Cambios en la ecofisiología del aparato digestivo de lechones recién destetados en respuesta a algunos componentes dietarios

1. ANTECEDENTES Proceso de adaptación a la alimentación inicial solida y desarrollo de la microbiota intestinal El destete es una etapa en la cual los lechones están sometidos a varios factores de estrés, entre ellos se destacan la separación de la madre y hermanos, el cambio de medio ambiente (instalaciones) y de alimentación (1). El lechón recién destetado es un animal altamente demandante de proteína y energía para los procesos fisiológicos relacionados con el desarrollo corporal y la maduración de su sistema inmunológico, entre otros. Paradójicamente, la capacidad digestiva necesaria para que digieran y absorban los nutrimentos es bastante limitada en el periodo posdestete, pues los órganos del tracto gastrointestinal (TGI) están poco desarrollados y la actividad de las secreciones digestivas es baja (2-4). Lo anterior hace que este periodo sea el más crítico en la vida del cerdo, en el que se presenta una fase de anorexia y subnutrición (5). Este estrés posdestete repercute inmediatamente y a mediano plazo en el desarrollo corporal de animales en crecimiento (6). El estrés fisiológico intestinal es causado por el cambio físico (de liquida a solida) y de nutrientes (de lactosa a almidón, de proteína animal a vegetal, etc.), en la alimentación del lechón lactante al alimento posdestete. El aparato digestivo y las enzimas digestivas deben adaptarse fisiológicamente a la digestión del nuevo alimento, principalmente de su fracción proteínica (7). El valor nutricional de las proteínas es determinado por su digestibilidad, su contenido y disponibilidad de aminoácidos (8,9) y la presencia de factores antinutricionales (7). Las proteínas vegetales son menos susceptibles a la digestión enzimática “in vivo” que las proteínas de origen animal (9) y las bases moleculares para esta diferencia todavía no han sido aclaradas (10). En el caso de los lechones recién destetados, con el TGI inmaduro y la poca capacidad de producción de ácido clorhídrico por la mucosa gástrica (11), la digestión de las proteínas de origen vegetal es todavía más problemática. Por otro lado, el lechón lactante es apto para digerir los carbohidratos de la leche y el cambio a la dieta posdestete, rica en carbohidratos complejos, asociado a la baja capacidad de producción de amilasa, hace con que al intestino grueso ingrese una gran cantidad de sustratos altamente fermentables (5). Esto conlleva seguramente a un cambio de las poblaciones microbianas, generando desordenes gastrointestinales, infecciones y diarreas (1,5,6). Estos cuadros patológicos pueden ser controlados con la adición de antibióticos en la dieta. La inclusión de antibióticos causa modificaciones en la microbiota del intestino delgado de los cerdos, permitiendo una mayor “eficiencia” intestinal, un mayor crecimiento de los animales y una protección contra microorganismos patógenos que provocan trastornos gastrointestinales (12). Debido a la prohibición del uso de antibióticos en la alimentación animal en Europa y EUA y a la demanda de productos cárnicos libres de antibióticos por los mercados importadores, se ha observado un incremento de los disturbios gastrointestinales en lechones en diferentes partes del mundo. Para contrarrestar este problema se ha promovido el uso de prácticas de manejo y estrategias nutricionales alternativas para el control

