

Desde el punto de vista nutricional, este poder

antioxidante se relaciona con el papel preventivo en

diversas enfermedades crónicas no transmisibles

como por ejemplo, las enfermedades cardio-

vasculares, cáncer entre otras patologías, así como en

el proceso normal y patológico de envejecimiento,

por ese motivo está siendo intensamente estudiado

mediante ensayos tanto in vivo como in vitro (Li et

al., 2009; Katsube et al., 2003; Dai et al., 2009).

Además a diferencia de otros antioxidantes presentes

en la dieta como por ejemplo, el ácido ascórbico y el

α- tocoferol que actúan en medio acuoso y/o en la

membrana fosfolipídica los polifenoles en cambio,

son capases de actuar en ambas fases y a pesar de la

reconocida capacidad antioxidante in vitro de estos

compuestos su eficacia in vivo debe ser mas estudiada

debido a que existen pocos datos con relación a su

biodisponibilidad.

Los mecanismos de la absorción gastrointestinal

de los compuestos fenolicos son desconocidos. Estos

compuestos se caracterizan por ser hidrofílicos y por

ese motivo no podrían penetrar la barrera intestinal

mediante difusión pasiva. Hasta el momento, el único

transportador activo de membrana descrito, que

podría estar involucrado en la absorción de éstos

metabolitos, es un mecanismo de transporte sodio–

dependiente vinculado con la absorción de ácido

ferúlico y cinámico en el intestino de roedores (Ader

et al., 1996).

Los flavonoides en general, con excepción de los

flavanoles se encuentran glicosilados o glucosilados

en los alimentos, por ese motivo no pueden ser

clivados por las enzimas digestivas humanas. Sin

embargo estudios recientes demostraron aproximada-

mente, un 50% de absorción para determinados

flavonoides (Passamonti et al., 2003, 2005;

Matuschek et al., 2006). En un estudio realizado con

seres humanos a los cuales se les administró

glicósidos de quercetina, fue observado que la

absorción ocurre aproximadamente 0,5–0,7 h después

de producirse la ingestión de quercetina 4–glucósido

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y 6–9 h después de la ingestión de rutina (quercetina–

3–ß–rutinósido). Demostrándose a partir de éstos

resultados, que la absorción de los glucósidos de

quercetina ocurre en el intestino delgado, siendo la

eficiencia de absorción superior que la eficiencia de

absorción de sus agliconas. Por otro lado, los

polifenoles que poseen una unidad ramnosa antes de

ser absorbidos, son hidrolizados en el colon por las

ramnosidasas presentes en la microflora intestinal

(Hollman y Katan, 1999; Morand et al., 2000; Crespy

et al., 2002; Mullen et al., 2002).

En este mismo sentido, la detección en la sangre

portal y mesentérica de metabolitos glucuronidados

después de realizar una perfusión con polifenoles en

el intestino delgado de ratas comprueba que la

glucuronidación de estos compuestos ocurre en

primer lugar en los enterocitos antes de que sean más

conjugados en el hígado (Sfakianos et al., 1997;

Spencer et al., 2001). Probablemente, éste mismo

proceso ocurre en seres humanos, debido a que se ha

comprobado en condiciones in vitro, que la

glucuronidación de quercetina y luteolina en

microsomas del intestino es más elevada que la

glucuronidación existente en microsomas del hígado

humano (Boersma et al., 2002).

La absorción y distribución de estos compuestos

también fue analizada utilizando métodos

cromatográficos, en diversos tejidos de roedores

como cerebro, células endoteliales, corazón, riñón,

bazo, páncreas, próstata, útero, ovario, glándula

mamaria, testículos, vejiga, hueso y piel (Youdim et

al., 2003; Maubach et al., 2003). En esos estudios

fueron determinadas concentraciones que se

extienden entre 30 a 3000 ng aglicona eq/g de tejido

dependiendo de la dosis administrada y del tejido

estudiado (Coldham y Sauer, 2000). En éste estudio

fue también demostrado que después de la

administración de altas concentraciones de quercetina

(aglicona), éste compuesto así como sus metabolitos

se distribuyen en diversos tejidos, alcanzando una

concentración de nanomoles por gramo de tejido,

siendo que la concentración más alta fue detectada en

pulmones y la más baja en cerebro y bazo de ratas y

de cerdos (de Boer et al., 2005).

En seres humanos la cantidad absorbida es muy

baja, siendo el acido galico y las isoflavonas los

compuestos que mejor se absorben (0,22-1,8 µmol/L

y 0,5-1,65 µmol/L respectivamente), seguidos por

flavanonas y por quercetin glicosideo. Entre los

fitoquimicos menos absorbidos se encuentran las

proantocianidinas y los antocianos, las

concentraciones detectadas oscilan entre 10-97

nmol/L dependiendo de la dosis administrada

(Shahrzad et al., 2000; Goldberg et al., 2003; Graefe

et al., 2001; Zubik y Meydani, 2003; Setchell et al.,

2003; Manach et al., 2005).

No obstante, experimentos realizados en

condiciones in vitro demuestran un significativo

poder antioxidante en concentraciones que oscilan

entre 0,1 a 100 μmol/L (Ludwig et al., 2004). De

acuerdo con datos de la literatura científica, los

niveles fisiológicos se encuentran aproximadamente

en 1 μmol/L; por ese motivo se sugiere que no todos

los polifenoles ingeridos presentan poder

antioxidante. Inclusive ciertos compuestos testados

no poseen relevancia biológica in vivo y además,

durante el proceso de absorción y metabolización

gastrointestinal pueden ocurrir modificaciones

químicas, generalmente no consideradas debido a que

la mayoría de los estudios experimentales realizados

fueron hechos en condiciones in vitro (por ejemplo

cultivo de células) y los compuestos de interés fueron

simplemente adicionados a los mismos, obviamente

esas investigaciones no representan el metabolismo

real de los fitoquimicos en condiciones in vivo,

además excluyen las posibles interacciones con otras

moléculas, así como las actividades sinérgicas y

aditivas entre los componentes presentes en el

extracto y/o alimento.

En ese mismo sentido, los efectos de la matriz de

los alimentos sobre la biodisponibilidad de los

compuestos fenolicos es un hecho que tampoco se ha

estudiado en detalle, podrían darse interacciones

entre éstos compuestos y otros componentes

presentes en los alimentos, como proteínas y

polisacáridos, afectando de ésta forma el proceso de

absorción de los mismos. Igualmente factores como

el pH gástrico e intestinal, fermentaciones intestinales

y la excreción biliar, podrían también afectar la

absorción de los polifenoles (Manach et al., 2004).

Consecuentemente, estos diseños experimentales

proporcionan información limitada y por ese motivo

debe existir cautela antes de realizar una

extrapolación directa de los resultados obtenidos en

condiciones in vitro a in vivo. Porque los efectos

moleculares de los polifenoles observados en

condiciones in vitro pueden no ser relevantes in vivo,

como sugerido por varios autores (Manach et al.,

2005).

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Antocianos

En la actualidad, este grupo de compuestos

fenolicos presentan un gran interés nutricional por su

contribución al mantenimiento de la salud humana.

Asimismo, varias de las propiedades beneficiosas

descritas en las frutas rojas, están vinculadas con la

presencia y el contenido de antocianos (Ramirez et

al., 2005; Dai et al., 2009).

Los antocianos, son pigmentos flavonólicos, que

presentan una estructura química adecuada para

actuar como agentes antioxidantes, donar hidrógenos

o electrones a los radicales libres, así como

capturarlos y desplazados en su estructura aromática

(Heim et al., 2002). La capacidad antioxidante de los

mismos, se relaciona con la presencia de grupos

hidroxilos en las posiciones 3´ y 4´ del anillo B, los

cuales conceden estabilidad al radical formado. Por

otro lado los grupos hidroxilos libres en las posición

3 del anillo C y en la posición 5 del anillo A, en

conjunto con el grupo carbonilo en la posición 4

actúan como donadores de electrones (Tsuda et al.,

1994; Espin et al., 2000; Prior y Wu, 2006.). Los

antocianos, también conocidos como antocianinas y

sus agliconas como antocianidinas, son los

principales responsables del color característico de

las frutas rojas y vinos tintos. En la Tabla 1 se indican

los diferentes nombres que reciben estos compuestos

según sean las sustituciones R1 y R2 (Tsuda et al.,

1994).

Tabla 1. Nomenclatura de los antocianos.

R1 R2 Compuesto

OH H Cianidina

OH OH Delfinidina

OH OCH3 Petunidina

OCH3 H Peonidina

OCH3 OCH3 Malvidina

Las propiedades beneficiosas de los antocianos se

han puesto de manifiesto en diferentes estudios, in

vivo como in vitro realizados tanto en animales de

experimentación como en seres humanos. Si bien no

se conocen los mecanismos de absorción

gastrointestinal de los compuestos fenolicos, se

considera que los antocianos constituyen una

excepción a la regla, debido a que se han encontrado

glicósidos intactos en el plasma, autores sugieren que

este hecho podría estar relacionado con la

inestabilidad de estos compuestos cuando se

encuentran como agliconas o a la existencia de un

mecanismo particular de absorción e metabolismo

para estos compuestos (Passamonti et al., 2005;

Joseph et al., 2005).

En ese sentido Passamonti et al. (2003), proponen

un sistema de transporte para los antocianos por

medio de translocasas a nivel gástrico, basándose en

el hecho de que estos compuestos presentan una

importante afinidad por el sistema previamente

mencionado. Otros autores postulan que los

antocianos podrían ser convertidos en glucurónidos

por la acción de una de las enzimas UDP glucosa

deshidrogenada (Wu et al., 2005). Similarmente

Felgines et al. (2002) comprobaron que después de 8

días de administración de extracto de blackberry, los

antocianos pueden ser detectados de forma intacta o

bien metilada, en la orina de estos animales

demostrando de esa forma que su viabilidad es muy

baja comparada con otros flavonoides (Ohnishi et al.,

2006).

Otros investigadores analizaron la distribución de

estos compuestos en diversos tejidos, confirmando la

presencia de antocianos glicosilados como la

cianidina, la peonidina y la delfinidina, y de sus

agliconas, glucuronideos y derivados metilados en

diversos tejidos como estomago, intestino delgado,

hígado, riñón, ojos y cerebro. Asimismo se ha

comprobado que en estos 2 últimos tejidos (ojos y

cerebro) estos compuestos pueden ser detectados

después de media hora de administración siendo que

la cantidad total determinada oscila entre 100 a 200

ng/g (Passamonti et al., 2003, 2005; Manach et al.,

2005; Matuschek et al., 2006).

Del mismo modo, evidencias recientes indican

que los antocianos son absorbidas y metabolizados en

seres humanos y que sus metabolitos pueden ser

detectados en la orina 24 h después de la

administración y que los mismos conservan su

estructura básica. Resultados farmacocineticos

demuestran que la concentración de los glucósidos y

sus derivados glucuronidos pueden ser detectados en

sangre entre las 0-5 h después de la ingesta, y que

dentro de ese periodo, se observa un aumento en el

grado de metilación. Por ese motivo los autores

sugieren que la bioactividad de los antocianos está

probablemente condicionada a un determinado

periodo de tiempo el cual estaría relacionado con su

transformación metabólica (Mazza, 2002; Prior y

Wu, 2006)

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Del mismo modo se ha investigado la viabilidad

de los antocianos utilizando diferentes dosis, fuentes

(tipo de berry) y matrices (jugo, extracto, capsulas).

Confirmándose que los mismos son rápidamente

absorbidos, y pueden ser detectados 1,5 h después de

la administración. Los autores sugieren que el

proceso de absorción ocurre probablemente en el

estomago y/o en el intestino delgado (Manach et al.,

2005; Prior y Wu, 2006). Sin embargo, las

concentraciones plasmáticas detectadas varían

significativamente y en general se detectan niveles

muy bajos menores a 1 µM. Los autores también

sugieren, que la actividad de la microflora del colon y

la baja estabilidad de los antocianos frente al pH del

intestino, serian en parte responsables por la

conversión de estos compuestos en moléculas

menores, y que los mismos son eliminados a través

de la urina entre las 4-6 h después de la

administración. Considerando que la proporción de

los antocianos excretados es menor al 0,1% de la

suma total ingerida, gran parte del metabolismo de

estos compuestos no esta completamente dilucidado.

(Prior y Wu, 2006).

Efectos fisiológicos asociados a los antocianos

Los efectos fisiológicos dos antocianos se deben a

su estructura química, siendo sus principales

propiedades la capacidad de eliminar radicales libres,

efectos sobre la fluidez de la membrana plasmática,

efecto antiinflamatorio y antinociceptivo, efecto

cardioprotector y neuroprotector efecto

antimutagénico, efecto anticarcinogénico, efecto

antivírico y antibacteriano (Espin et al., 2000;

Cheplick et al., 2007).

Dentro de estas propiedades la capacidad

antioxidante es una de las más analizadas. Diferentes

estudios ponen de manifiesto que el poder

antioxidante de los antocianos y de sus agliconas es

equivalente a las vitaminas C y E, y que la capacidad

de capturar radicales libres está directamente

relacionada con el efecto anticarcinogénico de estos

compuestos (Bagchi et al. 1998). Resultados

similares obtuvieron Narayan et al. (1999), al

comparar la capacidad antioxidante de los antocianos

con α tocoferol, hidroxianisol butirato e

hidroxitolueno butilado. Además parece ser que

existe una correlación linear entre la cantidad de

antocianos totales y la capacidad antioxidante en

diversas frutas como: blackberries, red raspberries,

black raspberries y strawberries (Henoinen et al.,

1998; Kakonen et al., 1998, Sellappan et al., 2002).

En nuestro laboratorio se han realizado varios

estudios sobre la capacidad antioxidante de extractos

provenientes de diferentes cultivares de Vaccinium

ashei y de Rubus sp., utilizando la técnica de 2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), demostrándose

que el extracto total, las fracciones aisladas

(flavonóidica, o ácidos fenólicos) como también

antocianos aislados exhiben significativo poder

antioxidante cuando comparados al TROLOX

(análogo de la vitamina E). Se ha comprobado

también que el extracto de Rubus presenta efecto

antiinflamatorio en ratas, se cree que ésta propiedad

se debe a la capacidad de los antocianos para

disminuir la liberación de citocinas. Además, los

antocianos pueden efectuar su actividad

antiinflamatoria debido principalmente a su

capacidad para inhibir la liberación del ácido

araquidónico, asi como las enzimas ciclooxigenasa y

lipooxigenasa, o bien debido a la fosforilación de

proteínas específicas causantes de la activación de las

mismas (Ramirez et al., 2009).

Similarmente, Seeram y Nair (2002), también

comprobaron que en condiciones in vitro, el poder

antioxidante de los antocianos individuales esta

directamente relacionado con la estructura química de

los mismos, y que la eficacia aumenta de forma

proporcional al número de grupos OH en el anillo B,

y en el caso de la cianidina en particular, la presencia

de unidades glicosiladas en la posición 3 del anillo C

decrece la actividad antioxidante, resultados similares

fueron obtenidos por Tsuda et al.(1994).

Matsumoto et al. (2004) analizaron los efectos de

la administración de extracto de chockeberry en un

modelo animal de lesiones gástricas hemorrágicas

inducidas con etanol, comprobando que el extracto

exhibe propiedades terapéuticas y/o preventivas

gastrointestinales. Del mismo modo se ha evaluado

la capacidad antioxidante de éstas frutas rojas sobre

la oxidación de las LDL, demostrándose que el

extracto de chokeberry y uvas disminuye los niveles

séricos de colesterol total y triglicéridos, al mismo

tiempo que provoca un aumento de los niveles de

colesterol ligado a HDL y una disminución de los

niveles de colesterol ligado a LDL y VLDL

(Valcheva-Kuzmanova et al., 2007). Adicionalmente,

Cooper et al. (2004) han demostrado en seres

humanos, que el consumo moderado de vino tinto

durante 10 días (200 mL), reduce los niveles de

colesterol/LDL.

Por otra parte se ha comprobado que extractos

provenientes de diferentes cultivares de Rubus,

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pueden inhibir la actividad de las enzimas α-amilasa,

α -glucosidasa y de la enzima conversora de

angiotensina-1 (ACE) in vitro, las cuales están

asociadas con la diabetes del tipo II e hipertensión

respectivamente (Cheplick et al., 2007). Asimismo

Herrera-Arellano et al. (2007), comprobaron que el

extracto de Hibiscus sabdariffa, rico en antocianos,

disminuye la presión sanguínea y reduce la actividad

de ACE en pacientes hipertensos.

Las propiedades antimutagénicas y anticarcino-

génicas de los antocianos se han puesto de manifiesto

en numerosos estudios tanto in vitro como in vivo

(Duthie et al., 2007). Según datos bibliográficos,

durante el proceso de desarrollo del cáncer se

producen una secuencia de eventos denominados

como iniciación (inducción de mutaciones en el

ADN), promoción (expansión tumorogénica) y

progresión (conversión de un tumor benigno/maligno

a cancerígeno). En éste sentido, debe considerarse el

hecho de que una vez iniciado este proceso el mismo

es prácticamente irreversible, por ese motivo es

importante prevenir el desarrollo del cáncer, e

identificar los compuestos que puedan inhibir la

propagación del tumor cancerígeno. De acuerdo con

datos bibliográficos, los puntos mas importantes que

deben ser controlados son la producción de

hidroperóxido, el incremento de la síntesis de ADN y

la inducción de la actividad de la enzima ornitina

descarboxilasa (Li et al., 2009; Katsube et al., 2003).

Para protagonizar un efecto real in vivo, los

compuestos de interés deben ser absorbidos de la

dieta y dirigidos hacia los órganos diana. En un

estudio realizado in vivo, por Ramirez-Tortosa et al.

(2001) con un extracto rico en antocianos

(delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y

malvidina, 1 g/kg) fue comprobado que cuando

combinados éstos compuestos, se observa una mejora

significativa de la capacidad antioxidante plasmática

en los animales tratados y que además existe una

disminución en los niveles de hidroperoxidos y 8-

oxo-deoxiguanosina en el hígado de esos animales,

ambas sustancias son marcadores específicos de la

dieta deficiente en vitamina E, e indicadores de

peroxidación lipidica y de daño endógeno en la

molécula de ADN.

Similarmente Duthie et al. (2004), investigaron las

consecuencias de una dieta deficiente en vitamina E,

juntamente con el efecto citoprotector del antociano

cianidina (100 mg/kg) sobre la molécula de ADN y

los lípidos celulares, utilizando un modelo in vitro de

cultivo de células y otro in vivo en ratas previamente

tratadas con los extractos. Observaron que, los

niveles plasmáticos y hepáticos de α-tocoferol en

ratas, disminuyen significativamente después de 12

semanas de tratamiento; la peroxidación lipídica se

incrementa significativamente en plasma, hígado y

células sanguíneas. Adicionalmente los niveles de

especies reactivas de oxígeno y de piruvato kinasa

están aumentados en fagocitos y plasma. Por otro

lado, los bajos niveles de vitamina E no alteran la

estabilidad del ADN en linfocitos de ratas, hígado o

colon. Similarmente el tratamiento con cianidina-3-

glicosideo no altera la peroxidación lipídica o el

ADN en ratas. Sin embargo produce un efecto

quimioprotectivo en la molécula de ADN en

colonocitos humanos como resultado del tratamiento

con antocianos. Si bien se conoce que la vitamina E

altera los niveles de oxidación lipídica in vivo, su

papel en el mantenimiento de la estabilidad del ADN

todavía no fue completamente dilucidado. Asimismo

fue observado que el tratamiento con cianidina-3-

glicosideo protege a la molécula de ADN del daño

oxidativo in vitro, en concentraciones nutricional-

mente relevantes no altera el daño oxidativo in vivo.

Los autores sugieren que esta discrepancia entre los

resultados observados en condiciones in vitro/in vivo

esté relacionado con la baja biodisponibilidad y al

metabolismo de los antocianos.

Otros autores comprobaron, que es posible reducir

hasta 50% la oxidación de bases de la molécula de

ADN después del tratamiento con Aronia

melanocarpa ELLIOT (black chokeberry), en

colonocitos humanos extraídos por biopsia. Estos

autores determinaron, el daño endógeno bien como

el daño inducido con peróxido de hidrógeno

(Rechkemmer y Pool-Zobel, 1998). Asimismo, Pool-

Zobel et al. (1999) demostraron que compuestos

aislados y purificados a partir de Aronia melanocarpa

ELLIOT reducían el daño de ADN inducido por

peróxido de hidrogeno en una línea de células

tumorales humana, no obstante el tratamiento no

altera el daño endógeno de la molécula de ADN.

También observaron que los compuestos purificados

tanto las agliconas como los glicosideos presentan el

mismo poder antioxidante, estos resultados sugieren

que los antocianos podrían ejercer efectos protectores

en tejidos específicos como por ejemplo el colon

humano.

Del mismo modo, Lazzé et al. (2003)

comprobaron que el pretratamiento con antocianos y

sus derivados: delfinidina y cianidina, protegen a la

molécula de ADN del daño inducido con tert-butil-

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hidroperóxido en músculo liso y en una línea celular

de hepatoma de ratos. También observaron que éstos

compuestos inhiben la citotoxicidad, la peroxidación

lipídica y la formación de aductos en la molécula de

ADN, por el contrario, no modifican el estado redox

de la célula y tampoco la oxidación de bases de la

molécula de ADN. No obstante, la presencia de

azúcar en la estructura de la molécula reduce el efecto

protectivo principalmente en las células de hepatoma

de ratos. Estos resultados ponen de manifiesto que

existe una relación estructura/función de los

antocianos y de sus derivados, y que inclusive la

sensibilidad específica de cada tejido frente al estres

oxidativo, la distribución y localización intracelular

de estos compuestos determinan el efecto protector.

Diferentes estudios de intervención nutricional ponen

de manifiesto que extractos provenientes de frutas

rojas en general así como sus antocianos aislados e

purificados disminuyen o retardan los efectos

deletéreos relacionados con la edad e inclusive

previenen enfermedades neurológicas y alteraciones

cognitivas. Del mismo modo fue demostrado que los

antocianos presentes en esos extractos atraviesan la

barrera hematoencefálica, y ejercen efectos en

diversas estructuras cerebrales como córtex, cerebelo

e estriado (Passamonti et al., 2003, 2005; Youdim et

al., 2003, 2004; Andrés-Lacueva et al., 2005).

En nuestro laboratorio se ha estudiado el efecto de

la suplementación por 30 días con extracto de

blueberry (3.2 mg/kg/dia de antocianos) en cerebro

de ratones, demostrandose que el extracto total ejerce

un efecto protector del daño endógeno de la molécula

de ADN en hipocampo y cortex cerebral de estos

animales, por el contrario no presenta efectos

protectivos frente al daño inducido con peroxido de

hidrogeno en las mismas estructuras cerebrales. Para

algunos autores estos resultados sugieren que los

antocianos presentes en el extracto, forman un

complejo con la cadena de ADN estabilizando de esta

forma a la molécula frente al daño oxidativo

(Ramirez et al., 2005; Barros et al., 2006).

Resultados similares fueron encontrados en ratas

idosas, después de la suplementacion por un período

de 6 meses con el mismo extracto no se observaron

efectos protectores en la integridad de la molécula de

ADN, no obstante después de la inducción de daño

con peróxido de hidrógeno se comprobó que el

extracto protege de forma significativa al ADN en el

córtex cerebral de los ratos tratados; por lo que se

piensa que esos resultados estarían relacionados con

las modificaciones en las propiedades físicas de la

membrana plasmática relacionadas con el proceso de

envejecimiento (por ej. rigidez), este hecho puede

condicionar la distribución intracelular de los

componentes del extracto, así como los efectos

biológicos de éste (Ramirez et al., 2008).

Noda et al. (2002) comprobaron que las

antocianidinas aisladas y purificadas a partir de

Punica granatum L.: delfinidina, cianidina y

pelargonidina, inhiben en ese orden la peroxidación

lipídica inducida por peróxido de hidrógeno en

cerebro de ratas en condiciones in vitro. Asimismo,

Narayan et al. (1999), demostraron que los

antocianos aislados disminuyen significativamente la

autoxidación y la peroxidación lipídica de forma no

competitiva, en un modelo in vitro de peroxidación

lipídica enzimática y no enzimática. Similarmente,

resultados provenientes de nuestro laboratorio

demostraron que el extracto de Rubus promueve

lipoperoxidación en hipocampo, estriado y córtex

cerebral de ratas después de 30 días de

suplementación (3,2 mg/kg/día de antocianos). No

obstante, fueron observados efectos protectivos

después de la suplementación por 30 días con

cianidina aislada a partir de la misma fruta (Ramirez

et al., 2008). También se ha observado que el extrato

total de Rubus induce un aumento significativo de

glutamato en ambas estructuras cerebrales estudiadas

(cortex, hipocampo), en cambio la suplementación

con cianidina 3 glicosideo produce una reducción

significativa en las cantidades totales de ese

neurotransmisor (Ramirez et al., 2009). De acuerdo

con la literatura un aumento en las concentraciones

de glutamato está asociado a la formación de

radicales libres. Como consecuencia de estos

antecedentes, en nuestro laboratorio decidimos

estudiar el efecto antinociceptivo del extracto de

mirtilo. Comprobando que después de 21 días de

suplementación oral, el extracto ejerce un efecto

antinociceptivo de forma dosis dependiente por

mecanismos todavía desconocidos (Ramirez et al.,

2009).

No obstante, intervenciones dietéticas realizadas

en seres humanos muestran resultados controvertidos,

se ha comprobado en individuos voluntarios que el

tratamiento con aronia, blueberry y boysenberry,

ejerce un efecto protector de la integridad del ADN

(efecto antigenotóxico), en células mononucleares

(Rechkemmer y Pool-Zobel 1998). Del mismo modo,

se ha observado que el consumo por 4 semanas de

jugo proveniente de una mezcla de diferentes tipos de

berries produce un disminución del daño oxidativo

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celular y un aumento en los niveles de glutatión

reducida (Weisel et al., 2006). Contrariamente, en

otro estudio donde los voluntarios fueron divididos

en dos grupos: el primer grupo recibió jugo de

blackcurrant y el segundo grupo jugo de antocianos

purificados a partir de la misma fruta durante un

periodo de 3 semanas, no se observaron diferencias

significativas en marcadores de daño del ADN entre

los grupos tratados y controles (Moller et al., 2004).

Senthilmohan et al. (2003) utilizaron el extracto

comercial denominado Enzogenol®, en un estudio

donde individuos adultos de entre 55 a 75 años de

edad, recibieron 240 mg de Enzogenol® y 120 mg de

vitamina C durante un periodo de 6 o 12 semanas.

Los autores demostraron que después de 12 semanas

de tratamiento se observó una reducción en el daño

endógeno de ADN en células sanguíneas como en la

oxidación de proteínas en suero.

Por otra parte, se ha comprobado que si bien la

capacidad antioxidante plasmática es un indicador

adecuado del estatus antioxidante, los marcadores

biológicos de estrés como de daño oxidativo se

encuentran en niveles muy bajos en los individuos

voluntarios (Mazza et al., 2002). Por ese motivo, en

estudios subsecuentes se utilizaron voluntarios que

habitualmente viven en condiciones de estrés, por

ejemplo, fumadores, obreros que utilizan la fuerza

muscular para realizar sus tareas o también

individuos que pertenecen grupos de riesgo

previamente identificados, dentro de este contexto

fue observado que la ingesta de cápsulas de

blackcurrant produce un incremento del flujo

sanguíneo periférico y que también alivia la fatiga

muscular característica de las personas que realizan

trabajos físicos repetitivos (Matsumoto et al., 2005).

Similarmente fue comprobado que el consumo de

jugo de chokeberry estimula las defensas

antioxidantes endógenas y limita el daño oxidativo

después de ejercicios físicos regulares (Pilaczynska-

Szcesniak et al., 2005). Asimismo, en fumadores

crónicos la ingesta prolongada de blueberry, reduce

los niveles de lípidos hidroxiperóxidos (McAnulty et

al., 2005). En pacientes que padecieron ataque

isquémico y que bebieron jugo de chokeberry en

combinación con estatina, durante 6 semanas, se

observó una reducción en los niveles séricos de iso-

prostanos y de LDL oxidada y un incremento de

adiponectin y reducción de la presión sanguínea y

consecuentemente una reducción significativa de la

inflamación (Naruszewicz et al., 2007).

Por otro lado, varios autores describen que las

propiedades antioxidantes de los compuestos

fenólicos son reducidas in vivo por causa de su

afinidad por las proteínas (Serafín et al., 2009).

Estudios recientes evaluaron la disponibilidad de los

polifenoles en plasma de voluntarios humanos

después de la ingestión de jugo de blueberry sin leche

y asociado con leche, las muestras de plasma fueron

colectadas 1, 2, y 5 h después de la ingesta. Los

individuos que consumieron únicamente blueberry

presentan un aumento en las concentraciones de los

marcadores plasmáticos ácido ferúlico y ácido

cafeico. En contraste, la ingesta de blueberry con

leche produce una disminución de éstos compuestos,

es decir no se detectó un aumento en la capacidad

antioxidante en el plasma. Esos resultados sugieren

que la ingestión de blueberry en asociación con leche

perjudica las propiedades antioxidantes y reduce la

absorción in vivo de los compuestos bioactivos

presentes en esas frutas (Serafín et al., 2009).

CONCLUSIÓN

Notablemente, numerosos trabajos científicos

demostraron una asociación entre el consumo de

frutas y verduras con el bajo riesgo de padecer ciertas

enfermedades crónico-degenerativas, esa propiedad

fue atribuida principalmente a la capacidad

antioxidante de los componentes de esos alimentos.

Si bien un amplio espectro de compuestos con

propiedades antioxidantes están presentes en los

alimentos de origen vegetal en general, es necesario

considerar que la capacidad antioxidante puede ser

perdida o reducida durante el proceso de absorción

debido a la transformación metabólica que está

comúnmente asociada con la conjugación de

moléculas. Además las moléculas que presentan una

estructura química compatible con la propiedad

antioxidante en condiciones in vitro podrían in vivo

ejercer otros efectos independientes de sus

propiedades antioxidantes, por ejemplo alterar la

actividad de ciertas enzimas, unirse a determinados

receptores de membrana, o a receptores nucleares

como ligando o imitadores.

Otro importante aspecto a considerar son los

efectos ejercidos por compuestos aislados con

relación a las matrices complejas que contienen una

amplia gama de compuestos que interaccionan entre

si. Deben ser realizadas más investigaciones para

explorar el mecanismo de acción de esos compuestos

aislados, y de esta forma utilizarlos como referencia

para el estudio de matrices complejas.

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Actualmente también se considera a la dieta como un

factor clave para el mantenimiento de la estabilidad

genómica, considerando que diversos micronutrientes

son coenzimas de enzimas vinculadas con la síntesis

y la reparación de la molécula de ADN, otro aspecto

que necesita ser mejor dilucidado es la interacción de

los compuestos fenolicos in vivo con metabolitos de

relevancia biológica como la molécula de ADN, las

proteínas y los lípidos. Esas interacciones,

probablemente, desempeñan un importante papel en

los efectos biológicos comprobados de esos

compuestos. Con relación a este punto surge un

nuevo paradigma, ¿cuál es la dosis adecuada de

compuestos individuales o de extracto total que podrá

ejercer un efecto biológico? ¿Durante cuánto tiempo

deberá ser realizada la suplementación y cuál es el

momento adecuado para iniciar ésta? En ese sentido

también necesitan ser realizados estudios de

toxicidad, principalmente para los trabajos en los

cuales las suplementaciones son realizadas durante un

periodo de tiempo prolongado.

REFERENCIAS

Ader P, Grenacher B, Langguth P, Scharrer E, Wolffram S.

1996. Cinnamate uptake by rat small intestine:

transport kinetics and transepithelial transfer. Exp

Physiol 81:943-955.

Andrés-Lacueva C, Shukitt-Hale B, Galli RL, Jauregui O,

Lamuela-Raventos RM Joseph JA. 2005.

Anthocyanins in aged blueberry-fed rats are found

centrally and may enhance memory. Nutrit Neurosci

8:111-120.

Bagchi D, Garg A, Krohn RL, Bagchi M, Bagchi BJ,

Balmoori J. 1998. Protective effects of grape seed

proanthocyanidins and selected antioxidants against

TPA-induced hepatic and brain lipid peroxidation and

DNA fragmentation, and peritoneal macrophage

activation in mice. Gen Pharmacol 30:771-776.

Barros DM, Amaral OB, Izquierdo I, Geracitano L,

Bassols Raseira MC, Henriques AT, Ramirez MR.

2006. Behavioral and genoprotective effects of

Vaccinium berries intake in mice. Behav Brain Res

84:229-234.

Boersma MG, van der Woude H, Bogaards J, Boeren S,

Vervoort J, Cnubben NH, van Iersel ML, van

Bladeren PJ, Rietjens IM. 2002. Regioselectivity of

phase II metabolism of luteolin and quercetin by

UDP-glucuronosyl transferases. Chem Res Toxicol

15:662-670.

Cheplick S, Kwon Y, Bhowmik P, Shetty K. 2007. Clonal

variation in raspberry fruit phenolics and relevance for

diabetes and hypertension management. J Food

Biochem 31:656-679.

Coldham NG, Sauer MJ. 2000. Pharmacokinetics of

genistein in the rat: gender-related differences,

potential mechanisms of biological action, and

implications for human health. Toxicol Appl

Pharmacol 164:206-215.

Cooper KA, Chopra M, Thurnham DI. 2004. Wine

polyphenols and promotion of cardiac health. Nutr

Res Rev 17:111-129.

Crespy V, Morand C, Besson C, Manach C, Demigne C,

Remesy C. 2002. Quercetin, but not its glycosides, is

absorbed from the rat stomach. J Agr Food Chem

50:618-621.

Criqui MH, Ringel BL. 1994. Does diet or alcohol explain

the French paradox? Lancet 344:1719-1723.

Dai J, Gupte A, Gates L, Mumper RJ. 2009. A

comprehensive study of anthocyanin-containing

extracts from selected blackberry cultivars: Extraction

methods, stability, anticancer properties and

mechanisms Food Chem Toxicol 47:837-847.

de Boer VC, Dihal AA, van der Woude H, Arts IC,

Wolffram S, Alink, GM, Rietjens IM, Keijer J,

Hollman PC. 2005. Tissue distribution of quercetin in

rats and pigs. J Nutr 135:1718-1725.

Duthie SJ, Gardner PT, Morrice PC, Wood SG, Pirie L,

Bestwick CC, Milne L, Duthie GG. 2004. DNA

stability and lipid peroxidation in vitamin E deficient

rats in vivo and colon cells in vitro. Eur J Nutr 44:195-

203.

Duthie SJ. 2007. Berry phytochemicals, genomic stability

and cancer: Evidence for chemoprotection at several

stages in the carcinogenic process. Mol Nutr Food Res

51:665-674.

Espin JC, Soler-Rivas C, Wichers HJ, Garcíaviguera C.

2000. Anthocyanin-based natural colorants: A new

source of antiradical activity for foodstuff. J Agr Food

Chem 48:1588-1592.

Felgines C, Texier O, Besson C, Fraisse D, Lamaison JL,

Remesy C. 2002. Blackberry anthocyanins are slightly

bioavailable in rats. Nutr Metab 132:1249-1253.

Goldberg DM, Yan J, Soleas GJ. 2003. Absorption of three

wine related polyphenols in three different matrices by

healthy subjects. Clin Biochem 36:79-87.

Graefe EU, Wittig J, MuelIer S, Riethling AK, Uehleke B,

Drewelov B, Pforte H, Jacobasch G, Derendorf H,

Veit M. 2001. Pharmacokinetics and bioavailability of

quercetin glycosides in humans. J Clin Pharmacol

41:492-499.

Goldberg G. 2003. Plants: diet and health. The report of a

British nutrition foundation task force. Oxford, U.K.:

Blackwell Publishing Ltd. 347 p.

Goldberg DM, Yan J, Soleas GJ. 2003. Absorption of

three wine related polyphenols in three different

matrices by healthy subjects. Clin Biochem 36:79-87.

Heim KE, Tagliaferro AR, Bobilya DJ. 2002. Flavonoid

antioxidants: chemistry, metabolism and structure-

activity relationships. J Nutr Biochem 13:572-584.

Page 21: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Ramírez et al. Propiedades antioxidantes de las frutas rojas

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 466

Heinonen IM, Meyer AS, Frankel EN. 1998. Antioxidant

activity of berry phenolics on human low-density

lipoprotein and liposome oxidation. J Agr Food Chem

46: 4107-4112.

Herrera-Arellano A, Miranda-Sanchez J, Avila-Castro P,

Herrera-Alvarez S, Jimenez-Ferrer JE, Zamilpa A,

Roman-Ramos R, Ponce-Monter H, Tortoriello J.

2007. Clinical effects produced by a standardized

herbal medicinal product of Hibiscus sabdariffa on

patients with hypertension. A randomized, double-

blind, lisinopril controlled clinical trail. Planta Med

73:6-12.

Hollman PC, Bijsman MN, van Gameren Y, Cnossen EP,

de Vries JH, Katan MB. 1999. The sugar moiety is a

major determinant of the absorption of dietary

flavonoid glycosides in man. Free Radical Res

31:569-573.

Joseph JA, Shukitt-Hale B, Casadesus G. 2005. Reversing

the deleterious effects of aging on neuronal

comunication and behavior: beneficial properties of

fruit polyphenolic compounds. Am J Clin Nutr

81:313-316.

Kahkonen MP, Hopia AI, Heinonen M. 2001. Berry

phenolics and their antioxidant activity. J Agr Food

Chem 49:4076-4082.

Katsube N, Keiko I, Tsushida T, Yamaki K, Kobori M.

2003. Induction of apoptosis in cancer cells by

bilberry (Vaccinium mirtillus) and the anthocyanins. J

Agr Food Chem 51:68-75.

Kimira M, Arai Y, Shimoi K, Watanabe S. 1998. Japanese

intake of flavonoids and isoflavonoids from foods. J

Epidemiol 8:168-175.

Lazzé MC, Pizzala R, Savio M, Stivala LA, Prosperi E,

Bianchi L. 2003. Anthocyanins protect against DNA

damage induced by tert-butyl-hydroperoxide in rat

smooth muscle and hepatoma cells. Mutat Res

535:103-115.

Li Y, Ambrosone CB, McCullough MJ, Ahn J, Stevens

VL, Thun MJ, Hong CC. 2009. Oxidative stress

related genotypes, fruit and vegetable consumption,

and breast cancer risk. Carcinogenesis 30:777-784.

Ludwig A, Lorenz M, Grimbo N, Steinle F, Meiners S,

Bartsch C, Stangl, K, Baumann G, Stangl V. 2004.The

tea flavonoid epigallocatechin-3-gallate reduces

cytokine-induced VCAM-1 expression and monocyte

adhesion to endothelial cells. Biochem Biophys Res

Commun 316:659-665.

Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C, Jimenez L.

2004. Polyphenols: food sources and bioavailability.

Am J Clin Nutr 79:727-747.

Manach E, Williamson G, Morand C, Seal A, Remesy C.

2005. Bioavailability and bioefficacy of polyphenols

in humans. Review of 97 bioavailability studies. Am J

Clin Nutr 81:230S-242S.

Matsumoto H, Takenami E, Iwasaki-Kurashige K, Osada

T, Katsumura T, Hamaoka T. 2005. Effects of

blackcurrant anthocyanin intake on peripheral muscle

circulation during typing work in humans. Eur J Appl

Physiol 94:36-45.

