Cambios en la distribución de las poblaciones linfoides B … · 2011-07-01 · Introducción El estudio de la diferenciación Ben MO y ganglio linfático ha permitido identificar

Cambios en la distribución de las poblaciones linfoides B circulantes en

pacientes con gammapatías monoclonales

Servicios de Citometría y HematologíaCentro de Investigación del Cáncer

Universidad de Salamanca y Hospital Universitario de Salamanca

Sesión IVb. Línea de Tumores Hematológicos – Subgrupo de Mieloma

Introducción

Aunque la célula tumoral del MM es la CP, podríaexistir un precursor clonal más inmaduro presente

en las células B circulantes

PRECURSOR LINFOIDE BPRECURSOR LINFOIDE B CCÉÉLULAS PLASMLULAS PLASMÁÁTICAS (TICAS (CPsCPs))

Pilarski et al Clin Cancer Res 2000Tarte et al Blood 2002

Rasmussen et al Leuk Lymphoma 2004

Introducción

El estudio de la diferenciación B en MO y ganglio linfático ha permitido identificar la existencia de poblaciones en distintos estadios madurativos

Sin embargo, en la SP la información acerca de las distintas subpoblaciones B circulantes es muy limitada

1. Estandarizar una estrategia sencilla, rápida y reproducible de identificación de las diferentes subpoblaciones linfoides Bpresentes en SP

2. Analizar su distribución en SP de adultos sanos

3. Comparar la distribución de las subpoblaciones B circulantes de pacientes con gammapatías monoclonales (GMSI, mieloma quiescente y MM sintomático) con adultos sanos de edad similar

4. Determinar la posible correlación entre el número absoluto de las diferentes subpoblaciones B circulantes y el componente monoclonal (CM) en las gammapatías monoclonales

Objetivos

48 adultos sanos79 pacientes con GM

-Técnica de inmunofluorescencia directa: marcajes múltiples con AcMo:PB/ AmCyan/ FITC/ PE/PerCPCy5.5/ PECy7/ APC/ AF700

CD20/ CD45/ sIgM/ sIgG/ CD19/ CD10/ CD27/ CD38 CD20/ CD45/ sIgM/ sIgA/ CD19/ CD10/ CD27/ CD38

- Adquisición en un citómetro de flujo FACSCanto II:Ventana de análisis por CD19 y/o CD38hi (linfocitos B y células plasmáticas) ≥1x106 células totales

AnAnáálisis lisis inmunofenotinmunofenotíípicopico de poblaciones linfoides B en SP:de poblaciones linfoides B en SP:

50.000 células>100.000 células CD19+

24 GMSI17 MM quiescente (MMq)38 MM sintomático (MM)

Material y Métodos

RESULTADOS

LB Memoria LB Memoria CD27CD27++ / CD38/ CD38--LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos CD27CD27++ / CD38/ CD38++

Contacto con el antContacto con el antíígenogeno

LB LB NaNaïïvevesIgMsIgM++ / CD27/ CD27--

LB inmaduros LB inmaduros CD10CD10++ / CD38/ CD38++

Poblaciones B circulantes en SP según su estadio madurativo

Alexa 700: CD38

Alexa 700: CD38

APC

: CD

27

APC

: CD

27

APC

: CD

27

FITC: sIgM

FITC: sIgM

PE-C

y7:

CD10

Poblaciones B circulantes en SP según el isotipo de la IgHLB

Mem

oria

Linf

opla

smoc

itos

APC

: CD

27

FITC: sIgM

LB M

emor

iaLi

nfop

lasm

ocit

os

APC

: CD

27

FITC: sIgM

FITC

: sI

gM

FITC

: sI

gM

FITC

: sI

gM

FITC

: sI

gM

PE: sIgG PE: sIgA

PE: sIgG

LB Memoria

PE: sIgA

Linfoplasmocitos

Poblaciones B circulantes en SP según el isotipo de la IgH

Identificación de subpoblaciones linfoides B circulantes mediante análisis inmunofenotípico

Linfocito B inmaduro/”naive”(CD10+, sIgM+,CD38++, CD20++, CD27-)

Linfocito B maduro/”naive”(CD10-, sIgM+, sIgD+, CD38+, CD20++, CD27-)

Linfocito B maduro de memoria(CD10-, sIgG+*, CD38d, CD20++, CD27+)

Linfocito B maduro de memoria(CD10-, sIgM+, CD38d, CD20++, CD27+)

Linfoplasmocito(CD10-, sIgG+, cIgG+, CD38++, CD20+, CD27+)

