Lección 16. INTRODUCCIÓN AL ANÁLISIS CUANTITATIVO.

Análisis cuantitativo: Conceptos básicos.

Propiedades analíticas de interés.

Trazabilidad.

Materiales de referencia.

Calibración instrumental y metodológica.

Validación.

MMéétodos relativos:todos relativos: que precisan calibración metodológica de la respuesta del instrumento de medida respecto a la concentración del componente de interés mediante patrones químico-analíticos que sí contiene el mismo analito objeto posterior de determinación.

Ej.: Métodos instrumentales

AnAnáálisis cuantitativolisis cuantitativo es el que tiene como objetivo determinar la

cantidad o proporción en que se encuentran los analitos en un

material. Origina una respuesta numérica que está caracterizada

por la incertidumbre implícita en toda medida experimental.

MMéétodos absolutos:todos absolutos: Se relacionan directamente con patrones básicos.

Ej.: Métodos gravimétricos kg patrón

MMéétodos estequiomtodos estequioméétricos:tricos: Se relacionan con patrones de tipo químico-analítico que no contienen al analito

Ej.: Volumetrías sustancias patrón que no contienen al

analito la determinación se basa directamente en la relación

estequiométrica de la reacción entre el valorante y el analito de la

muestra.

CALIBRACICALIBRACIÓÓN N

Problema AnalíticoProblema Analítico

MétodoAdecuadoMétodoAdecuado

• Información requerida• Muestra• Analitos• Recursos instrumentales

y humanos• Coste

• Información requerida• Muestra• Analitos• Recursos instrumentales

y humanos• Coste

• Información cuali o cuantitativa• Nivel de exactitud deseado• Nivel de precisión deseado• Rapidez • Coste

• Información cuali o cuantitativa• Nivel de exactitud deseado• Nivel de precisión deseado• Rapidez • Coste

• Límite de detección• Exactitud• Precisión• Selectividad• Robustez• Requerimientos instrumentales• Tiempo análisis• Coste

• Límite de detección• Exactitud• Precisión• Selectividad• Robustez• Requerimientos instrumentales• Tiempo análisis• Coste

TRAZABILIDAD

PARÁMETROS DE CALIDAD DE UN MÉTODO ANALÍTICO

Supremos

ExactitudRepresentatividad

Básicos

Límite de detecciónSensibilidadPrecisiónSelectividadRobustez

Complementarios

CosteRapidezSeguridad

EXACTITUDProximidad entre el resultado obtenido y el valor de referencia adecuado

REPRESENTATIVIDADPropiedad relacionada con la generación de resultados coherentes con las muestras recibidas en el laboratorio, el sistema en estudio y el problema analítico planteado.

SENSIBILIDADCambio que experimenta una determinada señal analítica por unidad de concentración

PRECISIÓNDispersión de los valores obtenidos alrededor del valor medio o proximidad entre los resultados obtenidos por aplicación del mismo procedimiento experimental varias veces bajo condiciones predescritas.

Repetibilidad

Reproducibilidad

LÍMITE DE DETECCIÓNMínima cantidad de analito que proporciona una señal significativamente diferente de la señal del blanco

LÍMITE DE DETERMINACIÓN

Mínima cantidad de analito capaz de ser determinada por un método analítico con una exactitud y precisión aceptables

SELECTIVIDADEs una medida del grado de interferencia que producen los compuestos que acompañan al analito en la muestra.

COSTE, RAPIDEZ, SEGURIDADCaracterísticas que también deben conocerse para hacer la selección de forma correcta.

ROBUSTEZ o SOLIDEZEvalúa la influencia de pequeños cambios en las condiciones analíticas sobre la fiabilidad del método analítico.

Se determina introduciendo pequeños cambios en el método (por ejemplo, en las condiciones analíticas) y examinando las consecuencias (factores que originan las fluctuaciones o influencias sobre la señal analítica).