Matsumoto M, Hara H, Chiji H, Kasai T. 2004.

Gastroprotective effect of red pigments in black

chokeberry fruit (Aronia melanocarpa Elliot) on acute

gastric hemorrhagic lesions in rats. J Agr Food Chem

52:2226-2229.

Matuschek MC, Hendriks WH, McGhie TK, Reynolds

GW. 2006. The jejunum is the main site of absorption

for anthocyanins in mice. J Nutr Biochem 17:31-36.

Maubach J, Bracke ME, Heyerick A, Depypere HT,

Serreyn RF, Mareel MM, De Keukeleire D. 2003.

Quantitation of soy-derived phytoestrogens in human

breast tissue and biological fluids by high-

performance liquid chromatography. J Chromatogr B

Anal Technol Biomed Life Sci 784:137-144.

Mazza G, Kay CD, Cotrell T, Holub BJ. 2002. Absorption

of anthocyanins from blueberries and serum

antioxidant status in human subjects. J Agr Food

Chem 50:7731-7737.

McAnulty SR, McAnulty LS, Morrow JD, Khardouni D,

Shooter L, Monk J, Gross S, Brown Y. 2005. Effect of

daily fruit ingestion on angiotensin converting enzyme

activity, blood pressure, and oxidative stress in

chronic smokers. Free Radical Res 39:1241-1248.

Moller P, Loft S, Alfthan G, Freese R. 2004. Oxidative

DNA damage in circulating mononuclear blood cells

after ingestion of blackcurrant juice or anthocyanin-

rich drink. Mutat Res 551:119-126.

Morand C, Manach C, Crespy V, Remesy C. 2000.

Quercetin 3-O-beta-glucoside is better absorbed than

other quercetin forms and is not present in rat plasma.

Free Radical Res 33:667-676.

Mullen W, Graf BA, Caldwell ST, Hartley RC, Duthie

GG, Edwards CA, Lean ME, Crozier A. 2002.

Determination of flavonol metabolites in plasma and

tissues of rats by HPLC-radiocounting and tandem

mass spectrometry following oral ingestion of

quercetin-4-glucoside. J Agr Food Chem 50:6902-

6909.

Narayan MS, Akhilender NK, Ravishankar GA, Srinivas

L, Venkataraman LV. 1999. Antioxidant effect of

anthocyanin on enzymatic and non-enzymatic lipid

peroxidation. Prostaglandins, Leukot Essent Fatty

Acid 60:1-4.

Naruszewicz M, Laniewska I, Millo B, Dluzniewski M.

2007. Combination therapy of statin with flavonoids

rich extract from chokeberry fruits enhanced reduction

in cardiovascular risk markers in patients after

myocardial infraction. Atherosclerosis 194:179-184.

Noda Y, Kaneyuki T, Mori A, Packer L. 2002. Antioxidant

activities of pomegranate fruit extract and its

anthocyanidins: Delphinidin, cyanidin, and

pelargonidin. J Agr Food Chem 50:166-171.

Page 22: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Ramírez et al. Propiedades antioxidantes de las frutas rojas

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 467

Ohnishi RTH, Kasajima N, Kaneda M, Kariyama R,

Kumon H, Hatano T, Yoshida T. 2006. Urinary

excretion of anthocyanins in humans after cranberry

juice ingestion. Biosci Biotechnol Biochem 70:1681-

1687.

Orgogozo JM, Dartigues JF, Lafont S, Letenneur L,

Commenges D, Salamon R, Renaud S, Breteler MB.

1997. Wine consumption and dementia in the elderly:

a prospective community study in the bourdeux area.

Rev Neurol 153:185-192.

Passamonti AS, Vrhovsekb U, Vanzoa A, Mattivib F.

2003. The stomach as a site for anthocyanins

absorption from food. FEBS Lett 544:210-213.

Passamonti S, Vrhovsek U, Vanzo A, Mattivi F. 2005. Fast

access of some grape pigments to the brain. J Agr

Food Chem 53:7029-7034.

Pilaczynska-Szczesniak L, Skarpanska-Steinborn A,

Deskur E, Basta P, Horoszkiewicz-Hassan M. 2005.

The influence of chokeberry juice supplementation on

the reduction of oxidative stress resulting from an

incremental rowing ergometer exercise. Tnt J Sport

Nutr Exerc Metab 15:48-58.

Pool-Zobel BL, Bub A, Schröder N, Rechkemmer G.

1999. Anthocyanins are potent antioxidants in model

systems but do not reduce endogenous oxidative DNA

damage in human colon cells. Eur J Nutr 38:227-234.

Prior RL, Wu X. 2006. Anthocyanins: structural

characteristics that result in unique metabolic patterns

and biological activities. Free Radical Res 40:1014-

1028.

Ramírez MR, Izquierdo IA, Bassols-Raseira MC, Zuanazzi

JA, Barros DM, Henriques AT. 2005. Effect of

lyophilised Vaccinium berries on memory, anxiety

and locomotion in adult rats. Pharm Res 52:457-462.

Ramirez MR, Bassols Raseira MC, Barros DM, Henriques

AT. 2008. Efeitos benéficos da suplementação com

mirtilo no sistema nervoso central: comparação entre

ratos adultos e ratos velhos. Simpósio Nacional del

Morango. 5°Encontro de Pequenas Frutas e frutas

Nativas do Mercosul. Livro de memória do evento, 95.

Ramirez MR, Passos C, Henriques AT. 2009. Estudo

preliminar do efeito da suplementação prolongada

com extrato de Rubus sp e cianidina isolada na

concentração de aminoácidos excitatórios e inibitórios

no SNC em ratos. Sociedade Brasileira de Química

(SBQ) Fortaleza Brasil.

Ramirez MR, Guterres L, Dickel OE, de Castro MR,

Henriques AT,

de Souza

MM, Barros DM. 2009.

Preliminary studies on the antinociceptive activity of

Vaccinium Ashei berry in experimental animal models.

J Med Food. DOI would be 10.1089/jmf. 2009.0079.

Ramirez-Tortosa C, Andersen OM, Gardner PT, Morrice

PC, Wood SG, Duthie S J, Collins AR, Duthie GG.

2001. Anthocyanin-rich extract decreases indices of

lipid peroxidation and DNA damage in vitamin E-

depleted rats. Free Radical Biol Med 31:1033-1037.

Rechkemmer G, Pool-Zobel BL. 1998. Antigenotoxic and

physiological properties of anthocyanins/

anthocyanidins in intestinal epithelial cells. In: COST

916, Bioactive plant cell wall components in nutrition

and health: Polyphenols in food (EUR 18169):131-

136.

Renaud S, Ruf JC. 1994. The French paradox: vegetables

or wine. Circulation 90:3118-3119.

Rice-Evans CA, Miller NJE, Paganga G. 1997.

Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends

Plant Sci 2:152-159.

Seeram NP, Nair MG. 2002. Inhibition of lipid

peroxidation and structure activity-related studies of

the dietary constituents anthocyanins, anthocyanidins,

and catechins. J Agr Food Chem 50:5308-5312.

Sellappan S, Akoh C, Krewer G. 2002. Phenolic

compounds and antioxidant capacity of Georgia-

grown blueberries and blackberries. J Agr Food Chem

50:2432-2438.

Senthilmohan ST, Zhang J, Stanley RA. 2003. Effects of

flavonoid extract Enzogenol® with vitamin C on

protein oxidation and DNA damage in older human

subjects. Nutr Res 23:1199-1210.

Serafín M, Testa MF, Villaño D, Pecorari M, van Wieren

K, Azzini E, Brambilla A, Maiani G. 2009.

Antioxidant activity of blueberry fruit is impaired by

association with milk. Free Radical Biol Med 46:769-

774.

Setchell KDR, Brown NM, Desai PB, Zimmer-Nechimias

L, Wolfe B, Jakate AS, Creutzinger V, Heubi JE.

2003. Bioavailability disposition and dose-response

effects of soy isoflavones when consumed by healthy

women at physiologically typical dietary intakes. J

Nutr 133:1027-1035.

Shahrzad S, Aoyagi K, Winter A, Koyama A, Bitsch I.

2000. Pharmacokinetics of gallic acid and its relative

bioavailability from tea in healthy humans. J Nutr

131:1207-1210.

Shoji T, Masumoto S, Moriichi N, Akiyama H, Kanda T,

Ohtake Y, Goda Y. 2006. Apple procyanidin

oligomers absorption in rats after oral administration:

analysis of procyanidins in plasma using the porter

method and high-performance liquid chromatography/

tandem mass spectrometry. J Agr Food Chern 54:884-

892.

Spencer JP, Schroeter H, Crossthwaithe AJ, Kuhnle G,

Williams RJ, Rice-Evans C. 2001. Contrasting

influences of glucuronidation and O-methylation of

epicatechin on hydrogen peroxide-induced cell death

in neurons and fibroblasts. Free Radical Biol Med

31:1139-1146.

Tsuda T, Watanabe M, Ohshima K, Nori- Norinobu S,

Choi SW, Kawakishi S, Osawa T. 1994. Antioxidative

activity of the anthocyanin pigments cyanindin 3-O-D

glucoside and cyanidin. J Agr Food Chem 42:2407-

2410.

Page 23: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Ramírez et al. Propiedades antioxidantes de las frutas rojas

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 468

Valcheva-Kuzmanova S, Kuzmanov K, Mihova V,

Krasnaliev I, Borisova P, Belcheva A. 2007.

Antihyperlipidemic effect of Aronia melanocarpa fruit

juice in rats fed a high-cholesterol diet. Plant Food

Hum Nutr 62:19-24.

Weisel T, Baum M, Eisenbrand G, Dietrich H, Will F,

Stockis JP, Kulling S, Rufer, C, Johannes C,

Janzowski C. 2006. An anthocyanin/polyphenolic-rich

fruit juice reduces oxidative DNA damage and

increases glutathione level in healthy probands.

Biotechnol J 1:388-397.

Wu X, Pittman HE, McKay S, Prior RL. 2005. Aglycones

and sugar moieties alter anthocyanin absorption and

metabolism after berry consumption in weanling pigs.

J Nutr 135:2417-2424.

Youdim KA, Dobbie MS, Kuhnle G, Proteggente AR,

Abbott NJ, Rice-Evans C. 2003. Interaction between

flavonoids and the blood–brain barrier: in vitro

studies. J Neurochem 85:180-192.

Youdim KA, Shukitt-Hale B, Joseph JA. 2004. Flavonoids

and the brain: Interactions at the blood–brain barrier

and their physiological effects on the central nervous

system. Free Radical Biol Med 37:1683-1693.

Zubik L, Meydani M. 2003. Bioavailability of soybean

isoflavones from aglycone and glucoside forms in

american women. Am J Clin Nutr 77:1459-1465.

Page 24: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

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BLACPMA ISSN 0717 7917 Revisión | Review

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Antioxidantes en berries nativos chilenos

[Antioxidants in Chilean native berries]

Carolina FREDES

Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile.

Abstract

Among plant natural products, interest in polyphenols is mainly due to its antioxidant properties. Many fruits recognized as berries have higher antioxidant capacity than other fruits and vegetables. In Chile, there are native berries with medicinal uses deep-rooted to mapuche culture and country people that have been studied by researchers both nationally and internationally. The aim of this article was to review the state of the art related to polyphenols identification, antioxidant capacity and polyphenols bioavailability of four native berries. Maqui fruits distinguish significantly for their polyphenols content and antioxidant activities. Research in Magellan barberry (calafate), Chilean guava (murta or murtilla) and Chilean strawberry deliver relative contributions of their antioxidant properties. However, higher scientific background is needed to validate the properties of these species so as to achieve a real appreciation of these unique raw materials for the development of functional foods and nutraceuticals.

Keywords: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Fragaria chiloensis; Berberis buxifolia; Polyphenols.

Resumen

Dentro de los productos naturales de origen vegetal, el interés por los polifenoles se debe principalmente a sus propiedades antioxidantes. Muchos frutos conocidos como berries presentan capacidades antioxidantes más altas, en relación a otras frutas y verduras. En Chile, existen berries nativos con usos medicinales muy arraigados a la cultura mapuche y rural del país, que han sido estudiados tanto por investigadores nacionales como internacionales. El objetivo de esta publicación fue revisar el estado del arte relacionado a la identificación de polifenoles, la capacidad antioxidante y la biodisponibilidad de compuestos polifenólicos de cuatro berries nativos. Los frutos de maqui destacan significativamente por sus contenidos de polifenoles y capacidad antioxidante, e investigaciones en calafate, murtilla y frutilla chilena entregan aportes relativos a sus propiedades antioxidantes. Sin embargo, aún, son necesarios mayores antecedentes científicos que validen las propiedades de estas especies de manera de lograr su real valorización como materias primas únicas, para el desarrollo de alimentos funcionales y nutracéuticos.

Palabras Clave: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Fragaria chiloensis; Berberis buxifolia; Polifenoles.

AOX, antioxidantes; AT, antocianos totales; BNCh, berries nativos chilenos; CA, capacidad antioxidante; DAD, detector con arreglo de diodos; ESI, Electro Spray Ionization, fma, forma botánica; ssp, sub-especie botánica; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; ; PT, polifenoles totales; UV-vis, ultravioleta-visible; var, variedad.

Recibido | Received: May 15, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: July 27, 2009. Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009 Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was not financed. This article must be cited as: Carolina Fredes. 2009. Antioxidantes en berries nativos chilenos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):469 – 478. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email [email protected]

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INTRODUCCIÓN

Los productos naturales (metabolitos secundarios) son compuestos orgánicos, producidos por las plantas, que parecen no tener una función directa sobre su crecimiento y desarrollo (Taiz y Zeiger, 1991). Estos compuestos no tienen un rol reconocido sobre procesos como la fotosíntesis, asimilación de agua y nutrientes y la respiración celular (Salisbury y Ross, 1994); sin embargo, tienen un rol importante en la defensa y adaptación de las plantas a su ambiente y como fuentes de principios activos con uso farmacéutico y alimenticio (Croteu et al., 2000).

De acuerdo al origen de sus rutas de biosíntesis, los productos naturales se dividen en terpenos o terpenoides, polifenoles y alcaloides. El interés principal sobre los polifenoles se debe a sus propiedades antioxidantes (AOX). Manach et al. (2004) clasifica los polifenoles de acuerdo al número de anillos aromáticos de sus estructuras químicas y las formas en que estos anillos se unen entre sí. De acuerdo a esta clasificación, los polifenoles se dividen en no flavonoides (ácidos fenólicos), donde se encuentran los ácidos hidroxibenzoicos (ácido elágico) e hidroxicinámicos (ácido cafeico), flavonoides, estilbenos y lignanos. Los flavonoides que poseen dos anillos aromáticos, unidos por tres carbonos que forman un heterociclo oxigenado, se subclasifican en flavonoles, flavonas, isoflavonas, flavanonas, antocianidinas y flavanoles. Además de esta variedad de moléculas, las antocianidinas se pueden unir a diferentes azúcares en distintas posiciones formando los antocianos. Por otro lado, los ácidos hidroxibenzoicos (ácido elágico) son componentes de compuestos de estructuras complejas como los taninos hidrolizables (elagitaninos) presentes en frutillas, frambuesas y moras, entre otras (Clifford y Scalbert, 2000).

Los flavonoides (Espin et al., 2000; Heim et al., 2002) muestran una gran capacidad para captar radicales libres causantes del estrés oxidativo, atribuyéndoseles a su vez un efecto beneficioso en la prevención de enfermedades cardiovasculares, cancerígenas y neurológicas (Ishige et al., 2001; Katsube et al., 2003; Schramm y German, 1998).

Existen diversos métodos para evaluar la capacidad antioxidante (CA) (Gil et al., 2000; Mermelstein, 2008), ya sea in vitro o in vivo. Una de las estrategias más aplicadas en las determinaciones

de la CA total in vitro de un compuesto, mezcla de AOX o alimento consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias cromógenas de naturaleza radicalaria, en que la pérdida de color ocurre de forma proporcional con la concentración. No obstante, las determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro dan tan sólo una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo. Los resultados de la CA in vivo de muchos polifenoles pueden diferir significativamente de los resultados in vitro (Manach et al., 2005; Sies, 2007; Mermelstein, 2008), ya que la absorción de los polifenoles en el organismo está determinada por sus estructuras químicas por lo que la real efectividad en el organismo dependerá de la biodisponibilidad de estos compuestos.

La CA de una mezcla de AOX no está determinada sólo por la suma de las CAs de cada uno de sus componentes; también depende del microambiente en que se encuentra el compuesto. Los compuestos interactúan entre sí pudiendo producirse efectos sinérgicos o inhibitorios (Prior y Cao, 1999; Robards et al., 1999).

Existe una gran variedad de especies de diversas familias botánicas (Rosaceae, Ericaceae, Myrtaceae, Berberidaceae, Elaeocarpaceae, entre otras), a cuyos frutos se les denomina berries o bayas. Éstas se caracterizan por sus frutos pequeños de colores rojo y púrpura. En términos botánicos, se define una baya como un fruto de múltiples semillas, de mesocarpio y endocarpio carnoso que proviene de una flor de ovario súpero (Bowling, 2000). Por lo tanto, en términos estrictamente botánicos, muy pocos de estos frutos son bayas verdaderas (sí lo serían el maqui y el calafate). Sin embargo, el uso del término berries es muy extendido a nivel científico y comercial (Seeram, 2008), por lo que en esta revisión, sin desmedro del uso adecuado del término botánico, se referirá a algunas especies que no poseen bayas verdaderas o que corresponden a otro tipo de frutos (por ejemplo, a poliaquenios).

El interés por el estudio de los berries nativos de Chile (BNCh) obedece a una tendencia mundial de búsqueda de frutas y nuevas materias primas con altos contenidos de AOX. Muchos berries se destacan por sus contenidos altos de polifenoles (Kahkonen et al., 1999; 2001; Seeram, 2008; Speisky et al., 2008). Halvorsen et al. (2002) determinaron la CA (método FRAP) de una serie de frutas y verduras consumidas en Noruega, en el que se destacaron las mayores CAs de algunas especies de berries silvestres (nativas), en

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relación a las especies cultivadas. Es así como, por ejemplo, la frutilla silvestre europea (Fragaria vesca) presentó 6,88 mM equivalentes Trolox/ 100 g, en comparación con la frutilla cultivada (Fragaria x ananassa) que presentó 2,17 mM equivalentes Trolox/ 100 g (de fruta fresca). Algo similar se observó con el mirtilo (Vaccinium myrtillus) que presentó 8,23 mM equivalentes Trolox/ 100 g, en comparación con el arándano (Vaccinium corymbosum) que presentó 3,64 mM equivalentes Trolox/ 100 g (de fruta fresca). Dada las condiciones edafoclimáticas donde crecen muchas especies de BNCh y a que los polifenoles (en especial los flavonoides) son compuestos cuya síntesis es favorecida por condiciones de estrés, se esperaría que estas especies presentaran contenidos altos de este tipo de AOX.

El objetivo de esta publicación fue revisar el estado del arte relacionado a la identificación y cuanti-ficación de polifenoles, CA y biodisponibilidad de polifenoles de BNCh.

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Usos tradicionales de algunas especies de BNCh La flora chilena representa un recurso genético

importante, especialmente si se considera su riqueza de especies. Chile central es un “hotspot” de biodiversidad. Tiene alrededor de 1.605 plantas endémicas, que equivalen al 0,5% de las 300.000 especies de plantas descritas mundialmente. Esto se traduce en que el 46,8% de las plantas descritas en Chile sean endémicas (Myers et al., 2000). La flora nativa fue utilizada por los habitantes prehispánicos con fines diversos, entre los cuales estuvo el uso alimenticio, combustible, religioso, ornamental, cestería, tintóreo y medicinal. La tradición de uso medicinal de las plantas chilenas por las poblaciones nativas ha quedado registrada en crónicas de los colonizadores quienes, a su vez, la enriquecieron con el aporte de plantas medicinales provenientes de Europa y otras regiones (Massardo y Rossi, 1996).

Los libros de medicina naturista muestran que el uso medicinal de las plantas nativas de Chile incluye un amplio espectro de afecciones y prácticas curativas (Rozzi y Massardo, 1994 a, 1994 b).

Esta revisión se concentró en cuatro BNCh (maqui, calafate, murtilla y frutilla) que poseen usos tradicionales muy difundidos por la población rural del país (Smith-Ramírez, 1994; Massardo y Rossi, 1996) y muy arraigados a la cultura mapuche (Houghton y Manby, 1985; Molares y Ladio, 2009). Para estas especies existen diferentes estudios

científicos que describen sus propiedades AOX que intentan validar sus usos tradicionales.

El maqui (Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz), pertenece a la familia Elaeocarpaceae (Fig. 1). Es una especie siempre-verde nativa de Chile que se distribuye entre Limarí (IV Región) y Aisén (IX Región), tanto en el valle central como en los faldeos cordilleranos, desde cerca del nivel del mar hasta los 2.500 m de altitud (Rodríguez et al. 1983). Posee una gran plasticidad morfológica, presentándose como arbusto en la zona septentrional de su distribución y como árbol en la zona meridional. Para la cultura mapuche es una especie sagrada, símbolo de “Buena intención” (Hoffmann, 1982). Los usos tradicionales de esta especie se basan en la utilización de infusiones de hojas para el tratamiento de enfermedades de la garganta, los frutos como antidiarreicos y el jugo de los frutos, para darle tinte al vino y otras bebidas (Muñoz et al., 2001; Montenegro, 2002). Figura 1. Maqui (Paredones, VI Región)

El calafate (Berberis buxifolia Lam.) pertenece a la familia Berberidaceae (Fig 2). Es un arbusto con espinas, siempre-verde nativo de Chile que se distribuye desde la Región Metropolitana a la XII Región. Las raíces de esta especie han sido utilizadas para el control de fiebres e inflamaciones, dolores estomacales, indigestiones y colitis y los frutos, por sus pigmentos naturales (Muñoz et al., 2001; Montenegro, 2002; Freile et al., 2003).

La murtilla o murta (Ugni molinae Turcz), pertenece a la familia Myrtaceae (Fig. 3). Es un arbusto siempre-verde nativo de Chile que se distribuye desde el sur de Talca (VII Región) a Río Palena (XI Región). La murta es conocida por este nombre en las provincias de Valdivia y Chiloé, como murtilla más al norte (Concepción) y como uñi, por los mapuches (Urban, 1934). Los usos tradicionales de esta especie se basan en la utilización de

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infusiones de hojas para el tratamiento de infecciones urinarias y enfermedades de la garganta y los frutos, por su poder astringente (Muñoz et al., 2001; Montenegro, 2002).

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Figura 2. Calafate (Puerto Williams, XII Región)

La frutilla chilena (Fragaria chiloensis (L.) Duch. ssp. chiloensis fma. patagonica Staudt y fma. chiloensis Staudt), pertenece a la familia Rosaceae. Es una planta herbácea perenne nativa de Chile que se distribuye entre la VIII y XII Región (Darrow, 1996). Lavin et al. (2000) indican que la fma. patagonica de frutos rojos (Fig. 4a) se distribuye entre Iloca (VII Región) y Chiloé (X Región), mientras que la fma. chiloensis (Fig. 4b) de frutos blancos se distribuye hasta la XII Región. El fruto de la frutilla corresponde a un poliaquenio que consiste en un tálamo central carnoso con múltiples aquenios en su superficie (frutos verdaderos). Los aquenios contribuyen entre un 0,3 y 1,1 % al peso total del fruto fresco (Cheel et al. 2007). No se describen usos medicinales para hojas y frutos; sin embargo, los frutos han sido utilizados tradicionalmente para la elaboración de mermeladas y conservas.

Figura 3. Murtilla (Cañete, VIII Región).

Figura 4. Frutilla chilena: a) fma. patagonica (Chiloé, X Region) y b) fma. chiloensis (Pichihuillinco, VIII Region).

Identificación y cuantificación de polifenoles en BNCh

La identificación de polifenoles de BNCh se ha realizado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a diferentes tipos de detectores (DAD, ESI-MS). Para la cuantificación de polifenoles totales (PT) se ha descrito el método del reactivo de Folin-Ciocalteau (Singleton y Rossi, 1965) y para antocianos (AT), el método diferencial de pH (Giusti y Wrolstad, 2001) mediante espectrofotometría UV-vis (ultravioleta-visible).

El interés por el maqui se ha centrado principalmente en su contenido de antocianos. Escribano-Bailón et al. (2006) identificaron mediante HPLC-DAD-MS ocho antocianos, para los que propusieron las siguientes identidades: delfinidina-3- sambubiósido -5-glucósido, delfinidina 3,5 diglucósido, cianidina-3- sambubiósido-5-glucósido, cianidina 3,5-diglucósido, delfinidina 3- sambubiósido, delfinidina 3- glucósido, cianidina 3- sambubiósido y cianidina 3- glucósido. Los derivados de delfinidina (73%) predominaron sobre los derivados de cianidina (37%), siendo la delfinidina-3-sambubiósido -5-glucósido el principal antociano (34% del total de antocianos). El contenido promedio de AT fue de 137,6 mg equivalentes de delfinidina 3- glucósido/100 g de fruta fresca.

El interés por el calafate, de manera similar al maqui, se ha centrado principalmente en sus contenidos de antocianos. No se han descrito los antocianos de calafate de manera pormenorizada, pero existen antecedentes de la evolución del contenido de AT durante el crecimiento y desarrollo del fruto (Arena y Curvetto, 2008). En este estudio se determinó que la máxima concentración de AT (761,30 mg equivalentes de cianidina 3- glucósido/100 g de fruta fresca) coincidió con la mayor concentración de sólidos solubles (24,88 °Brix) a los 126 días después de plena floración. La determinación de los sólidos solubles mediante

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refractometría es un análisis simple que se realiza en terreno, que permitiría cosechar esta fruta en el momento de máxima acumulación de AT.

Los polifenoles en la murtilla han sido principalmente estudiados en sus hojas, donde se han descrito ácidos fenólicos, taninos hidrolizables, flavanoles (epicatequina) y flavonoles (miricetina, quercetina) (Avello, 2000; Rubilar et al., 2006). Peña-Neira et al. (2007) determinaron los compuestos fenólicos de bajo peso molecular de frutos de murtilla de diferentes ecotipos mediante HPLC-DAD. Si bien los perfiles cromatográficos variaron de acuerdo a los ecotipos analizados, los principales polifenoles identificados fueron elagitaninos y derivados de flavonoles (quercetina).

Cheel et al. (2005) aislaron tres glicósidos de ácido E-cinámico, triptófano y cianidina-3-O-β-d-glucopiranósido de frutos maduros de frutilla chilena (fma. chiloensis). Los extractos de las diferentes partes del fruto (aquenios y tálamo), analizados mediante HPLC, indicaron que los aquenios contienen ácido elágico libre y cianidina-3-O-β-d-glucopiranósido, mientras que el tálamo contiene derivados del ácido E-cinámico y triptófano.

Simirgiotis et al. (2009) compararon la composición fenólica de extractos de frutilla chilena (fma. chiloensis y fma. patagonica) con la frutilla comercial (cv. Chandler) mediante HPLC-DAD y

HPLC-ESI-MS. La utilización combinada de LC -DAD/ESI-MS ha sido descrita como un método excelente y exacto para el análisis de polifenoles en frutillas (Seeram et al., 2006; Aaby et al., 2007; Lopes da Silva et al., 2007). De acuerdo a ese estudio, los componentes fenólicos de las tres especies corresponden principalmente a proantocianidinas, taninos hidrolizables, antocianos y glucósidos de flavonol. En ambas frutillas chilenas el principal glucósido de flavonol fue la quercetina 3-O-glucurónido y los antocianos identificados en menores concentraciones la cianidina-malonil-glucósido y pelargonidina-malonil-glucósido. La frutilla comercial presentó el mayor contenido de AT (27,90 mg/100 g de fruta fresca), mientras que la fma. chiloensis presentó el contenido más bajo (2,20 mg/100 g de fruta fresca). La fma. patagonica presentó un contenido intermedio (22,53 mg/100 g de fruta fresca). El ácido elágico fue el principal polifenol encontrado en la frutilla chilena blanca. Este estudio permitió una clara diferenciación entre los compuestos químicos de la frutilla comercial y de la frutilla chilena.

La Tabla 1 resume los principales grupos de polifenoles identificados en BNCh, donde se destaca la presencia de flavonoles (quercetina) y antocianidinas (cianidina).

Tabla 1. Principales polifenoles descritos en BNCh.

Especie Parte de la planta No flavonoides Flavonoides

Maqui Baya --- Antocianidinas (delfinidina, cianidina)

Calafate Baya --- Antocianidinas (ni),

Hoja Acidos fenólicos (ni) Flavanoles (epicatequina), flavonoles (miricetina, quercetina)

Murtilla

Fruto --- Flavonoles (quercetina)

Fruto --- Flavonoles (quercetina), antocianidinas (cianidina, pelargonidina)

Tálamo Ácido E- cinámico ---

Frutilla chilena

Aquenios Ácidos hidroxibenzoicos (ácido elágico) Antocianidinas (cianidina)

Adaptado de: Avello (2000), Cheel et al. (2005), Escribano-Bailón et al. (2006), Rubilar et al. (2006), Peña-Neira et al. (2007), Arena y Curvetto ( 2008), Simirgiotis et al. (2009). ni: compuestos químicos no identificados.

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Capacidad antioxidante y biodisponibilidad de BNCh

La determinación de la CA de BNCh se ha realizado mediante diferentes métodos: FRAP (ferric reducing activity power), TRAP (total radical-trapping antioxidant parameter), TAR (total antioxidant reactivity), TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), radical DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidracil), ORAC (oxygen radical absorbance capacity). El método FRAP mide la reducción del ión férrico (Fe+3) a ferroso (Fe+2) en la presencia de AOX, mientras que los métodos TRAP, TAR, TBARS, radical DPPH• y ORAC miden la capacidad de los AOX de atrapar diferentes tipos de radicales libres (Araya, 2002; Céspedes et al., 2008; Miranda-Rottmann et al., 2002).

Miranda-Rottmann et al. (2002) compararon los contenidos de PT y CA (métodos TRAP y TAR) de diferentes jugos concentrados (arándano, frambuesa, frutilla, cranberry, mora y maqui) y vino tinto. Las CAs fueron directamente proporcionales a los contenidos de PT, destacándose el jugo de maqui significativamente sobre el resto de los jugos concentrados y el vino tinto.

Araya et al. (2006) determinaron la CA (método FRAP) de una serie de frutas y verduras consumidas en Chile. El maqui destacó significativamente sobre el resto de las especies analizadas. Los valores de frutas estuvieron comprendidos entre 0,02 mM Fe/100 g para el pepino hasta 12,32 mM Fe/100 g para el maqui, destacando el valor alto de otros berries como la frutilla y zarzamora (3,10 y 3,55 mM Fe/100 g). En la zona intermedia se ubicaron frutos como el limón y el membrillo con (0,25 y 0,23 mM Fe/100 g) y los valores más bajos correspondieron a manzana (var. Fuji) y duraznos. Frente a estos resultados, el maqui sobresale por su CA determinada in vitro.

Céspedes et al. (2008) determinaron que el extracto metanólico de frutos de maqui presentó actividad antioxidante y cardioprotectora sobre la isquemia/reperfusión aguda de corazón de ratas in vivo. Por otra parte, este extracto fue capaz de prevenir estos eventos nocivos en el corazón del animal, por la disminución de la oxidación de lípidos y la reducción de la concentración de TBARS. Además, estos autores determinaron la CA del extracto metanólico de maqui mediante DPPH· (IC50), ORAC, FRAP y TBARS. El extracto

metanólico presentó un IC50 de 1,62 µg/mL y para TBARS un valor de 2,51 µg/mL, en comparación con el jugo de maqui que presentó un IC50 de 12,1 µg/mL y para TBARS un valor de 9,58 µg/mL. La CA del extracto metanólico de maqui estuvo fuertemente correlacionada con el contenido de PT (12,97 µM ECat/g), que se observó por los mayores valores de ORAC (29,69 µM ET/g) y FRAP (25 µM ECat/g). Estos resultados demostraron que estos frutos podrían ser útiles como fuentes de AOX, cardioprotectores y nutracéuticos.

Avello et al. (2008) evaluaron la CA (método TBARS) plasmática antes y después de la ingesta de infusiones de hojas de maqui (1%). El contenido de fenoles totales en la infusión fue de 0,074 mM equivalentes de ácido gálico. En este estudio, voluntarios sanos no fumadores y con índice de masa corporal dentro del rango normal para cada uno, bebieron esta infusión dos veces al día durante tres días (dosis descrita por la etnomedicina para el tratamiento de distintos cuadros). Los resultaron indicaron un aumento promedio de la CA a las 24 h observado por medio de TBARS (30,27 %).

Rubilar et al. (2006) determinaron la CA (radical DPPH·y TBARS) de diferentes tipos de extractos de hojas de murtilla. Los solventes utilizados fueron etanol, metanol y agua. El mayor contenido de PT (2,6% de equivalentes de ácido gálico) fue obtenido con metanol, mientras que la mayor CA (IC50) fue obtenida con el extracto etanólico (0,12 M ácido gálico/M DPPH·). El agua como solvente presentó el mejor resultado de CA por el método TBARS.

Avello y Pastene (2005) evaluaron la CA (método ORAC) plasmática antes y después de la ingesta de infusiones de hojas de murtilla (1%). En este estudio, voluntarios sanos (normolipédicos y no diabéticos), bebieron esta infusión dos veces al día durante tres días. Los resultados indicaron un aumento significativo (de 2.258 a 3.108 µM ET/L), en la CA del plasma de los voluntarios. Estos antecedentes serían un aporte valioso en la validación de los usos tradicionales de las hojas de esta especie.

Cheel et al. (2007) determinaron la CA (radical DPPH·) de la frutilla chilena (fma. patagonica y fma. chiloensis), frutilla comercial (var. Chandler) y de la frutilla silvestre europea. Los resultados de este análisis fueron expresados como porcentaje de decoloración del radical DPPH, el grado de decoloración indicó la eficiencia de las especies de atrapar radicales libres. La variedad Chandler presentó la mayor CA (86%), mientras que la fma.

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patagonica presentó la menor CA (43%). En este estudio, la frutilla silvestre europea presentó una CA menor que la frutilla cultivada, siendo estos resultados diferentes a los obtenidos por Halvorsen et al. (2002), lo que se podría deber a que ambos métodos de CA (radical DPPH· y FRAP) se basan en principios diferentes.

Simirgiotis et al. (2009) determinaron la CA (radical DPPH·) de extractos metanólicos de frutilla chilena (fma. chiloensis), de sus fracciones y compuestos purificados. Las fracciones etanólicas (B y E) presentaron CAs destacables que fluctuaron entre 20,3 y 41,4 µg/mL. Los principales compuestos químicos presentes en estas fracciones fueron pelargonidina-malonil-glucósido, elagitaninos, quercetina glucorónido y canferol cumaril-hexósido (en fracción B) y ácido elágico pentósido y ramnósido, ácido elágico y quercetina glucorónido (en fracción E).

La Tabla 2 resume los principales métodos de CA descritos en las publicaciones de BNCh. Es difícil establecer comparaciones entre los resultados obtenidos de estas publicaciones, ya que los métodos utilizados se basan en principios diferentes y bajo la

utilización de un mismo método, los resultados están expresados en diferentes unidades. Además, existen estudios de CA para jugos y extractos (con diferentes tipos de solventes) para los que los contenidos de PT y la CA pueden variar significativamente.

COMENTARIOS Y DESAFÍOS

Los antecedentes científicos de las propiedades AOX de BNCH publicados a la fecha presentan diferentes estados de avance; siendo los frutos de maqui los mayormente estudiados. De acuerdo a estas publicaciones, esta especie se destaca tanto por sus contenidos de PT y AT como por su CA in vitro e in vivo. Sin embargo, no existen estudios de biodisponibilidad de los polifenoles de maqui, calafate, murtilla y frutilla chilena. Para infusiones de hojas de maqui y murtilla existen resultados derivados de pequeñas intervenciones en voluntarios sanos pero, no se sabe qué compuestos o metabolitos dan cuenta de la actividad antioxidante y si alcanzan concentraciones plasmáticas relevantes.

Tabla 2. Métodos descritos para la determinación de CA de BNCh.

Método Expresión de resultados Referencia

FRAP mM Fe/100 g µM ECat/g

Araya, 2006 Céspedes et al., 2008

TRAP µM ET/L Miranda-Rottmann et al., 2002

TAR µM E T/L Miranda-Rottmann et al., 2002

TBARS µg EMDA/mL Céspedes et al., 2008 Rubilar et al., 2006

Radical DPPH· µg/mL

M ácido gálico/M DPPH· % decoloración DPPH· µg/mL

Céspedes et al., 2008 Rubilar et al., 2006 Cheel et al., 2007 Simirgiotis et al. 2009

ORAC µM ET/L

µM ET/g Avello y Pastene, 2005 Céspedes et al., 2008

ECat: equivalentes catequina. ET: equivalentes Trolox. EMDA: equivalentes malondialdehído % decoloración DPPH· = absorbancia del compuesto [o extracto] x 100 absorbancia del blanco

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Este tipo de evidencia es crucial para el desarrollo de alimentos saludables (funcionales). De acuerdo al Food and Drug Administration (www.cfsan.fda.gov/~dms/hpotguid.html), un mensaje que describe el nivel de nutrientes AOX presentes en un alimento es un mensaje de contenido de nutrientes, y un mensaje del contenido de nutrientes AOX sólo se puede hacer para aquellos compuestos para los que esté establecida una ingesta diaria de referencia (IDR). Para esto, los compuestos (o en este caso, los polifenoles) deben tener una actividad antioxidante reconocida, es decir, debe existir evidencia científica consistente que señale que el compuesto participa en procesos fisiológicos, bioquímicos o celulares que inactivan los radicales libres o previenen las reacciones químicas iniciadas por los radicales libres después de haber sido ingerido y absorbido en el tracto gastrointestinal. El uso de los BNCh como materias primas para el desarrollo de colorantes naturales sería otra alternativa de I+D interesante. La utilización de antocianos para el desarrollo de colorantes naturales está siendo reconsiderada por la industria alimenticia, debido a la mayor demanda de los consumidores por productos más naturales (Nachay, 2009). Esta tendencia se podría deber al cuestionamiento de la seguridad de los colorantes artificiales alimenticios y a estudios que los asocian con problemas de hiperactividad en niños entre 3 y 8-9 años (McCann et al., 2007). Frente a esto, el maqui, el calafate y la murtilla representan fuentes alternativas de antocianos. En Chile, existen pocos antecedentes de cultivo comercial de BNCh. Cabe señalar los aportes que ha realizado el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) en el estudio de la murtilla (http://www.murtillachile.cl/cultivo.asp) y diversas iniciativas locales para la frutilla chilena (fma. chiloensis) en la ciudad de Contulmo. Paralelamente a la generación de nuevas investigaciones en torno a las propiedades saludables de estas especies, sería necesario avanzar en el desarrollo de manejos agronómicos que faciliten sus cultivos, no sólo con el objeto de generar una oferta de materia prima que permita el escalamiento de productos a nivel industrial, sino para garantizar el uso sustentable de estos recursos nativos de Chile a mediano plazo. Finalmente, los BNCh podrían constituirse en materias primas únicas para el desarrollo de nuevos productos, debido a la tendencia mundial hacia

alimentos de carácter “natural” y con propiedades beneficiosas para la salud. Ante lo cual, las potencialidades de uso para los BNCh serían muy diversas y de grandes proyecciones.