de los problemas entéricos. Estas incluyen la manipulación de los ingredientes de la dieta para modificar las poblaciones bacterias patógenicas (13) y comensales. Sin embargo, todavía no se conoce el efecto de dieta sobre los cambios de la ecolofisiología intestinal incluyendo las poblaciones bacterianas predominantes. El trabajo pionero de Ball y Aherne (14) mostró una interacción negativa entre la digestibilidad aparente fecal de la energía y la presencia de heces con una mayor cantidad de humedad. En algunos estudios se investigó la utilización de minerales como el cobre y zinc (15), o prebióticos y probióticos (16) en la incidencia de diarreas. Otros autores reportan una disminución de problemas entéricos durante las dos primeras semanas posdestete al utilizar plasma porcino deshidratado (17) en las dietas. Jin et al. (18) observaron que la proteína de papa tiene actividad antimicrobiana, reduciendo efectivamente la población de bacterias coliformes. También se reporta que la caseína posee algunos péptidos funcionales que promueven la salud intestinal (19). La reducción del nivel de proteína cruda (PC) dietaria ha sido una de las alternativas más estudiadas (13,20-23). Salud intestinal y la diversidad bacteriana La salud intestinal puede ser definida como la capacidad del TGI de mantenerse en equilibrio, ya que es un ecosistema en constante cambio (24). Existen tres principales componentes de la salud intestinal: la dieta, la mucosa y la microbiota comensal. La mucosa está compuesta por el epitelio digestivo, el tejido linfoide asociado al intestino (TLAI) y el moco que recubre el epitelio (25). El TLAI, la microbiota comensal y el moco interactúan con las células del hospedero generando un sensible y dinámico equilibrio en el TGI, asegurando el correcto funcionamiento del proceso digestivo (25). El desarrollo del sistema inmune de la mucosa intestinal depende de la colonización por bacterias comensales y patogénicas (5). La microbiota del TGI es un ecosistema complejo que contiene varios miles de especies de bacterias, las cuales tienen un papel importante en la salud intestinal, previniendo la colonización de microorganismos potencialmente patogénicos (26). Tradicionalmente, los estudios para caracterizar la diversidad bacteriana intestinal se hacen con técnicas de cultivo, sin embargo, varios autores (27) han reportado que únicamente entre 0.1 y 10% de las bacterias en el ambiente son cultivables. Para muchos de los microorganismos se desconocen los medios de cultivo requeridos para su aislamiento (28-30). Las limitantes de las técnicas de cultivo, han sido superadas por el desarrollo de herramientas moleculares, que permiten detectar e identificar géneros bacterianos basándose en la secuencia del gen 16S ARNr (31). Varios análisis filogenéticos de este gen en el TGI de cerdos, han revelado que la microbiota intestinal es muy compleja y que la mayoría de las especies bacterianas no ha sido caracterizada (32). Con el desarrollo de estos métodos moleculares para la caracterización de poblaciones bacterianas, el conocimiento en el área de ecología intestinal ha avanzado enormemente. Análisis moleculares de diversidad y abundancia del gen 16S rRNA han revelado que las clases bacterianas de Clostridia, Bacteroides y Bacilli son las más abundantes miembros de la microbiota intestinal de cerdos y humanos (32-35). Sin embargo, todavía se desconoce como la dieta modula estas poblaciones microbianas. El estrés fisiológico a nivel intestinal muy probablemente está asociado a los cambios de la dieta en la etapa posdestete y consecuentemente a los cambios de la

microbiota. Es posible postular que el desequilibrio en la interacción entre la dieta, la microbiota intestinal y la respuesta celular de la mucosa intestinal es una condición desencadenante de la disfunción intestinal. Las técnicas moleculares propuestas, permitirán un mayor entendimiento de los cambios en las poblaciones microbianas resultantes de su adaptación a la dieta y el periodo posdestete necesario para que se alcance un equilibrio. 2. Hipótesis: La hipótesis es que los lechones destetados alimentados con dietas balanceadas simples (cereal-proteína de origen vegetal), con un alto nivel de proteína cruda y sin antibióticos, desarrollarán una respuesta inflamatoria aguda de su tracto digestivo, con cambios importantes en su fisiología y en el perfil de la población bacteriana intestinal, la cual participará en la fermentación de los carbohidratos y de las proteínas no digeridas y/o no absorbidas, lo que llevará a disturbios gastrointestinales. Sin embargo, dependiendo del tipo de proteína dietaria, de la inclusión de carbohidratos solubles y de algunos alimentos funcionales en la ración, la ecofisiología intestinal podrá ser afectada positivamente, ayudando a contrarrestar los efectos dañinos causados a la mucosa intestinal, y promoviendo una mejor salud intestinal. 3. Objetivos: Objetivo General: Generar conocimientos sobre los ajustes morfológicos, fisiológicos y microbiológicos del tracto gastrointestinal de lechones sometidos a las condiciones de estrés inherentes al destete, en respuesta a modificaciones en los componentes dietarios aportados, con énfasis en el nivel y fuente de proteína cruda, el tipo de carbohidrato y la presencia de algunos alimentos funcionales (antibióticos, probióticos o ácidos orgánicos). Objetivo particulares: 1. En la ausencia de antibióticos y con alteraciones en la composición química de las dietas de lechones recién destetados, en términos de sus nutrimentos (nivel y tipo de proteína y tipo de fibra dietaria) y/o de sus ingredientes (fuente de proteína, de carbohidratos, antibióticos y probióticos) se pretende evaluar el efecto de la dieta sobre:

a. La morfología microscópica de la mucosa intestinal, en términos de la arquitectura de sus vellosidades y la capacidad de reposición celular por las criptas de Lieberkün. b. El pH de los contenidos gastrointestinales. c. La actividad de enzimas intracelulares (Fosfatasa alcalina, Trifosfatasa adenosina y Fosfatasa ácida) indicadoras de la funcionalidad del TGI. d. La expresión génica de proteasas pancreáticas e intestinales. e. La respuesta inmune intestinal (expresión génica de citocinas e infiltración de linfocitos en la mucosa intestinal). f. El número de células de Globet y en la síntesis de mucinas en intestino delgado y ciego.

g. La fermentación microbiana en el intestino delgado y grueso. h. La diversidad genética bacteriana de los diferentes compartimientos del intestino delgado y grueso de los lechones. i. La diversidad genética de bacteriana del tracto intestinal.

4. Metas 4.1. Metas científicas a. Poner en evidencia las interacciones existentes entre los componentes dietarios, la diversidad bacteriana intestinal y las secreciones digestivas de lechones recién destetados. b. Relacionar la expresión génica de algunas variables (enzimas digestivas, citocinas, mucinas) y los cambios en la composición de la dieta iniciadora. c. Desarrollar un trabajo conjunto que contribuya a la mejora del nivel de consolidación del Cuerpo Académico “Morfofisiología y Nutrición Animal”. d. Incrementar la productividad científica (publicaciones en revistas internacionales) y difundir los conocimientos generados en este proyecto a nivel nacional e internacional; fortaleciendo el CA “Morfofisiología y Nutrición Animal” y contribuyendo a su consolidación. 4.2. Metas de formación de maestros y doctores en ciencias. 1. Formar un maestro en ciencias.

**Un estudiante de maestría se enfocará a los estudios morfológicos, fisiológicos y a la fermentación bacteriana en el trato gastrointestinal.

2. Formar un doctor en ciencias. **El estudiante de doctorado se enfocará a los estudios de la diversidad genética bacteriana y los aspectos relacionados con la respuesta inmune (células de Globet, expresión génica de mucinas e infiltración de linfocitos).

Los estudiantes estarán inscritos en los Programas de Posgrado de la Facultad de Ciencias Naturales (FCN) o de la UNAM. También se pretende involucrar a los alumnos de la Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia de la FCN como tesitas y/o ayudantes de investigación inscritos en programas de Servicio Social y Verano de la Ciencia (por lo menos 2 alumnos). 5. Metodología científica Los experimentos se realizarán en la granja porcina experimental del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas Pecuarias Y Forestales (CENID Fisiología). La elección de utilizar esta granja cuenta con la infraestructura adecuada y con el personal entrenado para trabajar en experimentación, además se pueden controlar las condiciones experimentales (higiene y manejo) de manera apropiada, lo que es mucho más problemático a nivel de granjas comerciales. Se garantiza que se observarán las reglas de bioseguridad, tanto a nivel de granja como de laboratorio, en donde se seguirán los protocolos adecuados para todas las mediciones efectuadas. Los niveles de proteína de las dietas se seleccionaron en base al análisis de los diferentes trabajos revisados, los cuales generalmente observan efectos de la disminución del nivel de PC cuando éstos son realmente contrastantes; así se tomó como nivel alto en PC el 22% y bajo en PC el 15%.