Linfoplasmocito(CD10-, sIgM+, cIgM+, CD38++, CD20+, CD27+)

Célula plasmática(CD10-, sIg-, cIgG+, CD38++, CD20-, CD27+)

Célula plasmática(CD10-, sIg-, cIgM+, CD38++, CD20-, CD27+)

*IgG o IgA o IgE

DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones linfoides B linfoides B circulantes en adultos sanos (n=48)circulantes en adultos sanos (n=48)

Frecuencia dentro de los LB

% (LB) Cells/uL

Mediana Rango Mediana Rango

LB inmaduros 3 (0.3-9) 3 (0.3-15)LB Naïve 63 (38-88) 81 (20-350)LB Memoria 33 (8-56) 43 (4-189)

IgM+ 16 (3-48) 22 (1-164)IgG+ 6 (1-18) 8 (1-54)IgA+ 5 (1-20) 8 (1-49)

Linfoplasmocitos 1 (0.2-9) 1 (0.1-11)

Nº Absoluto (células/uL)

Nº

Abs

cells

/uL

IgAIgA++IgGIgG++IgMIgM++

200200

100100

5050

1010

00

<40a<40a(n=21)(n=21)

[40[40--60]a60]a(n=11)(n=11)

>60a>60a(n=16)(n=16)

*p<0.05 vs. <40

# p<0.05 vs. [40-60]

350

300

250

200

150

100

5040

30

LB LB TotalesTotales

InmadurosInmaduros NaNaïïveve MemoriaMemoria LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos

*

*

*

#

#

* #

NNºº

AbsAbs

cells

cells

// µµLL

DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones linfoides B circulantes linfoides B circulantes de adultos sanos segde adultos sanos segúún la edadn la edad

100

50

20

10

0

*p<0.05 vs. <40

# p<0.05 vs. [40-60]


* #

#* #


* #* #

*

6

3

1

0.5

0

LinfoplasmocitosLinfoplasmocitosLB MemoriaLB Memoria

<40a<40a(n=21)(n=21)

[40[40--60]a60]a((n=11)n=11)

>60a>60a(n=16)(n=16)

NNºº

AbsAbs

cells

cells

// µµLL

DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones linfoides B circulantes linfoides B circulantes de adultos sanos segde adultos sanos segúún la edad e isotipon la edad e isotipo

DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones B de SP en adultos B de SP en adultos sanos >60a sanos >60a vsvs pacientes con GMpacientes con GM

LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos CCéélulas lulas PlasmPlasmááticasticas

GMGM(n=81)(n=81)

Adultos Adultos SanosSanos

>60a (n=16)>60a (n=16)


InmadurosInmaduros NaNaïïveve MemoriaMemoria

NNºº

AbsAbs

cells

cells

// µµLL

300

200

100

40

4

# p<0.05 vs. AS>60a

# #

300

200

100

20

0

LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos CCéélulas lulas PlasmPlasmááticasticas


>60a (n=16)>60a (n=16)


InmadurosInmaduros NaNaïïveve MemoriaMemoria

NNºº

AbsAbs

cells

cells

// µµLL

GMSIGMSI(n=24)(n=24)

MMqMMq(n=17)(n=17)

MMMM(n=40)(n=40)

# p<0.05 vs. AS>60a

#

#

#

#

#

#

#

DistribuciDistribucióón de las n de las subpoblacionessubpoblaciones B de SP en adultos B de SP en adultos sanos >60a sanos >60a vsvs pacientes con GMpacientes con GM

0

50

40

30

20

10

DISTRIBUCION DE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DISTRIBUCION DE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES EN ADULTOS SANOS >60a EN ADULTOS SANOS >60a vs. vs. PACIENTES GM PACIENTES GM IgGIgG

0,3

0,2

0,1

0

#

LB Memoria IgG+

NNºº

AbsAbs

cells

cells

// µµLL

NNºº

AbsAbs

cells

cells

// µµLL

Linfoplasmocitos IgG+


>60a (n=16)>60a (n=16)

GMSIGMSI(n=14)(n=14)

MMqMMq(n=6)(n=6)

MMMM(n=19)(n=19)

# p<0.05 vs. AS>60a

DISTRIBUCION DE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DISTRIBUCION DE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES EN ADULTOS SANOS >60a EN ADULTOS SANOS >60a vs. vs. PACIENTES GM PACIENTES GM IgAIgA

LB Memoria IgA+

NNºº

AbsAbs

cells

cells

// µµLL

Linfoplasmocitos IgA+


>60a (n=16)>60a (n=16)