AGRADECIMIENTOS

Beca CONICYT para realizar estudios de Doctorado en Chile. A los profesores Paz Robert (Dra. Química de la Facultad de Química y Farmacia, Universidad de Chile) y Miguel Gómez (Botánico de la Facultad de Agronomía, Pontificia Universidad Católica) por sus aportes valiosos a la redacción de este artículo.

REFERENCIAS Aaby K, Ekeberg D, Skrede G. 2007. Characterization of

phenolic compounds in strawberry (Fragaria x ananassa) fruits by different HPLC detectors and contribution of individual compounds to total antioxidant capacity. J Agr Food Chem 55(11):4395–4406.

Araya H, Clavijo C, Herrera C. 2006. Capacidad antioxidante de frutas y verduras cultivadas en Chile. Arch Latinoam Nutr 56(4):361-365.

Arena M, Curvetto N. 2008. Berberis buxifolia fruiting: Kinetic growth behavior and evolution of chemical properties during the fruiting period and different growing seasons. Sci Hortic 118:120–127.

Avello M. 2000. Estudio fitoquímicos de las hojas de Ugni molinae Turcz (“Murtilla”) y evaluación de las propiedades antioxidantes de sus componentes. Tesis pregrado, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

Avello M, Pastene E. 2005. Actividad antioxidante de infusos de Ugni molinae Turcz (“Murtilla”). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 4(2):33-39.

Avello M, Valladares R, Ordóñez JL. 2008. Capacidad antioxidante de Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz. Rev Cubana Plant Med. 13(4). [citado 2009-06-19]. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1028-47962008000400002&lng=es&nrm=iso

Bowling BL. 2000. The berry grower´s companion. Timber Press, Inc. Portland, Oregon, USA. 284 p.

Céspedes CL, Hafidi M, Pavon N, Alarcón J. 2008. Antioxidant and cardioprotective activities of phenolic extracts from fruits of Chilean blackberry Aristotelia chilensis (Elaeocarpaceae), Maqui. Food Chem 107:820–829.

Cheel J, Theoduloz C, Rodríguez J, Saud G, Caligari PDS, Schmeda-Hirschmann G. 2005. E-cinnamic acid derivatives and phenolics from chilean strawberry fruits, Fragaria chiloensis ssp. chiloensis. J Agr Food Chem 53(22):8512–8518.

Page 32: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Fredes Antioxidantes en berries nativos chilenos

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 477

Cheel J, Theoduloz C, Rodríguez J, Caligari PDS, Schmeda-Hirschmann G. 2007. Free radical scavenging activity and phenolic content in achenes and thalamus from Fragaria chiloensis ssp. chiloensis, F. vesca and F. x ananassa cv. Chandler. Food Chem 102:36–44.

Clifford MN, Scalbert A. 2000. Ellagitannins: occurrence in food, bioavailability and cancer prevention. J Food Sci Agr 80:1118–25.

Croteu R, Kutchan TM, Lewis N. G. 2000. Natural products (secondary metabolites). In: Biochemistry and Molecular Biology of Plants (Buchanan B, Gruissem W, Jones R eds.), American Society of Plant Physiologists, USA. 1250-1319.

Escribano-Bailón MT, Alcalde-Eon C, Muñoz O, Rivas-Gonzalo JC, Santos-Buelga C. 2006. Anthocyanins in berries of maqui (Aristotelia chilensis (Mol.) Stunz). Phytochem Anal 17:8-14.

Espin JC, Sololer-Rivas C, Wichers HJ, García-Viguera C. 2000. Anthocyanin-based natural colorants: A new source of antiradical activity for foodstuff. J Agr Food Chem 48:1588-1592.

Freile ML, Giannini F, Puccia G, Sturnioloc A, Roderoc L, Puccic O, Balzaretia V, Enriz RD. 2003. Antimicrobial activity of aqueous extracts and of berberine isolated from Berberis heterophylla. Fitoterapia 74:702–705.

Gil MA, Tomás-Barberán FA, Hess-Pierce B, Holcroft DM, Kader AA. 2000. Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing. J Agr Food Chem 48:4581-4589.

Giusti MM, Wrolstad RE. 2001. Unit F1.2.1-13: Anthocyanins. Characterization and measurement with UV–Visible spectroscopy. In: Currents Protocols in Food Analytical Chemistry (Wrolstad RE ed.), John Wiley & Sons, New York.

Halvorsen BL, Holte K, Myhrstad MCW, Barikmo I, Hvattum E, Remberg SF, Wold A-B, Haffner K, Baugerod H, Andersen LF, Moskaug J, Jacobs DR, Blomhoff R. 2002. A Systematic screening of total antioxidants in dietary plants. J Nutr 132:461–471.

Heim KE, Tagliaferro AR, Bobilya DJ. 2002. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J Nutr Biochem 13:572-584.

Hoffmann A. 1982. Flora silvestre de Chile. Zona Araucana. Árboles, arbustos y enredaderas leñosas. Ed. Fundación Claudio Gay, Chile. 220 p.

Houghton PJ, Manby J. 1985. Medicinal plants of the Mapuche. J Ethnopharmacol 13(1):89-103.

Ishige K, Schubert D, Sagara Y. 2001. Flavonoids protect neuronal cells from oxidative stress by three distinct mechanisms. Free Radical Biol Med 30:433-446.

Kahkonen MP, Hopia AI, Vuorela HJ, Rauha JP, Pihlaja K, Kujala TS, Heinonen M. 1999. Antioxidant activity

of plant extracts containing phenolic compounds. J Agr Food Chem 47:3954-3962.

Kahkonen MP, Hopia AI, Heinonen M. 2001. Berry phenolics and their antioxidant activity. J Agr Food Chem 49:4076-4082.

Katsube N, Keiko I, Tsushida T, Yamaki K, Kobor IM. 2003. Induction of apoptosis in cancer cells by bilberry (Vaccinium mirtillus) and the anthocyanins. J Agr Food Chem 51:68-75.

Lopes da Silva F, Escribano-Bailón MT, Pérez Alonso JJ, Rivas-Gonzalo JC, Santos-Buelga C. 2007. Anthocyanin pigments in strawberry. LWT 40:374–382.

Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C, Jiménez L. 2004. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr 79(5):727-747.

Manach C, Williamson G, Morand C, Scalbert A, Rémésy C. 2005. Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of 97 bioavailability studies. Am J Clin Nutr 82(suppl.):230S-242S.

Massardo F, Rossi R. 1996. Valoración de la biodiversidad: usos medicinales de la flora nativa chilena. AyD 3:76-81.

McCann D, Barrett A, Cooper A, Crumpler D, Dalen L, Grimshaw K, Kitchin E, Lok K, Porteous L, Prince E, Sonuga-Barke E, Warner JO, Stevenson J. 2007. Food additives and hyperactive behaviour in 3-year-old and 8/9-year-old children in the community: a randomised, double-blinded, placebo-controlled trial. Lancet 370(9598):1560-1567.

Mermelstein NH. 2008. Determining antioxidant activity. Food Chem 11:63-66.

Miranda-Rottmann S, Aspillaga A, Pérez R, Vasquez L, Martínez F, Leighton F. 2002. Juice and phenolic fractions of the berry Aristotelia chilensis inhibit LDL oxidation in vitro and protect human endothelial cells against oxidative stress. J Agr Food Chem 50:7542-7547.

Molares S, Ladio A. 2009. Ethnobotanical review of the Mapuche medicinal flora: Use patterns on a regional scale. J Ethnopharmacol 122:251–260.

Montenegro G. 2002. Chile nuestra flora útil. Universidad Católica de Chile Chile. 267 p.

Montes M, Wilkomirsky T. 1987. Medicina tradicional chilena. Editorial de la Universidad de Concepción. Concepción, Chile. 58 p.

Muñoz O, Montes M, Wilkomirsky T. 2001. Plantas medicinales de uso en Chile. Química y Farmacología. Editorial Universitaria, Chile. 330 p.

Myers N, Mittermeier RA, Mittermeier CG, da Fonseca GAB, Kent J. 2000. Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature 43:853-858.

Nachay K. 2009. A new color. Food Tech 4:50-62. Peña-Neira A, Fredes C, Hurtado, ML, Santos-Buelga C,

Pérez-Alonso J. 2007. Low molecular weight phenolic

Page 33: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Fredes Antioxidantes en berries nativos chilenos

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 478

and anthocyanin composition of the “Murta” (Ugni molinae Turcz.), a Chilean native berry. Berry Health Berry Symposium Corvallis-USA, June 11-12, 2007.

Prior RL, Cao G. 1999. In vivo total antioxidant capacity: comparison of different analytical methods. Free Radical Biol Med 27(11/12):1173-1181.

Robards K, Prenzler PD, Tucker G, Swatsitang P, Glover W. 1999. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chem 66:401-436.

Rodríguez RR, Matthei OS, Quezada MM. 1983. Flora arbórea de Chile. Editorial Universitaria de Concepción, Chile. 408 p.

Rozzi R, Massardo F. 1994a. Las Plantas Medicinales Chilenas II y III. Inform Nueva Med 1(5):16-17.

Rozzi R, Massardo F. 1994b. Las Plantas Medicinales Chilenas II y III. Inform Nueva Med 1(6):16-17.

Rubilar M, Pinelo M, Ihl M, Scheuermann E, Sineiro J, Nuñez MJ. 2006. Murta leaves (Ugni molinae Turcz) as a source of antioxidant polyphenols. J Agr Food Chem 54(1):59–64.

Salisbury FC, Ross C. 1994. Fisiología vegetal. Grupo Editorial Iberoamericana S.A. México.

Schramm DD, German JB. 1998. Potential effects of flavonoids on the etiology of vascular disease. J Nutr Biochem 9:560-566.

Seeram NP, Lee R, Scheuller HS, Heber D. 2006. Identification of phenolic compounds in strawberries

by liquid chromatography electrospray ionization mass spectroscopy. Food Chem 97:1–11.

Seeram NP. 2008. Berry fruits: compositional elements, biochemical activities, and the impact of their intake on human health, performance, and disease. J Agr Food Chem 56:627–629.

Sies H. 2007. Total antioxidant capacity: appraisal of a concept. J Nutr 137(6):1493-1495.

Simirgiotis MJ, Theoduloz C, Caligari PDS, and Schmeda-Hirschmann G. 2009. Comparison of phenolic composition and antioxidant properties of two native Chilean and one domestic strawberry genotypes. Food Chem 113:377-385.

Singleton VI, Rossi JA. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic 16:144-158.

Smith-Ramirez C. 1994. Usos artesanales del bosque nativo: la extracción silenciosa. AyD 2:71-76.

Speisky H, Peña A, Gómez M, Fredes C, Hurtado M, Gotteland M, Brunser O. 2008. Antioxidants in chilean berries. Acta Hort (ISHS) 777:485-492.

Taiz L, Zeiger E. 1991. Plant Physiology. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc, USA. 565 p.

Urban O. 1934. Botánica de las plantas endémicas de Chile. Soc. Imp. y Lit. “Concepción”. Concepción. 291 p.

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BLACPMA ISSN 0717 7917 Artículo Original | Original Article

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Extractos antioxidantes y antimicrobianos de Aristotelia chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosméticos

[Antioxidants and antimicrobial extracts of Aristotelia chilensis and Ugni molinae and its applications as preservatives in cosmetic products]

Marcia AVELLO1*, Rogelio VALDIVIA1, Ruth SANZANA1, María Angélica MONDACA2, Sigrid MENNICKENT1, Valeska AESCHLIMANN1, Magalis BITTNER3, José BECERRA3

1Facultad de Farmacia; 2Facultad de Ciencias Biológicas; 3Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

Abstract

The global market for cosmetics preservatives and antioxidants has experienced a significant shift towards natural products, as it has been called into question the safety of preservatives used in industry. The aim of this study was to evaluate the potential of Aristotelia chilensis and Ugni molinae leaf extracts, for their use as natural antioxidants and preservatives in cosmetics. This study was motivated by background information on the presence of antimicrobial and antioxidant compounds in both species. Extracts from leaf of Aristotelia chilensis and Ugni molinae were evaluated by determination of their antimicrobial and antioxidant capacity. The extraction was developed in Soxhlet apparatus, the antioxidant capacity was tested through the stabilization of the radical free 1-1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH) and the antimicrobial was evaluated through inhibition activity on Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, and Candida albicans, in addition the extracts were standardized in gallic acid equivalents (EAG) through the Folin-Ciocalteu method, which is a form of standardized extracts in a chemical marker. The best extracts were selected in terms of antimicrobial and antioxidant capacity to conduct trials of application in cosmetics. In these formulations, physicochemical, sensorial and microbial stabilities over time and in different storage conditions were determined. None of this products developed bacterial or fungal grow, and all of them maintained the physicochemical and sensorial features.

Keywords: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Preservatives; Antioxidants; Cosmetics.

Resumen

El mercado mundial de los preservantes y antioxidantes cosméticos ha experimentado un importante vuelco hacia los productos naturales, puesto que se ha puesto en entredicho la seguridad de los preservantes más utilizados en la industria. Este estudio tiene como objetivo evaluar el potencial de extractos de hojas de Aristotelia chilensis y Ugni molinae, para su uso como preservantes y antioxidantes naturales en productos cosméticos. Este estudio ha sido motivado por antecedentes acerca de la capacidad antimicrobiana y antioxidante de los compuestos presentes en ambas especies. A partir de hojas de Aristotelia chilensis y Ugni molinae se elaboraron extractos, determinando la capacidad antioxidante y antimicrobiana de éstos. La extracción se desarrolló en aparato Soxhlet, la capacidad antioxidante se realizó a través de la estabilización del radical libre 1-1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) y la actividad antimicrobiana se analizó frente a Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, y Candida albicans, además los extractos se estandarizaron en Equivalentes de ácido gálico (EAG) a través del método Folin-Ciocalteu, que es una forma de uniformar extractos en un marcador químico. Se seleccionaron los mejores extractos en cuanto a capacidad antioxidante y antimicrobiana para realizar ensayos de aplicación en productos cosméticos. En éstos se determinó la estabilidad fisicoquímica, sensorial y microbiana en función del tiempo, en diferentes condiciones de almacenamiento. De los productos elaborados, en ninguno se observó desarrollo bacteriano ni fúngico, y se mantuvieron las características físicoquímicas y sensoriales.

Palabras Clave: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Preservantes; Antioxidantes; Cosméticos. Recibido | Received: January 14, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: August 4, 2009. Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009 Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was financed by Proyecto Interno DIUC 207.074.038 and Proyecto Anillo PBCT ADI-38, from Universidad de Concepción.. This article must be cited as: Marcia Avello, Rogelio Valdivia, Ruth Sanzana, María Angélica Mondaca, Sigrid Mennickent, Valeska Aeschlimann, Magalis Bittner, José Becerra. 2009. Extractos antioxidantes y antimicrobianos de Aristotelia chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosméticos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):479 – 486. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email [email protected] .

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INTRODUCCIÓN

Los productos denominados “cosméticos” cumplen muy diversas funciones, incluyendo no sólo los productos de belleza, sino también los productos para el cuidado personal, la higiene y el bienestar (Schrickel y Bittner, 2001).

Aunque los representantes de la industria cosmética mundial declaran que todos los componentes utilizados en sus productos están sujetos a rigurosas pruebas de seguridad para garantizar la protección tanto de los usuarios como de sus trabajadores, lo cierto es que muchos componentes que alguna vez fueron considerados seguros han sido prohibidos, después de décadas de uso intensivo, por los organismos competentes, ante nuevas evidencias respecto de su falta de seguridad (Darbre, 2006). Debido a lo anteriormente expuesto, los consumidores perciben el segmento de los productos naturales como más seguro para su salud y el ambiente, lo cual crea para los ingredientes de origen natural una oportunidad creciente en el mercado de los cosméticos. A la vez, el reemplazo de ingredientes sintéticos por otros naturales de igual eficacia o desempeño constituye un importante desafío científico y tecnológico.

Los preservantes ayudan a mantener la estabilidad de un producto creando un ambiente inhóspito para el crecimiento antimicrobiano. Además, los productos deben poseer un efecto antioxidante que les permita evitar la rancidez por oxidación de los componentes lipídicos de una formulación o aquellos que sean susceptibles de degradación oxidativa. Muchas moléculas naturales cumplen, en general, una función o la otra, pero no ambas en la misma aplicación. Entre los preservantes más utilizados en cosmética está el grupo de los parabenos, los cuales se han utilizado por más de 20 años tanto en alimentos como en cosméticos, y se encuentran presentes en más del 50% de los productos cosméticos actualmente en estanterías (Soni et al., 2005) Los parabenos han sido el centro de una gran controversia desde que en el 2004 fue publicado un artículo que daba cuenta de la presencia de parabenos en el tejido canceroso de los tumores de mamas de varias mujeres (Darbre et al., 2004). Esta investigación, aunque en forma equívoca, ligó la presencia de parabenos con el riesgo de cáncer de mama, y desencadenó un importante debate entre las empresas y los investigadores involucrados. Aunque la Comisión Científica para Productos al

Consumidor (SCCP) de la Unión Europea ha adoptado un postura moderada indicando que la evidencia científica es insuficiente para aseverar que los parabenos producen cáncer, el mercado consumidor empezó inmediatamente a ejercer una presión sobre los productores, demandando nuevas alternativas (Terasaka et al., 2006). La percepción positiva de los consumidores acerca de la seguridad e inocuidad de los ingredientes naturales, ha estimulado la aparición de nuevos sistemas preservantes de origen natural junto a sus homólogos sintéticos; las mezclas de aceites esenciales tienen buena acción antimicrobiana pero, en general, pobre acción antioxidante. Además, su potente aroma las hace poco aptas en un amplio rango de aplicaciones (Fundación para la Innovación Agraria, 2003).

Los extractos de las especies chilenas Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz Elaeocarpaceae (Maqui) y Ugni molinae Turcz. Myrtaceae (Murtilla), han mostrado interesantes resultados tanto por su acción antioxidante, así como su capacidad antibacteriana, debido a la composición fenólica de sus hojas (Rubilar et al., 2006; Suwalsky et al., 2008). Estas especies chilenas revisten gran importancia en el marco de la creación de valor a partir de productos forestales no madereros mediante tecnologías sustentables (Ministerio de Agricultura, Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), 2006).

El principal uso comercial de Aristotelia chilensis se concentra en extractos del fruto como colorante. En los últimos años, las investigaciones acerca de los extractos de Aristotelia chilensis se han volcado a la determinación de propiedades terapéuticas más allá de estudios farmacológicos, utilizando modelos in vitro, basados en la premisa de que las capacidades antioxidantes específicas de Aristotelia chilensis tendrían un efecto en eventos aterogénicos tempranos (Avello et al., 2008). Por su parte, Ugni molinae ha recibido gran atención en los últimos años, debido al impulso que le ha dado el Instituto de Investigaciones Agropecuarias del Ministerio de Agricultura de Chile (INIA) al promocionarlo como el primer berrie nativo que representa una real alternativa de cultivo para la zona sur (Ministerio de Agricultura, Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), 2006) del país. La composición química de extractos de Ugni molinae, su contenido de polifenoles y sus capacidades antiinflamatoria y antioxidante han sido estudiados por investigadores de distintas universidades, y se encuentran detalladas en publicaciones de distinto

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nivel de impacto (Avello y Pastene, 2005; Suwalsky et al., 2006; 2006a).

Ciertamente existe una creciente oportunidad de mercado para nuevos extractos naturales como preservantes para productos cosméticos, ya sea por sí solos si sus propiedades lo ameritan, o en mezclas, con otros productos naturales, y también con productos sintéticos.

El objetivo del siguiente estudio fue evaluar el potencial preservante y antioxidante de extractos de hojas de Aristotelia chilensis y Ugni molinae para su uso en productos cosméticos. No existen estudios preliminares de este tipo, radicando la originalidad de éste en la incorporación de extractos biológicamente activos para conservar productos comerciales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material Vegetal Se colectaron hojas de Aristotelia chilensis (Mol.)

Stuntz (Elaeocarpaceae) (Maqui) y Ugni molinae Turcz. (Myrtaceae) (Murtilla), en los meses de diciembre del 2005 y marzo del 2006 en campos de la VIII de Chile. El material vegetal fue identificado en el Departamento de Botánica, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas de la Universidad de Concepción (CONC Nº 153285 y CONC Nº 146511, respectivamente).

Las hojas cosechadas se deshidrataron a la sombra, y se procesaron deshidratadas. De cada muestra se tomaron 2000 gramos de material vegetal deshidratado, el cual se redujo de tamaño hasta un tamaño de partícula de 0,5 cm.

Extracción La extracción se realizó con 50 gramos de muestra

molida tanto de hojas de Aristotelia chilensis como de Ugni molinae en aparato Soxhlet. En cada caso, se ensayaron los siguientes solventes: H2O100%, mezcla EtOH-H2O (40%-60% / 60%-40%), EtOH 100%, mezclas MeOH- H2O (40%-60% / 60%-40%) y MeOH 100%. La relación masa-solvente fue de 6:1. Cada extracción se llevó a cabo hasta agotar el material vegetal, lo cual se determinó mediante la medición del contenido de sólidos en el extracto.

Cada extracto se concentró en rotavapor y se llevó a sequedad en liofilizador. Para cada extracto se determinó el rendimiento total en base seca. Los extractos se guardaron en lugar seco y protegido de la luz hasta el momento de su utilización.

Determinación de Fenoles Totales Cada extracto se estandarizó por su contenido

fenólico en moles/L de Equivalentes de Ácido Gálico (M EAG), que es una forma de uniformar extractos en un marcador químico (Singleton y Rossi, 1965), medido por el método de Folin-Ciocalteu (Velioglu et al., 1998), el protocolo fue el siguiente, a 0,5 mL de extractos al 1% preparados en agua, se le adicionó 25 mL H2O destilada, 2,5 mL Reactivo Folin-Ciocalteu (Merck, Germany) y 10 mL Carbonato de Sodio 20%, en el mismo orden. Luego se enrasó a 50 mL con H2O destilada. Se agitó, para homogeneizar y se dejó reposar por 30 minutos. Paralelamente se preparó un blanco analítico con agua destilada. La absorbancia de la muestra fue medida a una longitud de onda de 765 nm en espectrofotómetro (Shimadzu UV-VIS 1601) y las absorbancias de las muestras fueron interpoladas en una curva de calibración preparada con ácido gálico (Merck, Germany) en las condiciones antes descritas. La determinación de fenoles totales se realizó por triplicado para cada extracto.

Capacidad Antioxidante A cada extracto se le realizó análisis de capacidad

antioxidante de manera preliminar, con el fin de seleccionar aquéllos que presentan una mayor capacidad, para su incorporación en una fórmula cosmética.

Se empleó el modelo de decoloración del radical libre DPPH (Joyeux et al., 1995). Se mezclaron 750 μL de los extractos preparados en etanol a 6,0 y 0,6 μM EAG con 1,5 mL de la solución etanólica (20 mg/mL) del radical libre DPPH (Merck, Germany). La absorbancia se determinó a 517 nm en espectrofotómetro (Shimadzu UV-VIS 1601) después de 5 minutos de reposo. Como estándar se utilizó ácido gálico (Merck, Germany) y como blanco etanol. La capacidad antioxidante se expresó en porcentaje de estabilización del radical. La capacidad antioxidante se realizó por triplicado para cada extracto.

Capacidad Antimicrobiana A cada extracto se le realizó análisis de capacidad

antimicrobiana de manera preliminar cualitativa por inhibición del crecimiento bacteriano, en triplicado para cada extracto, con el fin de seleccionar aquéllos que presentan una mayor capacidad, para su incorporación en una fórmula cosmética.

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La actividad antimicrobiana se determinó por el método de difusión en agar tripticasa para bacterias y agar Sabouraud para hongos, utilizando Staphylococcus aureus (ATTC 6538P), Pseudomonas aeruginosa (ATTC 27653), Enterobacter aerogenes (UC-1) y Candida albicans (UC-A), correspondientes a una concentración de 106 ufc/mL. En orificios de 7 mm de diámetro se depositaron 100 μL de los extractos a ensayar (4 mg/mL) en suero fisiológico. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 h y se realizaron lecturas del diámetro del halo de inhibición del crecimiento microbiano utilizando un pie de metro que da una precision de ± 1 mm. El parámetro de selección fue un diámetro del halo de inhibición superior a 15 mm frente a los microorganismos. Se utilizaron como controles Amoxicilina (25 µg/mL) (Lab. Chile) y Caspofungina (5 µg/mL), (Lab. Neo-Sensitabs).

Parámetros de Selección de Extractos Se seleccionaron los mejores extractos con

respecto a capacidad antioxidante y antimicrobiana para incorporarlos en formulaciones cosméticas y estudiar su estabilidad en la formulación y capacidad de protección en los productos terminados. Los parámetros fueron los siguientes: 100% de capacidad antioxidante frente a DPPH de extractos (6,0-0,6 μM) EAG que corresponden a concentraciones similares a antioxidantes sintéticos utilizados en formulaciones cosméticas, y un diámetro de halo de inhibición igual o superior a 15 mm frente a Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes y Candida albicans de los extractos en una concentración de 4mg/L, que corresponde a la concentración máxima de parabenos permitida por la legislación chilena en productos cosméticos.

Forma Cosmética y Ensayos de Estabilidad Cuadro 1. Composicion de la Crema de limpieza O/W (Aceite/Agua)

Ingredientes: Cantidad Aceite Mineral 65/67 50 g Cera de abeja 7 g Tween 40 2 g Atlas G 1726 8 g Extractos 4 g Agua destilada c.s.p 100 g

Aceite Mineral 65/67, es una mezcla de aceites minerales de baja viscosidad y media viscosidad. Atlas G 1726, corresponde a PEG-20 Sorbitan Beeswax.

Como controles se utilizó la misma fórmula sin preservantes ni antioxidantes sintéticos ni extractos, y otra utilizando metil y propil parabenos (0,015 g) y BHT (0,02 g).

Estabilidad de la Formulación en el Tiempo Se estudió la estabilidad desde el punto de vista

físicoquímico, sensorial, rancidez y microbiológico por un período de 6 meses. Paralelamente se estudiaron controles; formulaciones conteniendo parabenos y antioxidantes sintéticos en las condiciones que a continuación se detallan y también formulaciones sin extractos, preservantes ni antioxidantes sintéticos.

Estabilidad Físicoquímica y Sensorial Los productos se almacenaron por 6 meses en las

siguientes condiciones: Normales (N); luz natural, temperatura ambiente, Luz (λ); exposición a la luz natural 5h/día, Oscuridad (O); estante cerrado, Frío (F); 4 ºC. En forma bisemanal se monitorearon las siguientes características físicoquímicas y sensoriales: color, textura, olor, pH, separación de fases y formación de precipitado.

Rancidez (Índice de Peróxido) En matraz Erlenmeyer se agregó 500 mg de

muestra y 160 μL de mezcla ácido acético-cloroformo (6+4) y se agitó hasta disolver la formulación, se agregó 50 μL de solución saturada de KI al 5% en metanol, dejando reposar por 10 min en lugar oscuro. Se agregó 5 mL de agua y 50 μL de almidón. El desarrollo de un color azul indica reacción positiva y la intensidad del mismo denota mayor o menor concentración de peróxidos (Rondon et al., 2004). Esta reacción se llevó acabo en forma bisemanal por 6 meses.

Estabilidad Microbiológica En forma bisemanal y por 6 meses las cremas se

inocularon en caldo de cultivo nutritivo, se incubaron a 37 ºC por 48 h y se observó si existía turbidez. En caso de observarse turbidez los productos se sembraron en agar tripticasa para el estudio de bacterias y agar Sabouraud para el estudio de hongos. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h y se realizaron lecturas del diámetro del halo de inhibición del crecimiento microbiano.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Este trabajo reporta en el potencial uso de extractos vegetales con alta capacidad antioxidante (100% de inhibición en DPPH a 6,0-0,6 μM EAG), y antimicrobiana (diámetro de halo de inhibición igual o superior a 15 mm con extractos a 4mg/L), como conservantes en productos cosméticos.

Los extractos seleccionados e incorporados a los productos cosméticos fueron lo siguientes: 1.-Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con MeOH 100%, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII región de Chile, 2.-Extracto de hojas de Aristotelia chilensis, obtenido con 60% EtOH-40% H2O, colectadas en marzo, 2006 en la VIII región de Chile, 3.-Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con 40% MeOH-60% H2O, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII región de Chile y 4.- Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con H2O 100%, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII región de Chile (Tabla 1).

El contenido de fenoles totales de los extractos seleccionados se observa en la Tabla 1. Se observó un alto contenido de fenoles totales en el extracto hidroalcohólico de Aristotelia chilensis, y fue aún mayor en el extracto hidroalcohólico de Ugni molinae, esto indica la naturaleza química de las moléculas fenólicas que contienen las hojas de estas especies. Este resultado no tiene relación con el

rendimiento de los extractos, que fue mayor en el extracto metanólico de Ugni molinae, simplemente los fenoles totales indican los compuestos fenólicos solubles en los solventes de extracción y no tiene relación con el rendimiento. Tampoco se observó variación en la capacidad antioxidante, puesto que todos los extractos desarrollaron un 100% de capacidad antioxidante en las concentraciones estudiadas (6,0-0,6 μM) EAG. Si hubo diferencia con respecto al diámetro del halo de inhibición de crecimiento bacteriano, por lo tanto este fue el parámetro que condicionó la selección.

El extracto de las hojas de la especie Ugni molinae colectadas en la VIII región en diciembre del 2005, fue el que obtuvo la mejor actividad antimicrobiana.

De los productos elaborados, en ninguno se observó desarrollo bacteriano ni fúngico, y el índice de peróxido fue negativo, los productos mantuvieron sus propiedades físicoquímicas y sensoriales durante los 6 meses de observación en las condiciones ensayadas.

En los controles que contenían parabenos y antioxidantes sintéticos, no se observaron cambios significativos en las propiedades estudiadas, durante los 6 meses. En los controles que no contenían extractos, parabenos ni antioxidantes sintéticos se observaron cambios en el color, olor y se desarrollaron bacterias ambientales (Tabla 2).

Tabla 1. Extractos seleccionados; características de extracción, contenido en fenoles totales, capacidad antioxidante y antimicrobiana.

Muestra Especie

(Mes Colecta / Región)

Solvente extracción

m/s Rendimiento (%)

Fenoles Totales

(M EAG)

Halo de Inhibición (Ø ± 1 mm)

Ps. Enter. St. Can

Especie

U. molinae

(Dic / VIII)

MeOH 100%

MeOH 60%- H2O 40%

H2O 100%

6/1

6/1

6/1

37,9

16,3

11,4

0,031

0,035

0,032

25 21 23 25

25 21 21 20

28 25 20 25

A. chilensis

(Mar / VIII)

EtOH 60%- H2O 40%

6/1 5,9 0,040 24 26 19 20

m/s: relación masa-solvente; Fenoles totales (M EAG): Fenoles totales en concentración Molar equivalentes a ácido gálico; Bacterias: Ps.: Pseudomona aeruginosa. Enter.: Enterobacter aerogenes. St.: Staphylococcus aureus. Hongos: Can: Candida albicans; Rendimiento (%) Gramos de extracto por 100 g de planta seca

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La eficacia como preservantes y antioxidantes de los extractos seleccionados abre una nueva perspectiva no sólo a la industria cosmética, sino a toda aquella que requiera de preservantes y antioxidantes de origen vegetal. La coloración característica de cada extracto seleccionado, en un futuro puede ser modificada, sin alterar sus propiedades antioxidantes y antimicrobianas, pensando en desarrollar materias primas que no afecten la fórmula final.

La capacidad antioxidante no fue determinante en la selección de extractos a incorporarlos en las formulaciones, puesto que, todos los extractos mostraron una capacidad del 100%, por lo tanto, la selección se basó en los estudios microbiológicos.

Los microorganismos fueron seleccionados debido a la resistencia antibiótica que han desarrollado a través del tiempo y a las infecciones intrahospitalarias que causan, pero sobre todo porque

un requisito para la venta al público de una formulación cosmética es ausencia absoluta de patógenos. La actividad microbiológica observada es determinante, puesto que los agentes microbiológicos expuestos a los extractos son altamente patógenos, sobre todo Pseudomona aeruginosa, que es un microorganismo que crece en condiciones adversas, siendo muy difícil el inhibir su desarrollo. Los extractos seleccionados mostraron una actividad antimicrobiana equivalente a un halo de inhibición superior a 20 mm.

La actividad de los extractos seleccionados frente a Candida albicans, muestran una potente actividad antifúngica, resultado que enriquece las posibilidades de los extractos seleccionados como antimicrobianos.

Estas propiedades biológicas se deben principalmente a la composición fenólica de los extractos estudiados (Avello et al., 2008; 2008a).

Tabla 2. Estabilidad sensorial, físicoquímica y microbiológica de productos cosméticos, durante el período de estudio (6 meses, Jun a Dic).

Producto Condiciones Almacenamiento

Parámetros Fisicoquímicos c o t pH sf pp

Rancidez Microbiológico

Crema O/W Control Parabenos Antioxidante Sintético

Normales Luz Oscuridad Frío

Estables Negativo Negativo

Crema O/W Control sin Parabenos ni Antioxidantes Sintéticos

Normales Luz Oscuridad Frío

Δ Δ Estables Δ Δ Estables Δ Δ Estables Δ Δ Estables

Negativo Contaminación Ambiental

Crema O/W Extracto U. molinae MeOH 100%

Normales Luz Oscuridad Frío

Estables Negativo Negativo

Crema O/W Extracto U. molinae MeOH 60%-H2O 40%

Normales Luz Oscuridad Frío

Estables Negativo Negativo

Crema O/W Extracto U. molinae H2O 100%

Normales Luz Oscuridad Frío

Estables Negativo Negativo

Crema O/W Extracto A. chilensis EtOH 60%- H2O 40%

Normales Luz Oscuridad Frío

Estables Negativo Negativo

Parámetros Físicoquímicos: Δ: cambios; c : Color ; o: Olor; t : Textura; sf : Separación de Fases ; pp: Formación de Precipitado

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La importante actividad antimicrobiana se proyecta también a la industria farmacéutica, puesto que los antibacterianos convencionales presentan efectos adversos considerables, además la eficiente actividad frente a Pseudomona aeruginosa es de especial interés, porque muchos enfermos crónicos (diabéticos) y otros afectados (quemados) desarrollan infecciones recurrentes con esta bacteria que es multiresistente a estos agentes sintéticos.

Los extractos, según nuestro estudio, pueden clasificarse como antibacterianos de amplio espectro, puesto que hipotéticamente, si se tuvieran que controlar estas bacterias en su conjunto, se deben combinar antibacterianos sintéticos o hemisintéticos específicos. En el caso de los extractos seleccionados evitarían el desarrollo y consecuencias de las cepas estudiadas.

La fórmula escogida, es rica en materia lipídica, y agua, medios de cultivo para microorganismos y muy susceptibles a la oxidación. El estudio de estabilidad mostró la capacidad de los extractos para conservar la fórmula en diversas condiciones, siendo el extracto más potente el obtenido con 100% H2O. Esto considera, también, aspectos ambientales, como por ejemplo, minimizar el uso de solventes.

Los preservantes utilizados en formulaciones cosméticas, tomando como referencia los más cuestionados (parabenos), son de amplio espectro y su actividad antimicrobiana frente a estos agentes es comparable a la de los extractos seleccionados.

Por lo tanto, los extractos de las especies en estudio son comparables a productos preservantes y antioxidantes comerciales para formulaciones cosméticas.

CONCLUSIONES

La Los extractos de hojas de Ugni molinae (obtenidos con MeOH 100%, 60%, y H2O 100%) y de Aristotelia chilensis (obtenido con 60% EtOH) agregados como preservantes y antioxidantes mantuvieron las características sensoriales y fisicoquímicas de una formulación cosmética altamente lipídica demostrando su potencial como aditivos naturales de aplicación cosmética.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el financiamiento a la Dirección de Investigación (Proyecto Interno DIUC 207.074.038), a la Dirección de Post grado y al Proyecto a Anillo PBCT ADI-38, de la Universidad de Concepción.

REFERENCIAS Avello M, Pastene E. 2005. Actividad antioxidante de

infusos de Ugni molinae Turcz. (murtilla). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 4(2):33–39.

Avello M, Valladares R, Ordóñez JL. 2008. Capacidad antioxidante de Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz. Rev Cubana Plant Med 13(4).

Avello M, Valdivia R, Mondaca MA, Ordóñez JL, Bittner M, Becerra J. 2008a. Actividad de Ugni molinae Turcz. frente a microorganismos de importancia clínica. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):141-144.

Darbre PD, Aljarrah A, Miller WR, Coldham NG, Sauer MJ, Pope GS. 2004. Concentrations of paraben in human breast tumors. J Appl Toxicol 24:5-13.

Darbre PD. 2006. Environmental oestrogens, cosmetics and breast cancer. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 20(1):121-143.

Fundación para la Innovación Agraria (FIA) Ministerio de Agricultura, Gobierno de Chile. 2003. Plantas medicinales y aromáticas evaluadas en Chile. FIA. Santiago-Chile, pp. 13-38.

Joyeux M, Mobstein A, Anton R, Mortier F. 1995. Comparative antilipoperoxidant antinecrotic and scavenging properties of terpenes and biflavones from ginkgo and some flavonoids. Planta Med 61:126-129.

Ministerio de Agricultura, Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) Región del Bío-Bío. 2006. Avances en la multiplicación y caracterización de algunas plantas medicinales nativas. SAG. Santiago-Chile, pp. 79-87.

Rondon E, Pacheco E, Ortega F. 2004. Estimación de la vida útil de un análogo comercial de mayonesa utilizando el factor de aceleración Q10. Rev Fac Agron 21(1):68-83.

Rubilar M, Pinelo M, Ihl M, Scheuermann E, Sineiro J, Nuñez MJ. 2006. Murta leaves (Ugni molinae Turcz.) as a source of antioxidant phenols. J Agr Food Chem 54:59-64.

Schrickel S, Bittner M. 2001. La salud en nuestras manos. plantas medicinales en chile, riqueza natural y científica. Editora y Gráfica Lamas, Concepción-Chile, pp. vii-viii.

Singleton VL, Rossi JA. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. AJEV. 16: 144-158.

Soni M, Carabin I, Burdock G. 2005. Safety assessment of esters of p-hydroxybenzoic acid (parabens). Food ChemToxicol 43:985-1015.

Suwalsky M, Orellana P, Avello M, Villena F, Sotomayor C. 2006. Human erythrocytes are affected in vitro by extracts of Ugni molinae leaves. Food ChemToxicol 44:1393–1398.

Suwalsky M, Orellana P, Avello M, Villena F. 2006a. Protective effect of Ugni molinae Turcz against

Page 41: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

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www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 486

oxidative damage of human erythrocytes. Food Chem Toxicol 45:130–145.

Suwalsky M, Vargas P, Avello M, Villena F, Sotomayor C. 2008. Human erythrocytes are affected in vitro by flavonoids of Aristotelia chilensis (Maqui) leaves. Int J Pharm 363:85-90.

Terasaka S, Inoue A, Tanji M, Kiyama R. 2006. Expresión profiling of estrogen-responsive genes in breast cancer

cells treated with alkylphenols, chlorinated phenols, parabens or bis- and benzoylphenols for evaluation of estrogenic activity. Toxicol Lett 163:130-141.

Velioglu Y, Mazza G, Gao L, Oomah B. 1998. Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables and grain products. J Agr Food Chem 46:4113-4117.