5.1. Experimentos Se realizarán cuatro experimentos consecutivos. A continuación se describen las particularidades de cada experimento y las metodologías que serán utilizadas para el análisis de las variables a estudiar. 5.1.1 Experimento 1. Se estudiará el efecto de la adición de probiótico o antibiótico en la dieta durante las tres primeras semanas posdestete. Se evaluarán tres dietas experimentales balanceadas para cubrir los requerimientos de aminoácidos esenciales (AAE) (36): Dieta 1, ración alta en proteína cruda (PC, 20%), adicionada con antibiótico y sin probiótico (control positivo); Dieta 2, ración balanceada alta en proteína cruda (PC, 20%), sin adición de antibiótico y con probiótico (control negativo); Dieta 3, ración baja en PC (16%) sin antibiótico y adicionado con probiótico. El probiótico utilizado será de origen comercial en la dosis recomendada por el proveedor. Se utilizarán 72 lechones destetados a los 21 días de vida, provenientes de 12 camadas, que se alojarán en 18 corrales, siendo 4 lechones por corral, haciendo un total de 24 lechones (4 lechones * 6 corrales) por tratamiento. 5.1.2 Experimento 2. Se estudiará el efecto de la interacción de diferentes niveles de proteína y tipo de carbohidratos de la dieta durante las tres primeras semanas posdestete. Se evaluarán seis dietas balanceadas para cubrir los requerimientos de aminoácidos esenciales (AAE) (36): Dieta 1 alta en PC (20%), adicionada con carbohidrato soluble (lactosa) y antibiótico; Dieta 2 alta en PC (20%), adicionada con carbohidratos insolubles (proveniente de trigo) y antibióticos; Dieta 3 alta en PC (20%), adicionada con carbohidratos solubles (lactosa) sin antibióticos; Dieta 4 alta en PC (20%) adicionada con carbohidratos insolubles (proveniente de trigo), sin antibióticos; Dieta 5, ración baja en PC (16%), adicionada con carbohidratos solubles (lactosa), sin antibióticos; Dieta 6, ración baja en PC (16%) adicionada con carbohidratos insolubles (proveniente de trigo), sin antibióticos. Se utilizarán 144 lechones destetados a los 21 días de vida, provenientes de 24 camadas, que se alojarán en 24 corrales de destete, siendo 6 lechones por corral, haciendo un total de 24 lechones por tratamiento (6 lechones * 4 corrales). 5.1.3 Experimento 3. Se estudiará el efecto de la interacción de diferentes niveles de proteína y la presencia o ausencia de ácido butírico en la dieta durante las tres primeras semanas posdestete. Se evaluarán tres dietas balanceadas para cubrir los requerimientos de AAE (36): Dieta 1, alta en PC (20%), sin la presencia de ácido butírico y adicionada con antibiótico (control positivo); Dieta 2, alta en PC (20%), adicionada con ácido butírico protegido y sin antibióticos; Dieta 3, alta en PC (20%) adicionada con ácido butírico No protegido y sin antibióticos. Se utilizarán 72 lechones destetados a los 21 días de vida, provenientes de 12 camadas, que se alojarán en 18 corrales de destete, siendo 4 lechones por corral, haciendo un total de 24 lechones por tratamiento (4 lechones * 6 corrales). 5.1.4 Experimento 4. Se estudiará el efecto del tipo de proteína de la dieta ingerida durante las tres primeras semanas posdestete. Las fuentes de proteína seleccionadas como la proteína de papa y plasma porcino tienen propiedades