GMSIGMSI(n=7)(n=7)

MMqMMq(n=4)(n=4)

MMMM(n=11)(n=11)

50

40

30

20

10

2

1

1NNºº

AbsAbs

cells

cells

// µµLL

#

# p<0.05 vs. AS>60a

#

CORRELACICORRELACIÓÓN ENTRE SUBPOBLACIONES B N ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES CIRCULANTES vs. vs. CONCENTRACION DE CM EN CONCENTRACION DE CM EN MGUS MGUS

LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos

21

2

1

0

Concentración de CM (g/dL)

R2= 0.57

NNºº AbsAbs((cellscells//µµL)L)

p=0.005


p=0.02

LinfoplasmocitosLinfoplasmocitos

InmadurosInmaduros

NaNaïïveve

MemoriaMemoria


54321

1

0

R2= 0.613

CORRELACICORRELACIÓÓN ENTRE SUBPOBLACIONES B N ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES CIRCULANTES vs. vs. CONCENTRACION DE CM EN CONCENTRACION DE CM EN MMqMMq

5432

0.5

0.25

0

R2= 0.978


LB Memoria LB Memoria IgAIgA++

LB Memoria LB Memoria

p=0.02

CORRELACICORRELACIÓÓN ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DE N ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DE ACUERDO CON EL ISOTIPO ACUERDO CON EL ISOTIPO vs. vs. CONCENTRACION DE CM EN CONCENTRACION DE CM EN MMqMMq


LB Memoria LB Memoria IgGIgG++

LB Memoria LB Memoria

4.53.52.51.5

0.25

0.15

0

p=0.09

R2= 0.6



MM quiescente MM quiescente IgAIgA (n=4)(n=4)

MM quiescente MM quiescente IgGIgG (n=6)(n=6)

CORRELACICORRELACIÓÓN ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DE ACUERDO N ENTRE SUBPOBLACIONES B CIRCULANTES DE ACUERDO CON EL ISOTIPO CON EL ISOTIPO vs. vs. CONCENTRACION DE CM EN CONCENTRACION DE CM EN MMMM IgGIgG

108642

% L

B M

emor

ia

100

80

60

40

20

0

p=0.002

R2= 0.6108642

% L

B M

em I

gG+

30

20

10

0p=0.007

R2= 0.46

108642% L

B M

em I

gA+ 20

15

10

5

0

108642% L

B M

em I

gM+ 40

30

20

10

0

P=0.005

R2= 0.5

p=0.02

R2= 0.35

1 Los LB de SP de adultos sanos son muy heterogéneos, identificándose hasta 10 subpoblaciones B diferentes

2 El número de LB circulantes varía con la edad, disminuyendo en adultos sanos con mas de 60 años debido al descenso de las subpoblaciones de Memoria y Linfoplasmocitos

3 Los pacientes con GM tienen una disminución significativa de LB que no han reconocido antígeno (B inmaduras en todos los grupos y naive en MMq)

4 En pacientes con MMq, una elevada concentración de CMse correlaciona con un menor número de LB de memoria que expresan el mismo isotipo de cadena pesada que las células mielomatosas, mientras que en el MM sintomáticola correlación es directa

Conclusiones

¿Existen células B clonales -con el mismo patrón de reordenamiento VDJ en IgH que las células plasmáticas neoplásicas- en las distintas subpoblaciones linfoides B circulantes

en pacientes con MM?

PRECURSOR LINFOIDE BPRECURSOR LINFOIDE B CCÉÉLULAS PLASMLULAS PLASMÁÁTICAS (TICAS (CPsCPs))

Estrategias de separación de las subpoblaciones linfoides B circulantes en un citómetro-separador (FACSAria; BDB)

Purezas >98%

¿Existen células B clonales en las distintas subpoblaciones B de SP en pacientes con el MM?

FASE DE ESTANDARIZACIFASE DE ESTANDARIZACIÓÓN DE LA TN DE LA TÉÉCNICA (PCR): CNICA (PCR): Realizada sobre muestras de SP de pacientes con LLCRealizada sobre muestras de SP de pacientes con LLC--BB

Potencia de la técnica(Nº mínimo de células)

#1 50 células 2/210 células 2/2

#2 50 células 3/510 células 1/2

#3 50 células 3/3

#4 50 células 2/3

Sensibilidad *(con 50 células clonales)

#5 5% 1/11% 1/10.1% 1/1

#6 5% 1/11% 1/10.1% 1/1

* No comprobada por secuenciaciónsino por tamaño

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