Page 42: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

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BLACPMA ISSN 0717 7917 Artículo Original | Original Article

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Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation

[Propiedades antioxidantes de Rosmarinus officinalis y sus efectos sobre la biotransformación de xenobióticos] María E. LETELIER, Araceli TERÁN, Marcela A. BARRA, Paula ARACENA-PARKS

Laboratory of Pharmacology, Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, Chemical and Pharmaceutical Sciences School, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

Abstract

Rosmarinus officinalis (rosemary) extracts display antioxidant properties mainly due to the presence of polyphenols. These properties have yet to be systematically studied in biological systems. In this study, we used rat liver microsomes to evaluate the antioxidant capacity of a dry extract from rosemary leaves. Noteworthy, compounds occurring in herbal extracts are xenobiotics to animals, thus mainly biotransformed in the hepatic endoplasmic reticulum. Thus, we also studied the ability of this extract to inhibit different xenobiotics biotransformation pathways. The rosemary extract prevented all tested oxidative processes that were evaluated in rat liver microsomes. It also inhibited the activities of: 1) UDP-glucuronyltransferase; 2) microsomal GSH-transferase; and 3) cytochrome P450 system (N-demethylating activity). Our results indicate that herbal extracts, in addition to act as antioxidants, display a significant interaction with the metabolism of xenobiotics and/or endogenous compounds. Considerations about such interaction are discussed.

Keywords: Rosmarinus officinalis; Rosemary; Herbal antioxidant; Cu2+/ascorbate; Oxidative stress; Cytochrome P450 system; UDP-glucuronyltransferase; GSH-transferase.

Resumen

Extractos de Rosmarinus officinalis (romero) presentan propiedades antioxidantes debido, principalmente, a la presencia de polifenoles. Dichas propiedades no han sido sistemáticamente estudiadas en sistemas biológicos. En el presente estudio, utilizamos microsomas de hígado de rata para evaluar la actividad antioxidante de un extracto seco de hojas de romero. Cabe destacar que los compuestos presentes en preparados herbales son xenobióticos para los animales, por lo que son biotransformados principalmente en el retículo endoplásmico hepático. Por ello, también estudiamos la capacidad de este extracto para inhibir diferentes vías de biotransformación de xenobióticos. El extracto de romero protegió todos los procesos oxidativos que fueron evaluados en microsomas hepáticos de rata. Éste también inhibió las actividades de: 1) UDP-glucuroniltransferasa; 2) GSH-transferasa microsómica; y 3) el sistema citocromo P450 (actividad N-desmetilante). Nuestros resultados indican que los extractos herbales, además de comportarse como antioxidantes, pueden interaccionar significativamente con el metabolismo de xenobióticos y/o compuestos endógenos. Consideraciones acerca de dicha interacción son sometidas a discusión.

Palabras Clave: Rosmarinus officinalis; Romero; Antioxidantes; Cu2+/ascorbato; Estrés oxidativo; Sistema citocromo P450; UDP-glucuroniltransferasa; GSH-transferasa.

ABBREVIATIONS: ABTS, 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate); CYP450, cytochrome P450; DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; G-6-P, glucose—phosphate; GST, glutathione S-transferase; ROS, reactive oxygen species; UDPGT, UDP-glucuronyltransferase. Recibido | Received: March 2, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: May 12, 2009. Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009. Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was not financially supported This article must be cited as: María E. Letelier, Araceli Terán, Marcela A. Barra, Paula Aracena-Parks. 2009. Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on

xenobiotic biotransformation. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):487 – 497. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: María Eugenia Letelier, M.Sc., Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, School of Chemical and Pharmaceutical Sciences, Universidad de Chile. Olivos 1007, Independencia, Santiago, Chile. Phone: 56-2-9782885. Fax: 56-2-9782912. E-mail address: [email protected]

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INTRODUCTION

All aerobic organisms generate reactive oxygen species (ROS) as part of highly regulated enzymes and as a by-product of oxygen metabolism. ROS, which include superoxide anion, hydroxyl radical, and hydrogen peroxide, are highly reactive species capable to oxidize biological molecules, such as lipids, proteins, and nucleic acids (Droge, 2002). Thus, several antioxidant mechanisms have evolved to prevent oxidative damage to cells. This antioxidant capacity includes non-enzymatic and enzymatic mechanisms (Benzie, 2000). GSH and vitamin E are classical examples of the non-enzymatic antioxidant mechanism, as these molecules act as free radical scavengers (Evstigneeva et al.,, 1998; Elias et al., 2008). The enzymatic antioxidant system of cells includes enzymes that catalyze the reduction of ROS, and include superoxide dismutase and catalase (Elias et al., 2008). GSH also plays a role in this system, as a cofactor of GSH-peroxidase. When ROS generation overwhelms the cell’s antioxidant capacity, oxidative stress is ensued. Oxidative stress can lead to cell damage and ultimately cell death (Halliwell and Gutteridge, 1988). During oxidative stress, some enzymes that are involved in drug metabolism, such as GSH-transferases (GSTs), can also act as antioxidants, through the metabolism of highly electrophilic and lipophilic compounds (van der Aar et al., 1996). In addition, some GSTs occurring in the endoplasmic reticulum also display peroxidase activity (Mosialou and Morgenstern, 1989). An increase in the expression of such enzymes has been also described during oxidative stress (Pinkus et al., 1996; Mari and Cederbaum, 2001).

Increasing evidence has demonstrated that compounds occurring in plants have antioxidant capacity, mainly in virtue of their ability to scavenge free radicals (Masella et al., 2005). Systematic studies on the antioxidant capacity of total herbal extracts are missing. This is mainly due to the purification of specific compounds from extracts and assessment of their free radical scavenging properties using synthetic radicals such as 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) y 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) (Antolovich et al., 2002). Isolation of compounds from herbal extracts allows the study and understanding of the antioxidant properties of these specific substances. Such studies, however, may

overlook the potential synergy and/or additive antioxidant effects that the various molecules occurring in the whole extract exert through different mechanisms. On the other hand, synthetic free radicals are useful for the rapid screening of the antioxidant capacities of herbal extracts or isolated compounds. These free radicals display redox mechanisms that are very different from those of oxygen free radicals, which are the oxidants occurring in biological systems. Therefore, the use of such technique may not reflect a true biological antioxidant capacity of herbal compounds (Letelier et al., 2008).

By definition, all herbal antioxidant substances are xenobiotics for mammals. Therefore, they are metabolized through the drug-metabolizing pathways, occurring mainly in the endoplasmic reticulum of liver cells. The enzymatic systems of such pathways include the cytochrome P450 (CYP450) system (Kramer and Tracy, 2008), UDP-glucuronyltransferase (UDPGT) (Tephly and Burchell, 1990), and microsomal GST (Rinaldi et al., 2002). Thus, all herbal antioxidant substances, depending on their physicochemical properties, are likely to behave as competitive inhibitors of these enzymatic systems with respect to their activity towards endogenous compounds and drugs. Noteworthy, CYP450 is the main contributor of oxidative stress in the endoplasmic reticulum, because it catalyzes the generation of highly electrophilic metabolites and also directly releases ROS when uncoupled (James et al., 2003; Shimada, 2006). Thus, herbal compounds may display and additional antioxidant mechanism by inhibiting CYP450 (Johnson, 2008).

Rosmarinus officinalis (rosemary) belongs to the Lamiaceae family, constituted by numerous medicinal plant species. Rosemary can be found in the Mediterranean basin of south Europe, north of Africa and southwest Asia. This plant is produced mainly in Spain, Tunisia, Morocco, and to a lesser extent, Portugal, Turkey and India. Rosemary can also be found in Chile, between the V and IX regions. Although mainly used as a condiment, several therapeutic actions are attributed to rosemary, including antimicrobial, antispasmodic, hypertensive and sedative activities (Simon et al., 1984). Antioxidant properties of plants are thought to be mainly due to polyphenols occurring in all herbal extracts (i.e. flavonoids, flavones, flavonols, anthocyanines, etc.) that are scavengers of ROS

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(Middleton et al., 2000). Alcoholic extracts from rosemary leaves, stems and flowers display antioxidant properties (Pathak et al., 1991; Cañigueral et al., 1998). These extracts are enriched in polyphenols, such as carnosol, rosmanol, carnosic acid, and rosmarinic acid (del Bano et al, 2003; Moreno et al, 2006).

In the present study, we first evaluated the antioxidant properties of a dry extract of rosemary leaves, in terms of protecting rat liver microsomes lipids, thiol-containing proteins, and UDPGT activity from damage induced by Cu2+/ascorbate, a ROS generating system. We compared the biological antioxidant activity of this extract with its free radical scavenging activity using DPPH. In addition, we evaluated the potential inhibitory effect of this extract on the activities of the CYP450 system, UDPGT, and microsomal GST. When evaluated separately, the rosemary extract behaved as an antioxidant and as an inhibitor of the tested enzymatic activities. When evaluated simultaneously, however, we found that the extract displayed a lower inhibitory effect, giving precedence to its antioxidant activity. The significance of these results on the potential toxicity of herbal extracts through the inhibition they exert on drug-metabolizing enzymes is discussed.

MATERIAL AND METHODS

Chemicals 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), GSH,

p-Nitrophenol (PNP), UDP-glucuronic acid (UDPGA), p-Nitroanisole (PNA), Aminopyrine, NADP, glucose-6-phosphate (G-6-P), glucose-6-phosphate dehydrogenase, Tris-HCl, and bovine albumin (Fraction IV) were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Trichloroacetic acid (TCA), thiobarbituric acid (TBA), sodium ascorbate, FeCl3, CuSO4, MgCl2, and Folin-Ciocalteu’s reagent were purchased from Merck Co. Chile. 1-chloro-2,4-dinitrobenzene was purchased from ACROS Organics (New Jersey, NJ, USA). Other chemicals were of analytical grade. Dry extract of Rosmarinus officinalis leaves (vegetable drug) was graciously provided by Laboratorios Ximena Polanco (Santiago, Chile), along with proprietary information regarding yield. Stocks of this dry extract (0.2 to 1 mg/mL) were prepared in a mixture of water: ethanol (1:1) the same day of the experiments.

Animals Adult male Sprague Dawley rats (200-250 g),

maintained at the vivarium of the School of Chemical and Pharmaceutical Sciences (Universidad de Chile, Santiago, Chile) were used. Rats were allowed free access to pelleted food, maintained with controlled temperature (22ºC) and photoperiod (lights on from 07:00 to 19:00 h). All procedures were performed using protocols approved by the Institutional Ethical Committee of the School of Chemical and Pharmaceutical Sciences, Universidad de Chile, and according to the guidelines of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NRC, USA).

Isolation of rat liver microsomes Microsomal fraction was prepared according to

Letelier et al. (2005). Rats were fasted for 15 h with water ad libitum, and sacrificed by decapitation. Livers were perfused in situ with 4 volumes of 25 ml 0.9 % W/V NaCl, excised, and placed on ice. All homogenization and fractionation procedures were performed at 4ºC and all centrifugations were performed using either a Suprafuge 22 Heraeus centrifuge or an XL-90 Beckmann ultracentrifuge. Liver tissue (9 -11 g wet weight), devoid of connective and vascular tissue, was homogenized with five volumes of 0.154 M KCl, with eight strokes in a Dounce Wheaton B homogenizer. Homogenates were centrifuged at 9,000xg for 15 min and sediments were discarded. Supernatants were then centrifuged at 105,000xg for 60 min. Pellets (microsomes) were stored at -80ºC until use. Protein determinations were performed according to Lowry et al. (1951).

Determination of polyphenols Polyphenols were determined by the method

described by Letelier et al. (2008). Fifty μL herbal extract were mixed with 250 μL Folin Ciocalteau reagent, 750 μL 20% w/v sodium carbonate and distilled water to a final volume of 5 mL. Blanks contained all reagents other than herbal extract. Reaction mixtures were then incubated for 2 h protected from light. Afterwards, the absorbance of the samples was determined at 760 nm in a UV3 Unicam UV–VIS spectrophotometer, using their respective blanks as reference. Catechin, a polyphenol compound, was used as a reference standard. Results were expressed as nmol catechin/μg rosemary extract.

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Determination of DPPH bleaching activity This assay was determined according to Letelier et

al. (2008). In a final volume of 1 mL, increasing concentrations of rosemary extract were mixed with 20 μg/mL of DPPH. Fresh DPPH stock solutions were prepared in ethanol. Blanks contained herbal extract and vehicle. DPPH bleaching activity of all mixtures was recorded continuously at 37 ºC for 20 min at 517 nm in a UV3 Unicam UV-VIS Spectrophotometer. Reaction rates were determined in conditions where product formation was linearly dependent with time.

Microsomal lipid peroxidation assay The extent of lipid peroxidation following pre-

treatment of microsomes with Cu2+/ascorbate was estimated assaying thiobarbituric acid reactive species (TBARS), according to Letelier et al. (2005). Mixtures (1 mL final volume) contained 1 mg/mL microsomal protein, 25 nM CuSO4, 1 mM sodium ascorbate in 50 mM phosphate buffer, pH 7.4. Blanks contained all the reagents but microsomal protein. Blanks and samples were incubated for 20 min at 37°C with constant agitation. TBARS were calculated using the ε532=156/mM/cm and expressed as Data are presented as nmol TBARS/min/mg protein.

Determination of microsomal thiol content Thiol groups were titrated with DTNB as

described by Letelier et al. (2005). Microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with 25 ηM CuSO4, 1 mM sodium ascorbate in 50 mM phosphate buffer, pH 7.4. Blanks contained all reagents but microsomal protein. Blanks and samples were incubated for 30 min at 37 °C with constant agitation. Afterwards, microsomal thiol content was titrated with 0.6 mM DTNB. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate prior determination of the microsomal thiol content. Thiol concentration was estimated on the basis of the equimolar apparition of 5-thio-2-nitrobenzoic acid (ε410=13,600/M/cm) and is presented as nmol thiols/min/mg protein.

Assay of UDPGT activity p-nitrophenol conjugation with UDPGA, reaction

catalyzed by UDPGT was assayed according to Letelier et al. (2007). Activity was assayed by

determining the remaining p-nitrophenol after 15 min incubation of microsomes (2 mg protein/mL) in the following conditions: 0.5 mM p-nitrophenol, 2 mM UDPGA, 4 mM MgCl2, in 100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5. Blanks were assayed in the absence of UDPGA. Reactions were stopped by addition of TCA to 5% (W/V) final concentration; samples were then centrifuged at 10,000g for 10 min in a Suprafuge 22 Heraeus centrifuge and supernatants were collected. NaOH was added to the supernatants to final 0.5 M. Reaction rates were determined in conditions where product formation was linearly-dependent to time and protein concentration. To calculate UDPGT activity, a standard curve of p-nitrophenol was generated. To evaluate the antioxidant effect of herbal extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate before determining UDPGT activity. Data are presented as nmol conjugate/min/mg protein.

Assay of GST activity Conjugation of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene,

reaction catalyzed by GST, was assayed according Letelier et al.(2006). The reaction mixture contained 0.1 mg/mL microsomal protein, 1 mM 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, and 4 mM GSH in 100 mM phosphate buffer, pH 6.5. Blanks were assayed in the absence of GSH. Apparition of the conjugated product was continuously recorded for 3 min at 25ºC, at 340 nm in a UV3 Unicam UV-VIS spectrophotometer. To calculate GST activity, the ε340=9.6 mM/cm of the conjugate was used. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate before determining GST activity. Data are presented as µmol conjugate/min/mg protein.

Assay of the CYP450 system activity Activity of the CYP450 system was assayed as the

N-demethylating activity on Aminopyrine, according to Letelier et al. (1985). The reaction mixture contained microsomes (1 mg protein/mL), 5 mM aminopyrine, 3.5 mM MgCl2, 0.1 M G-6-P, 10 mM NADP, 5 Units/mL G-6-P dehydrogenase, in 35 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0. Blank contained all reagents but G-6-P dehydrogenase. All mixtures were incubated for 15 min at 37 ºC. Reactions were stopped by addition of TCA to 5% (W/V) final concentration; samples were then centrifuged at 10,000g for 10 min in a Suprafuge 22 Heraeus

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Letelier et al. Antioxidant properties and xenobiotic biotransformation of Rosmarinus officinalis

centrifuge and supernatants were collected. To develop the colorimetric reaction, 0.5 mL of a mixture of 0.1 mL of 2,4-pentanodione and 25 mL of 4 M ammonium acetate was added to 1 mL of supernatant and mixtures were incubated for 2 h protected from light. Absorbance of samples was then determined at 400 nm in a UV3 Unicam UV–VIS spectrophotometer, using their respective blanks as reference. To calculate the N-demethylating activity of the CYP450 system, a standard curve of formaldehyde was generated. Reaction rates were determined in conditions where product formation was linearly-dependent to time and protein concentration. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate before determining this activity.

Generation of the CYP450 monooxygenase spectrum

CYP450 monooxygenase spectrum was obtained according to Omura and Sato (Omura and Sato, 1964). This method uses the ability of the carbon monoxide to coordinate with the heme group of the monooxygenase; the resulting conjugate has a peak of maximum absorbance at 450 nm (ε=91/mM/cm. The reaction mixture (blank and sample) contained 1 mg/mL microsomal protein, 5 mM sodium dithionite and 50 mM phosphate buffer, pH 7.4. The spectrum was generated following addition of carbon monoxide to the sample in a UV3 Unicam UV–VIS spectrophotometer. To assess the possible interaction of compounds occurring in the rosemary extract with the CYP450 monooxygenase, 28 µg of extract were added to microsomes prior or after the addition of sodium dithionite. A decrease in the absorbance at 450 nm of the CYP450 monooxygenase when incubated with the rosemary extract was interpreted as an interaction.

Statistical analysis Data presented correspond to the mean of at least

4 independent experiments ± SEM. Statistical significance (ANOVA) and regression analyses were performed using Graph Pad Prism 5.0. Differences were considered as significant when p<0.05.

RESULTS

Antioxidant capacity of Rosmarinus officinalis We first studied the antioxidant properties of

an aqueous solution of a dry extract from rosemary leaves. As an initial test, we determined the content of polyphenols of this aqueous preparation, as detailed in Materials and Methods. We obtained detectable values of polyphenols content, equivalent to 0.53 ± 0.009 (n=4) µmol of catechin/mg extract or 87.9 ± 1.53 μmol of catechin/g vegetable drug. Thus, most likely the rosemary extract used will display antioxidant properties.

DPPH bleaching is a common measure of antioxidant capacity of herbal extracts. As depicted in Fig. 1, rosemary extract induced DPPH bleaching, in a concentration-dependent manner. The dependence with concentration followed a semi-logarithmic curve (r=0.983). From the semi-logarithmic regression, we calculated that 19.02 ± 0.87 µg extract/mL (n=4) elicited the half-maximum bleaching effect on DPPH in the conditions tested (see Materials and Methods). Figure 1. Effect of the rosemary extract on DPPH bleaching.

The dry extract from rosemary leaves was dissolved in H2O: ethanol (1:1) to 0.2 mg/mL and DPPH was dissolved in ethanol. The DPPH bleaching assay was performed as detailed in Material and Methods. Data are plotted as the mean ± SEM (n>4) of DPPH in ΔAbs517/20min in a semi-logarithmic scale against the extract concentration. The IC50 value was calculated from the dose-response inhibition regression using the log [extract] (r=0.983).

As expected, the rosemary extract used in our

study displayed antioxidant capacity as measured by the DPPH method. In our experience, this antioxidant capacity must be validated with biological systems to allow conclusion regarding the overall antioxidant properties of any herbal extract (Letelier et al., 2008).

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For this purpose, we used rat liver microsomes as a biological system and Cu2+/ascorbate as a ROS generating system. We tested the antioxidant capacity of the rosemary extract, as its ability to prevent several oxidative consequences of ROS generation by the Cu2+/ascorbate system: 1) lipid and thiol oxidation, 2) oxidative activation of UDPGT activity, and 3) oxidative changes on the CYP450 monooxygenase.

Effect of rosemary extract on microsomal lipid

peroxidation Incubation of rat liver microsomes with

Cu2+/ascorbate led to the generation of 2.36 ± 0.018 nmol TBARS/min/mg protein (n=4). As depicted in Fig. 2, pre-incubation of microsomes with rosemary extract prevented this lipoperoxidative effect in a linear-dependent manner (r=0.999), with an IC50 value of 5.63 μg extract/mg protein.

Figure 2. Effect of the rosemary extract on microsomal lipid peroxidation elicited by Cu2+/ascorbate.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; lipid peroxidation was assayed as TBARS generation, as described in Materials and Methods. Data are presented as % lipid peroxidation using untreated microsomes as control (2.36 ± 0.018 nmol TBARS/min/mg protein, n=4) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. The IC50 value was obtained from the linear regression of the data (r=0.999).

Effect of rosemary extract on microsomal thiol

oxidation Thiol groups occurring in the lateral chain of

proteins are reactive to oxidation by ROS, likely leading to structural changes in proteins that are

reflected in functional changes. Thus, titration of thiol groups in biological samples can be used as a marker for oxidative damage in proteins. Incubation of microsomes with Cu2+/ascorbate decreased the microsomal thiol content from 28.4 ± 0.12 to 19.4 ± 0.23 nmol thiol/mg protein (about 30%, n=4). As shown in Fig. 3, pre-incubation with the rosemary extract prevented the thiol loss in a linear-dependent manner (r=0.994), with an IC50 value of 13.05 µg extract/mg protein.

Figure 3. Effect of the rosemary extract on the microsomal thiol content loss elicited by Cu2+/ascorbate.

Microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; thiol groups were titrated with DTNB according to Material and Methods. Data are presented as % residual thiols using untreated microsomes as control (28.4 ± 0.12 nmol thiol/mg protein, n=4) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. The IC50 value was obtained from the linear regression of the data (r=0.994).

Effect of rosemary extract on the oxidative

damage of CYP450 monooxygenase The Cu2+/ascorbate system causes conformational

changes on the CYP450 monooxygenase, which are reflected as a loss in the characteristic absorbance at 450 nm of the protein conjugate with carbon monoxide (see Materials and Methods). As shown in Fig. 4, Cu2+/ascorbate led to a progressive loss of this absorbance in time, effect that was completely abolished when pre-incubating microsomes with the rosemary extract.

Effect of rosemary extract on the oxidative

activation of the UDPGT activity UDPGT is a microsomal enzyme that becomes

activated by the Cu2+/ascorbate system (Letelier et al., 2007). Indeed, incubation of microsomes with

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this system elicited the increase in the UDPGT activity, in terms of p-Nitrophenol conjugation, from 12.57 ± 0.30 to 26.6 ± 0.16 nmol conjugate/min/mg protein (~2-fold, n=4). As depicted in Fig. 5, pre-incubation of microsomes with low concentrations of rosemary extract (up to 28 µg extract/mg protein) prevented the UDPGT activation in a concentration-dependent manner. Remarkably, higher concentrations of rosemary extract (56 and 112 µg extract/mg protein) elicited inhibition of the UDPGT activity compared with the untreated control without Cu2+/ascorbate. This is suggestive of additional non-oxidative mechanisms taking place under the conditions tested. It is possible that the polyphenols occurring in the rosemary extract may be inhibiting this enzymatic activity by competing with its substrate p-nitrophenol. In agreement to this postulate, pre-incubation of microsomes with increasing concentrations of rosemary extract, in the absence of Cu2+/ascorbate, inhibited the conjugation of p-nitrophenol in a linear-dependent manner (r=0.999), as shown in Fig. 6.

Figure 4. Effect of the rosemary extract on the changes of UDPGT activity elicited by Cu2+/ascorbate.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; UDPGT activity was assayed using p-Nitrophenol as substrate and UDPGA, as detailed in Materials and Methods. Data are presented as fold UDPGT activity change in a semi-logarithmic plot, using untreated microsomes as control (12.57 ± 0.30 nmol conjugate/min/mg protein, n=4, dotted line) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. The solid line depicts the dose-response inhibition regression using the log [extract] (r=0.998).

Figure 5. Effect of the rosemary extract on the CYP450 monooxygenase content loss elicited by Cu2+/ascorbate.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; CYP450 monooxygenase content was assayed as described in Materials and Methods. Data are presented as a time plot of the % residual CYP450 mono-oxygenase content using the initial Abs450 as 100%, and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. Closed circles: control (without incubation with rosemary extract) and closed squares: microsomes pre-incubated with rosemary extract.

Figure 6. Effect of the rosemary extract on UDPGT activity.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract and UDPGT activity was assayed using p-Nitrophenol as substrate and UDPGA, according to Materials and Methods. Data are presented as % residual UDPGT activity using untreated microsomes as control (12.57 ± 0.30 nmol conjugate/min/mg protein, n=4) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. The solid line depicts the linear regression of the data (r=0.999).

Effects of Rosmarinus officinalis on the drug-metabolism pathway

The inhibition of UDPGT activity when microsomes are pre-incubated with rosemary extract

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in the absence of Cu2+/ascorbate (Fig. 6) is in agreement with the idea that polyphenols from this extract may behave as xenobiotic compounds. As such, they would be a substrate of drug-metabolizing enzymes occurring in rat liver microsomes, including UDPGT, explaining the inhibitory effect on the conjugation of p-nitrophenol. If this postulate is correct, then rosemary extract should also behave as an inhibitor of other drug-metabolizing enzymes, decreasing the activities of GST and/or the CYP450 system. Therefore, we studied the effect of the rosemary extract on: 1) the conjugation of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene with GSH, reaction catalyzed by GST, and 2) N-demethylation of aminopyrine reaction catalyzed by the CYP450 system.

Effect of rosemary extract on GST activity GST isoenzymes, along with UDPGT, catalyze

reactions of conjugation of xenobiotics (Phase II). GSTs catalyze the conjugation of lipophilic and highly electrophilic compounds with GSH. We assayed the microsomal GST activity using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene as a substrate, with a control value of 1.12 ± 0.003 µmol conjugate/min/mg protein (n=4). As shown in Fig. 7, re-incubation of microsomes with increasing concentrations of rosemary extract led to inhibition of microsomal GST activity, in a concentration-dependent manner. These data are in agreement with the rosemary extract potentially behaving as a competitor of the conjugation of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene with GSH by microsomal GST.

Effect of the rosemary extract on the N-

demethylation of Aminopyrine by the CYP450 system

The CYP450 system catalyzes the oxidation of lipophilic compounds (Phase I). We assayed the N-demethylation activity of the CYP450 on Aminopyrine, and obtained a control value of 39.02 ± 0.53 nmol product/min/mg protein (n=8). As depicted in Fig. 8, pre-incubation of microsomes with rosemary extract slightly inhibited this activity. As observed with GST, these data are in agreement with the idea that the rosemary extract may act as a competitor of the CYP450 system metabolism.

Figure 7. Effect of the rosemary extract on microsomal GST activity.

Rat liver microsomes (0.1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract and GST activity was assayed using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene as substrate and GSH, according to Materials and Methods. Data are presented as residual GST activity (in µmol conjugate/min/mg protein) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. * p<0.05 compared to control (one-way ANOVA).

As indicated above (Materials and Methods), to

measure the structural changes of the CYP450 monooxygenase, microsomes are treated with sodium dithionite to reduce the heme group to a Fe2+ form. In this condition, the Fe2+ is able to react with carbon monoxide, and the product displays a characteristic and classical peak of absorbance at 450 nm (Omura and Sato, 1964). Substrates of the CYP450 system bind, as a first step, to the heme group of the CYP450 monooxygenase in the Fe3+ form. If the rosemary extract is competing CYP450 system substrates, pre-incubation of microsomes with this extract before reduction and formation of the CYP450 mono-oxygenase-CO complex should lead to a loss in the absorbance at 450 nm. The non-specific binding of rosemary extract compounds to the membrane was assessed by performing this assay incubating micro-somes with this extract after reduction and formation of the CYP450-CO complex. Thus, the difference in the absorbance loss (Fig. 9, inset) will correspond to the specific binding. As shown in Fig. 9, both conditions led to a decrease in the absorbance at 450 nm, but this decrease was partially prevented by reduction and formation of the CYP450 mono-oxygenase-CO complex prior to incubation with the extract.

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Figure 8. Effect of the rosemary extract on the N-demethylating activity of the CYP450 system.

Figure 9. Effect of the rosemary extract on the CYP450 monooxygenase content.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract and the N-demethylating activity of the CYP450 system was assayed using Aminopyrine as substrate and a NADPH-generating system, according to Materials and Methods. Data are presented as residual CYP450 activity (in nmol product/min/mg protein) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. * p<0.05 compared to control (one-way ANOVA).

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with the rosemary extract prior to (closed circles, total loss) or following (closed squares, nonspecific loss) the reduction of the Fe3+-form of the CYP450 monooxygenase, formation of its complex with carbon monoxide, and measurement of the absorbance at 450 nm, according to Material and Methods. Data are presented as residual CYP450 monooxygenase (in nmol/mg protein) and represent the mean ± SEM of at least 4 independent experiments. The inset depicts the difference calculated between the total and non-specific loss.

These data confirm that there are some molecules occurring in the rosemary extract that are likely competitive inhibitors of the CYP450 system activity.

DISCUSSION

When employing widely accepted methods to study the antioxidant capacity of the rosemary extract used in this study, we detected polyphenols occurring in the hydro-alcoholic solution of the dry extract. In addition, this extract displayed DPPH bleaching activity (Fig. 1). In our experience, the use of DPPH is only useful when screening the relative antioxidant capacity of several herbal extracts or isolated com-pounds. This determination, however, may under-estimate the true antioxidant capacity of compounds in biological systems, since DPPH and oxygen free radicals display different redox mechanisms (Letelier et al., 2008). In agreement with this, the IC50 for the antioxidant activity of the rosemary extract in terms

of microsomal lipid peroxidation and thiol oxidation by the Cu2+/ascorbate system were 4- and 2-fold lower, respectively, than that obtained for the DPPH bleaching assay (Figs. 2 and 3). Moreover, this extract was able to completely prevent the oxidative structural damage on the CYP450 monooxygenase elicited by the Cu2+/ascorbate system (Fig. 4). In summary, the antioxidant capacity of a substance is a property comprising much more than just a free radical scavenging activity. Therefore, we strongly advice a systematic analysis of the antioxidant capacity of herbal extracts/compounds using biological systems, in addition to the screening with synthetic free radicals, such as DPPH or ABTS.

Remarkably, when studying the antioxidant capacity of the rosemary extract in terms of protecting UDPGT from oxidative activation by the Cu2+/ascorbate system (Letelier et al., 2007), we found that the extract inhibited this activity at the highest concentrations tested (Fig. 5). The inhibitory

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property of the rosemary extract on the UDPGT activity, however, gave precedence to its antioxidant capacity. On the other hand, this result suggested that compounds found in the rosemary extract could behave as inhibitors of the drug-metabolizing enzymes occurring in microsomes: UDPGT, microsomal GST and the CYP450 system. A systematic analysis of the concentration-dependent effect of the rosemary extract on reactions catalyzed by each of these enzymes (Figs. 6, 7, and 8) showed the inhibitory properties of the rosemary extract on all reactions tested. This strongly suggested that molecules occurring in this extract, being xenobiotic compounds, are likely to be substrates of these enzymes and, consequently, competitive inhibitors of the reactions these enzymes catalyze. This was further confirmed for the case of the CYP450 system, in which we could detect specific binding of compounds occurring in the herbal extract to the Fe3+-form of the CYP450 monooxygenase (Fig. 9).

Taken together, these findings indicate that the rosemary extract must contain lipophilic substances that are substrates of the CYP450 system. Because this extract is able to inhibit the N-demethylation activity of this system, we postulate that is likely to contain lipophilic substituted amines. Noteworthy, most of the drugs used for the treatment of psychotropic disorders, such as antidepressants and anxiolytic medications, contain substituted amine groups. Therefore, it can be postulated that this rosemary extract may display psychotropic activity. Recently, it has been reported (conference abstract) that the same extract indeed displays antidepressant and anxiolytic activity in rats, mimicking the activities of fluoxetine and diazepam, respectively (Diaz-Veliz et al.,, 2008). Additional research is needed to test our postulates.

In addition to a potential competitive effect of rosemary compounds on N-demethylation by the CYP450 system, there are other possible mechanisms for rosemary extract to have a psychotropic activity, such as the presence of sedative compounds (Gonzalez-Trujano et al, 2007; Machado et al, 2009). In this regard, it has been shown that rosemary extract contain certain polyphenols with sedative activity (Machado et al, 2009). Because polyphenols are biotransformed mainly by UDPGT, we believe it is unlikely these type of compounds can be substrates (and therefore, competitive inhibitors) of the CYP450 system. More research will be required to address if these are exclusive mechanisms or not.

Rosemary is mainly used as a condiment. Our data demonstrate that a dry extract from rosemary leaves displays antioxidant activity in biological systems, as evaluated in rat liver microsomes. Furthermore, compounds occurring in this extract are able to inhibit the drug-metabolizing pathways in a manner that gives precedence to their antioxidant capacity.

CONCLUSION

Our results suggest that the presence of compounds with substituted amine groups in herbal extracts, assessed as their capacity to competitively inhibit the N-demethylating activity of the CYP450 system, is related to a potential psychotropic activity. To the best of our knowledge, this is the first indication of potential psychotropic activity in an herbal extract. We are currently researching this possibility for rosemary and other herbal extracts.

REFERENCES Antolovich M, Prenzler PD, Patsalides E, McDonald S,

Robards K. 2002. Methods for testing antioxidant activity. Analyst 127(1):183-198.

Benzie IF. 2000. Evolution of antioxidant defence mechanisms. Eur J Nutr 39(2):53-61.

Cañigueral S, Vita R, Wichtl M. 1998. Plantas medicinales y drogas vegetales para infusión y tisana. Un manual de base científica para Farmacéuticos y Médicos. Ed. I OEMF International SRL, Milán, Italia. pp. 624.

del Bano MJ, Lorente J, Castillo J, Benavente-Garcia O, del Rio JA, Ortuno A, Quirin KW, Gerard D. 2003. Phenolic diterpenes, flavones, and rosmarinic acid distribution during the development of leaves, flowers, stems, and roots of Rosmarinus officinalis. Antioxidant activity. J Agr Food. Chem 51(15):4247-4253.

Diaz-Veliz G, Vasquez MA, Mora S. 2008. Anxiolytic and antidepressant effects of the hydroalcoholic extract of Rosmarinus officinalis (rosemary) in rats. XVIII Congress of the Latin American Pharmacological Society (Pharmacological Society of Chile, Coquimbo, Chile, 12-16 October) p. 153

Droge W. 2002. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 82(1):47-95.

Elias RJ, Kellerby SS, Decker EA. 2008. Antioxidant activity of proteins and peptides. Crit Rev Food. Sci Nutr 48(5):430-441.

Evstigneeva RP, Volkov IM, Chudinova VV. 1998. Vitamin E as a universal antioxidant and stabilizer of biological membranes. Membr Cell Biol 12(2):151-172.

Gonzalez-Trujano ME, Pena EI, Martinez AL, Moreno J, Guevara-Fefer P, Deciga-Campos M, Lopez-Munoz FJ. 2007. Evaluation of the antinociceptive effect of

Page 52: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Letelier et al. Antioxidant properties and xenobiotic biotransformation of Rosmarinus officinalis

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 497

Masella R, Di Benedetto R, Vari R, Filesi C, Giovannini C. 2005. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes. J Nutr Biochem 16(10):577-586.

Rosmarinus officinalis L. using three different experimental models in rodents. J Ethnopharmacol 111(3):476-482.

Halliwell B, Gutteridge JM. 1988. Free radicals and antioxidant protection: mechanisms and significance in toxicology and disease. Hum Toxicol 7(1):7-13. Middleton E Jr, Kandaswami C, Theoharides TC. 2000.

The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol Rev 52(4):673-751.

James LP, Mayeux PR, Hinson JA. 2003. Acetaminophen-induced hepatotoxicity. Drug Metab Dispos 31(12):1499-1506.

Moreno S, Scheyer T, Romano CS, Vojnov AA. 2006. Antioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition. Free Radical Res 40(2):223-231.

Johnson WW. 2008. Cytochrome P450 inactivation by pharmaceuticals and phytochemicals: therapeutic relevance. Drug Metab. Rev 40(1):101-147.

Kramer MA, Tracy TS. 2008. Studying cytochrome P450 kinetics in drug metabolism. Expert Opin Drug Metab Toxicol 4(5):591-603.

Mosialou E, Morgenstern R. 1989. Activity of rat liver microsomal glutathione transferase toward products of lipid peroxidation and studies of the effect of inhibitors on glutathione-dependent protection against lipid peroxidation. Arch Biochem Biophys 275(1):289-294.

Letelier ME, Del Villar E, Sanchez E. 1985. Drug tolerance and detoxicating enzymes in Octodon degus and Wistar rats. A comparative study. Comp Biochem. Physiol C 80(1):195-198.

Omura T, Sato R. 1964. The Carbon Monoxide-Binding Pigment of Liver Microsomes. I. Evidence for Its Hemoprotein Nature. J Biol Chem 239:2370-2378.

Letelier ME, Lagos F, Faundez M, Miranda D, Montoya M, Aracena-Parks P. Gonzalez-Lira V. 2007. Copper modifies liver microsomal UDP-glucuronyltransferase activity through different and opposite mechanisms. Chem Biol Interact 167(1):1-11.

Pathak D, Pathak KB, Singla B. 1991. Flavonoids as medicinal agents. Recent advances. Fitoterapia LXII(5):371-387. Letelier ME, Lepe AM, Faundez M, Salazar J, Marin R,

Aracena P, Speisky H. 2005. Possible mechanisms underlying copper-induced damage in biological membranes leading to cellular toxicity. Chem Biol Interact 151(2):71-82.

Pinkus R, Weiner LM, Daniel V. 1996. Role of oxidants and antioxidants in the induction of AP-1, NF-kappaB, and glutathione S-transferase gene expression. J Biol Chem 271(23):13422-13429.

Rinaldi R, Eliasson E, Swedmark S, Morgenstern R. 2002. Reactive intermediates and the dynamics of glutathione transferases. Drug Metab Dispos 30(10):1053-1058.

Letelier ME, Martinez M, Gonzalez-Lira V, Faundez M, Aracena-Parks P. 2006. Inhibition of cytosolic glutathione S-transferase activity from rat liver by copper. Chem Biol Interact 164(1-2):39-48.

Shimada T. 2006. Xenobiotic-metabolizing enzymes involved in activation and detoxification of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons. Drug Metab Pharmacokinet 21(4):257-276.

Letelier ME, Molina-Berrios A, Cortes-Troncoso J, Jara-Sandoval J, Holst M, Palma K, Montoya M, Miranda D, Gonzalez-Lira V. 2008. DPPH and oxygen free radicals as pro-oxidant of biomolecules. Toxicol In Vitro 22(2):279-286. Simon JE, Chadwick AF, Craker LE. 1984. Herbs: an

indexed bibliography, 1971-1980: the scientific literature on selected herbs, and aromatic and medicinal plants of the temperate zone. Ed. I Archon Books, Hamden, CT, USA, pp. 770

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193(1):265-275.

Machado DG, Bettio LE, Cunha MP, Capra JC, Dalmarco JB, Pizzolatti MG, Rodrigues AL. 2009. Antidepressant-like effect of the extract of Rosmarinus officinalis in mice: Involvement of the monoaminergic system. Prog. Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 33(4):642-50.

Tephly TR, Burchell B. 1990. UDP-glucuronosyltransferases: a family of detoxifying enzymes. Trends Pharmacol Sci 11(7):276-279.

van der Aar EM, Buikema D, Commandeur JN, te Koppele JM, van Ommen B, van Bladeren PJ, Vermeulen NP. 1996. Enzyme kinetics and substrate selectivities of rat glutathione S-transferase isoenzymes towards a series of new 2-substituted 1-chloro-4-nitrobenzenes. Xenobiotica 26(2):143-155.

