DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BRADFORD
DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE BRADFORD(no sacar esta
hoja)Blanco: Este tubo no contiene protena, se reemplaza la muestra
por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se
realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se
descuenta de la absorbancia del resto de los tubos.
Curva de calibracin: Para su realizacin se utilizar la solucin
testigo de concentracin conocida. Con la medida de absorbancia de
cada tubo y conociendo la cantidad de protenas que contiene cada
uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibracin
(grfico A595 vs (g de protena). Es necesario realizarla cada vez
que se procesen las muestras. La concentracin del TESTIGO es 100
(g/ml.Muestra incgnita: se procesa en simultneo y en las mismas
condiciones que la curva de calibracin. El tubo contiene la muestra
y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer
la cantidad de protenas de la muestra ((g), se determina la
absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibracin.
Cada grupo procesa una sola Muestra incgnita (A o B).Protocolo:
Tubo
H2O
((l)Testigo
((l)Muestra
A o B
((l)Reactivo de
Bradford
(ml)Protena
((g)Absorbancia
a 595 nm
Blanco600------------------2
1450150----------2
2300300----------2
3--------600----------2
Muestra
A o B---------------6002
Procedimiento:
Pipetear en el orden de la tabla:
- Primero el AGUA con la pipeta de 1 ml (rotulada H2O).
- El TESTIGO con otra pipeta de 1 ml (rotulada T) respetando el
orden de los tubos: 1,2 y 3.
- Luego con otra pipeta de 1 ml (rotulada A o B segn
corresponda) la MUESTRA INCGNITA en su tubo correspondiente.
-Por ltimo, el reactivo de Bradford con la pipeta de 5 ml
(rotulada R).
- Mezclar el contenido de los tubos.- Incubar 5 minutos a
temperatura ambiente.Observar el color de la curva de calibracin y
comparar con el color de la muestra incgnita con la curva. De esta
manera estimar los valores de protenas de la muestra incgnita.
Luego leer en el fotocolormetro tanto la curva y como la muestra
incgnita. Completar la tabla con los valores de absorbancia y
realizar el grfico A595 vs (g de protena.
Interpolar en el grfico el valor de absorbancia de las muestras
incgnita en dicha curva y determinar (g de protena de las muestras
y en luego determinar su concentracin (g/ml. Analizar si existe
concordancia con el valor estimado visualmente.
Al finalizar el trabajo prctico es IMPORTANTE que todo el
material quede limpio y en su lugar.Se enjuagarn las pipetas con
agua. Para limpiar los tubos de Bradford los alumnos contarn con
una pizeta con etanol. Primero se descartar el contenido de los
tubos en las piletas. Luego se enjuagarn los tubos con un poco de
etanol y por ltimo con abundante agua.