antimicrobianas y la pasta de ajonjolí aparentemente tiene una capacidad ligeramente laxante, pero es libre de proteínas alergénicas como las de la pasta de soya. Se evaluarán 4 dietas experimentales todas con un alto nivel de PC (20%) pero cada una con fuentes de proteína de diferente calidad: Dieta 1, pasta de soya adicionada con antibiótico (dieta control); Dieta 2, pasta de soya+concentrado de proteína de papa, sin antibiótico; Dieta 3, pasta de soya+plasma porcino deshidratado, sin antibiótico; Dieta 4, pasta de ajonjolí, adicionada con antibiótico. Se utilizarán 72 lechones destetados a los 21 días de vida, provenientes de 12 camadas, que se alojarán en 18 corrales, siendo 4 lechones por corral, haciendo un total de 24 lechones por tratamiento (4 lechones * 6 corrales). 5.2 Alojamiento y Manejo General: Los lechones se alojarán en corrales de destete suspensos, proveídos de bebedero de chupón y comedero con 6 bocas y tendrán libre acceso al alimento y agua, durante todo el periodo experimental. Durante la experimentación, como indicador del estado de salud (37) de los animales, éstos se pesarán al destete y al día de cada sacrificio y el consumo de alimento se calculará por la diferencia entre la cantidad de alimento ofrecida y el alimento rechazado pesado al final de cada semana. Cuatro lechones serán sacrificados (ver apartado 5.3.2) al día del destete y servirán como un grupo control que no consumió alimento (día 0). En los días 7, 14 y 21 posdestete, de cada tratamiento se sacrificará un animal por corral, el cual será elegido al azar, para la colecta de contenidos de, íleon, ciego y colon y medir en cada contenido el pH y la concentración de metabolitos microbianos (amoniaco, ácidos grasos volátiles (AGV´s) y ácido láctico) como indicadores de la actividad microbiana (22). En muestras de mucosa y en las digestas de los diferentes segmentos del TGI se determinará la diversidad bacteriana. Se tomarán porciones de 10 cm del duodeno, yeyuno e íleon para los análisis histológicos, inmunológicos y enzimáticos. Se colectará el páncreas y se obtendrá muestras de la mucosa gástrica e intestinal para evaluar la actividad y expresión génica de las enzimas digestivas. También se pesarán los órganos digestivos (estómago vacío, intestino delgado vacío y grueso vacío, hígado y páncreas) para evaluar el desarrollo morfológico del TGI. Las metodologías empleadas para el sacrificio de los lechones y colecta de los órganos, así como para el procesamiento, almacenamiento y análisis que se describen en el apartado 5.3. 5.3. Metodologías a ser empleadas 5.3.1 Análisis molecular de la diversidad bacteriana intestinal. Estos análisis se llevarán a cabo en el laboratorio del Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Naturales. La implementación de la técnica y todo el procedimiento serán desarrollados por el alumno del doctorado y contará con la asesoría de los doctores Gerardo Nava y Tércia Cesária Reis de Souza. Se tomarán muestras de contenido y mucosa intestinal de las diferentes secciones del TGI. Cada muestra será depositada en tubos estériles y congelados en nitrógeno líquido inmediatamente después de la colecta. Posteriormente serán mantenidos a – 80 °C hasta que se realice la extracción de ADN molecular. La extracción de ADN se llevará a cabo con el kit comercial de Quiagen (Qiagen USA), método que ha demostrado ser el más efectivo para el análisis molecular de la microbiología