Mari M, Cederbaum AI. 2001. Induction of catalase, alpha, and microsomal glutathione S-transferase in CYP2E1 overexpressing HepG2 cells and protection against short-term oxidative stress. Hepatology 33(3):652-661.

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© 2009 The Authors © 2009 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 8 (6), 498 - 508

BLACPMA ISSN 0717 7917 Artículo Original | Original Article

BLACPMA es una publicación de la Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los términos de una licencia “Atribución Creativa Común-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional” (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Antioxidant capacity and polyphenolic content of twelve traditionally used herbal medicinal infusions from the South American Andes

[Capacidad antioxidante y contenido polifenólico de doce infusiones medicinales usadas tradicionalmente en los Andes sudamericanos]

Leonel E. ROJO 1, Julio BENITES 1, José LÓPEZ 1, Mauricio ROJAS 1, Pilar DÍAZ 1, José ORDÓÑEZ 2, and Edgar PASTENE 2*

1Laboratorio de Productos Naturales, Departamento de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile 2 Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

Abstract

Twelve plants used traditionally in ethno-medicine from the South American Andes were studied. Infusions were compared in terms of their free radical scavenger properties, using four different methods (AAPH-induced haemolysis, TEAC-DPPH, FRAP and TEAC-crocin). All herbal teas showed a strong antioxidant capacity, the results obtained with FRAP and TEAC-DPPH being very similar. When compared at a dilution of 0.03%, Parastrephia lucida, Parastrephia lepidophylla, Senecio nutans, Azorella compacta and Baccharis tola, showed a protective effect against oxidative damage on human erythrocytes greater than that of Trolox (p < 0.001). Upon correlating the polyphenolic contents with the antioxidant capacity a positive association for all plants (TEAC-DPPH vs GAE; r2 = 0.7437) was found. Interestingly, there was a better correlation between polyphenolic contents and the protective effect against APPH-induced haemolytic activity.

Keywords: Antioxidants; Free radical scavengers; Herbal infusion; Oxidative damage; Crocin assay.

Resumen

Se estudiaron doce plantas de los Andes Sudamericanos, tradicionalmente usadas en etno-medicina. Las infusiones preparadas fueron comparadas en cuanto a sus propiedades atrapadoras de radicales libres, mediante cuatro métodos diferentes (hemólisis inducida por AAPH, TEAC-DPPH, FRAP y TEAC-crocina). Todas las especies demostraron una marcada capacidad antioxidante, siendo los resultados obtenidos con TEAC-DPPH y FRAP muy similares. Al ser comparados a una dilución de 0,03%, las especies: Parastrephia lucida, Parastrephia lepidophylla, Senecio nutans, Azorella compacta y Baccharis tola, mostraron un efecto protector del daño oxidativo sobre eritrocitos humanos superior al de Trolox (p < 0,001). Al correlacionar el contenido polifenólico con la capacidad antioxidante se encontró una asociación positiva para todas las plantas (TEAC-DPPH vs EAG; r2 = 0,7437). Interesantemente, se observó una mejor correlación entre los niveles de polifenoles y el efecto protector de la actividad hemolítica inducida por AAPH.

Palabras Clave: Antioxidantes; Atrapadores de radicales libres; Infusiones herbales; Daño oxidativo; Ensayo de Crocina.

Recibido | Received: April 6, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: June 20, 2009. Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009. Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was financially supported by Dirección de Investigación UNAP, Grant: “Efecto protector de Plantas Altiplánicas de la I Rregión sobre biomembranas expuestas al daño oxidativo causado por radicales libres” This article must be cited as: Leonel Rojo, Julio Benites, José Lopez, Mauricio Rojas, Pilar Díaz, José Ordóñez, and Edgar Pastene. 2009. Antioxidant capacity and polyphenolic content of twelve traditionally used herbal medicinal infusions from the South American Andes. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):498 – 508. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email [email protected]

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INTRODUCTION

For hundreds of years, since the pre-Hispanic period, the intake of herbal infusions has been deeply rooted among South Andean Amerindian Cultures (Aymara and Quechua) mainly based on the ethno-medicinal purposes attributed to these plants, e.g. for cardiovascular and gastrointestinal disorders (Villagrán et al., 2003). These plant species grow mainly in the Northern Chilean and Southern Peruvian Highlands, which are commonly known as the “Altiplano”. This geographical region is a unique environment located more than 3,000 meters above sea level (Rojo et al., 2006). The herbal teas brewed from these plants are claimed to have interesting biological properties such as anti-inflammatory, antimicrobial and antioxidant activities (Villagrán et al., 2003; Rojo et al., 2006). This suggests that local effects on the gastrointestinal tract may have a role in the pharmacological effects attributed to these infusions. Recent phytomedicinal studies have shown that a variety of compounds isolated from these species display strong anti-inflammatory, anti-microbial and antioxidant effects (Kähkönen et al., 1999; Wojdlo et al., 2007). However, to the best of our knowledge, there is no evidence available comparing the antioxidant activity of these medicinal beverages to date. This is an important shortcoming, since these herbal teas are widely consumed among the populations of Chile, Peru, Bolivia and Argentina and could be an important source of natural antioxidants. Today, a consistent body of evidence has been published supporting the role of oxygen and nitrogen derived reactive species (ROS and RNS) in the pathogenesis of cancer, cardiovascular diseases, chronic inflammatory processes and neuro-degenerative disorders (Lai et al., 2001). Indeed, natural antioxidants can delay or inhibit lipid peroxidation and oxidative damage of DNA and proteins, which are molecular events that typically occur during chronic disease (Velioglu et al., 1998; Wang and Ballington, 2007). Thus, the consumption of natural antioxidants can offer protection against epidemiologically relevant diseases and also can be a potential source of natural antioxidants to be included in nutraceutical formulations or functional foods (Wong et al., 2006). In addition, several reports show that antioxidant properties of herbal teas and foods are positively correlated with their total polyphenol content (TPC) (Lu and Foo, 2001; Murthy et al.,

2002). Thus, it is likely that those plants containing high levels of water-soluble polyphenols are of major interest as potential sources of natural antioxidants (Lu and Foo, 2001; Murthy et al., 2002; Revilla and Ryan, 2000; Göktürk et al., 2007) and aqueous infusions prepared with these plants can provide the intestine with water-soluble free radical scavengers acting either on locally generated ROS/RNS or as a systemic pool that could prevent the oxidation of bio-molecules (Djeridane et al., 2006, Speisky et al., 2006). Based on this evidence, the interest in natural antioxidants, especially from plant sources, has progressively increased during the last fifteen years (Jayaprakasha et al., 2003). The purpose of this work is to study the antioxidant capacities of twelve herbal teas widely consumed by South-American populations, mainly those living in the highlands of northern Argentina and Chile, southern Perú and western Bolivia. These herbal teas were prepared from plants grown under similar climatic conditions and were assessed for their in vitro antioxidant capacities. In this study, the free radical scavenging capacities of the herbal teas were followed via their reaction with the stable DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) free radical, their capacity to inhibit AAPH-induced haemolysis, their ferric reducing antioxidant power (FRAP) and their capacity to delay the bleaching of crocin induced by the radical initiator AAPH. For these twelve aqueous extracts (infusions or teas), correlations were established between the total polyphenol content and the result of different assays addressed to evaluate the antioxidant capacity.

MATERIAL AND METHODS

Plant material Twelve plant species were collected fresh in July

2004 in the province of Colchane located at 3500 m.a.s.l., in the region of Tarapacá in Chile. The plant material was identified and authenticated by Prof. Dr. Roberto Rodriguez at the Universidad de Concepción. Voucher specimens are deposited in the Herbarium of the University of Concepción and in the Laboratory of Natural Products at Arturo Prat University. The plants studied here and their specific locations were as follows: Añawaya (Adesmia melanthes Philippi, Fabaceae, 19º17’82’S, 68º40’84’’W), Chachacoma (Senecio nutans, Asteraceae, 19º17’86’’ S, 68º40’83” W), Chana (Chuquiraga atacamensis Kuntze, Asteraceae,

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19º17’86’’S, 68º40’83’’ W) Kipa hembra (Fabiana densa J. Remy, Solanaceae, 19º18’69’’ S, 68º40’47’’ W), Kipa macho (Fabiana squamata, Solanaceae, 19º21’19’’S, 68º42’85’’ W), Lampaya (Lampaya medicinalis Phil., Verbenaceae, 19º17’86’’S, 68º40’83’’W), Llareta (Azorella compacta, Apiaceae, 19º86’86’’S, 68º40’95’’W), Ñaca (Baccharis tola Phil. subsp. altiplanica Hellwig, Asteraceae, 19º17’86’’ S, 68º40’83’’ W), Puskayu (Opuntia ignescens, Cactaceae, 19º17’81’’S,68º43’89’’W), Rika-Rika (Acantholippia deserticola, Verbenaceae, 19º18’194’’S, 68º41’125’’ W), Tola (Parastrephia lepidophylla Wedd, (Asteraceae, 19º18’88’’S, 68º43’85’’W), Umatola (Parastrephia lucida. Meyen. Cabrera, Asteraceae, 19º17’72’’ S, 68º38’96’’ W).

Upon arrival at the laboratory, herbal samples were cleaned with tap water to remove debris. Then the plant material was air-dried at room temperature in a ventilated area. The dried leaves were stored in sealed polyethylene bags with silica gel included as a desiccant.

Chemicals AAPH (2,2’-Azobis(2-methylpropionamidine)

dihydrochloride) and DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) and TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine) were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Folin-Ciocalteu reagent, and other chemicals and solvents were procured from Merck (Darmstadt, Germany) and were of analytical grade.

Extraction Dried samples (20 g) were ground using a

domestic blender and extracted with 80 mL of deionised water. Next, the mixtures were heated for 5 min, with occasional agitation. Then the herbal teas were passed through 40 μm filter paper (Whatman).

Determination of total polyphenolic content The total polyphenolic contents in the herbal teas

were evaluated with Folin-Ciocalteu reagent according to the method of Singleton and Rossi (1965), using gallic acid as a standard. Briefly, 100 µL of aqueous extracts were mixed with 200 µL of Folin-Ciocalteau reagent, 2 mL of distilled water, and 1 mL of 20 % Na2CO3, and the absorbance of the mixture was measured at 765 nm after incubation for 1 hour at room temperature. Standard plots were made from gallic acid solutions (5 – 20 mg/L, final

concentration). The equation of the gallic acid calibration curve was y = 0.091x + 0.0229 (r2 = 0.9951) and results were expressed as mg per litre of gallic acid equivalents (GAE). Samples were analyzed in triplicate.

Antioxidant assays DPPH radical scavenging assay (TEAC-DPPH) For radical scavenging capacity the DPPH assay

was used with slight modifications (Bonoli et al., 2004). Briefly, a 100 µL sample of each extract was added to 2.9 mL of 100 µmol/L DPPH solutions in methanol-water (8:2 v/v). A decrease in absorbance was determined at 517 nm during 30 min at 25°C. The blank reference cuvette contained only methanol-water (8:2 v/v). Differences in absorbance were compared with a standard plot made from Trolox solutions (20 – 200 µmol/L), and results were expressed as µmol of Trolox equivalents per litre of infusion (TEAC). All measurements were performed in triplicate.

Ferric reducing antioxidant power (FRAP) For the FRAP assay (Cao and Prior, 1998), a

mixture of 100 mmol/L acetate buffer (pH 3.6), 10 mmol/L TPTZ, and 20 mmol/L ferric chloride (10:1:1 v:v:v) was prepared (FRAP reagent). To 900 µL of FRAP reagent, 90 μL of water and 30 μL of sample were added. The absorbance readings started immediately after the addition of the sample, and were performed at 593 nm during 10 min. The blank consisted of 120 µL of water and 900 µL of reagent. The final absorbance of each sample was compared with those obtained from the standard curve made from Trolox (10 – 100 µmol/L) and results were expressed as µmol of Trolox per litre of infusion. All measurements were performed in triplicate.

Crocin bleaching assay (TEAC-crocin) The crocin bleaching assay was used with minor

modifications to the original protocol suggested by Tubaro et al., (1996). Briefly, crocin was extracted and purified from saffron according to the method of Ordoudi et al., (2006). A stock solution of crocin was prepared in methanol and was diluted with 0.1 mol/L phosphate buffer, pH 7.0 in order to obtain a 1.35 x 10-5 mol/L crocin solution (the absorption coefficient of crocin at 443 nm is 1.33 x 105/mol/cm). As initiator, a stock solution of AAPH (250 mmol/L) was prepared in phosphate buffer (10 mmol/L; pH 7.0). The assay was performed in the cuvettes adding

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the reactants in the following order: 20 µL of sample (conveniently diluted in water) or standard, 80 µL of AAPH (250 mmol/L) and finally 1000 µL of crocin solution. The bleaching rate of crocin was monitored at 443 nm and 40 °C during 25 min using a Jasco V-500 spectrophotometer (Easton, USA). The blank reference cuvette contained only methanol-water (8:2 v/v). Antioxidant capacity was calculated using similar expressions adapted from ORAC methodology (Wang et al., 2000; Naguib, 2000). The corrected area under the relative absorbance curve (AUC) of each sample was compared with those obtained from the standard curve made from Trolox (3.5 – 60 µmol/L) and results were expressed as µmol of Trolox equivalent (TEAC) per litre of infusion. These TEAC values refer to the net protection (AUC) of crocin in presence of an herbal antioxidant. All measurements were performed in duplicate.

Inhibition of AAPH-induced haemolysis Blood samples were obtained from healthy donors

by venipuncture (Laboratory of Natural Products, Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile), according to bioethical protocols approved by this institution. The citrated blood samples were centrifuged at 1000 xg for 10 min and washed three times with phosphate-buffered saline (PBS). Supernatant and buffy coat were carefully removed by aspiration after each wash. Washed erythrocytes were finally suspended in PBS. The haemolysis of erythrocytes induced by AAPH was assessed by using a modification of a method described previously (Miki et al., 1987). Briefly, 25 μL aliquots of erythrocyte suspension were incubated at 37 ºC for 2.5 h in the presence of 100 mmol/L-AAPH to induce haemolysis. The advantages of this method were that the AAPH decomposes thermally to generate radicals without biotransformation or enzymes and the rate of radical generation is easily controlled by adjusting the concentration of initiator (Ko et al., 1997). The concentration that inhibited AAPH induced haemolysis by 50% (IC50) was determined for each herbal infusion. Haemolysis was monitored by spectrophotometry at 540 nm. All measurements were performed in triplicate.

Statistical analysis Data are reported as mean ± standard deviation.

GraphPad Prism® (Windows Release Version 4.0) software was used for statistical analysis of the

experimental data. One-way analysis of variance (ANOVA) was used for statistical analysis. P-values less than 0.05 were considered statistically significant.

RESULTS

Total polyphenol content (TPC) As shown in Table 1, total polyphenol content

(TPC) values varied from 3668 to 31389 mg GAE/L of herbal infusion (average 15717 mg/L). Among these 12 Andean herbal infusions the lowest TPC (< 8000 mg GAE/L) was for Baccharis tola Phil. subsp. altiplanica Hellwig, and the order of TPC values was as follows: Baccharis tola Phil. subsp. altiplanica Hellwig < Chuquiraga atacamensis Kuntze < Azorella compacta < Fabiana squamata < Acantholippia deserticola. Seven infusions showed TPC > 10000 mg GAE/L: the order being as follows: Opuntia ignescens < Parastrephia lepidophylla (Wedd) Cabr. < Parastrephia lucida (Meyen) Cabr. < Lampaya medicinalis < Senecio nutans < Adesmia melanthes Philippi < Fabiana densa J. Remy.

Antioxidant capacity (TEAC-DPPH, TEAC-crocin and FRAP)

The results described in Table 2 and Fig. 1 summarizes all the antioxidant studies we have performed in this work. In Table 2 we show the antioxidant capacity of 12 aqueous extracts addressed by different methods. By far the most potent antioxidant species according to the FRAP assay were Opuntia ignescens and Acantholippia deserticola. This is not the same pattern observed when analyzed by the TEAC-DPPH and TEAC-crocin assays, which also differ between each other.

Inhibition of AAPH induced haemolysis In our study, herbal teas from Parastrephia

lucida, Baccharis tola, Azorella compacta and Senecio nutans displayed around twice the anti-oxidant activity displayed by 0.03% Trolox (Fig. 3). Fabiana densa, displayed an anti-haemolytic activity equivalent to Trolox (0.03% w/v). These results are in agreement with the high TPC of these species (Table 1). When concentrations of herbal infusions were increased up to 0.066 and 1.33% (w/v) a significantly greater antihaemolytic effect was observed only for Acantholippia deserticola infusion (Fig. 4).

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Figure 1. Linear correlation between antioxidant capacity (TEAC-DPPH) and total phenolic content in 12 herbal infusions: A positive correlation is observed between TEAC-DPPH (Trolox equivalents), and total polyphenolic content (GAE mg/L) with a coefficient of determination r2 = 0.7239. The two-tailed P value is < 0.0001, considered highly significant.

Figure 2. TEAC-crocin assay results for 12 herbal infusions. (A) Representative kinetic curves from crocin bleaching (absorbance at 443 nm) induced by AAPH in the presence of different standard solutions of the water soluble antioxidant Trolox (3.5 – 60 µmol/L). In the secondary plot (B) the AUC was plotted against Trolox concentration. The net AUC was equal to AUCstandard – AUCblank. Graph B shows that AUC is proportional to the antioxidant activity.

0 100 200 300 4000

250

500

750

1000

1250

1500

1750

mg GAE L-1

TEA

C-D

PPH

(μm

ol L

-1)

Figure 3. Inhibition of AAPH induced haemolysis by herbal teas (0.033 % w/v). Parastrephia lucida, Senecio nutans, Azorella compacta and Baccharis tola displayed the highest protective effect (** p<0,001) when compared to Trolox. Also, herbal tea from Parastrephia lepidophylla, displayed a significantly higher antioxidant-antihemolitic effect than Trolox (* p < 0,01).

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Figure 4. Effect of tea concentration on antioxidant effect. The plot shows the inhibition of AAPH induced hemolysis by different concentrations of herbal teas. Herbal infusions form Acantholippia sp., Baccharis sp., Parastrephia lepidophylla, Azorella compacta, Senecio nutans and Adesmia melanthes (A) displayed a protective effect against RBC oxidative damage in a concentration dependent manner only in a narrow concentration range, from 0.0 to 0.3 % (w/v). For Lampaya medicinalis, Fabiana squamata, Chuquiraga atacamensis Kuntze and Opuntia ignescens (B) this protective effect was concentration dependent only from 0.0 to 0.15 % (w/v)

Concentration (m/v)

Concentration (m/v)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Ant

ihae

mol

ytic

effe

ct(%

)A

ntih

aem

olyt

icef

fect

(%)

100

80

60

40

20

0

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Acantholippia deserticola

Baccaris tola

Parastrephia lepidophyla

Azorella compacta

Senecio nutans

Adesmia melanthes

Fabiana densa

Fabiana squamata

Lampaya medicinalis

Chuquiraga atacamensis

Parastrephia lucida

Opuntia ignescens

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Table 1. Taxonomic data of 12 species used as herbal infusions in the Southern Andes

Family Scientific name Common name

Fabaceae Adesmia melanthes Philippi Añawaya

Asteraceae Senecio nutans Chachacoma

Asteraceae Chuquiraga atacamensis Kuntze Chana

Solanaceae Fabiana densa J. Remy Kipa hembra

Solanaceae Fabiana squamata Kipa macho

Verbenaceae Lampaya medicinalis Lampaya

Apiaceae Azorella compacta Llareta

Asteraceae Baccharis tola Phil. subsp. altiplanica Hellwig Ñaca

Cactaceae Opuntia ignescens Puskayu

Verbenaceae Acantholippia deserticola Rika-rika

Asteraceae Parastrephia lepidophylla (Wedd.) Cabr. Tola

Asteraceae Parastrephia lucida (Meyen) Cabr. Umatola

Table 2. Summary of antioxidant capacity of species used as herbal infusions assessed by different methods.

Name Total phenolics a GAE mg/L

TEACb DPPH µmol/L

TEACb Crocin µmol/L

FRAPc µmol/L

Adesmia melanthes Phil. 303 1523 1667 7000

Senecio nutans 272 609 837 4100

Chuquiraga atacamensis K. 54 77 3660 2500

Fabiana densa 314 1026 8820 5700

Fabiana squamata 71 74 337 3300

Lampaya medicinalis 220 1045 898 1870

Azorella compacta 70 459 452 2300

Baccharis tola 37 67 101 1800

Opuntia ignescens 116 6 101 51800

Acantholippia deserticola 72 222 1169 56200

Parastrephia lepidophylla 164 265 1139 4200

Parastrephia lucida 194 541 1072 4400

a mg of gallic acid equivalents per litre of aqueous extract. b The antioxidant capacities estimated by crocin and DPPH assays were expressed as Trolox equivalents per litre of aqueous extract. The data are displayed with mean standard deviations of three replications. c The antioxidant capacities estimated by FRAP assay were expressed as Trolox equivalents per litre of aqueous extract.

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DISCUSSION

It is important to highlight the fact that FRAP reflects the presence of all reducing substances in a certain matrix, not only polyphenolic compounds. Thus, the presence of non-phenolic substances, such as vitamin C and Cu (I) cannot be ruled out. Hence, interpretations of FRAP results must consider these potential limitations. As well, in order to avoid incorrect interpretation of TPC measurements by the Folin-Ciocalteu method, the same consideration must be taken into account. Despite these limitations in the FRAP and TPC methods, correlations between total polyphenolic content and FRAP values are widely used to assess the antioxidant potential of herbal infusions and other foodstuffs (Heimler et al., 2007).

Currently, many investigators use the TAC assay to assess the antioxidant capacity of a wide variety of samples. Usually, the method is based on an endpoint measurement after an incubation period during which the azo-initiator (AAPH) promotes crocin bleaching. An important scientific contribution of our work is to improve on the classical TAC methodology, where the area under the relative absorbance decay versus time curve is used as an index of antioxidant capacity (Figure 2). This approach is similar to what is done in the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay, in which the oxidation of the fluorescent probe fluorescein is monitored over time. Area under the curve (AUC) determination has remarkable advantages in comparison with endpoint measurements (Cao et al., 1998). Thus, these kinetic approaches allowed us to combine information from two measurements; (i) the rate of crocin bleaching over time and (ii) the endpoint value, both in a single parameter. TEAC-crocin antioxidant capacity, calculated this way, positively correlated with the total polyphenol content (TPC) in these twelve herbal teas (Table 2).

The oxidation of red blood cells (RBC) by molecular oxygen was performed in an aqueous suspension with the azo-compound AAPH as a free-radical initiator. The RBC membranes are oxidized at a constant rate by a free-radical chain mechanism, resulting in haemolysis. The extent of haemolysis is proportional to the concentration of free radicals and is inhibited by water-soluble antioxidants. This is an excellent model to study RBC free radical damage in animals and humans. Compared to other in vitro assays, the best correlations between antioxidant capacity and TPC for these herbal teas were observed

when using the AAPH-induced haemolysis assay. This difference may be explained by the lipidic and proteinic environment used as the substrate for oxidation reactions. A new method recently developed (Wolfe and Liu, 2007), provides promising avenues to understand the mechanisms of protection against oxidative damage in cell systems. The method is based on the use of HepG2 cell lines, AAPH and the intracellular probe 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA). In this system the production of reactive oxygen species (ROS) is monitored spectrofluorometrically while DCFH-DA diffuses through the cell membrane and is enzymatically hydrolyzed by intracellular esterases to the non-fluorescent derivative dichlorofluorescin (DCFH). The latter can be rapidly oxidized to the highly fluorescent dichlorofluorescin (DCF) in the presence of ROS (Wolfe and Liu, 2007). This is relevant if we consider that several of the herbal species studied in this work have been reported to contain non-phenolic liposoluble compounds that could participate in the protection against ROS damage in cell systems.

Despite the high TPC determined for Lampaya medicinalis infusions, a low anti-haemolytic activity was observed. The latter suggests that other hydrosoluble compounds such as carbohydrates, saponins, lignans, alkaloids, tannins and small proteins could exert haemolytic effects, thus decreasing the protective effect of soluble phenolic antioxidants.

These interesting results encourage us to undertake further investigations to increase the phytochemical information on this species in order to fully understand which the main contributors to the overall antioxidant power are. Nevertheless, in some cases the available chemical information does not allow us to predict potential antioxidant effects at all. For example, in the case of Senecio nutans several volatile compounds were identified by De Feo et al., (2003). They highlighted the presence of sabinene and α-terpinene as main components of the essential oil. Without proper experimental evidence it is difficult to address the question if some of the volatile compounds themselves or their mixture displays an antioxidant effect. . An increasing body of evidence suggests that some volatile constituents of essential oils have potential roles as antioxidants in human health and food preservation (Takahashi et al., 2003; Grassmann et al., 2003; Kulisic et al., 2005). Other examples of isolated volatile phenolic compounds from essential oils are: thymol, carvacrol

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and eugenol, which have been reported to display an elevated antioxidant activity when assessed in vitro and also in vivo (Rao et al., 1999; Yanpallewar et al., 2004; Lee et al., 2005).

Hitherto, Fabiana densa infusions have not been reported to display antioxidant activity. Only one report was found in the literature describing the isolation of two antibacterial compounds: ent-beyer-15-en-18-O-succinate and ent-beyer-15-en-18-O-oxalate (Erazo et al., 2002). In the case of Azorella compacta, several reports have been published describing diterpenoids as the major compounds with biological activity. Many of these molecules are structurally related to the mulinane and azorellane nuclei (Loyola et al., 1997; Araya et al., 2003). These compounds have also been assessed for their hypoglycaemic and anti-Tripanozoma cruzi activities (Araya et al., 2003; Fuentes et al., 2005). However, no reference to the antioxidant activity of this species or its major secondary metabolites has been reported to date. The background for the herbal tea from Ch. atacamensis is quite different. In this case aerial parts of the plant have proved to be rich in vanillin, lupeol, betulin, erythrodiol, and the triterpene taraxast-20(21)-ene-3β,6-diol (Hoeneisen et al., 2000). Lupeol and betulin display strong free radical scavenging activity (Nagaraj, 2000; Oh et al., 2006) but the overall antioxidant capacity of this herbal tea is more likely associated with its polyphenolic content instead of these kinds of substances. Indeed, Juárez et al., (2002) identified some ubiquitous flavonoids in Ch. atacamensis, among them quercetin-3-O-glucoside, quercetin-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-glucoside and kaempferol-3-O-rutinoside, whose antioxidant properties have been widely reported and reviewed elsewhere (Silva et al., 2002; Heim et al., 2002). We have recently reported the composition of the essential oil of Acantholippia sp. The latter contains two major compounds (α and β-thujones) accounting for almost 98% percent of the essential oil composition. Interestingly, the thujone diasteromers are convulsivant agents acting as non-competitive blockers of the gamma-aminobutyric acid-gated chloride channel. Therefore studies on the concentrations of these metabolites in herbal infusions are essential steps to understanding their overall effects on human health. It is important to highlight the potential neurotoxic effect of this herbal tea, since infusions of Acantholippia can extract substantial amounts of the essential oil increasing the risk of toxic effects from thujones in humans. To the

best of our knowledge no previous evidence on antioxidant effects of this plant has been reported.

CONCLUSION

In the Chilean Andes and highlands peculiarly adverse environmental factors occur, such as frost and drought, which dramatically affect the length of the growth season. When the environmental temperature varies so dramatically, critical chill stress reduces the photosynthetic rate and promotes free radical damage (Wise and Naylor, 1987). Therefore we hypothesize that herbal species growing under these uniquely extreme environmental conditions have developed particularly potent non-enzymatic antioxidant mechanisms such as free radical scavengers and also photoprotective molecules.

REFERENCES

Araya J, Neira I, da Silva S, Mortara R, Manqué P, Cordero E, Sagua H, Loyola A, Bohórquez J, Morales G, González J. 2003. Diterpenoids from Azorella compacta (Umbelliferae) active on Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz Rio de Janeiro 98(3):413-417.

Bonoli M, Verardo V, Marcioli E, Caboni M. 2004. Antioxidant phenols in barley (Hordeum vulgare L.) flour: Comparative spectrophotometric study among extraction methods of free and bound phenolic compounds. J Agr Food Chem 52:5195-5200.

Cao G, Prior R. 1998. Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clin Chem 44:1309-1315.

De Feo V, Soria E, Urrunaga R, Senatore F. 2003. Chemical composition of essential oil of Senecio nitans Sch.-Bip. (Asteraceae). Flavour Frag J 18(3):234-236.

Djeridane A, Yousfi M, Nadjemi B, Boutassouna D, Stocker P, Vidal N. 2006. Antioxidant activity of some Algerian medicinal plant extracts containing phenolic compounds. Food Chem 97:654-660.

Erazo S, Zaldivar M, Delporte C, Backhouse N, Tapia P, Elmonte E,, Franco DF, Negrete. 2002. Antibacterial diterpenoids from Fabiana densa var. ramulosa. Planta Med 68, 361-363.

Fuentes N, Sagua H, Morales G, Borquez J, San Martin A, Soto J, Loyola L. 2005. Experimental antihyperglycemic effect of diterpenoids of

Page 62: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Rojo et al. Antioxidant capacity of herbal medicinal infusions from the South American Andes

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 507

Llareta Azorella compacta (Umbelliferae) Phil. in rats. Phytother Res 19(8):713-716.

Göktürk N, Özkan G , Yasar S. 2007. Evaluation of the antiradical and antioxidant potential of grape extracts, Food Control 18(9):1131-1136.

Grassmann J, Hippeli S, Vollmann R, Elstner E. 2003. Antioxidative properties of the essential oil from Pinus mugo. J Agr Food Chem 51:7576-7582.

Heim K, Tagliaferro A, Bobiya D. 2002. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J Nutr Biochem 13:572-584.

Heimler D, Isolani L, Vignolini P, Tombelli S, Romani A. 2007. Polyphenol content and antioxidative activity in some species of freshly consumed salads. J Agr Food Chem 55(5):1724-1729.

Hoeneisen M, Rojas A, Bittner M, Becerra J, Silva M, Jakupovic J. 2000. Constituents of Chuquiraga atacamensis and C. ulicina. Bol Soc Chil Quím 45(1):49-52.

Jayaprakasha GK, Selvi T, Sakariah KK. 2003. Antibacterial and antioxidant activities of grape (Vitis vinifera) seed extracts. Food Res Int 36:117-122.

Juárez B, Mendiolo M. 2002. Flavonoid chemistry of Chuquiraga (Asteraceae). Biochem Syst Ecol 30:371-373.

Kähkönen MP, Hopia AI, Vuorela HJ, Rauha J-P, Pihlaja K, Kujala TS, Heinonen M. 1999. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds, J Agr Food Chem 47:3954-3962.

Ko FN, Hsiao G, Kuo YH. 1997. Protection of oxidative hemolysis by demethyldiisoeugenol in normal and beta-thalassemic red blood cells. Free Radical Biol Med 22(1-2):215-222.

Kulisic T, Radonic A, Milos M. 2005. Inhibition of lard oxidation by fractions of different essential oils. Grasas Aceites 56(4):284-291.

Lai LS, Chou ST, Chao WW. 2001. Studies on the antioxidative activities of Hsian-tsao (Mesona procumbens Hemsl.) leaf gum. J Agr Food Chem 49(2):963-968.

Lee S-J, Umano K, Shibamoto T, Lee K-G. 2005. Identification of volatile components in basil (Ocimum basilicum L.) and thyme leaves (Thymus vulgaris L.) and their antioxidant properties. Food Chem 91:131-137.

Lu Y, Foo YL. 2001. Antioxidant activities of polyphenols from sage (Salvia officinalis). Food Chem 75(2):197-202.

Loyola L, Bórquez J, Morales G, San Martin A. 1997. Diterpenoids from Azorella compacta. Phytochemistry 44(4):649-651.

Miki M, Tamai H, Mino M, Yamamoto Y, Niki E. 1987. Free-radical chain oxidation of rat red blood cells by molecular oxygen and its inhibition by alpha-tocopherol. Arch Biochem Biophys 258(2):373-380.

Murthy KNC, Singh RP, Jayaprakasha GK. 2002. Antioxidant activity of grape (Vitis vinifera) pomace extracts. J Agr Food Chem 50(21):5909-5914.

Nagaraj M, Sunitha S, Varalakshmi P. 2000. Effect of lupeol, a pentacyclic triterpene, on the lipid peroxidation and antioxidant status in rat kidney after chronic cadmium exposure. J Appl Toxicol 20(5):413-417.

Naguib Y. 2000. A fluorimetric method for measurement of oxygen radical-scavenging activity of water-soluble antioxidants. Anal Biochem 284:93-98.

Oh S-H, Choi J-E, Lim S-Ch. 2006. Protection of betulin against cadmium-induced apoptosis in hepatoma cells. Toxicology 220:1-12.

Ordoudi S, Tsimidou M. 2006. Crocin bleaching assay step by step: observations and suggestions for an alternative validated protocol. J Agric Food Chem 54(5):1663-1671.

Rao M, Kumar M, Rao M. 1999. In vitro and in vivo effects of phenolic antioxidants against cisplatin-induced nephrotoxicity. J Biochem 125:383-390.

Revilla E, Ryan JM. 2000. Analysis of several phenolic compounds with potential antioxidant properties in grape extracts and wines by high-performance liquid chromatography-photodiode array detection without sample preparation. J Chromatogr A (1-2), 881:461-469.

Rojo L, Benites J, Rodrígues A, Venancio F, Ramalho l, Teixeira A, Feio S, do Ceu Costa M. 2006. Composition and antimicrobial screening of the essential oil of Acantholippia deserticola (Phil. ex F. Phil.) Moldenke. J Essent Oil Res. 18: 695-697.

Singleton V, Rossi J. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Viticult 16(3):144-158.

Page 63: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Rojo et al. Antioxidant capacity of herbal medicinal infusions from the South American Andes

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 508

Silva M, Santos M, Caroço G, Rocha R, Justino G, Mira L. 2002. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids: a re-examination. Free Radical Res 36(11):1219-1227.

Speisky H, Rocco C, Carrasco C, Lissi EA, López-Alarcón C. 2006. Antioxidant screening of medicinal herbal teas. Phytother Res 20(6):462-467.

Takahashi Y, Inaba N, Kuwahara S, Kuki W. 2003. Antioxidative effects of citrus essential oil components on human low-density lipoprotein in vitro. Biosci Biotechnol Biochem 67(1):197-197.

Tubaro F, Micossi E, Ursini F. 1996. The antioxidant capacity of complex mixtures by kinetic analysis of crocin bleaching Inhibition. J Am Oil Chem Soc 73(2):173-179.

Velioglu YS, Mazza G, Gao L, Oomah BD. 1998. Antioxidant activity and total polyphenolics in selected fruits, vegetables and grain products. J Agric Food Chem 46:4113-4117.

Villagrán C, Romo M, Castro V. 2003. Ethnobotany of the southern Andes within the first region of Chile: a connection between altiplano cultures and the high canyons of the superior Loa. Chungara, Rev Antropol Chile 35(1):73–124.

Wang SY, Ballington JR. 2007. Free radical scavenging capacity and antioxidant enzyme

activity in deerberry (Vaccinium stamineum L.), LWT-Food Sci Technol 73:1352-1361.

Wang S, Lin H-S. 2000. Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry, raspberry and strawberry varieties with cultivate and developmental stage. J Agric Food Chem 48:140-146.

Wise RR, Naylor AW, 1987. Chilling-enhanced photooxidation. Evidence for the role of singlet oxygen and superoxide in the breakdown of pigments and endogenous antioxidants. Plant Physiol 83:278-282.

Wojdlo A, Oszmianski J, Czemerys R. 2007. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem 105:940-949.

Wolfe K, Liu R. 2007. Cellular antioxidant activity (CAA) assay for assessing antioxidants, foods, and dietary supplements. J Agric Food Chem 55:8896-8907

Wong SP, Leong LP, William-Koh JH. 2006. Antioxidant activities of aqueous extracts of selected plants. Food Chem 99:775–783.

Yanpallewar S, Rai S, Kumar M, Acharya S. 2004. Evaluation of antioxidant and neuroprotective effect of Ocimum sanctum on transient cerebral ischemia and long-term cerebral hypoperfusion. Pharmacol Biochem Behavior 79:155-164.

Page 64: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

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BLACPMA ISSN 0717 7917 Artículo Original | Original Article

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Antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas

del maíz morado (Zea mays L.): Método de extracción

[Anthocyanins, total phenolic compounds and antioxidant activity of purple corn (Zea mays L) cobs: Extraction method]

Arilmi GORRITI GUTIERREZ1, Jorge ARROYO ACEVEDO1, Luisa NEGRON BALLARTE1, Bertha JURADO TEIXEIRA1, Harold PURIZACA LLAJARUNA1, Ilario SANTIAGO AQUISE1, Evelyng TAYPE ESPINOZA1, Fredy QUISPE JACOBO2

1Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad Nacional Mayor de San Marco, Lima, Perú. 2Empresa AGRONEGOCIOS PERUAGRO S.R.L., Lima, Perú

Abstract

Anthocyanins, total phenolic compounds and antioxidant activity of the extracts of purple corn cobs were evaluated in the investigation. The extractions were carried out in ethanolic solutions to 20% and pH 2 conditioned according to a factorial design with the factors temperature and times both in 4 levels. The results indicate anthocyanins between 11.567 and 37.127 mg/g cob, total phenolic compounds expressed as GAE between 23.426 and 76.962 mg GAE/g cob, and DPPH remaining between 17.06 and 68.80 %. The analysis of lineal regression indicates highly significant dependences between the antioxidant activity and total phenolic compounds (r2 = 0.9974).

Keywords: Corn purple cob; Zea mays; Anthocyanins; Phenolic compounds; Antioxidant activity, DPPH.

Resumen

Las antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de los extractos de corontas de maíz morado fueron evaluados en la investigación. Las extracciones se realizaron en soluciones etanólicas al 20 % y pH 2 acondicionadas según un diseño factorial con los factores temperatura y tiempo ambos en 4 niveles. Los resultados indican antocianinas entre 11.567 y 37.127 mg/g de coronta, fenoles totales expresados como GAE entre 23.426 y 76.962 mg GAE/g de coronta, y DPPH remanente entre los 17.06 y 68.80 %. El análisis de regresión lineal indica dependencias altamente significativas entre la actividad antioxidante y fenoles totales (r2= 0.9974).

Palabras Clave: Maíz morado; Zea mays; Antocianinas; Fenoles totales; Actividad antioxidante; DPPH.

Recibido | Received: January 30, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: June 15, 2009. Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009 Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiación | Funding: This work was financed by Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Perú – CONCYTEC, Proyecto No. 317-2007-CONCYTEC. This article must be cited as: Arilmi Gorriti Gutierrez, Jorge Arroyo Acevedo, Luisa Negron Ballarte, Bertha Jurado Teixeira, Harold Purizaca Llajaruna, Ilario Santiago Aquise, Evelyng Taype Espinoza, Fredy Quispe Jacobo. 2009. Antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas del maíz morado (Zea mays L.): Método de extracción. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):509 – 518. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email [email protected], [email protected].