Se define como la capacidad que tiene un método analítico para permanecer relativamente insensible a ligeros cambios

en el procedimiento, en la calidad de los reactivos o en las condiciones experimentales

TRAZABILIDAD

El término «trazabilidad» puede ser usado con tres enfoques principales:

a) Si se refiere a un productoproducto, está relacionado con el origen de los materiales y de las piezas, la historia de su producción y la distribución y localización del producto después de que haya sido entregado o distribuido.

b) Si se refiere a la calibracicalibracióónn, se aplica a la relación de los equipos de medida con los estándares nacionales o internacionales, con los estándares primarios, con las constantes o propiedades físicas básicas o con los materiales de referencia.

c) Si se refiere a la adquisiciadquisicióón de datosn de datos, se relaciona con los datos generados y los cálculos utilizados.

Se define de forma genérica como la aptitud de rastrear (conocer la

historia, aplicación o localización de una entidad (producto, proceso,

servicio, organización) por medio de identificaciones registradas.

TRAZABILIDADAquella característica de un resultado analítico que implica su relación inequívoca con estándares o materiales de referencia apropiados a través de una cadena ininterrumpida de comparaciones en las que la calibración juega un papel preponderante

TRAZABILIDAD ESTÁNDARES

Resultado

Definición y relación de los

estándares entre sí

Instrumentos de

medidaCalibración

ESTANDARES DE REFERENCIAPATRONES

Instituto Nacional de Normas y Tecnología (National Institute of Standards and Tecnology, NIST)

Farmacopea de los Estados Unidos(United States Pharmacopeia)

• MATERIAL DE REFERENCIA

(RM) (Reference Material)

• MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO (CRM) (Certified Reference Material)

• MATERIAL ESTANDAR DE REFERENCIA (SRM) (Standard Reference Material)

MATERIAL DE REFERENCIAmaterial o sustancia, en el cual una o más de sus propiedades están suficientemente bien establecidas para que sea usado en la calibración de un aparato, la estimación de un método de medición o para asignarles valores a los materiales

MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADOes un material en el que los valores de una o más de sus propiedades están certificados por un procedimiento técnicamente válido, bien sea que esté acompañado de, o pueda obtenerse, un certificado u otra documentación emitida por un ente certificador.

MATERIAL ESTANDAR DE REFERENCIAmaterial emitido por la oficina de normas de Estados Unidos (U.S. National Bureau of Standards, NBS) cuyo nombre fue cambiado a Instituto Nacional de Normas y Tecnología (National Institute for Standards and Technology, NIST). Tienen propiedades físicas o químicas específicas certificadas (son emitidos con certificados).

CALIBRACICALIBRACIÓÓNN

El uso de estándares de medida apropiados es fundamental en Análisis Cuantitativo ya que sin ellos no se podría medir ni comparar.

La calibración metodológicatiene como meta establecer una relación clara e inequívoca entre la respuesta instrumental y la cantidad/concentración del analito.

El objetivo de la calibración instrumental es garantizar el funcionamiento correcto del instrumento empleado para la cuantificación ( ej. balanza, bureta, espectrofotómetro,etc.)

CALIBRACIÓN INSTRUMENTAL

CALIBRACIÓN METODOLÓGICA

MMÉÉTODOS DE CALIBRADOTODOS DE CALIBRADO

En muchos tipos de análisis químicos se mide la respuesta del procedimiento analítico a cantidades conocidas de analito, y basándose en ellas se puede interpretar la respuesta de una muestra de contenido desconocido

Implican la obtención de una “función de calibrado” que define la respuesta equivalente a concentraciones conocidas del componente analizado. Una vez conocida esta función, se utiliza para determinar la concentración a partir de la señal instrumental obtenida.

0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 3 4 5 6

Función de calibrado

Ajuste por mínimos cuadrados

• Patrón Externo (directo)

• Adición patrón (adición estandar)

• Patrón Interno

MMÉÉTODO PATRTODO PATRÓÓN EXTERNON EXTERNO•Comparación de las señales de la muestra con las correspondientes a las del calibrado (disoluciones patrón)

Estándares de diferente concentración del analito (preparados artificialmente para que su matriz sea semejante a la de la muestra real- El uso de estnadates puros puede conducir a errores sistemáticos importantes).

•Se someten al proceso los patrones y la muestra de forma independiente.