intestinal (38). El análisis de la diversidad genética bacteriana se llevará a cabo con el método de TRFLP (siglas en ingles de Terminal Restriction Fragments Length Polymorphism). El diseño de este método seguirá los principios moleculares descritos por Grüntizig et al. (39). Se hará la extracción del ADN bacteriano de la muestra (1), el gen de interés (16S ARNr) será amplificado por la técnica de PCR (2) utilizando un primer marcado por fluorescencia. Los productos de la PCR, después de una purificación, serán digeridos por enzimas de restricción, lo que generará fragmentos terminales de diferentes tamaños. Éstos serán separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida. Un lector laser detecta fragmentos marcados en su parte terminal y se genera un perfil teniendo como base la longitud de los fragmentos. Los productos de la PCR serán digeridos con enzimas de restricción y los fragmentos terminales generados serán enviados para su análisis al Centro de Biotecnología de la Universidad de Illinois. Este procedimiento ayudará a identificar la especie de cada fragmento terminal recuperado de las muestras intestinales de los animales en experimentación. 5.3.2 Sacrificio y análisis macro y microscópico de tejidos. En los días de los sacrificios, los lechones se desensibilizarán por inhalación de CO2 durante 3 minutos y posteriormente se sacrificarán seccionándoles la vena yugular para su exsanguinación. Una vez sacrificados se procederá la apertura de la cavidad abdominal para la colecta de los órganos digestivos (páncreas, hígado, estómago vacío, intestino delgado e intestino grueso), los cuales se disecarán y pesarán. Se tomarán muestras del contenido y mucosa de íleon ciego y colon, las cuales serán inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido y se conservarán a –80 °C, hasta la realización de los análisis pertinentes (diversidad genética bacteriana, productos del metabolismo bacteriano, etc.). También se medirá el pH de cada digesta colectada. El peso de los órganos se reportará en su valor absoluto (gramos) y relativo (con relación al peso vivo (g·Kg-1 de peso vivo)). Inmediatamente después de la obtención del peso de los órganos, el páncreas se congelará en nitrógeno líquido y posteriormente se conservará a – 80 ºC, hasta que se realicen los análisis de la actividad de tripsina (40). Se determinará la cantidad de proteína en el páncreas (41) para reportar la actividad específica de las enzimas. El intestino delgado se dividirá en tres partes iguales (duodeno, yeyuno e íleon) y se cortará una porción de cada región de aproximadamente 10 cm. de largo, para realizar los cortes histológicos y medir la altura de las vellosidades y la profundidad de las criptas de acuerdo a la metodología descrita por Reis de Souza et al. (42). En los mismos cortes histológicos se hará el conteo de los linfocitos intraepiteliales (43). También se prepararán cortes histológicos para identificación de las células de Globet productoras de mucinas por histoquímica, a través de tinciones especiales para mucinas neutras (reactivo de Schiff), mucinas ácidas (azul alciano) descrita por Piel et al. (54). Una porción de cada segmento de íleon, ciego y colon, será colectada y utilizada para extraer RNA total y medir la expresión de genes que codifican para la síntesis de citoquinas (apartado 5.3.5). En las partes restantes del intestino se les realizará un raspado de la mucosa intestinal sobre una base refrigerada, se congelará en nitrógeno líquido y se conservará a –80°C hasta la determinación de la actividad enzimática de las exopeptidasas intestinales: aminopeptidasa N, aminopeptidasa A, y dipeptidildipeptidasa (45-47) y para los estudios de expresión génica de