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Gorriti Gutierrez et al. Fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas de Zea mays

INTRODUCCIÓN

El maíz morado es una variedad pigmentada de Zea mays L., cultivado en América Latina, principalmente en Perú y Bolivia, donde se utiliza en la elaboración de bebidas “Chicha morada”, mazamorras y otros alimentos (Escribano-Bailón et al., 2004); el maíz morado es uno de los cereales donde la composición de antocianinas ha sido definida por estudios de espectrometría de masas (LC-DAS-MS), 1H y 13C RMN bidimensional homo y heteronuclear, HSCCC y HPLC-MS (Escribano-Bailón et al., 2004), el estudio de componentes desarrollado por Pascual-Teresa et al. (2002) y Schwartz et al. (2003) de un extracto comercial de corontas de maíz morado revela la presencia de un dímero y derivados mono y di-glicosidados de cianidina, pelargonidina y peonidina, Tabla 1. Las características estructurales de las antocianinas y los colores atractivos que presentan, su relativa estabilidad en medio acuoso según el pH con la presencia de estructuras tales como el catión flavilium, una base quinoidal, una pseudo base carbinol y

una chalcona (Mazza & Miniati, 1993; Giusti & Wrosltad, 2001; Cabrita et al., 2004), determinan una mayor estabilidad frente a cambios de pH, temperatura y exposición a la luz, debido a procesos de copigmentación y asociación intermolecular e intramolecular que se desarrollan en el medio (Escribano-Bailón et al., 2004; Salas et al., 2004), convierten a estos compuestos en fuentes potenciales de colorantes naturales (Escribano-Bailón et al., 2004; Cevallos-Casals y Cisneros-Zevallos, 2004; Giusti & Wrolstad, 2003), y sustancias activas de alimentos funcionales, nutracéuticos y medicamentos (Korhonen, 2002). Los dobles enlaces deslocalizados en estos polifenoles y la presencia de otros compuestos fenólicos en las corontas de maíz morado determinan una serie de propiedades que fueron demostradas en estos compuestos (Duhard et al., 1997). El objetivo principal de la presente investigación fue la identificación de las condiciones de extracción de los compuestos activos de las corontas del maíz morado a través de la determinación de antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante.

Tabla 1 - Componentes de un extracto comercial de antocianinas de corontas de maíz morado

Pico Compuesto Rf [M]+ Fragmentos [M+H]+ AR (%)

1 Dímeroa 14,0 899 737; 575; 423 1,8

2 Cianidina-3-glucósido 28,8 449 287 54,3

3 Pelargonidina-3-glucósido 34,8 433 271 6,1

4 Peonidina-3-glucósido 37,2 463 301 14,7

5 Cianidina-3-(6”-malonilglucósido) 39,8 535 449; 287 11,6

6 Pelargonidina-3-(6”-malonilglucósido) 42,3 519 433; 271 3

7 Peonidina-3-(6”-malonilglucósido) 43,2 549 463; 301 5,5

8 Cianidina-3-(6”-etilmalonilglucósido) 47,7 563 449; 287 2,6

9 Pelargonidina-3-(6”-etilmalonilglucósido) 48,9 547 433; 271 0,2

10 Peonidina-3-(6”-etilmalonilglucósido) 49,5 577 463; 301 0,1

a: Dímero formado por la condensación directa de un flavan-3-ol y cianidian-3,5-diglucósido, AR: Abundancia relativa. Resultados encontrados por Pascual-Teresa et al. (2002).

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MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y reactivos Las corontas de maíz morado del cultivar testigo

Joya (TJ) utilizados en la investigación se obtuvieron de mazorcas recolectadas en un campo experimental del distrito de la Joya del Departamento de Arequipa, Perú, ubicado aproximadamente en latitud sur 16º25´27” y longitud oeste 71º48´43” sobre los 1644 metros sobre el nivel del mar, entre los meses de febrero y abril del 2008. Todos los reactivos y solventes utilizados fueron de grado analítico Sigma Aldrich Chemical Co. y Merck.

Métodos Preparación del extracto y determinación de

antocianinas según el método de pH diferencial Alrededor de 2,5 g de muestra (coronta molida y

tamizada de maíz morado) fueron extraídos con 200 mL de solución etanólica al 20 % y pH 2, bajo determinadas condiciones de tiempos de extracción (30, 60, 120 y 240 min.) y temperaturas de extracción (25, 60, 75 y 90 ºC). Los extractos obtenidos fueron filtrados a través de papel filtro (Whatman No.1) con la ayuda de una bomba de vacío (COPELAMETIC, USA), y una alícuota del extracto se diluyen convenientemente en una fiola de 25 mL con las soluciones buffer de cloruro de potasio (pH 1) y acetato de sodio (pH 4.5). En las soluciones preparadas se determinó el contenido de antocianinas según el método de pH diferencial, de acuerdo a Giusti & Wrosltad (2001) utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (PHARO 300, Merck) y su contenido se expresó como cianidina-3-glucósido de acuerdo a la siguiente expresión:

Antocianinas (mg/L)= ∆A × MW × FD ×1000/(ε × l) (1) Donde ∆A (cambio en la absorbancia) = (A510 −

A700) a pH 1,0 − (A510 − A700) a pH 4.5; MW (del inglés molecular weight, masa molecular) = 449.2 g/mol para cianidina-3-glucósido; FD = factor de dilución; l = longitud de paso de celda en cm; ε = 26900 (coeficiente de extinción molar) para cianidina-3-glucósido; 1000 = factor de conversión de gramos (g) a miligramos (mg); todos los análisis fueron realizados por triplicado (n = 3), (Yang et al., 2007a; Wrolstad et al., 2003).

Determinación de fenoles totales La cantidad de fenoles totales se determinó según

el método de Folin-Ciocalteu usando ácido gálico como estándar, para esto se prepararon soluciones de 40, 80, 120, 160 y 200 ppm con las que se construyó la curva de calibración, dando un r2= 0,9994. El procedimiento para la evaluación de fenoles totales fue el siguiente, una alícuota de la muestra (0,7 mL) se mezcló con 7 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu, (10 %) dejándose en reposo por 3 min, seguidamente se mezclaron con 7 mL de carbonato de sodio (7,5 %) y la solución resultante se dejó en reposo por 2 horas a temperatura ambiente y en oscuridad, las absorbancias de las muestras fueron leídas a 760 nm en un espectrofotómetro UV-Vis. Todas las muestras fueron analizadas por triplicado, y los fenoles totales fueron expresados como equivalentes en miligramos de ácido gálico (GAE) por g de muestra (Fiskaa et al., 2007; Hülya, 2007; Zheng et al., 2007).

Determinación de la actividad antioxidante

según DPPH El efecto antioxidante de las muestras sobre el

radical estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) se evaluó de la siguiente manera, 0.1 mL de la muestra se procede a mezclar con 3.9 mL de una solución 0,25 mM del radical DPPH, se homogeniza y dejan en reposo por 90 minutos en la oscuridad a 25 ºC, transcurrido el tiempo se procede a medir la absorbancia a 517 nm en el espectrofotómetro UV-Vis. El porcentaje remanente de DPPH en solución fue calculado según la ecuación:

DPPH remanente (%) = (Ao – Af)/ Ao x 100 (2) Donde: Ao, Af, representan respectivamente las

absorbancias inicial del DPPH y de la muestra con DPPH después de 90 min. Todos los análisis fueron realizados por triplicado (n= 3), (Pérez et al., 2003; Llorach et al., 2008; Iqbal et al., 2007).

Análisis estadístico Todos los resultados fueron analizados en el

paquete estadístico SAS V7 (SAS Institute Inc.), el análisis factorial implementado a nivel de laboratorio para la preparación de los extractos contemplo los factores: temperatura de extracción (25, 60, 75 y 90 ºC; 4 niveles) y tiempo de extracción (30, 60, 120 y 240 min; 4 niveles) bajo un pH de extracción de 2 y una solución etanólica al 20%. Los resultados fueron

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sometidos a un análisis de varianza y prueba de rangos múltiples de Duncan (p<0,05) empleando el procedimiento GLM en un diseño completo al azar con arreglo factorial en el programa SAS, la hipótesis planteada en los experimentos fue que todos los tratamientos a la muestra (temperatura de extracción y tiempo de extracción) tienen el mismo efecto sobre la concentración de antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante (Salinas y Daza, 1996; Chipana, 1997).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Antocianinas La extracción de antocianinas de las corontas de

maíz morado en solución etanólica al 20% y pH 2, según el diseño factorial que considero los factores temperatura de extracción con los niveles 25, 60, 75 y 90 ºC, y tiempo de extracción con los niveles 30, 60, 120 y 240 min, indica que existen diferencias altamente significativas con p < 0,01 para los diferentes tratamientos realizados a la muestra según

el análisis de varianza, y prueba de rangos múltiples de Duncan con p < 0,05, Tabla 2.

Los valores encontrados para las antocianinas extraídas de las corontas de maíz morado, según las diferentes condiciones de extracción y la expresión (1), indican valores entre 11,567 mg/g coronta para el tratamiento 1 (Temperatura de 25 ºC y tiempo 30 minutos) y 37,127 mg/g coronta para el tratamiento 12 (temperatura de 75 ºC y tiempo de 240 minutos). De acuerdo al análisis de significancia de Duncan con p < 0,05 se observa que las mejores condiciones de extracción de antocianinas de las corontas de maíz morado se realizan a la temperatura de 75 ºC y en tiempos de 120 y 240 min, Tabla 2 y Fig. 1, las condiciones extracción con bajos contenidos de antocianinas corresponden a la temperatura de 25 ºC y el tiempo de 30 minutos.

Las condiciones de extracción en solución etanólica al 20% y pH 2 se encuentran consideradas en la patente No. US 7, 192,456 B2 (Method of preparing a purified purple corn colour agent) que recomienda soluciones hidroalcohólicas al 20 – 40% y pHs ácidos, (Takahito et al., 2007).

Tabla 2 - Antocianinas, fenoles totales y DPPH remanente en los diferentes tratamientos

T

Temperatura (ºC)

Tiempo (minutos)

Antocianinas (mg/g muestra)

Fenoles totales (GAE mg/g muestra)

DPPH remanente (%)

1 25 30 11,567 ± 1,272 e 23,426 ± 0,233 m 68,80 ± 0,087 a

2 25 60 15,322 ± 0,564 e,d 29,081 ± 0,178 k 65,95 ± 0,121 b

3 25 120 15,721 ± 0,717 e,d 27,337 ± 0,102 l 65,90 ± 0,158 b

4 25 240 22,000 ± 0,840 c,d 29,995 ± 0,128 j 65,39 ± 0,139 c

5 60 30 21,130 ± 2,039 c,d 70,037 ± 0,058 i 17,07 ± 0,451 k

6 60 60 29,437 ± 3,330 a,b,c 70,748 ± 0,155 h 18,28 ± 0,138 i,j

7 60 120 34,629 ± 2,290 a,b 71,561 ± 0,077 g 19,47 ± 0,190 g

8 60 240 34,734 ± 3,793 a,b 72,442 ± 0,051 f 20,11 ± 0,359 f

9 75 30 25,939 ± 1,543 b,c 73,796 ± 0,058 e 27,11 ± 0,190 d

10 75 60 32,649 ± 0,986 a,b 73,830 ± 0,155 e 21,71 ± 0,139 e

11 75 120 35,233 ± 0,733 a 74,761 ± 0,106 d 20,06 ± 0,263 f

12 75 240 37,127 ± 10,226 a 75,337 ± 0,134 c 20,21 ± 0,182 f

13 90 30 26,177 ± 3,493 b,c 75,202 ± 0,178 d 20,03 ± 0,124 f

14 90 60 32,841 ± 4,605 a,b 75,658 ± 0,205 b 18,98 ± 0,155 h

15 90 120 33,286 ± 2,705 a,b 76,962 ± 0,254 a 18,63 ± 0,268 i,h

16 90 240 34,010 ± 10,421 a,b 76,945 ± 0,178 a 18,11 ± 0,155 j

T: tratamiento, solución de extracción: 20% etanol, pH de extracción: 2, valores promedio de 3 repeticiones ± desviación estándar.

Las medias seguidas por las mismas letras dentro de cada columna no son significativas en p < 0,05.

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Figura 1 - Contenido de antocianinas según temperatura y tiempo de extracción en los diferentes tratamientos.

0

10

20

30

40

30 60 120 240

Tiempo de extracción (min)

Ant

ocia

nina

s (m

g/g

mue

stra

)

25 ºC 60 ºC 75 ºC 90ºC

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Yang et al. (2007a), en un trabajo relacionado con la optimización de extracción de antocianinas de corontas de maíz morado de un cultivar de la China en soluciones etanolicas y metanolicas en medio ácido acondicionados con ácido acético y cítrico, encontraron valores cercanos a 6 mg/g muestra (5,90 mg de antocianina/g muestra) según diseño factorial, ese mismo año Yang et al. (2007b) en otra investigación relacionada con la cinética de degradación térmica de antocianinas del maíz morado en medio acuoso encontraron el valor de 0,680 mg de antocianina/g muestra, en ambos casos los valores fueron inferiores a los hallados en la investigación. Escribano-Bailón et al. (2004) en una revisión de antocianinas en cereales mencionaron contenidos de 1642 mg/100g en base húmeda para el maíz morado y 1779 mg/100g en base seca, cercanos a los encontrados en la investigación. La investigación desarrollada por Pedreschi y Cisneros-Zevallos (2007) sobre antocianinas de un extracto comercial de antocianinas del maíz morado proveniente de Perú, determinó contenidos de antocianina/g de la fracción acuosa (FA) según HPLC-DAD en los niveles de 15,43 mg de cianidina 3-glucósido/g de FA, 2,33 mg de pelargonidina 3-glucósido/g de FA, 4,44 mg de peonidina 3-glucósido/g de FA, 10,37 mg de cianidina acilada 3-glucósido/g de FA, 2,83 mg de pelargonidina acilada 3-glucósido/g de FA y 4,85 mg de peonidina acilada 3-glucósido/g de FA, que hacen un total de 40,25 mg de antocianinas/g de FA, valores superiores a los encontrados en la investigación.

Figura 2 - Contenido de antocianinas según factores individuales de temperatura y tiempo de extracción

La evaluación de los efectos individuales de la temperatura y el tiempo de extracción sobre el contenido de antocianinas en los diferentes tratamientos según pruebas de rangos múltiples de Duncan con p < 0,05 para determinar las mejores condiciones de extracción considerando un solo factor (tiempo, temperatura), muestra que no existen diferencias de extracción de antocianinas a las temperaturas de 60, 75 y 90 ºC, a pesar de que a los 75 ºC se observa el mayor valor promedio (32,737 mg/g de coronta), Fig. 2(a); según el tiempo de extracción las antocianinas extraídas a 60, 120 y 240 min son estadísticamente similares, los valores se etiquetan como “a”, Figura 2(b); resultados que difieren cuando se evalúan las interacciones entre ambos factores tiempo *temperatura, Tabla 2 y Fig.1, donde las mejores condiciones de extracción

16.279 b

29.983 a

32.737 a 31.579 a

0

10

20

30

40

0 30 60 90

Temperatura de extracción (ºC)

Ant

ocia

nina

(mg/

g m

uest

ra)

2 (a)

31.968 a30.990 a28.675 a

21.203 b

0

10

20

30

40

0 50 100 150 200 250

Tiempo de extracción (min)

Ant

ocia

nina

(mg/

g m

uest

ra)

2 (b)

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corresponden a los tratamientos 11 y 12 con 35,233 y 37,127 mg/g de coronta, respectivamente.

Fenoles totales El contenido de fenoles totales según la

metodología de Folin-Ciocalteu muestra valores promedio expresados como equivalentes en mg de ácido gálico (GAE) por g de coronta para los extractos entre, 23,426 mg/g para las condiciones temperatura y tiempo de extracción de 25 ºC y 30 min y 76,945 mg/g para la temperatura de 90 ºC y tiempo de 240 minutos. El análisis de varianza de los fenoles totales encontrados en los diferentes extractos (16 tratamientos), de acuerdo al diseño factorial planteado indica diferencias altamente significativas con p < 0,01 para las diferentes condiciones de extracción. Las mejores condiciones de extracción de estos compuestos corresponden a los tratamientos 15 y 16 (temperatura de 90 ºC y tiempos de 120 y 240 min), según la prueba de rangos múltiples de Duncan con p < 0,05 que en la Tabla 2 se etiquetan con letra “a” de la columna respectiva, Fig. 3.

Figura 3 - Fenoles totales según temperatura y tiempo de extracción en los tratamientos

0

20

40

60

80

100

30 60 120 240

Tiempo de extracción (min)

GA

E (m

g/g

mue

stra

)

25 ºC 60 ºC 75 ºC 90 ºC

Pedreschi y Cisneros-Zevallos (2007) en un estudio sobre compuestos fenólicos del maíz morado, al analizar por HPLC-DAD la fracción de acetato de etilo (FAE) de un muestra comercial de antocianinas de maíz morado, determinaron los siguientes compuestos fenólicos según tiempos de retención (tr): 14,61 mg de ácido protocatechuico/g de FAE con un tr de 4,62 min, 8,46 mg de ácido vanillico/g de FAE con un tr de 8,87 min, 6,98 mg de un fenólico

desconocido/g de FAE con un tr de 14,36 min, trazas de ácido p-coumarico con un tr de 14,67 min, 20 mg de derivado de quercetina/g de FAE con un tr de 15,90 min, 5,36 mg de derivado de quercetina/g de FAE con un tr de 16,40 min, 20,02 mg de derivado de quercetina/g de FAE con un tr de 16,92 min, 11,55 mg de derivado de hesperitina/g de FAE con un tr de 18,67 min, 23,10 mg de fenólico desconocido/g de FAE con un tr de 18,95 min, y 25,79 mg de compuestos fenólicos derivados del ácido hidroxicinámico/g de FAE con tr de 21,01; 21,64; 22,44 y 22,81 min, haciendo un total de 135 mg de fenoles totales/g de FAE, resultado que se encuentra por encima de los encontrados en la investigación donde se alcanzaron los 76,962 mg GAE/g de coronta; sin embargo es necesario indicar que la muestra investigada por Pedreschi y Cisneros-Zevallos (2007) corresponde a una FAE de una muestra comercial de antocianinas (extracto atomizado), mientras que la muestra investigada por nosotros fueron corontas de maíz morado.

Los efectos individuales de la temperatura y el tiempo sobre la extracción de los fenoles totales en los diferentes tratamientos según el análisis de varianza indica diferencias altamente significativas con p < 0,01 para las temperaturas y tiempos de extracción, las pruebas de rangos múltiples de Duncan con p < 0,05 para determinar las mejores condiciones de extracción considerando un solo factor (tiempo, temperatura), muestran que existen diferencias de extracción de estos compuestos a las temperaturas de 25, 60, 75 y 90 ºC, Fig. 4(a); y diferencias de extracción según los tiempos de 30, 60, 120 y 240 min para estos compuestos, la Fig. 4(b) grafica y etiqueta estos resultados; siendo estos diferentes cuando se evalúan las interacciones entre ambos factores, Tabla 2 y Fig. 3, donde las mejores condiciones de extracción corresponden a los tratamientos 15 y 16 donde se alcanzaron los 76,962 y 76,945 mg GAE/g de muestra respectivamente. Luque-Rodríguez et al. (2007) al investigar la extracción liquida en soluciones calientes de etanol-agua de antocianinas y otros compuestos fenólicos de residuos de cáscaras de uva producidos en la elaboración del vino, produjo en muestras deshidratadas a 40 ºC valores de fenólicos totales iguales a 126 mg GAE/g de cáscara y 17 mg de antocianina/g de cáscara a los 60 min, valores que fueron superiores en fenoles totales pero similares en antocianinas a los encontrados en la investigación.

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Figura 4. Fenoles totales según factores individuales de temperatura y tiempo de extracción.

76.192 a74.431 b

71.197 c

27.459 d

0

20

40

60

80

100

-10 10 30 50 70 90

Temperatura de extracción (ºC)

GA

E (m

g/g

mue

stra

)

4(a)

60.615 d

62.329 c 62.655 b 63.679 a

50

54

58

62

66

0 50 100 150 200 250

Tiempo de extracción (min)

GA

E (m

g/g

mue

stra

)

4(b)

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Actividad antioxidante La actividad antioxidante de los fenoles simples y

polifenoles presentes en los diferentes extractos obtenidos según diferentes tiempos y temperaturas de extracción, frente al radical estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) se realizó según la metodología descrita, donde una alícuota de la solución antioxidante de los extractos hidroalcohólicos de la coronta de maíz morado diluidos convenientemente (1/4) se hicieron reaccionar con la solución de DPPH (Pérez et al., 2003; Llorach et al., 2008; Iqbal et al., 2007). Los resultados hallados al finalizar el tiempo de reacción muestran valores de DPPH remanente (%) entre 68,80 % para el tratamiento 1 y 17,06 % para el tratamiento 5, Tabla 2, Figs. 5 y 6.

Los valores de DPPH remanente (%) para ser evaluados estadísticamente en un análisis de varianza y prueba de significancia de contrastes múltiples de Duncan con p < 0,05 se transformaron a

.(%).cos remanenteDPPHenoar , los resultados indican que existen diferencias altamente significativas con p

< 0,01 en el análisis de varianza, es decir el diseño factorial implementado con los factores temperatura y tiempo en sus diferentes niveles permite rechazar la hipótesis planteada según los resultado de la actividad antioxidante (similares comportamientos se observaron en antocianinas y fenoles totales). Figura 5 - DPPH remanente (%) al variar las condiciones de temperatura y tiempo de extracción

65.39 25ºC

65.90 25ºC

65.95 25ºC

68.80 25ºC

20.11 60ºC

19.47 60ºC

18.28 60ºC

17.06 60ºC

20.21 75ºC

20.06 75ºC

21.71 75ºC

27.11 75ºC

18.11 90ºC

18.63 90ºC

18.98 90ºC

20.03 90ºC

0 20 40 60 80 10

30

60

120

240

Tiem

po d

e ex

trac

ción

(min

)

DPPH remanente (%)

0

Figura 6 - DPPH remanente (%) en los diferentes tratamientos.

68.80 a

65.95 b65.90 b

65.39 c

17.07 k18.28 i,j

19.47 g20.11 f

27.11 d21.71 e

20.06 f

20.21 f20.03 f

18.98 h18.63 i,h

18.11 j

100

0 20 40 60 80 100

Blanco

12

3

45

67

8

910

1112

13

1415

16

Trat

amie

ntos

DPPH remanente (%)

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El análisis de contrastes múltiples de Duncan con p < 0,05 muestra que los tratamientos 1-4 presentan la mayor cantidad de DPPH en solución, siendo en consecuencia los tratamientos con las mas bajas capacidades antioxidantes, el análisis también indica que los extractos con mayor capacidad antioxidante se encuentran en los tratamientos 5, 16, 15 y 14 debido a que presentaron las mas bajas cantidades de DPPH remanente (17,06; 18,11; 18,63 y 18,98%), las Figs. 5 y 6 describen estos resultados. El análisis de significancia también indica que las extracciones de compuestos antioxidantes de las corontas de maíz morado se realizan eficientemente a temperaturas entre los 60 y 90 ºC, y tiempos entre 60 y 240 minutos.

Relaciones entre antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante

El análisis de varianza de la regresión lineal entre antocianinas y fenoles totales de los diferentes extractos de las corontas de maíz morado indica relaciones altamente significativas con p< 0,01 y un r2= 0.5888, Fig. 7. Figura 7 - Análisis de regresión entre antocianinas y fenoles totales

y = 0.3355x + 6.7338 R2 = 0.5888

0

10

20

30

40

50

60

20 40 60 80

GAE (mg/g muestra)

Ant

ocia

nina

(mg/

g m

uest

ra)

Netzel et al. (2007) en el análisis de frutos

australianos nativos como origen de antioxidantes para alimentos, encontró relaciones similares a los encontrados en la investigación con valores de r2= 0,545 entre antocianinas (µmol/g peso fresco) y fenoles totales (µmol/g peso fresco).

La evaluación de DDPH remanente en solución (%) con los fenoles totales en los diferentes extractos a través del análisis de varianza de la regresión lineal muestra relaciones altamente significativas con p< 0,01 y r2=0,9774, indicando que la actividad antioxidante de los extractos del maíz morado se debe a la presencia de compuestos fenólicos, Fig. 8; similares resultados hallaron Netzel et al. (2007) al evaluar la actividad antioxidante de los frutos nativos

expresado en equivalentes Trolox con los fenoles totales de los frutos, encontrando relaciones cercanas a 1 (r2= 0,949). Figura 8 - Análisis de regresión entre DPPH remanente en solución (%) y fenoles totales

y = -0.9893x + 93.269 R2 = 0.9774

0

20

40

60

80

20 40 60 80

GAE (mg/g muestra)

DPP

H re

man

ente

(%)

Por otro lado, Cai et al. (2004) en una

investigación relacionada con la actividad antioxidante y los compuestos fenólicos de 112 plantas de la medicina tradicional China asociadas con terapias del cáncer, encontraron correlaciones altamente significativas en los extractos metanólicos (r2= 0,9638, 112 plantas; r2= 0,9530, 110 plantas) y acuosos (r2= 0,9580, 112 plantas, r2= 0,9504, 110 plantas) preparados a partir de las 112 plantas de la medicina tradicional China, sugiriendo que los compuestos fenólicos contribuyen significativamente a la capacidad antioxidante de las plantas.

Entre los compuestos fenólicos se encuentran los polifenoles del tipo antocianina y otros fenólicos sencillos; dentro de la investigación se evalúo la relación entre el DPPH remanente en solución (%) con las antocianinas en los diferentes extractos, y los resultados del análisis de varianza de la regresión lineal indican relaciones altamente significativas con p< 0,01 y r2= 0,5367, Fig. 9.

CONCLUSIONES

La extracción de antocianinas en soluciones de etanol al 20 % y pH 2 de corontas de maíz morado se realizan eficientemente a la temperatura de 75 ºC y tiempos entre los 120 y 240 minutos donde se alcanzaron los 35,233 mg/g coronta y 37,127 mg/g coronta, respectivamente, mientras los fenoles totales expresados como equivalentes de ácido gálico en mg/g de coronta llegaron a los 76,962 y 76,945 para los tratamientos 15 y 16 correspondientes a los 120 y 240 min y la temperatura de 90 ºC.

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Figura 9 - Análisis de regresión entre DPPH remanente en solución (%) y antocianinas

y = -1.0379x + 56.318 R2 = 0.5367

0

20

40

60

80

0 10 20 30 4

Antocianina (mg/g muestra)

DPP

H re

man

ente

(%)

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0

La actividad antioxidante de las corontas de maíz morado, expresada como porcentaje de DPPH remanente en solución, se debe principalmente a los compuestos fenólicos presentes en solución, estando en concordancia con lo informado en literatura.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresamos nuestro agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Perú – CONCYTEC, por el financiamiento a la presente investigación del Proyecto No. 317-2007-CONCYTEC.

REFERENCIAS Cabrita L, Fossen T, Andersen Øyvind M. 2000. Colour

and stability of the six common anthocyanidin 3-glucosides in aqueous solutions. Food Chem 68:101-107.

Cevallos-Casals Bolivar A, Cisneros-Zevallos L. 2004. Stability of anthocyanins-based aqueous extracts of Andean purple corn and red-fleshed sweet potato compared to synthetic and natural colorants. Food Chem 86:69-77.

Cai Y, Luo Q, Sun M, Corke H. 2004. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer. Life Sci 74:2157-2184.

Chipana Quispe O. 1997. Guía SAS aplicado a diseños experimentales. Centro de Cómputo, Escuela de Post – Grado, UNALM., pp. 40. Lima

Duhard V, Garnier C, Megard, D. 1997. Comparison of the stability of selected anthocyanin colorants in drink model systems. Agro Food Industry Hi Tech 8:28-34.

Escribano-Bailón MT, Santos Buelga C, Rivas-Gonzalo JC. 2004. Anthocyanins in cereals. J Chromatogr A. 1054:129-141.

Fiskaa HS, Borge GIA, Bengtison GB, Bilger W, Berge A, Haffner K, Asbjørn SK. 2007. Phenolics contents and other health and sensory properties of apple fruit (Malus domestica Borkh., cv. aroma): Effects of post harvest UV-B irradiation. Postharvest Biol Tec 45:1-10.

Giusti MM, Wrosltad RE. 2001. Characterization and measurements of anthocyanins by UV-VIS spectroscopy. In Current protocols in Food Analitical Chemistry (pp 13), New YorK: John Wiley & Sons, Inc. (Unit F1.2.1-F1.2.13).

Giusti MM, Wrolstad RE. 2003. Acylated anthocyanin from edible sources and their applications in food systems. Biocheml Eng J 14:217-225.

Hülya OH. 2007. Total antioxidant activities, phenolics, anthocyanins, polyphenoloxidase activities of selected red grape cultivars and their correlations. Sci Hortic 111:235-241.

Iqbal S, Bhanger MI, Anwar F. 2007. Antioxidant properties and components of bran extracts from selected wheat varieties commercial available in Pakistan. LWT 40:361-367.

Korhonen H. 2002. Technology options for new nutritional concepts. Intern J Dairy Technol 55:79-88.

Luque-Rodríguez JM, Luque de Castro MD, Peréz-Juan P. 2007. Dynamic superheated liquid extraction of anthocyanins and other phenolics from red grape skins of winemaking residues. Bioresource Technol 98:2705-2713.

Llorach R, Martínez-Sánchez A, Tomás-Barberán FA, Gil MI, Ferreres F. 2008. Characterization of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chem 108:1028-1038.

Mazza G, Miniati E. 1993. Introduction. In Anthocyanin in fruit, vegetables and grains (pp 1-28), Boca Raton, FL: CRC Press (Chapter 1).

Netzel M, Netzel G, Tian Q, Schwartz S, Konczak I. 2007. Native Australian fruits – a novel source of antioxidants for food. Innov Food Sci Emerg Technol 8:339-346.

Pascual-Teresa S, Santos-Buelga C, Rivas-Gonzalo JC. 2002. LC-MS Análisis of anthocyanins from purple corn cob. J Sci Food Agr 82:1003-1006.

Pedreschi R, Cisneros-Zevallos L. 2007. Phenolics profiles of Andean purple corn (Zea mays L.). Food Chem 100:956-963.

Pérez RM, Vargas R, Martinez FJ, García CV, Hernández B. 2003. Actividad antioxidante de los alcaloides de Bocconia arborea. Estudio sobre seis métodos de análisis. Ars Pharm 41(1):5-21.

Salas E, Le Guernevé C, Fulcrand H, Poncet-Legrand C, Cheynier V. 2004. Structure determination and colour properties of a new directly linked flavonol-anthocyanin dimer. Tetrahedron Lett 45:8725-8729.

Salinas Flores J, Daza Portocarrero L. 1996. Manual de SAS para PC´S. Departamento de Estadística e

Page 73: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Gorriti Gutierrez et al. Fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas de Zea mays

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 518

Yang Z, Fan G, Gu Z, Han Y, Chen Z. 2007a. Optimization extraction of anthocyanins from purple corn (Zea mays L.) cob using tristimulus colorimetry. Eur Food Res Technol; DOI 10.1007/S 00217-007-0735-4: Springer-Verlag.

Informática, Facultad de Economía y Planificación, UNALM., pp. 114. Lima.

Schwartz M, Hillebrand S, Habben S, Degenhardt A, Winterhalter P. 2003. Application of high-speed countercurrent chromatography to the large-scale isolation of anthocyanins. Biochem Eng J 14:179-189. Yang Z, Han Y, Gu Z, Fan G, Chen Z. 2007b. Termal

degradation kinetics of aqueous anthocyanins and visual color of purple corn (Zea mays L.). Innovative Food Science & Emerging Technologies INNFO-00478, pps 7.

Takahito IT, Makoto ST, Hiramitsu AT, Takatoshi K T. 2007. Method of preparing a purified purple corn colouring agent. United States Patent Patent No. US 7,192,456 B2.

Zheng Y, Wang SY, Wang CY, Zheng W. 2007. Changes in strawberry phenolics, anthocyanins, and antioxidant capacity in response to high oxygen treatments. LWT 40:49-57.

Wrolstad RE, Durst RW, Lee J. 2005. Tracking colour and pigment changes in anthocyanins products. Trends Food Sci Tech 16:423-428.

Page 74: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

© 2009 The Authors © 2009 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 8 (6), 519 - 528

BLACPMA ISSN 0717 7917

Artículo Original | Original Article

BLACPMA es una publicación de la Cooperación Latinoamericana y Caribeña de Plantas Medicinales y Aromáticas

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Actividad antioxidante e inhibición de la peroxidación lipídica de extractos de frutos de mortiño (Vaccinium meridionale SW)

[Antioxidant activity and inhibition of lipid peroxidation of mortiño fruits extracts (Vaccinium meridionale SW] Carlos GAVIRIA MONTOYA1, Clara OCHOA OSPINA1, Nelly SÁNCHEZ MESA1, Clara MEDINA CANO2, Mario LOBO ARIAS2, Paula GALEANO GARCÍA1, Ana MOSQUERA MARTÍNEZ1, Angélica TAMAYO TENORIO1, Yasmin LOPERA

PÉREZ1, Benjamín ROJANO1* 1Laboratorio de Ciencia de Alimentos. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, Universidad Nacional de Colombia

2CORPOICA “La Selva”, Km 7 vía Rionegro Llanogrande, Antioquia, Colombia

Abstract

Mortiño (Vaccinium meridionale fruits) is considered as a functional food. It is rich in polyphenolic compounds that have colorant and antioxidant properties, and these structures are potential health protectors. In this work phenol an anthocyanic contents were determined with values of 201 ± 10 y 609 ± 39 respectively; antioxidant activity was studied with the methodologies DPPH (2404 ± 120 TEAC values), ABTS (8694 ± 435 TEAC values) and FRAP (581± 29 AEAC values); all results are comparable or higher than the Vaccinium reported in other researches. The effects of anthocyanic extracts of mortiño were also studied over the lipidic peroxidación of corn oil, analyzing the evolution of conjugated diene (CD), the value of peroxides (PV) and the formation of reactive substances with 2-thiobarbituric acid, as indicators of oxidation, expressed as the inverse of the rate of oxidation (Φ) with values of 3.0 × 10-4 ± 8.9× 10-6, 8.0 × 10-4 ± 6.1× 10-5 y 4.0 × 10-4 ± 1.0× 10-4, respectively.

Keywords: peroxidation, mortiño, antioxidant, Vaccinium

Resumen

El mortiño (o frutos del Vaccinium meridionale) se puede considerar como un alimento nutracéutico, porque es rica en compuestos polifenólicos que tienen la propiedad de ser colorantes y antioxidantes potencialmente protectoras de la salud. En este trabajo se determino el contenido de antocianinas y fenoles con valores de 201 ± 10 y 609 ± 39 respectivamente; la actividad antioxidante se estudio por las metodologías DPPH (2404 ± 120 valores de TEAC), ABTS (8694 ± 435 valores de TEAC) y FRAP (581± 29 valores de AEAC), todos estos resultados son comparables o superiores a los Vaccinium reportados en otras investigaciones. Además, se estudiaron los efectos de los extractos antociánicos del mortiño sobre la peroxidación lipídica de aceite de maíz, analizando la evolución de dienos conjugados, el valor de peróxidos y la formación de sustancias reactivas con el ácido 2-tiobarbitúrico, como indicadores de la oxidación, expresados como el inverso de la tasa de deterioro (Φ) con valores de 3,0 × 10-4 ± 8,9× 10-6, 8,0 × 10-4 ± 6,1× 10-5 y 4,0 × 10-4 ± 1,0× 10-4, respectivamente.

Palabras Clave: peroxidación, mortiño, antioxidantes, Vaccinium

Recibido | Received: August 10, 2009. Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: October 30, 2009. Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009 Declaración de intereses | Declaration of interests: Los autores no tienen conflicto de intereses declarados. Financiación | Funding: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) de Colombia, por el apoyo económico a través del proyecto numero 2008L1363-333 Citenlo como | This article must be cited as: Carlos Gaviria Montoya, Clara Ochoa Ospina, Nelly Sánchez Mesa, Clara Medina Cano, Mario Lobo Arias, Paula Galeano García, Ana Mosquera Martínez, Angélica Tamayo Tenorio, Yasmin Lopera Pérez, Benjamín Rojano. 2009. Actividad antioxidante e inhibición de la peroxidación lipídica de extractos de frutos de mortiño (Vaccinium meridionale SW). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):519 – 528. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: [email protected]

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INTRODUCCIÓN

Los antioxidantes son sustancias que disminuyen o retardan las reacciones de oxidación sobre diferentes sustratos y pueden ser naturales o sintéticos. El butilhidroxianisol (BHA), y el butil hidroxitolueno (BHT) son los antioxidantes sintéticos de mayor uso en la industria de alimentos y farmacéutica; sin embargo, se han encontrado efectos secundarios, como el aumento del colesterol, hepatomegalia e inducción de cáncer hepático, entre otras (Fuchs, 1998; Bush and Taylor, 1998; Ito et al., 1983); debido a esto, y a la creciente importancia de los antioxidantes en la industria farmacéutica y alimenticia es necesaria la búsqueda de moléculas alternativas de origen natural con gran actividad y que no tengan efectos citotóxicos, ni genotóxicos (López et al., 2008; Rojano et al, 2008a, Rojano et al, 2008b).

Los productos vegetales, son entonces una alternativa para usar como antioxidantes, porque poseen una variedad de compuestos como: antocianos, flavonoides, carotenoides, acido ascórbico entre otros que pueden ser inocuos para la salud y que además, actúan a bajas concentraciones. Muchos antioxidantes son usados en la industria de alimentos por su capacidad conservadora; porque, retardan el proceso de rancidez, disminuyen la posibilidad de generación de compuestos tóxicos, evitan la decoloración de los pigmentos, no permiten los cambios en la textura, disminuyen la pérdida de valor nutricional causada por la degradación de los ácidos grasos esenciales y por la destrucción de las vitaminas A, E y D (Parr and Bolwell, 2008; Rojano et al., 2008a; y muchos de estos compuestos o sus fuentes naturales, se consideran como nutracéuticos.

La industria química en las aéreas farmacéuticas y de alimentos, consideran que el crecimiento del mercado de los antioxidantes requiere de la educación apropiada del consumidor y de investigaciones científicas pertinentes. Los estudios deben estar dirigidos a la búsqueda de compuestos puros o extractos activos como nuevas fuentes antioxidantes; y que a su vez, deben focalizarse hacia los beneficios que producen los antioxidantes en la salud de modo preventivo (Cornelli, 2009).

El género Vaccinium (Ericaceae) tiene cerca de 400 especies y los frutos han atraído el interés de muchos investigadores alrededor del mundo, debido al alto contenido de compuestos polifenólicos, tales como ácido cinámico, flavonoles, antocianinas y

antocianidinas (Parr and Bolwell, 2008; Kahkonen, 2001; Kalt et al., 2001; Prior et al., 1998). La actividad antioxidante de las bayas del género Vaccinium como: arándano (blueberry) y arándano rojo (lingonberry) se ha encontrado que está influenciada por el contenido de antocianinas y fenoles totales, los genotipos, la variación en las condiciones ambientales, el estado de madurez de las frutas y de las condiciones de almacenamiento en poscosecha. (Beccaro et al., 2006; Cho et al., 2004; Lohachoompol, 2008; Çelik, 2008; Conner et al., 2002a, 2002b; Kalt et al., 1999, 2003).

En la Zona alto Andina en América del Sur, se reportan 3 especies de Vaccinium: V. corymbodendrum, V. floribundum y V. meridionale; distribuidas desde Venezuela hasta Bolivia a una altitud entre 2600 a 4000 m. En Colombia la especie Vaccinium meridionale es conocida como “Mortiño” y la colecta se realiza de forma extractiva en los bosques, ocasionando daño a las poblaciones naturales debido a la gran demanda de los frutos. La agroindustria del mortiño en Colombia es incipiente y el fruto es transformado en diferentes productos como dulces, mermeladas y vinos.