•La relación entre la señal y la concentración de analito, se denomina "recta de calibrado" y es válida en el intervalo de concentraciones ensayado.

• La concentración de analito en la muestra problema se determina por interpolación

En la determinación de un analito (A) por un método instrumental se obtienen los siguientes datos de calibración:

CA(ppm) 0 2 6 10 14 18Señal 0,031 0,173 0,422 0,702 0,956 1,248

1.-Representar la curva de calibración2.-Calcular la concentración M de A (PFA=207,2) en una muestra cuya señal analítica es 0,532 3.-Calcular el limite de detección y el de cuantificación sabiendo que la desviación estándar del blanco es s=0,0079

En la determinación de un analito (A) por un método instrumental se obtienen los siguientes datos de calibración:

CA(ppm) 0 2 6 10 14 18Señal 0,031 0,173 0,422 0,702 0,956 1,248

1.-Representar la curva de calibración2.-Calcular la concentración M de A (PFA=207,2) en una muestra cuya señal analítica es 0,532 3.-Calcular el limite de detección y el de cuantificación sabiendo que la desviación estándar del blanco es s=0,0079

ppm

Señal

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 5 10 15

2.2.-- 0,532 = 0,067 ppm + 0,0307,49 = ppm (mg/l)

M = (g/l) / PF M =7,49x10-3 / 207,2

M = 3,62 x 10-5

3.3.-- CLD = 3 sB/mCLC = 10 sB /m

CLD = 0,354 ppmCLC = 1,179 ppm

m = 0,067b = 0,030CC = 0,999

m = 0,067b = 0,030CC = 0,999

1.1.--

Para eliminar los efectos de la matriz se trabaja sobre la matriz real

ADICION PATRADICION PATRÓÓN (ADICIN (ADICIÓÓN ESTN ESTÁÁNDAR)NDAR)

• Se desea asegurar un comportamiento similar de patrones y problema.Muestras complejas o matrices difíciles de reproducir

(alimentos, muestras biológicas o medio ambientales)

Calibración metodológica "in situ“.

ADICION PATRADICION PATRÓÓN (ADICIN (ADICIÓÓN ESTN ESTÁÁNDAR)NDAR)

PROCEDIMIENTO-Consiste en preparar los patrones con la misma muestra a analizar y añadir una cantidad conocida de la especie química a determinar.

-A n alícuotas de la muestra real se la añaden concentraciones crecientes, por ejemplo de 0 a 5 unidades arbitrarias, del estándar puro del analito. Todas ellas contienen una concentración de analito que es la suma de la original (se busca) y la añadida

-Se someten las n alícuotas de muestras reales enriquecidas al proceso analítico, obteniéndose una señal para cada alícuota.

-Se representan las señales en función de la concentración del estándar añadido. Se obtiene una recta de calibrado paralela a la que se obtendría con los estándares puros

-La señal sobre el eje de ordenadas es la que origina la muestra original.

-La concentración de analito en la muestra se obtiene por extrapolación de la recta de calibrado, su cruce con la prolongación del eje de abscisas proporciona el dato buscado.

CxCs

YSiendo C= Cx + Cs

Concentración del patrón adicionado

Concentración del problema

Yx = Señal debida al problema Ys = Señal debida al patrón

Y

La determinación de Fe en vinos se realiza por AA usando el método de la adición patrón. Se añaden 10 ml de muestra y cantidades variables de una disolución de Fe patrón de 10 ppm enrasándose a 50 ml con agua desionizaday midiendo la AA, obteniéndose los siguientes datos:

ml Fe 0 5 10 15 20AA 0,040 0,062 0,081 0,102 0,135

Calcular la ecuación de la recta de regresión y la concentración (ppm) de Fe en el vino.