Teniendo en cuenta el creciente interés en las propiedades nutraceúticas de los frutos del genero Vaccinium y la gran demanda de aditivos naturales en los mercados internacionales; en este trabajo, se estudian las propiedades antioxidantes del mortiño (V. meridionale), y se determina el contenido de compuestos polifenólicos; además, se evalúan los efectos de los extractos antociánicos sobre la conservación a la peroxidación lipídica de aceite de maíz; analizando la evolución de la formación de dienos conjugados, valor de peróxidos y la determinación del contenido de sustancias reactivas con el ácido 2-tiobarbitúrico, como indicadores de la oxidación. Todo esto, para señalar el uso potencial del mortiño, como alimento nutracéutico y aditivo conservante de la peroxidación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal Los frutos evaluados fueron obtenidos de la

colección de germoplasma de Vaccinium, ubicada en el Centro de Investigaciones “La Selva” de Corpoica, localizado en el municipio de Rionegro, Antioquia (Colombia) a 2120 msnm, a una temperatura promedia de 17 ºC y humedad relativa media del 78%. El lugar experimental pertenece a la zona de

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vida bosque húmedo Montano Bajo (bh-MB) y está ubicado a 06° 08´ 06´´ de latitud norte y 75° 25´ 03´´ de longitud oeste. El aceite de maíz es libre de aditivos proveniente de Industrias del Maíz, Cali, Colombia (libre de aditivos).

Reactivos y equipos El radical libre DPPH (1,1-difenil–2-

picrilhidrazilo), fosfato ácido de sodio, MeOH, ácido acético, tricloruro de hierro, 2,4,6-tri (2-piridil) triazina (TPTZ) fueron comprados a Aldrich Chem. Co (Millwakee, WI), ácido 2,2-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico) (ABTS), ácido tiobarbiturico (TBA), butilhidroxitolueno (BHT), 1,1,3,3 tetraetoxipropano (TEP) fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO), ciclohexano, acido clorhídrico, n-hexano, 2-propanol, 1-butanol, sulfato de hierro, cloruro de bario, tiosulfato de amonio y sulfato de bario fueron obtenidos de Merck (Alemania). El agua usada en los experimentos fue grado HPLC. Todos los experimentos se realizaron en un espectrofotómetro UV-Vis Jenway 6405.

Preparación de extractos para medir la actividad antioxidante

Los extractos se obtuvieron de la siguiente forma: 20 g. de cada una de las muestras fueron homogenizadas, usando como solvente de extracción metanol–HCl 1% en una relación (6:1 p/v). Este procedimiento se repitió hasta agotar la muestra. Los extractos fueron filtrados en papel Wathman No 4 y concentrados en un rotavapor a 40 °C. Los extractos se almacenaron a –20 °C durante el periodo de estudio.

Preparación de las muestras para la peroxidación lipídica

A 50 g de aceite de maíz libre de aditivos, se adiciona el extracto antociánico mezclado con el agente emulsificante NP10, hasta obtener concentraciones finales de 250, 500 y 750 μg/mL. Como patrón se utilizó BHT a una concentración de 500 μg/mL y como blanco de muestra se preparó una muestra de aceite sin antioxidantes. Se almacenaron en recipientes de vidrio a una temperatura de 30 ºC por 10 días. Los productos de oxidación se evaluaron determinando el Valor de Peróxido (PV), sustancias reactivas al ácido 2-tiobartiurico (TBARS) y la formación de dienos conjugados (DC).

Evaluación de la capacidad antioxidante por el método del DPPH

Se empleó el método de Brand-Williams et al (1995) con algunas modificaciones (Rojano et al, 2008a). El 1,1-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH●), es un radical libre estable que presenta una coloración púrpura en medio metanólico, como consecuencia de la donación de un electrón o un protón por un compuesto con poder antioxidante la tonalidad desaparece. Este procedimiento se lleva a cabo utilizando 10 μL del compuesto estudiado y 990 μL de la solución metanólica de DPPH● (20 mg/L). Como referencia se usó la misma cantidad de DPPH y 10 μL del solvente de la muestra (DMSO). Luego de 30 minutos de reacción a temperatura ambiente y en la oscuridad, se lee la absorbancia a una longitud de onda de 517 nm. Para cada muestra estudiada se calcula el porcentaje de inhibición del radical y los resultados se expresan como valores TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) mediante la construcción de una curva patrón usando varias concentraciones de antioxidante TROLOX®.

Evaluación de la capacidad antioxidante por el método del radical catiónico ABTS+.

La generación del radical catiónico ABTS+. constituye la base de uno de los métodos espectrofotométricos que mas se ha utilizado para determinar la actividad antioxidante total de extractos, compuestos puros, mezclas acuosas y bebidas (Re et al., 1999). El radical es un cromóforo que absorbe a una longitud de onda de 415 ó 732 nm y se genera por la reacción de oxidación del ABTS (2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato de amonio)) (3,5 mM) con persulfato de potasio (1,25 mM). Después de 24 h de reacción, se ajusta la absorbancia con PBS pH 7,4 hasta 0,70 unidades, a una longitud de onda de 732 nm. Para la evaluación se emplean 10 μL del compuesto y 990 μL de la solución del radical ABTS●+. Luego de 30 min de reacción a temperatura ambiente y en la oscuridad, se lee el cambio en la absorbancia respecto a la referencia del reactivo. La referencia consiste 10 μL del solvente de la muestra y 990 μL de la solución del radical ABTS●+. Los resultados se expresan como valores TEAC mediante la construcción de una curva patrón usando diferentes concentraciones de TROLOX® (Arts et al., 2004).

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Evaluación de la capacidad reductora FRAP El principio de este método está basado en el

incremento en absorbancia debido a la formación del complejo 2,4,6-tripyridil-s-triazina (TPTZ)-Fe(II) en presencia de un agente reductor (Benzie and Strain, 1996). El reactivo es una disolución de TPTZ (10 μM en HCl 40 μM) y FeCl3 0,3 μM en buffer ácido acético-acetato de sodio (pH 3,4); la mezcla de reacción consistió en 900 μL de ésta solución, 50 μL de una solución del extracto en MeOH y 50 μL de agua destilada. Luego de 7 min de reacción se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 593 nm. Los valores FRAP son expresados teniendo en cuenta una curva de referencia de ácido ascórbico como patrón primario; la actividad de cada muestra se expresó como valor FRAP (mg de ácido ascórbico por cada 100 g de antioxidante).

Determinación de fenoles totales La determinación de fenoles se realizó por el

método colorimétrico de Folin-Ciocalteu (Singleton and Rossi, 1965). Se construye una curva patrón usando como estándar ácido gálico. Se diluye el extracto a una concentración en la cual el contenido de fenoles se encuentra dentro del intervalo de la curva patrón. Los resultados se expresaron como mg de ácido gálico/100g de fruta fresca. Las lecturas se realizan a 760 nm.

Determinación de antocianinas totales Las antocianinas totales se determinaron mediante

el método diferencial de pH (Gaviria et al., 2007). Las absorbancias fueron medidas a 530 nm y 700 nm en buffers de pH 1,0 y 4,5; usando la expresión A = [(A530 - A700)pH1.0 - (A530 - A700)pH4.5], y el cianidin-3-glucósido con un coeficiente de extinción molar de 26900. Los resultados se expresaron como mg equivalentes de cianidin-3-glucósido por 100 g de fruta fresca.

Determinación de dienos conjugados (DC) El contenido de DC se determinó por un

procedimiento descrito previamente (Zuta et al., 2007), con algunas modificaciones: 10 µL de muestra se mezclan con 2990 µL de ciclohexano y se agita en un vortex por 10 s, luego se toman 500 µL de la mezcla y se le adicionan 1500 µL de ciclohexano. La absorbancia de los dienos conjugados se mide a 234 nm. Los resultados se expresaron como valores de dienos conjugados (DC), el BHT se uso como

referencia a una concentración de 500 μg/mL. Los valores de dienos conjugados (DC, adimensionales) se calculan según la expresión: CD = A/C*L, donde A: Absorbancia de la muestra a 234 nm, C: Concentración de la muestra (g/100 mL) y L: Longitud de la celda (cm) = 1 cm.

Determinación del valor de peróxidos (PV) El valor de peróxidos se determinó mediante el

método descrito por Shanta & Decker (1994), con algunas modificaciones realizadas por Rojano et al. (2008c). Este método se fundamenta en la capacidad de los peróxidos lipídicos de oxidar el Fe2+ hasta Fe3+. A 300 μL de muestra, se adicionan 20 mL de hexano-2-propanol (3:2) y se agita por 10 segundos, luego se toma 1,5 mL de la mezcla y se adiciona 2,8 mL de una solución de metanol-1-butanol (2:1). De esta mezcla se toman 100 μL y se adiciona 900 μL de la solución estándar, preparada mediante la adición de NH4SCN 0,44 M al sobrenadante formado por la mezcla FeSO4 0,144 M y BaCl2 en HCl 0,4 M, se agita y se incuba por un periodo de 20 min en la oscuridad. Se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm. Los resultados se expresaron como meq de peróxido/kg de muestra, mediante el uso de una curva estándar construida usando peróxido de cumeno, como patrón.

Determinación del contenido de sustancias reactivas con el ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS)

La determinación del contenido de sustancias reactivas con el ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS) se realizó mediante el procedimiento de Guzmán-Chozas et al. (1997), con algunas modificaciones realizadas por Rojano et al. (Guzmán-Chozas et al., 1997; Rojano et al., 2008c). En un tubo de ensayo se colocan 5 mL del reactivo de TBA (ácido 2- tiobarbitúrico 0,7% en ácido acético glacial al 99,9%), y 0,4 g de muestra y se agita por 10 s y fueron llevados a un baño de agua a 90° C por 1 hora. Los tubos, enfriados en agua, se centrifugaron a 5000 rpm por 20 min tras lo cual se eliminó el sobrenadante. Una porción de la muestra se llevó a una cubeta de vidrio y su absorbancia fue leída a 532 nm. Los resultados se expresaron como mg de malonadialdehído/kg (MDA) de muestra usando una curva estándar. La curva estándar fue construida realizando diluciones apropiadas de una solución acuosa de 1,1,3,3 tetraetoxipropano 1,0x10-3 M. Estas soluciones fueron tratadas con el reactivo de TBA (ácido 2- tiobarbitúrico 0,02 M en ácido acético

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glacial al 90%) y la absorbancia fue medida a 532 nm.

Análisis estadísticos Las regresiones fueron calculadas con un nivel de

significancia del 95% (p<0,05), usando el programa Statgraphics Plus versión 5.1 (Statistical Graphics Corp., Rockville, MD).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El contenido de antocianinas totales expresados como mg eq de cianidin - 3- glicosido/100 g fruta fresca (Tabla 1), encontradas en los frutos del mortiño (Vaccinium meridionale), es alto (201 ± 10) comparado con los reportados para los frutos de otras especies. Prior et al. (1998), encontró que el contenido de antocianinas totales valores de 92 – 235 para el Northern Highbush blueberry (Vaccinium corymbosum), 60 – 187 para el Rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei) y 290 – 300 para Lowbush blueberry (Vaccinium angustifolium) (Prior et al., 1998; Kalt and Dufour, 1997; Capocasa et al., 2008). Wang & Ballington (2007), encontraron para el deerberry (Vaccinium stamineum) un contenido de 371 – 630. La coloración de la piel de los frutos de mortiño varía entre azul a rojo o azul intenso y depende de la presencia de antocianinas.

En los frutos del mortiño (Vaccinium meridionale), el contenido de fenoles totales (mg eq de acido galico/100 g de fruta fresca) es bastante alto comparado con los frutos de otros Vaccinium e incluso de otras especies. El mortiño presenta un contenido de fenoles totales de 609 ± 39, él es comparable con el presentado por el Northern Highbush blueberry, Rabbiteye blueberry, Lowbush blueberry, los cuales son de 181 – 473, 230 – 457, 290 – 495, respectivamente y 151 – 246 para la uva (Vitis vinifera) (Prior et al., 1998; Kalt and Dufour, 1997; Capocasa et al., 2008; Wang & Ballington 2007).

Los métodos DPPH y ABTS, evalúan la capacidad de los extractos de mortiño para atrapar radicales libres en medios orgánicos y acuosos respectivamente. La actividad antioxidante del mortiño expresada por la metodología del radical DPPH, fue mucho menor a los valores obtenidos para el radical ABTS. Esto puede ser debido a que la fracción evaluada del fruto es un extracto metanólico acidificado, con una alta concentración de compuestos polares que presentan una mejor

solubilidad en los medios acuosos donde se realiza el ensayo con el radical ABTS.

Los frutos del genero Vaccinium, se caracterizan por poseer una gran cantidad de diferentes compuestos con actividad antioxidante (Beccaro et al., 2006). La actividad antioxidante evaluada con el radical DPPH● de los frutos del Vaccinium meridionale Sw., presenta un valor de 2404 TEAC, ligeramente mayores a los reportados para blueberry (1035) y menores que los encontrados en Andean blackberry (4100 TEAC) (Prior et al., 1998; Kalt and Dufour, 1997; Capocasa et al., 2008; Wang & Ballington, 2007).

La actividad antioxidante evaluada con el radical ABTS+● de los frutos del Vaccinium meridionale Sw., presenta un valor de 8694 TEAC; mucho mayor que los reportados para blueberry (Vaccinum spp. cv. Biloxi) 3945 TEAC, Rabbiteye blueberries (Vaccinium ashei) 1973 – 3829 TEAC, Southern highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L. Hybrids) 811-2645 TEAC y blackberries (Rubus L.) con un valor de 1804-2650 TEAC. (Netzel et al., 2007; Vasco et al., 2008; Sellappan et al., 2002).

Son pocos los reportes sobre el valor FRAP expresado como AEAC para el género Vaccinium, sin embargo los extractos de mortiño con un valor de 581 mg de acido ascórbico por cada 100 g de fruta fresca son mejores reductores que la mayoría de las frutas reportadas, excepto la curuba y la mora (Botero et al., 2007).

Peroxidación lipídica de aceite de maíz En los alimentos con alto contenido de lípidos, la

etapa más importante de la peroxidación, es la formación y descomposición de los hidroperóxidos; que generan una serie de compuestos oxidados como cetonas, aldehídos, alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad, que determinan el valor sensorial del alimento; proceso denominado rancidez oxidativa. Los antioxidantes pueden retardar la rancidez, pero nunca la detienen, porque la oxidación ocurre a bajas presiones de oxigeno y se hace inevitable, a pesar del uso de todas las metodologías de conservación, como frio, escaldado y empaque (Rodríguez et al., 2007; Nedyalka and Emma, 2001; Aubourg et al., 2004).

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Tabla 1. Contenido de antocianinas, fenoles totales, porcentaje de sólidos extraíbles y actividad antioxidante.

Antocianinas totales

200,6 ± 10,2 mg eq de cianidin – 3-glicosido/ 100g fruta fresca

Fenoles totales 609 ± 31 mg eq de ácido gálico/ 100g de fruta fresca

Rendimiento† 13,26 ± 0,34 % TEAC-DPPH 2404 ±120 μM de Trolox/ 100g de fruta

fresca TEAC-ABTS 8694 ±435 μM de Trolox/ 100g de fruta

fresca FRAP 581 ±29 mg de ácido Ascórbico/ 100g de

fruta fresca † base húmeda

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Las muestras de aceite de maíz, se monitorearon

por un periodo de 10 días midiendo los niveles de DC, PV expresado como meq de peróxido/kg. de muestra (meq/kg) y TBARS muestra). El proceso de oxidación se inhibió usando extractos metanólicos de mortiño como antioxidante a diferentes concentraciones metanólicas (250, 500, y 750 μg/mL), y BHT a 500 μg/mL, que es la concentración máxima permisible en alimentos.

Dienos conjugados (DC) La formación de dienos conjugados (DC) ocurre

durante las primeras fases de la oxidación lipídica. La evaluación del contenido de DC es un buen parámetro para la valoración del deterioro oxidativo de aceites, y a la vez indica la efectividad del antioxidante (Aubourg et al., 2004). La Fig. 1 muestra el incremento relativo del contenido de DC en las muestras de aceite de maíz con extracto antociánico, BHT y blanco a una temperatura constante de almacenamiento de 30 °C, como una función del tiempo. Se observó un patrón regular de incremento para todas las muestras durante el tiempo de experimentación; hasta el día tres el incremento de DC en las muestras con antioxidante no fue apreciable, mientras que el blanco aumentó considerablemente hasta el día cuatro.

Las muestras con extractos de antocianinas presentaron un incremento entre el día tres y el día cuatro y a partir de allí todas ellas exhibieron un comportamiento aproximadamente constante. En el día ocho todas las muestras presentaron un incremento grande en el contenido de DC hasta el día diez. Los valores DC de todas las muestras estabilizadas fueron mucho menores que el blanco; indicando una buena actividad antioxidante de los extractos. Se observaron altos contenidos de DC para el blanco, indicando una intensidad considerable de

la oxidación, seguido por las muestras con extractos a las concentraciones de 250, 500, 750 μg/mL y BHT respectivamente. El contenido de DC de la muestra a la concentración de 250 μg/mL, fue el más alto de las muestras evaluadas, con valores menores que el blanco, durante todo el periodo de almacenamiento.

Valor de peróxido (PV) El valor de peróxido es un buen indicador del

grado de oxidación inicial en aceites. La Fig. 2, muestra el incremento de VP para todas las muestras durante el tiempo de almacenamiento. El incremento del VP es debido a la formación de hidroperóxidos, productos de la oxidación primaria (Abdulkarim et al., 2007). Figura 1. Efecto del extracto antociánico a diferentes concentraciones y BHT en la formación de DC en aceite de maíz durante diez días de almacenamiento a 30 ºC.

25003500450055006500

2 4 6 8 10 12Tiempo (días)Die

nos

Con

juga

dosBHTBlanco 250500750

El incremento del VP fue aproximadamente constante durante los cuatro primeros días de experimentación, pero a diferentes gradientes según la concentración de extracto o del BHT. A partir del día cuatro el incremento en el VP del blanco y la concentración de 250 μg/mL de extracto fue mayor que el obtenido con las otras muestras. Los valores de peróxido estuvieron en el rango de 0,238 a 0,252 meq/kg para las muestras que contenían el extracto antociánico, mientras que para el BHT fue de 0,235 meq/kg y 0,259 meq/kg para el blanco en el décimo día. El blanco presentó el contenido más alto de VP, seguido de 250, 500, 750 μg/mL y BHT, respectivamente. La velocidad de incremento de VP permaneció uniforme para 500 y 750 μg/mL durante todo el periodo de almacenamiento, sugiriendo una buena eficiencia de los extractos a 500 y 750 μg/mL para la estabilización del aceite de maíz (Abdulkarim et al., 2007).

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Sustancias reactivas al acido tiobarbitúrico (TBARS) La Fig. 3 muestra el efecto de las diferentes concentraciones del extracto antociánico, BHT y el blanco sobre la formación de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) en las muestras de aceite de maíz en el tiempo. Un incremento continuo de TBARS fue observado en todas las muestras durante el tiempo de almacenamiento. El blanco exhibió los valores más altos de TBARS en todas las etapas de análisis durante el almacenamiento. El aumento en la concentración de TBARS fue lento y similar para todas las muestras hasta el día 3, a partir del cual se aceleró la formación en el blanco y las concentraciones de 250 y 500 μg/mL hasta el último día. El incremento en el contenido de TBARS fue más intenso y de comportamiento lineal para el blanco y las muestras con 250 y 500 μg/mL de extracto antociánico. Las muestras de 750 μg/mL y BHT se comportaron igual entre el día 3 y el día 4, y a partir del cual mostraron un comportamiento exponencial, exhibiendo un mayor contenido de TBARS la muestra de 750 μg/mL, en especial entre los días 8 y 10 donde el incremento fue más pronunciado.

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El comportamiento de la formación de DC, PV y TBARS en el tiempo, puede modelarse mediante regresiones exponenciales cuyas pendientes dependen de la concentración y de la naturaleza del antioxidante. Por esto, se hace necesario obtener un parámetro (Φ) que determine la acción antioxidante de cualquier compuesto en un proceso oxidativo en particular.

Para calcular el valor Φ del compuesto en los ensayos DC, se realizó el siguiente procedimiento descrito por Rojano et al. (2008c): se determinó φi que es la pendiente de la regresión exponencial de los DC contra el tiempo, para cada concentración. Con los valores de φi, se calculó la relación φ0/φi; donde φ0 es la pendiente del blanco. El valor de la pendiente de la regresión lineal de φ0/φi contra la concentración es el valor de la constante Φ, que en este caso particular, refleja el efecto total de las antocianinas como antioxidante, con respecto a la inhibición del proceso de oxidación del aceite de maíz, en la formación de DC. El cálculo de Φ, se hizo a partir de la siguiente ecuación:

φ0/φi = 0,0003(mg/kg de muestra) + 0,9413

La constante global de inhibición (Φ) de la formación de DC en el aceite de maiz por efecto del

extracto antociánico es: Φ = 3,0 × 10-4 ± 8,9× 10-6 mg/kg de muestra; con una r2 = 99,93%, F = 1342,71 y p = 0,0174. Figura 2. Efecto del extracto antociánico a diferentes concentraciones y BHT en la formación de PV en aceite de maíz durante 10 días de almacenamiento a 30 °C

0,2

0,21

0,22

0,23

0,24

0,25

0,26

0,27

1 6 11

Valo

r de

Peró

xido

s (m

eq /

Kg)

Tiempo (días)

BHT

Blanc

250

500

750

Figura 3. Efecto del extracto antociánico a diferentes concentraciones y BHT en la formación de TBARS en aceite de maíz durante diez días de almacenamiento a 30 ºC.

3000

4000

5000

6000

7000

0 2 4 6 8 10 12TBAR

S (m

g / K

g de

mue

stra

)

Tiempo (días)

BHT

Blanco

250

500

750

De otro lado, a partir de los valores de φ0/φi se pudo calcular el porcentaje de inhibición para cada concentración de antioxidante, expresado como:

% de inhibición = (1 - φ0/φi) * 100 (1)

El BHT presentó mayor capacidad para inhibir los procesos oxidativos acelerados a 30 °C en aceite, en comparación con los extractos de antocianinas, porque a la concentración de 500 μg/mL inhibió un 37,7%, mientras que las antocianinas a 750 μg/mL, inhibieron solamente el 15,7%; estos resultados están acordes con diversos reportes bibliográficos (Abdulkarim et al., 2007).

Para calcular la constante (Φ) en los ensayos PV, se procede como en el caso anterior; se calculan los valores de φ0, φi y las relaciones de φ0/φi; se calcula el valor de la constante global Φ para la inhibición de

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formación de hidroperóxidos en el proceso de oxidación de aceite a 30 °C. El valor resultante es: Φ = 8,0 × 10-4 ± 6,1× 10-5; con una r2 = 99,45%, r = 0,995, F = 181,8 y p = 0,0471. Con los valores de φ0/φi se calculó el porcentaje de inhibición para cada concentración de antioxidante, con la ecuación (1). Al comparar los resultados obtenidos para las muestras con contenido de antocianos y BHT se pudo observar una mayor capacidad de inhibición del proceso oxidativo para el BHT, porque la concentración de 500 μg/mL inhibió un 41,4 %, en comparación con un 34,1% obtenido con las antocianinas a 750 μg/mL; resultados que concuerdan con diversos reportes bibliográficos (Wanasundara and Shahidi, 1998).

Los tratamientos con el extracto antociánico de mortiño redujeron la oxidación del aceite de maíz durante la incubación a 30 °C, demostrando un efecto inhibitorio en la formación de TBARS e indicando una protección potencial de la oxidación para el aceite. Con los datos de la figura 3, se calcularon los valores de φ0, φi y las relaciones de φ0/φi. De igual manera, que en el caso anterior se calculó el valor de la constante global Φ para inhibir la formación de TBARS en el proceso de oxidación de aceite a 30 °C. El valor resultante fue Φ = 4,0 × 10-4 ± 1,0× 10-5, con una r2 = 91,52 %, F = 10,80 y p = 0,1881. De otro lado, a partir de los valores de φ0/φi se calculó el porcentaje de inhibición para cada concentración de antioxidante, con la ecuación (1).

El BHT presentó mayor capacidad para inhibir el proceso oxidativo a 30 °C en aceite de maíz, en comparación con los extractos antociánicos, porque la concentración de 500 μg/mL inhibió un 37,2%, mientras que las antocianinas a 750 μg/mL, inhibieron solamente el 19,6%; estos resultados están acordes con diversos reportes bibliográficos para otras estructuras químicas (Siriwardhana and Jeon, 2004; Rojano et al., 2008c).

CONCLUSIONES

El mortiño (Vaccinum meridionale SW) es una fruta con alto contenido de compuestos polifenólicos, que se expresan a través de su alta capacidad antioxidante, con valores comparables o superiores a los diversos Vaccinium encontrados en diferentes latitudes del mundo; los cuales tienen índice alto de comercialización, como alimentos nutracéuticos o como fruta fresca. Una limitación de las técnicas usadas es que el comportamiento reductor de los extractos del mortiño se puede ver afectado por el

contenido de azucares reductores y acido ascórbico. Teniendo en cuenta esto, el extracto antociánico de mortiño, presentó una buena eficiencia inhibitoria de la peroxidación lipídica en comparación con el blanco, sin embargo el antioxidante sintético BHT mostró el mayor efecto inhibitorio de la oxidación lipídica. Por lo tanto, se puede concluir que el extracto antociánico, en las concentraciones estudiadas, es capaz de proteger el aceite de maíz contra la oxidación y se puede recomendar como una buena fuente de antioxidantes naturales para la estabilización de sistemas alimenticios, especialmente los aceites vegetales. Estos resultados están acordes con los conceptos sobre la paradoja polar planteada por Frankel et al. (1997); de tal manera, que en fase continua como los aceites, los antioxidantes hidrofílicos (extractos antociánicos) pueden ser efectivos por concentrarse en la interfase aire-aceite, que es donde ocurre el fenómeno oxidativo.

AGRADECIMIENTOS

Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) de Colombia, por el apoyo económico a través del proyecto numero 2008L1363-333 y a la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, Facultad de Ciencias. Igualmente, se agradece el suministro de materiales por parte de CORPOICA, en el marco de un trabajo apoyado por Corantioquia.

REFERENCIAS Abdulkarim SM, Long K, Lai OM, Muhammad SKS,

Ghazali HM. 2007. Frying quality and stability of high-oleic Moringa oleifera seed oil in comparison with other vegetable oils. Food Chem 105:1382-1389.

Arts M, Dallinga S, Voss H P, Haenen G, Bast A. 2004. A new approach to assess the total antioxidant capacity using the TEAC assay. Food Chem 88:567-570.

Aubourg SP, Piñeiro C, González MJ. 2004. Quality loss related to rancidity development during frozen storage of horse (Trachurus trachurus). JAOCS 81(7):671-678.

Beccaro G, Mellano MG, Botta R, Chiabrando V, Bounous G. 2006. Phenolic and anthocyanin content and antioxidant activity in fruits of bilberry (Vaccinium myrtillus L.) and of highbush blueberry (V. corymbosum L.) cultivars in North Western Italy. Acta Horticult 715:553-558.

Benzie IFF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem 239:70-76.

Page 82: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Rojano et al. Actividad antioxidante de frutos de mortiño (Vaccinium meridionale SW)

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol.8 (6) 2009 | 527

Botero ML, Ricaurte S, Monsalve C, Rojano B. 2007. Capacidad reductora de 15 frutas tropicales. Scentia Tech 33:295-296.

Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. 1995.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm.-Wiss U Technol 28:25-30.

Bush RK, Taylor SL. 1998. Adverse reactions to food and drug additives, in Allergy. Principles and Practice, 5th ed. Mosby, St. Louis. 1183.

Capocasa F, Scalzo J, Mezzetti B, Battino M. 2008. Combining quality and antioxidant attributes in the strawberry: The role of genotype. Food Chem 111:872-878.

Çelik H, Özgen M, Serçe S, Kaya C. 2008. Phytochemical accumulation and antioxidant capacity at four maturity stages of cranberry fruit. Sci Hortic 117:345-348

Cho MJ, Howard LR, Prior RL, Clark JR. 2004. Flavonoid glycosides and antioxidant capacity of various blackberry, blueberry and red grape genotypes determined by high-performance liquid chromatography/mass spectrometry. J Sci Food Agr 84(13):1771-1782.

Conner AM, Luby JJ, Hancock JF, Berkheimer S, Hanson EJ. 2002a. Changes in fruit antioxidant activity among blueberry cultivars during cold temperature storage. J Agr Food Chem 50(4):893-898.

Conner AM, Luby JJ, Tong CBS, Finn CE, Hancock JF. 2002b. Genotypic and environmental variation in antioxidant activity, total phenolic content, and anthocyanin content among blueberry cultivars. J Am Soc Hortic Sci 127(1):89-97.

Cornelli U. 2009. Antioxidant use in nutraceuticals. Clin Dermatol 27:175-194.

Frankel EN, Huang S-W, Aeschbach R. 1997. Antioxidant activity of green teas in different lipid systems. J Am Oil Chem Soc 74:1039-1315.

Fuchs J. 1998. Potentials and limitations of the natural antioxidants alpha-Tocopherol, L-Ascorbic Acid and Beta-Caroteno in cutaneus photoprotection. Free Radic Biol Med 25(7):848-873.

Gaviria C, Cifuentes O, Monsalve C, Rojano B. 2007. Actividad antioxidante de extractos metanólicos de Attalea butyracea. Sci Tech 33:297-299.

Guzmán-Chozas M, Vicario I, Guillén-Sans R. 1997. Spectrophotometric profiles of off-flavor aldehydes by using their reactions with 2-thiobarbituric acid. J Agr Food Chem 45:2452-2457.

Ito N, Fukushima S, Hasegawa A, Shibata M, Ogiso T. 1983. Carcinogenecity of butylated hydroxyanisole in F344 rats. J Natl Cancer Inst 70:343-347.

Kahkonen MP, Hopia AI, Heinonen M. 2001. Berry phenolics and their antioxidant activity. J Agr Food Chem 49:4076-4082

Kalt W, Dufour D. 1997. Health functionality of blueberries. Hortechnology 7:216-221.

Kalt W, Lawand C, Ryan DAJ, McDonald JE, Donner H, Forney CF. 2003. Oxygen radical absorbing capacity, anthocyanin and phenolic content of highbush bluberries (Vaccinium corymbosum L.) during ripening and storage. J Am Soc Hortic Sci 128(6):917-923.

Kalt W, McDonald JE, Ricker RD, Lu X. 1999. Anthocyanin content and profile within and among blueberry species. Can J Plant Sci 79(4):617-623.

Kalt W, Ryan D, Duy J, Prior R, Ehlenfeldt M, Kloet V. 2001. Interspecific variation in anthocyanins, phenolics, and antioxidant capacity among genotypes of highbush and lowbush blueberries (Vaccinium Section cyanococcus spp.). J Agr Food Chem 49:4761-4767.

Lohachoompol V, Mulholland M, Srzednicki G, Craske J. 2008. Determination of anthocyanins in various cultivars of highbush and rabbiteye blueberries. Food Chem 111:249-256.

López JB, Rojano B, Lasso C, Sánchez I. 2008. Evaluación genotóxica y citotóxica del isoespintanol en cultivos de linfocitos humanos. Tercer Congreso Colombiano De Biotecnología - Segundo Seminario Internacional de Bionegocios. Cartagena.

Nedyalka VY, Emma MM. 2001. Stabilisation of edible oils with natural antioxidants. Eur J Lipid Sci Technol. 103(11):752-767.

Netzel M, Netzel G, Tian Q, Schwartz S, Konczak I. 2007. Native Australian fruits–a novel source of antioxidants for food. Innov Food Sci Emerg Technol 8:339-346.

Parr AJ, Bolwell GP. 2008. Phenols in the plant and in man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile. J Sci Food Agr 80:985-1012.

Prior RL, Cao G, Martin A, Sofic E, McEwen J, O'Brien Ch, Lischner N, Ehlenfeldt M, Kalt W, Krewer G, Mainland CM. 1998. Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturity, and variety of Vaccinium species. J Agr Food Chem 46(7):2686-2693.

Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med 26:1231-1237.

Rodríguez A, Lozada V, Larraín MA, Quitral V, Vinagre J, Aubourg, SP. 2007. Development of lipid changes related to quality loss during the frozen storage of farmed coho salmon. J Am Oil Chem Soc 84:727-734.

Rojano B, Gaviria C, Gil M, Saez J, Schinella G, Tournier H. 2008a. Actividad antioxidante del isoespintanol en diferentes medios. Vitae 15(1):173-181.

Rojano B, Saez J, Schinella G, Quijano J, Vélez E, Gil A. 2008b. Experimental and theoretical determination of the antioxidant properties of isoespintanol (2-Isopropyl-3,6-dimethoxy-5-methylphenol). J Mol Struct 877:1- 6.

Page 83: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Rojano et al. Actividad antioxidante de frutos de mortiño (Vaccinium meridionale SW)

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol.8 (6) 2009 | 528

Singleton VL, Rossi JA. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic–phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic16:144-158.

Rojano B, Gaviria C, Saez J. 2008c. Determinación de la actividad antioxidante en un modelo de peroxidación lipídica de mantequilla inhibida por el isoespintanol. Vitae 15(2):1-9. Vasco C, Ruales J, Kamal-Eldin A. 2008. Total phenolic

compounds and antioxidant capacities of major fruits from Ecuador. Food Chem 111: 816-823.

Sellappan S, Akoh C, Krewer G. 2002. Phenolic compounds and antioxidant capacity of Georgia-grown blueberries and blackberries. J Agr Food Chem 50(8):2432-2438.

Wanasundara UN, Shahidi F. 1998. Antioxidant and pro-oxidant activity of green tea extracts in marine oils. Food Chem 63(3):342-355. Siriwardhana N, Jeon Y. 2004. Antioxidative effect of

cactus pear fruit (Opuntia ficus-indica) extract on lipid peroxidation inhibition in oils and emulsion model systems. Eur Food Res Technol 219: 369-376.

Wang SY, Ballington JR. 2007. Free radical scavenging capacity and antioxidant enzyme activity in deerberry (Vaccinium stamineum l.). Food Sci Technol Today 73:1352-1361. Shanta NC, Decker EA. 1994. Rapid, sensitive, iron-based

spectrophotometric methods for determination of peroxide values of food lipids. JAOAC Int 77:421-424.

Zuta PC, Simpson BK, Zhao X, Leclerc L. 2007. The effect of α-tocopherol on the oxidation of mackerel oil. Food Chem 100(2):800-807.

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Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21 aqueous

extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina)

[Capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales de 21 extractos acuosos de plantas nativas del Valle de

Traslasierra (Argentina)]

Martin M. DADÉ*1, Daniel E. FIORAVANTI1, Guillermo R. SCHINELLA1,2, Horacio A. TOURNIER1,2

1Cátedra de Farmacología Básica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de La Plata. 2Comisión de Investigaciones Científicas,

Provincia de Buenos Aires. Argentina.

Abstract

The use of medicinal herbs derivatives is an alternative to conventional medicine to treat diseases associated with oxidative stress. In this study we

assessed the antioxidant capacity (AC) and the total phenolic (TP) and flavonoid content (FV) of 21 extracts obtained from commercially available supplies

of native plants of Traslasierra valley, Córdoba; Hedeoma multiflorum, Minthostachys mollis, Lippia turbinata, Satureja parvifolia, Aloysia triphylla, Aloysia gratíssima, Aloysia polystachya, Heterothalamus allienus, Xanthium spinosum, Gnaphalium gaudichaidianum, Flaveria bidentis, Hypericum connatum,

Larrea divaricata, Aristolocchia macroura, Erythraea quitensis, Geoffroea decorticans, Solanum rutilum, Urtica dioica, Usnea gracilis, Anemia tomentosa

and Lycopodium saururus. AC was assessed on the basis of different methods: The scavenging of stable free radicals ABTS and DPPH, the ability to reduce Fe+3 in the FRAP assay, and the capacity to inhibit the lipid peroxidation of copper-induced human plasma oxidation. All extracts were able to bleach the

radicals in the range of 0.03 - 4.48 µmol of Trolox equivalent/mg dry extract. S. parvifolia and H. connatum extracts exhibited the highest scavenging activity

for both, DPPH radical (1.48 and 1.77 µmol Tx eq/mg dry extract) and ABTS radical (3.20 and 4.48 µmol Tx eq./mg dry extract). S. parvifolia, L. divaricata and H. connatum showed the highest reducing capacity (8.89, 8.44 and 7.72 μmol eq. of ascorbic acid/mg dry extract) following by H. allienus and H.

multiflorum. At 100 µg/mL, S. parvifolia and H. connatum also showed a very high capacity (> 85%) to inhibit Cu 2+ - induced human plasma peroxidation.

E. quitensis, L.divaricata and H. multiflorum were also potent inhibitors of lipoperoxidation. There was a significant correlation between the TP and FV

content and the AC (P<0.001). Taken together, our results suggest that the aqueous extracts of H. multiflorum, H. allienus, L. divaricata, H. connatum and S.

parvifolia may be important sources for the isolation of compounds with potential use as pharmacological or nutritional tools..

Keywords: Antioxidant capacity; Herbal antioxidant; ABTS; DPPH; Oxidative stress; Argentina

Resumen

El empleo de plantas medicinales constituye una alternativa a la medicina convencional para el tratamiento de patologías asociadas con la producción de

estrés oxidativo. En este estudio evaluamos la capacidad antioxidante total (AC) y el contenido de fenoles (TP) y flavonoides (FV)de 21 extractos obtenidos de plantas nativas del valle de Traslasierra, Córdoba, Argentina. Las especies estudiadas fueron Hedeoma multiflorum, Minthostachys mollis, Lippia

turbinata, Satureja parvifolia, Aloysia triphylla, Aloysia gratíssima, Aloysia polystachya, Heterothalamus allienus, Xanthium spinosum, Gnaphalium

gaudichaidianum,Flaveria bidentis, Hypericum connatum, Larrea divaricata, Aristolocchia macroura, Erythraea quitensis, Geoffroea decorticans,Solanum rutilum, Urtica dioica, Usnea gracilis, Anemia tomentosa y Lycopodium saururus. AC se evaluó utilizando diferentes métodos: La capacidad de captación de

los radicales libres estables ABTS y DPPH; la capacidad de reducción del Fe+3 mediante el ensayo FRAP y la capacidad de inhibición de la peroxidación

lipídica del plasma humano inducida por cobre. Todos los extractos tenían capacidad de captación de ABTS y DPPH en el rango de 0,03- 4,48 µmol de Trolox equivalentes /mg extracto seco. La mayor potencia fue encontrada en S. parvifolia y H. connatum (1,48 and 1,77 µmol Tx eq. / mg extracto seco para

DPPH y 3,20 and 4,48 µmol Tx eq./mg extracto seco para ABTS). S. parvifolia, L. divaricata y H. connatum mostraron la mayor capacidad reductora (8,89,

8,44 and 7,72 μmol eq. de ácido ascorbico/mg extacto seco) seguidos por H. allienus y H. multiflorum. A la concentración de 100 µg/mL, S. parvifolia y H.

connatum, E. quitensis, L. divaricata y H. multiflorum mostraron también una muy alta capacidad de inhibición de la peroxidación lipídica del plasma

inducida por Cu 2+. Se encontró una significativa correlación entre el contenido de TP y FV y la actividad antioxidante (P<0,001). Tomados en conjunto,

nuestros resultados permiten sugerir que los extractos acuosos de H. multiflorum, H. allienus, L. divaricata, H. connatum y S. parvifolia pueden constituir importantes fuentes para el aislamiento de compuestos con alta actividad antioxidante de uso potencial desde el punto de vista farmacológico y nutricional.