Hay que pasarlos a ppm

La determinación de Fe en vinos se realiza por AA usando el método de la adición patrón. Se añaden 10 ml de muestra y cantidades variables de una disolución de Fe patrón de 10 ppm enrasándose a 50 ml con agua desionizaday midiendo la AA, obteniéndose los siguientes datos:

ml Fe 0 5 10 15 20AA 0,040 0,062 0,081 0,102 0,135

Calcular la ecuación de la recta de regresión y la concentración (ppm) de Fe en el vino.

y = b + mx ���� y = 0 ���� x = -b / m

ppm = -0,038 / 0,023 ���� ppm = 1,65

Vinicial Cinicial = VfinalCfinal

10 x ppm = 50 x 1,65

R.R.-- 8,26 8,26 ppmppm

V.10 = 50 ppm 0 1 2 3 4

Hay que pasarlos a ppm

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

-2 -1 0 1 2 3 4 5

m = 0,023b = 0,038CC = 0,994

m = 0,023b = 0,038CC = 0,994

AA

ppm

MMÉÉTODO DEL ESTTODO DEL ESTÁÁNDAR INTERNONDAR INTERNOOBJETIVO:

-minimizar fluctuaciones instrumentales -establecer referencias con fines cualitativos y cuantitativos.

• Estándar o patrón interno diferente al de la calibración convencional.

El patrón interno es una cantidad conocida de un compuesto o elemento, no presente en la matriz de la muestra, que se adiciona tanto a los estándares como a la muestra problema

PROCEDIMIENTO

Supongamos una muestra que contiene el analito X que queremos determinar, el procedimiento consiste en:1.- Preparar mezclas conocidas del patrón interno (I) y de los patrones del analito/os a determinar (X) para construir una curva patrón.

2.- Cuando una cantidad conocida de patrón se agrega a una muestra problema, la curva de calibrado puede utilizarse para hallar la concentración del problema.

3.-Las fluctuaciones en la señal afectan por igual al analito y al patrón pero no a la relación.

Características del patrón interno-compatibilidad (p.e. solubilidad) con la muestra y el patrón-características químicas y fisico-químicas similares al analito-respuesta discriminada respecto del analito

Concentración XConcentración I

Señal debida XSeñal debida I Y

X

I

Se determina mediante HPLC la concentración de ácido acetilsalicílico (AAS) y Cafeína (CAF) en comprimidos analgésicos usando ácido salicílico (AS) como estándar interno. Para ello se preparan una serie de patrones con concentraciones conocidas de AAS y CAF, se les añaden 100 ml de metanol y 10 ml de una disolución estándar de p.i. y se enrasan a 250 ml obteniéndose los siguientes resultados

patrones AAS(mg) CAF(mg) HAAS/HAS HCAF/HAS

1 200 20 20,5 10,6

2 250 40 25,1 23,0

3 300 60 30,9 36,8

Una muestra de un comprimido analgésico se coloca en un matraz de 250 ml, se disuelve en 100 ml de metanol, se le añaden 10 ml del p.i. y se filtra. El análisis de esta muestra da una relación de alturas de picos de 23,2 para AAS y 19,7 para CAF. Calcular los mg de AAS y CAF en el comprimido

Se determina mediante HPLC la concentración de ácido acetilsalicílico (AAS) y Cafeína (CAF) en comprimidos analgésicos usando ácido salicílico (AS) como estándar interno. Para ello se preparan una serie de patrones con concentraciones conocidas de AAS y CAF, se les añaden 100 ml de metanol y 10 ml de una disolución estándar de p.i. y se enrasan a 250 ml obteniéndose los siguientes resultados

patrones AAS(mg) CAF(mg) HAAS/HAS HCAF/HAS

1 200 20 20,5 10,6

2 250 40 25,1 23,0

3 300 60 30,9 36,8

Una muestra de un comprimido analgésico se coloca en un matraz de 250 ml, se disuelve en 100 ml de metanol, se le añaden 10 ml del p.i. y se filtra. El análisis de esta muestra da una relación de alturas de picos de 23,2 para AAS y 19,7 para CAF. Calcular los mg de AAS y CAF en el comprimido

m = 0,104

b = -0,5

CC = 0,998

m = 0,655

b = -2,73

CC = 0,999

y = m x + b y = m x + b

23,2 = 0,104 x -0,5 17,9 = 0,655 x -2,73

x = 288 mg / comprimido

HAAS/HAS HCAF/HAS

mg AAS mg CAF

x = 31,5 mg / comprimido