Palabras Clave: Capacidad antioxidante; Antioxidantes herbales; ABTS; DPPH; Estrés oxidativo; Argentina.

Recibido | Received: October 7, 2009.

Aceptado en Versión Corregida | Accepted in Corrected Version: November 1, 2009.

Publicado en Línea | Published Online: November 30, 2009.

Declaración de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests.

Financiación | Funding: This work was supported by a grant from the Universidad Nacional de La Plata (Programa de Incentivos X 446)

This article must be cited as: Martin M. Dadé, Daniel E. Fioravanti, Guillermo R. Schinella, Horacio A. Tournier. 2009. Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21

aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):529 – 539. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Horacio Tournier. Cátedra de Farmacología Básica 60 y 120 La Plata (1900), Argentina. E-mail: [email protected]. Telefax: 54 21 421 6932

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INTRODUCTION

Medicinal herbs are some of the oldest medicines

around the world and their increased use in recent

years is an evidence of public interest in having

alternatives to conventional medicine.

There is growing evidence that consumption of

certain foods, dietary supplements or traditional

beverages, guide to a reduction in some parameters of

oxidative damage in biological systems (Aruoma et

al., 2003; Juan et al., 2006). Oxidative damage is

produced by reactive oxygen species (ROS) which

are continuously produced during the aerobic life.

ROS seems to be involved in the pathogenesis of

several human diseases including cancer, diabetes,

cardiovascular diseases, ageing, etc. (Gutteridge,

1994). Aerobic organisms are protected from oxygen

toxicity by a natural antioxidant defence system

constituted by enzymatic and non enzymatic

mechanisms (Halliwell, 1996). If this endogenous

system is inadequate for the purpose of scavenging

the ROS completely, oxidative damage to important

macromolecules occurs (Halliwell, 1999). ROS

neutralization by natural antioxidants could attenuate

the oxidative damage tissue (Delaporte et al., 2002 ).

The roles of medicinal herbs in the prevention and

cure of disease associated with oxidative stress have

been attributed, in part, to antioxidant properties of

their constituents. Many herbs are rich in compounds

with demonstrated antioxidant capacity, particularly

the liposoluble and water soluble vitamins (E and C,

respectively) and other compounds like the

amphipatic polyphenols which can act as reducing

agents, hydrogen donators, singlet oxygen quenchers

and metal chelators (Morel et al., 1998; Ulrich-

Merzenich et al., 2009).

Frequently used plants in traditional medicine are

assumed to be safe, due to their long-term use and

natural origen. Many Elgorashi et al., 2002 tific

articles have been published on natural products and

their diverse effects, but each plant species has

several different natural constituents, many of which

have not been studied.

South America countries have a long history of

using and producing medicinal and aromatic plants.

In the Argentine traditional medicine, this kind of

plants is used in the form of infusions or decoctions

and this is a common practice among people of rural

and also urban communities (Ratera and Ratera,

1980; Toursarkissian, 1980; Alonso, 2004).

Although many pharmacological as well as toxic

actions have been reported for Argentinean plants,

more information is needed about different properties

of those plants widely used as foods, nutritional

supplements or in the traditional medicine.

In Argentina, the Cordoba province is remarkable

for its diversity and it is a rich source of medicinal

plants, many of them used as part of folk remedies

(Zuloaga, 1999).

In Cordoba, Traslasierra valley is today, one of

main center in the country for medicinal and aromatic

herbs production (Fig. 1).

Figure 1. Geographic location of Traslasierra valley, Córdoba,

Argentina

Map from Wikimedia Commons.

Located at the foot of the highest peak in Cordoba,

the Champaquí hill (2800 m.o.s.l.), the Traslasierra

Valley is flanked to the east by the ¨Sierras Grandes

or ¨Sierra de Comechingones¨, which drop abruptly

downwards, and the ¨Sierras of Altautina, Pocho and

Guasapampa¨ to the west.

Goleniowski et al. (2006) reported that medicinal

native plants from Sierras Grandes make up

aproximately 30% of the total Argentina medicinal

Valle de

Traslasierra

(Provincia de

Córdoba)

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native flora. More recently, 41 plants of Córdoba

province were tested for their phenol content and

antioxidant capacity using a model food system

(Borneo et al., 2009)

Apart from these 41 plants, numerous other

natives plants of Traslasierra valley are used in

Argentina traditional medicine but they have not been

yet investigated for their antioxidant activity. The aim

of the present study was to examine the total

antioxidant potential and the total phenolic and

flavonoid content of 21 aqueous extracts obtained

from native plants of Traslasierra valley (Table 1).

MATERIAL AND METHODS

Plant material and preparation of extracts

Commercially available supplies of dried plant

materials used throughout the study were bought in

bulk from the Almacén Natural Prama, Villa de las

Rosas, Córdoba, Argentina.

Herbal samples were authenticated by Dr.

E.Spegazzini (Departamento de Ciencias Biologicas,

Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional

de La Plata) and they were free of preservative and

artificial flavoring. Herbal were maintained preserved

from light and humid and processed before 3 month

of the purchased. Extracts were obtained from

infusions or decoctions prepared in common way in

which teas are consumed for human population.

Table 1. Botanical species and their popular use

Plant Family Popular name Popular use

Hedeoma multiflorum (Benth) Lamiaceae Tomillo serrano Digestive tract diseases, Flavoring

Minthostachys mollis (Kunt, Griseb) Lamiaceae Peperina Anti-inflammatory, Digestive tract diseases,

spasmolytic.

Lippia turbinata (Griseb) Lamiaceae Poleo Flavouring, Digestive tract diseases, sedative

Satureja parvifolia (Philippi) Epling Lamiaceae Muña muña Anti- rheumatic, spasmolytic, aphrodisiac

Aloysia triphilla (L'Hérit.) Britt. Verbenaceae Cedrón Spasmolytic, sedative

Aloysia gratíssima (Gill. et Hook) Verbenaceae Palo amarillo Cholagogue, gastric and duodenal ulcer

Aloysia polystachya (Griseb et Moldenke) Verbenaceae Te de burro Digestive tract diseases, gastric disorders

Heterothalamus allienus (Spreng.) O.Kuntze Asteraceae Romerillo Antifungal, ornamental

Xanthium spinosum (Lam.) Asteraceae Cepa caballo Diuretic

Gnaphalium gaudichaidianum DC Asteraceae Vira Vira Antipyretic, antitussive, fatigue

Flaveria bidentis (L.) O. Kuntze Asteraceae Contrayerba Antiseptic, vermifuge, diuretic

Hypericum connatum (Lam.) Clusiaceae Cabotoril Cardiotonic

Larrea divaricata (Cav.) Zygophyllaceae Jarilla Anti-rheumatic, antigout, bruises

Aristolocchia macroura (Gomez) Aristoloquiaceae Mil hombres Anti-rheumatic, diuretic

Erythraea quitensis (HBK) Gentianaceae Canchalagua Anti-rheumatic, digestive tract diseases

Geoffroea decorticans (Gill. ex Hook. & Arn.)

Burkart) Fabaceae Chañar Antitussive, expectorant

Solanum rutilum (Gr.) Solanaceae Espina colorada Diuretic, antigout

Urtica dioica (L.) Urticaceae Ortiga Depurative, antihypertensive, diabetes

Usnea gracilis (Stirt) Parmeliaceae Barba de la

piedra Antimicrobial

Anemia tomentosa (Sav.) Swartz. Esquiceaceae Doradilla Diuretic, antihypertensive, antitussive

Lycopodium saururus (Lam.) Licopodeaceae Cola de

quirquincho Aphrodisiac

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Briefly, herbal samples (10 g) were weighed into

250 mL Erlenmeyer flasks and 200 mL of boiling

distilled water were added and left to cool down to 40

°C. Decoctions were prepared by boiling 10 g of

herbal samples in 250 mL of distilled water for

20 min. After cooling, the extractives were filtered,

lyophilized and the dry matter was maintained at -20

°C until use it.

For bioassay analyses, samples of each extract

were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 10

mg/mL). Stock solutions were serially diluted with

the solvent to obtain different concentrations (1-250

µg/mL).

Chemicals

2, 2-Diphenyl - 1-picryl hydrazyl (DPPH), 2, 4, 6-

tripyridyl-s-triazine (TPTZ ) and 2, 2´- azino-bis (3-

ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium

salt (ABTS), and quercetin-3-rutinoside (rutin), were

obtained from Sigma Chemical Company, St. Louis,

MO, USA. All other chemical used were of the

highest analytical grade.

Determination of total phenol and total flavonoid

content

Total phenol concentration in selected medicinal

plant extractives were determined

spectrophotometrically according to the Folin–

Ciocalteu colorimetric method (Singleton and Rossi,

1965), using caffeic acid as the standard and

expressing the results as µmol equivalents of caffeic

acid (CAE) per mg of dry extract.

Total flavonoids were estimated in the plant

extract using a colorimetric method, based on the

formation of a complex flavonoid-aluminium

(Sakanaka et al., 2005). Briefly, aliquot of extracts or

standard solutions (rutin) were mixed with 400 µl of

distilled water and 30 µL of a 5% sodium nitrite

solution. After 6 minutes, a 10% aluminium chloride

sodium (30µl) was added and the mixture was

allowed to stand for 5 minutes. After that, 200 µL of

1M NaOH solution and 240 µl of distilled water were

added and the absorbance was measured at 510 nm.

All determinations were done in triplicate and values

were calculated from a calibration curve obtained

with rutin. Final results were expressed as µmol of

rutin equivalents (RE) per mg dry extract.

DPPH·radical scavenging activity

Reduction of this radical was determined

according to Cavin (1998) with some modifications.

For the assay, 10 L of the plant extract was added to

990 μL of a 0.04 mg/mL DPPH· solution in methanol.

A series of concentrations ranging from 1 to 100 μg

dry extract/mL were tested. The mixtures were

shaken vigorously and incubated in the dark for

20 min after which the reduction of DPPH·

absorption was measured at 517 nm. A calibration

curve was constructed by measuring the reduction in

absorbance of the DPPH solution in the presence of

different concentrations of Trolox (0–400 μM).

Results were expressed as µmol of Trolox

equivalents (TE)/ mg dry extract. All determinations

were performed in triplicate. In the scavenging

assays, DMSO was used as negative control.

ABTS·+

radical scavenging activity

Other assay used to determine the antioxidant

capacity of extracts was the TEAC assay (scavenging

of the radical 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-

6 sulphonic acid, ABTS) (Re et al., 1999) with some

modifications. ABTS·+

radical was generated by

reacting 7 mM ABTS·+

solution in water with

2.45 mM potassium persulfate in the dark for 12–

16 h. Absorbance of the reactant was later adjusted to

0.700 ± 0.02 with PBS at a wavelength of 734 nm.

Radical scavenging reaction was started by addition

of 10µl of appropriately diluted extracts to 990 µl the

ABTS·+

solution. The absorbance of the mixture was

recorded at 734 nm 25 min after addition of the

sample. A Trolox calibration curve (0-200 µM) was

constructed. Results were expressed as µmol

equivalent of Trolox (TE)/mg dry extract. All

determinations were performed in triplicate.

Ferric reducing activity (FRAP assay)

The ferric reducing activity of the plant extracts

was estimated based on the FRAP assay (Benzie,

1996). The solutions for this assay consisted of

300 mmol/L acetate buffer, 10 mmol/L TPTZ (2,4,6-

tris(2-pyridyl)-s-triazine) in 40 mmol/L of HCl and

20 mmol/L FeCl3 · 6H2O. Reagent for this assay was

prepared on the day of assay by mixing 25 mL

acetate buffer with 2.5 mL TPTZ solution and 2.5 mL

FeCl3 · 6H2O.

The assay was performed as followed: 990 μL of

the FRAP reagent were added to 10 µL of appro-

priately diluted extracts or buffer. Absorbance

readings at 593 nm were recorded 20 min after the

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start of the reaction. The change in absorbance was

related to the absorbance changes of a standard

solution of ascorbic acid tested in parallel. Results

were expressed as µmol of ascorbic acid equivalents

(AAE) / mg of dry weight of the extract.

Lipid peroxidation assays

Human plasma was oxidatively modified by a

non-enzymic method. 100 μL of heparin plasma

(200 ± 20 μg total cholesterol) was diluted with 350

μL PBS and the oxidation was started by adding

50 μL CuSO4 10 mM. After 180 min of incubation at

37 °C the reaction was stopped by adding EDTA.

These incubations and relevant controls were

performed in the presence of the different extracts

(100 µg/mL). Only one time point at 3 h for

incubation was selected. This was in accordance with

previous studies which indicated that this was the

optimal period for oxidative modification of human

plasma to occur. (Schinella et al., 2007). Thio-

barbituric acid reactive substances (TBARS)

production were used as an indicator of lipid

peroxidation (Pompella et al., 1987). Results are

expressed as percentage of inhibition related to

controls without the extract. Butylated

hydroxytoluene (BHT) was used as a positive control.

Statistics

Data were expressed as means ± SD. Statistical

analysis was performed by one-way analysis of

variance (ANOVA) followed by Turkey-Kramer

multiple comparisons test. Differences were

considered significant at p < 0.05. The inhibitory

concentration 50% (IC50) was calculated from

concentration/effect regression line.

RESULTS AND DISCUSSION

Scavenging of free radicals

The antioxidant capacities of plant extracts largely

depend on their composition and conditions of the

test system and they are influenced by many factors,

which cannot be fully described with one single

method. Therefore, it is necessary to perform more

than one type of antioxidant capacity measurement to

take into account the various mechanisms of the

antioxidant action. The antioxidant activity of plant

extract was evaluated on the basis of different

methods: the scavenging effects of the stable ABTS

and DPPH free radicals, the ability to reduce

ferric(III) iron to ferrous (II) iron in the FRAP

reagent, and the capacity to inhibit the lipid

peroxidation using as biological system the copper-

induced human plasma oxidation.

Because of their high reactivity, most free radicals

react rapidly with oxidizable substrates. Methods

used for evaluation of radical-trapping properties

often utilize stable model free radicals as indicators

for radical-scavenging abilities, among which 1,1-

diphenyl-2-picrilhydrazyl radical (DPPH.) and

2,2′azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)

radical cation (ABTS.+

), have gained the highest

popularity.

Plants extracts may contain a wide variety of

radical scavenging molecules, such as phenolic and

nitrogen compounds , vitamins, terpenoids and some

other endogenous metabolites (Cai et al., 2004)

which act by mechanisms that may involve hydrogen

atom transfer or electron transfer (Litwinienko and

Ingold, 2007; Musalik et al., 2009).

The results on the free radical scavenging activity

of the different extracts are shown in Table 2. The

data presented in this study demonstrate that all the

reported species possess free radical scavenging

activity although in a wide range.

The preparations were able to reduce the stable

free radical DPPH to the yellow-coloured 1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl. The highest DPPH

scavenging activity was observed with H. connatum

and S. parvifolia extracts. (1.77 and 1.48 µmol

TE/mg dry extract respectively). Lower but important

scavenging activities were observed with L.

divaricata and H. multiflorum. The lowest radical

scavenging activity was exhibited by U. dioica, L.

saururus and U. gracilis ( < 0.1 µmol TE/mg dry

extract)

ABTS radical cation decolourization assay is

another excellent tool for determining the antioxidant

capacity of different compounds or herbal extracts.

In this assay, again H. connatum and S. parvifolia

extracts showed the highest scavenging capacity

(4.48 and 3.20 µmol TE /mg dry extract

respectively). Lowest activity were observed with U.

dioica, L. saururus and U. gracilis (< 0.2 µmol

TE/mg dry extract).

Reducing activity

Antioxidant activity of plant extracts was also

tested using the FRAP assay, which is a simple assay

that gives fast, reproducible results. Benzie and Strain

(1996) FRAP is versatile and can be readily applied

to different kind of materials like teas, wines, plant

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extracts and biological fluids. In this assay, the

antioxidant activity is determined on the basis of the

ability of an extract to reduce ferric (III) to ferrous

(II).

Table 2 show a wide range of differences in the

reducing capacity of the studied extracts. The FRAP

values varied from 0.28 to 8.89 µmol of AAE / mg

dry extract. S. parvifolia, L. divaricata and H.

connatum were found to have the highest antioxidant

activity (8.89, 8.44 and 7.72 μmol AAE/mg dry

extract respectively) followed by H. allienus (5.20

µmol AAE/mg), H. multiflorum (3.66 µmol

AAE/mg) and A. macroura (3.16 µmol AAE/mg).

Lowest FRAP values were founded in U. dioica, L.

saururus and U. gracilis extracts (< 0.5 µmol

AAE/mg dry extract).

Table 2. Antioxidant activity of plant extracts

Plant DPPHa ABTSa FRAPb

lípid

peroxidation

(% inhibition)c

Hedeoma multiflorum 0.70 ± 0.12 1.02 ± 0.04 3.66 ± 0.40 89.4 ± 3.2

Minthostachys mollis 0.27 ± 0.04 0.70 ± 0.02 2.32 ± 0.34 23.1 ± 9.9

Lippia turbinata 0.18 ± 0.02 0.64 ± 0.02 1.50 ± 0.16 23.9 ± 2.6

Satureja parvifolia 1.48 ± 0.10 3.20 ± 0.15 8.89 ± 0.90 90.1 ± 1.2

Aloysia triphylla 0.35 ± 0.06 0.52 ± 0.05 2.92 ± 0.25 49.4 ± 11.6

Aloysia gratísima 0.34 ± 0.05 0.49 ± 0.01 2.59 ± 0.21 27.0 ± 7.1

Aloysia polystachya 0.51 ± 0.06 0.75 ± 0.01 2.55 ± 0.28 42.4 ± 3.6

Heterothalamus allienus 0.59 ± 0.05 2.41 ± 0.04 5.20 ± 0.32 91.2 ± 2.0

Xanthium spinosum 0.12 ± 0.02 0.53 ± 0.02 0.88 ± 0.08 ND

Gnaphalium

gaudichaidianum 0.42 ± 0.02 2.32 ± 0.07 2.89 ± 0.72 41.7 ± 4.3

Flaveria bidentis 0.23 ± 0.01 0.79 ± 0.02 2.14 ± 0.16 36.1 ± 1.9

Hypericum connatum 1.77 ± 0.09 4.48 ± 0.07 7.72 ± 0.67 86.5 ± 3.9

Larrea divaricata 0.76 ± 0.06 0.70 ± 0.01 8.44 ± 0.64 80.1 ± 2.6

Aristolocchia macroura 0.10 ± 0.01 0.49 ± 0.03 3.16 ± 0.39 60.4 ± 4.3

Erythraea quitensis 0.39 ± 0.04 0.76 ± 0.02 2.43 ± 0.14 83.7 ± 2.0

Geoffroea decorticans 0.16 ± 0.03 0.92 ± 0.01 1.44 ± 0.17 27.4 ± 1.7

Solanum rutilum 0.20 ± 0.03 0.74 ± 0.02 1.11 ± 0.10 38.1 ± 1.3

Urtica dioica 0.03 ± 0.01 0.19 ± 0.02 0.49 ± 0.04 28.0 ± 2.6

Usnea gracilis 0.03 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.28 ± 0.02 ND

Anemia tomentosa 0.43 ± 0.03 1.28 ± 0.08 2.42 ± 0.54 20.6 ± 1.0

Lycopodium saururus 0.04 ± 0.02 0.16 ± 0.01 0.48 ± 0.02 13.5 ± 2.3

a Results are expresed as µmol equivalents of Trolox/ mg dry extract b Results are expresed as µmol equivalents of ascorbic acid/mg dry extract c Extracts were assessed at a final concentration of 100 µg/ml

ND: not determined

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Inhibition of lipid peroxidation

Proteins, nucleic acids and lipids are significant

targets of cellular injuries. Lipid peroxidation is an

oxidative alteration of polyunsaturated fatty acids

components of different cellular structures. (Janero,

1990)

Metal ions, at micromolar concentrations, plays a

role in human plasma lipids oxidation (Gaut and

Heinecke, 2001). It has been suggested that low

density lipoprotein (LDL) oxidation induced in vitro

in whole plasma is expected to reflect the oxidation

in vivo more adequately than in vitro oxidation of the

isolated lipoprotein (Spranger et al., 1998). For that

reason we assessed the antioxidant capacity of

extracts for lipoperoxidation protection using whole

human plasma. All extracts were tested at a final

concentration of 100 µg/mL and the inhibition of

human plasma lipids peroxidation was assayed by the

TBARS test.

Almost all tested extracts inhibited peroxidation

and among those, S. parvifolia, L. divaricata, H.

connatum, E. quitensis, H. multiflorum and H.

allienus were the most active extracts with values of

percentage of inhibition greater than 80% while A.

tomentosa and L. saururus showed the lowest activity

(< 20% of inhibition).

Total phenolics and flavonoids content

Table 3 reports the results of percentage of yield,

the total phenolics and total flavonoids content of

each plant extract. The amounts of total phenolics

varied widely in the different analysed extracts and

ranged from 0.16 to 2.07 µmol equivalents of caffeic

acid/mg of dry extract. This variation can be expected

for plant extracts due to the presence of other

constituents and/or the presence of different types of

phenols. Among plant extracts, H. connatum, S.

parvifolia and A. triphylla contained the highest

amount of phenolics (2.07, 1.90 and 1.70 µmol

CAE/mg dry extract respectively). The lowest level

of phenolic content was observed in U. dioica, U.

gracilis and L. saururus. (0.21, 0.19 and 0.16

CAE/mg dry extract, respectively).

Among plant extracts, H. connatum and S.

parvifolia contained the highest amount of flavonoids

(0.94 and 0.91 µmol RE/ mg dry extract) whereas the

lowest level was found in U. gracilis, L. saururus,

U.dioica and A. macroura (0.05 to 0.08 RE/mg dry

extract).

Several studies have evaluated the relationships

between antioxidant activities of plant products and

their phenolic contents (Shahidi, 2003). In our case,

comparison of total phenolics and flavonoid contents

with antioxidant activities show significant

correlations (Fig. 2).

In our work, L. divaricata and A. macromoura

extracts showed a high ability to reduce the FRAP

reagent and to inhibit the lipoperoxidation with

relatively low concentrations of total phenols and

flavonoids.

This relatively high antioxidant activity of extracts

with low phenolic content suggests that the type of

phenolics could be a determinant of these activities

rather than their amounts.

Conversely, A. triphylla is relatively rich in total

phenolics, but its activity as scavenger of free

radicals is low.

Our results agree with those of Shahidi (2003)

who reported that differences in antioxidant activities

of plant extracts could be due to different qualitative

and quantitative composition of their phenolic

constituents.

The data presented in this study demonstrate that

almost all the reported species possess antioxidant

activity. Indeed, their aqueous extracts scavenged the

free radicals DPPH and ABTS, reduced the Fe+3

of

FRAP reagent and inhibited the lipid peroxidation of

human plasma.

Among the assessed extracts, Satureja parvifolia

(muña muña) and Hypericum connatum (cabotoril)

showed the highest activity to scavenge DPPH and

ABTS free radicals, to reduce the Fe(III) to Fe (II) in

FRAP reagent and a very high capacity to inhibit

lipid peroxidation of human plasma. Also

Heterothalamus allienus demonstrated high capacity

to scavenge ABTS radical, reducing activity and

inhibition of lipid peroxidation.

Oxidative damage is considered a likely cause of

arsenic-induced tissue damage, particularly those

with high oxygen consumption rate. The high

antioxidant activity of H. allienus could explain the

demonstrated protective activity of this plant against

the arsenite-induced renal injury (Soria et al., 2008).

On the other hand, some biological and

pharmacological actions have been reported for S.

parvifolia and H. connatum, the two plants with the

highest antioxidant capacity in the all studied models.

S. parvifolia showed antiprotozoal and

antiplasmodial activity (Van Baren et al., 2006) and it

was very active against different microorganisms and

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was suggested that this might be due to high

concentration of flavonoids (Hernandez et al., 2000)

H. connatum also demonstrated to have other

pharmacological actions.

Previous investigations of extracts of this plant

showed them to be active against the feline

immunodeficiency virus (FIV), which shares

biological and pathogenic features with the human

immunodeficiency virus (HIV) (Schmitt et al., 2001).

In Argentina, the plant is widely used as cardiotonic

and recently antiherpetic and antifungal activities

were also demonstrated. (Fusco et al., 2007; Fritz et

al., 2007).

Nevertheless, to our best knowledge, the potent

antioxidant properties of these two plants have not

been yet reported. Further investigations are necesary

to determine which components of muña muña

(Satureja parvifolia ) and cabotoril (Hypericum

connatum)extracts are responsible for such

antioxidant capacity.

Table 3. Extracts yield and total content of phenolics and flavonoids

Plant Extract Yield (%) Total polyphenols* Total flavonoids**

Hedeoma multiflorum infusion 12.9 1.01 ± 0.04 0.70 ± 0.07

Minthostachys mollis infusion 20.8 0.48 ± 0.01 0.24 ± 0.01

Lippia turbinata infusion 16.8 0.41 ± 0.04 0.12 ± 0.01

Satureja parvifolia infusion 14.9 1.90 ± 0.05 0.91 ± 0.02

Aloysia triphylla infusion 14.9 1.70 ± 0.19 0.50 ± 0.04

Aloysia gratissima infusion 17.6 0.80 ± 0.03 0.33 ± 0.03

Aloysia polystachya infusion 14.4 0.65 ± 0.04 0.41 ± 0.01

Heterothalamus allienus infusion 15.9 1.48 ± 0.02 0.54 ± 0.03

Xanthium spinosum decoction 23.1 0.51 ± 0.02 0.17 ± 0.02

Gnaphalium

gaudichaidianum infusion 5.9 1.34 ± 0.04 0.42 ± 0.02

Flaveria bidentis decoction 12.8 0.86 ± 0.01 0.18 ± 0.02

Hypericum connatum infusion 16.1 2.07 ± 0.14 0.94 ± 0.02

Larrea divaricata infusion 17.1 1.07 ± 0.02 0.38 ± 0.03

Aristolocchia macroura decoction 12.1 0.44 ± 0.05 0.08 ± 0.01

Erythraea quitensis infusion 18.5 0.59 ± 0.04 0.32 ± 0.02

Geoffroea decorticans decoction 7.1 0.97 ± 0.01 0.13 ± 0.01

Solanum rutilum decoction 17.8 0.63 ± 0.03 0.13 ± 0.02

Urtica dioica infusion 18.5 0.21 ± 0.02 0.06 ± 0.02

Usnea gracilis decoction 9.9 0.19 ± 0.02 0.05 ± 0.01

Anemia tomentosa infusion 14.9 0.64 ± 0.01 0.27 ± 0.03

Lycopodium saururus infusion 5.2 0.16 ± 0.01 0.05 ± 0.02

* Results are expressed as µmol of cafeic acid equivalents / mg dry matter. ** Results are expressed as µmol of rutin equivalents /mg dry matter.

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Figure 2. Correlations between total phenolics and flavonoids content and antioxidant activity.

DPPH vs. TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

1

2 r2= 0.6689; P< 0.001

TP (mol caffeic acid eq/mg dry extract)

DP

PH

(

mo

l T

x e

q/m

g d

ry e

xtr

act)

DPPH vs. FV

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

1

2 r2= 0.8655; P< 0.001

FV (mol rutin eq./mg dry extract)

DP

PH

(

mo

l T

x e

q./m

g d

ry e

xtr

act)

ABTS vs. TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

1

2

3

4

5 r2= 0.6729; P< 0.001

TP (mol caffeic acid acid eq/mg dry extract)

AB

TS

(

mo

l T

x e

q./

mg

dry

ex

tra

ct)

ABTS vs. TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

1

2

3

4

5 r2= 0.6729; P< 0.001

TP (mol caffeic acid acid eq/mg dry extract)

AB

TS

(

mo

l T

x e

q./m

g d

ry e

xtr

act)

FRAP vs. TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0

2.5

5.0

7.5

10.0 r2= 0.6072; P< 0.001

TP (mol caffeic acid eq/mg dry extract)

FR

AP

(

mo

l A

A e

q./m

g d

ry e

xtr

act)

FRAP vs. FV

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.0

2.5

5.0

7.5

10.0 r2= 0.6625; P< 0.001

FV (mol rutin eq./mg dry extract)

FR

AP

(

mo

l A

A e

q./

mg

dry

ex

tra

ct)

LP vs TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

25

50

75

100 r2= 0.4061; P< 0.01

TP (mol caffeic acid eq/mg dry extract)

Lip

id p

ero

xid

ati

on

(%

)

LP vs. FV

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

25

50

75

100 r2= 0.5603; P< 0.001

FV (mol rutin eq./mg dry extract)

Lip

id p

ero

xid

ati

on

(%

)

DPPH vs. TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

1

2 r2= 0.6689; P< 0.001

TP (mol caffeic acid eq/mg dry extract)

DP

PH

(

mo

l T

x e

q/m

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xtr

act)

DPPH vs. FV

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

1

2 r2= 0.8655; P< 0.001

FV (mol rutin eq./mg dry extract)

DP

PH

(

mo

l T

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q./m

g d

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xtr

act)

ABTS vs. TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

1

2

3

4

5 r2= 0.6729; P< 0.001

TP (mol caffeic acid acid eq/mg dry extract)

AB

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ABTS vs. TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

1

2

3

4

5 r2= 0.6729; P< 0.001

TP (mol caffeic acid acid eq/mg dry extract)

AB

TS

(

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FRAP vs. TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0

2.5

5.0

7.5

10.0 r2= 0.6072; P< 0.001

TP (mol caffeic acid eq/mg dry extract)

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FRAP vs. FV

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.0

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10.0 r2= 0.6625; P< 0.001

FV (mol rutin eq./mg dry extract)

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LP vs TP

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

25

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100 r2= 0.4061; P< 0.01

TP (mol caffeic acid eq/mg dry extract)

Lip

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(%

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LP vs. FV

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

25

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100 r2= 0.5603; P< 0.001

FV (mol rutin eq./mg dry extract)

Lip

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(%

)

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CONCLUSION

Extracts of vegetables rich in phenolics are

increasingly of interest in several fields. In the food

industry because they could retard oxidative

degradation of lipids and thereby improve the quality

and nutritional value of food. From the medical point

of view, supplementation with antioxidants would be

useful for diseases associated with oxidative stress.

In terms of in vitro antioxidant activities and

phenolic content, Hedeoma multiflorum,

Heterothalamus allienus, Larrea divaricata, and

particularly Hypericum connatum and Satureja

parvifolia, could be excelent sources of antioxidant

products with potential use as pharmacological or

nutritional tools.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Ramón Martinez for excellent technical

assistance. This work has been supported by a grant

from the Universidad Nacional de La Plata

(Programa de Incentivos X 446)

REFERENCES

Alonso J. 2004. Tratado de Fitofármacos y Nutracéuticos.

Corpus Ed. Buenos Aruoma OI, Bahorun T, Jen LS.

2003. Neuroprotection by bioactive components in

medicinal and food plant extracts. Mutat Res 544:203-

215.

Benzie IF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of

plasma (FRAP) as a measure of “Antioxidant Power”:

The FRAP assay. Anal Biochem 39:70-76.

Borneo R, León AE, Aguirre A, Ribotta P, Cantero, JJ.

2009. Antioxidant capacity of medicinal plants from

the Province of Córdoba (Argentina) and their in vitro

testing in a model food system. Food Chem 112: 664–

670.

Cai Y, Luo Q, Sun M, Corke H. 2004. Antioxidant activity

and phenolic compounds of 112 traditional Chinese

medicinal plants associated with anticancer. Life Sci

74:2157-2184.

Cavin A, Hostettmann K, Dyatmyko W, Potterat O. 1998.

Antioxidant and lipophilic constituents of Tinospora

crispa. Planta Med 64:393-396.

Fusco MDR, Sosa A, Petenatti ME, Juárez A, Del Vitto

LA, Petenatti EM. 2007. Herpes virus inhibitory

substances from Hypericum connatum Lam., a plant

used in southern Brazil to treat oral lesions. Lat Am J

Pharm 26:209-214.

Fritz D, Venturi CR, Cargnin S, Schripsema B, Roehe

PM, Alves Montanha J, von Poser GL. 2007. Herpes

virus inhibitory substances from Hypericum connatum

Lam., a plant used in southern Brazil to treat oral

lesions. J Ethnopharmacol 113: 517-520.

Geronikaki AA, Gavalas AM. 2006. Antioxidants and anti-

inflammatory diseases: synthetic and natural

antioxidants with anti-inflammatory activity. Comb.

Chem High Throughput Screen 9:425–442.

Goleniowski ME, Bongiovanni GA, Palacio L, Nuñez CO,

Cantero JJ. 2006. Medicinal plants from the “Sierra de

Comechingones”, Argentina. J Ethnopharmacol

107:324-341.

Gutteridge JM, Halliwell B. 1994. Oxygen-derived

species: their relation to human disease and

environmental stress. Environ Health Perspec

102(Suppl 10):5-12.

Halliwell B. 1996. Antioxidants in human health and

disease. Annu Rev Nutr 16:33-50

Halliwell B. 1999. Antioxidant defence mechanisms: from

the beginning to the end (of the beginning). Free

Radical Res 4:261-72.

Hernandez NE , Tereschuk ML, Abdala LR. 2000.

Antimicrobial activity of flavonoids in medicinal

plants from Tafi del Valle (Tucuman, Argentina) J

Ethnopharmacol 73:317-322

Juan ME, Wenzel U, Ruiz-Gutierrez V, Daniel H, Planas

JM. 2006. Olive fruit extracts inhibit proliferation and

induce apoptosis in HT-29 human colon cancer cells. J

Nutr 136:2553-2557.

Litwinienko G, Ingold KU. 2007. solvent effects on the

rates and mechanisms of reaction of phenols with free

radicals. Acc Chem Res 40:222-230,

Morel I, Abaléa V, Sergent O, Cillard P, Cillard J. 1998.

Involvement of phenoxyl radical intermediates in lipid

antioxidant action of myricetin in iron-treated rat

hepatocyte culture. Biochem Pharmacol 55:1399-

1404.

Musalik M, Kuzmicz R, Pawlowski TS, Litwiniewnko

G. 2009. Acidity of hydroxyl groups: An overlooked

influence on antiradical properties of flavonoids. J Org

Chem 74:2699-2709

Pompella A, Maellaro E, Casini AF, Ferrali M, Ciccoli L,

Comporti M. 1987. Measurement of lipid peroxidation

in vivo: A comparison of different procedures. Lipids

22:206–211.

Ratera EL, Ratera MO. 1980. In: Plantas de la Flora

Argentina Empleadas en Medicina Popular,

Hemisferio Sur, Bs. As, pp. 227–232

Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M,

Rice-Evans C. 1999. Antioxidant activity applying an

improved ABTS radical cation decolorization assay.

Free Radical Biol Med 26:1231-1237.

Sakanaka S, Tachibana Y, Okada Y. 2005. Preparation and

antioxidant properties of extracts of Japanese

persimmon leaf tea (kakinoha-cha). Food Chem

89:569-575.

Schinella GR, Tournier HA, Máñez S, de Buschiazzo P,

Recio M, Ríos JL. 2007. Tiliroside and gnaphaliin

inhibit human low density lipoprotein oxidation.

Fitoterapia 78:1-6.

Page 94: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

Dadé et al. Antioxidant capacity of native plants from Traslasierra valley (Argentina)

www.blacpma.org Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas Vol. 8 (6) 2009 | 539

Schmitt AC, Ravazzolo AP, von Poser GL. (2001)

Investigation of some Hypericum species native to

Southern of Brazil for antiviral activity. J

Ethnopharmacol 77:239–245.

Shahidi F, Marian N. 2003. In Phenolics in food and

nutraceuticals (vol. 1). Boca Raton, FL: CRS Press

LLC. Pp. 144–150

Singleton VL, Rossi JA. 1965. Colorimetry of total

phenolics with phospho-molybdic-phosphotungstic

acid reagents. Am J Enol Viticul 16:144–158.

Soria EA, Goleniowski ME, Cantero JJ, Bongiovanni GA.

2008. Antioxidant activity of different extracts of

Argentinian medicinal plants against arsenic-induced

toxicity in renal cells. Hum Exp Toxicol 27:341-346.

Spranger T, Finckh B, Fingerhut R, Kohlschütter A,

Beisiegel U, Kontush A. 1998. How different

constituents of human plasma and low density

lipoprotein determine plasma oxidizability by copper.

Chem Phys Lipids 91:39-52.

Tousarkissian M. 1980. In: Plantas Medicinales de la

Argentina: Sus nombres Botánicos, Vulgares, usos y

Distribución Geográfica, Ed. Hemisferio Sur, Bs. As,

pp. 1–139.

Ulrich-Merzenich G, Heike Zeitle H, Hans Vetter H, Karin

Kraft K. 2009. Synergy research: Vitamins and

secondary plant components in the maintenance of the

redox-homeostasis and in cell signaling.

Phytomedicine 16:2-16.

Va n Baren C, Anao I, Lira PDL, Debenedetti S, Houghton

P, Croft S Martino V. (2006). Triterpenic acids and

flavonoids from Satureja parvifolia, evaluation of

their antiprotozoal activity . Z Naturforsch 61c:189-

192.

Zuloaga F O, Morrone O, Rodríguez D. 1999. Análisis de

la biodiversidad en plantas vasculares de la Argentina.

Kurtziana 27:17–167.

Page 95: Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas ... · Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas ... Paraguay. Jeannette Gavillan ... Facultad de

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Eventos

4th Global Summit on Medicinal and Aromatic Plants December 1-5, 2009 Kuching, Sarawak, Malaysia

2010

Trends in Natural Products Research A PSE Young Scientist Meeting. 11 - 14 April, 2010 Leicester School of Pharmacy - Leicester, UK Contact: Dr Randolph Arroo

9th Annual Oxford International Conference on the Science of BotanicalsApril 12 - 15, 2010 Mississippi, U.S.A.

33rd annual meeting of the Society of Ethnobiology "The Meeting Place: Integrating Ethnobiological

Knowledge" May 5-8, 2010 Victoria, British Columbia, Canada

12th ISE Congress, International Society of EthnobiologyMay 9-14, 2010 Tofino, British Columbia, Canada.

51st Annual Meeting of the Society for Economic Botany June 6-10, 2010 Xalapa, Mexico, Centro de Investagaciones Tropicales,

Universidad Veracruzana (CITRO) and Insituto de Ecología, A. C. (INECOL)

14th International Congredd "Phytopharm 2010"July 1 - 3, 2010 St. Peterburg, Russia Flyer: First Announcement

25th International Conference on PolyphenolsJoint meeting with Groupe Polyphénols 23 - 27 August, 2010 Montpellier, FRANCE Contact: [email protected] Web site:

Terpenes- Application, Activity & Analysis 26-29 September 2010 Istanbul, TURKEY Contact: Dr Fatih Demirci

11th International Congress of Ethnopharmacology Continuity and Change in Ethnopharmacology:

Transdisciplinary Science for our Future September 21-24, 2010 Albacete, Castilla La Mancha, Spain

58th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research - Gesellschaft für Arzneipflanzen-und Naturstoff-Forschung e.V.Aug 29 - Sep 2, 2010 Berlin, Germany Flyer

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