pepsina el estómago se abrirá y se colectarán las muestras de contenido y mucosa gástrica según lo que describen Henderson y Jensen (48). La actividad de la pepsina en la mucosa gástrica se medirá de acuerdo a Rick et al. (49). Todos los participantes colaborarán en las actividades de los días de sacrificio. 5.3.3 Análisis de los productos metabólicos de la actividad microbiana. Estos análisis estarán a cargo de la Dra. Tércia Cesária Reis de Souza, juntamente con un alumno de maestría, en el Laboratorio de Nutrición Animal de la Facultad de Ciencias Naturales. La concentración de amoniaco de las digestas del íleon, ciego, colon y en las heces será determinada usando espectrofotometría, utilizando el método descrito por Novozamsky et al. (50) y tomando en cuenta las adaptaciones realizadas por Nyachoti et al. (17) y Htoo et al. (23). La concentración de AGV´s (ácidos acético, propionico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico y caproico) será determinada por cromatografía de gases utilizando el método descrito por Novozamsky et al. (50) y tomando en cuenta las adaptaciones realizadas por Nyachoti et al. (17) y Htoo et al. (23). El ácido láctico será determinado por una técnica enzimática descrita por Vahjen et al. (51). 5.3.4 Expresión génica de las enzimas digestivas (pepsina, tripsina y proteasas intestinales). Estos análisis estarán a cargo de la M. en C. Araceli Aguilera Barreyro en el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Naturales, juntamente con el estudiante de doctorado. Muestras de estómago, páncreas y mucosa intestinal serán colectadas y almacenadas como se describió anteriormente. La extracción de ARN total se realizará con un producto comercial de Qiagen (Qiagen USA) (52). La cuantificación de expresión de cada gene se realizará con el método transcripción reversa y PCR en un solo paso utilizando una enzima comercial y el método de Sybergreen (QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit). Para cada RT-PCR se utilizarán las secuencias iniciadores de replicación (primers) específicos descritos por Lee et al. (53). 5.3.5 Expresión de genes que codifican para la síntesis de citoquinas (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12p40, IL-18 y Ciclofilina). Al sacrificio se colectará 1 cm de cada sección del intestino delgado y colon, se colocará en 1 ml de Extract-all (Eurobio), se congelará en nitrógeno líquido y se conservará a –80°C hasta la extracción del ARN total como se describió anteriormente. La cuantificación de expresión de los gen que codifican las citoquinas se realizará con el método QuantiTect SYBR Green RT-PCR siguiendo las recomendaciones descritas por Janeczko et al. (52) y Pié et al. (54). La implementación de la técnica y todo el procedimiento será supervisado por la M en C María de Jesús Guerrero Carrillo y el Dr. Juan Joel Mosqueta, juntamente con el estudiante de doctorado. 5.3.6 Actividad de enzimas intracelulares indicadoras de la funcionalidad del TGI. Estos procedimientos estarán a cargo de la M. en C. María de Jesús Guerrero Carrillo y un alumno de la maestría en el laboratorio de Histopatologia de la Facultad de Ciencias Naturales. Se medirá la actividad de enzimas intraepiteliales relacionadas con el proceso de digestión y absorción de los nutrimentos (Fosfatasa alcalina, Trifosfatasa adenosina y Fosfatasa ácida) (43). Para esto, en los sacrificios se colectarán muestras de estómago, duodeno,

yeyuno, íleon, hígado y páncreas y se conservarán en una solución de alcohol a 80% (v/v) hasta la el empleo de las técnicas de histoquímicas (43,55,56), empleando una escala colores de 0 a 4 (43) para determinar la actividad enzimática. 5.3.7 Análisis químicos de las dietas e ingredientes. En cada dieta y materia prima se determinará la cantidad de proteína cruda, materia seca (MS) y proteína cruda (PC) (57), fibra detergente neutro (FDN) (58) y aminoácidos por medio de cromatografía en fase reversa (59). Los análisis se realizarán en el Laboratorio de Nutrición Animal por el M en C José Guadalupe Gómez Soto, con la ayuda de los estudiantes de licenciatura LMVZ. 5.3.8 Análisis estadísticos. Los resultados de los experimentos se analizarán según un modelo de bloques al azar (60), en donde cada bloque estará conformado por los animales sacrificados en los diferentes días. El análisis estadístico se realizará empleando el procedimiento GLM del paquete estadístico SAS (61). En el estudio de la diversidad de bacteriana y su asociación con los parámetros de fisiología intestinal, los resultados serán evaluados a través de análisis estadísticos multivariados (análisis de componentes principales) empleando el procedimiento ACP del paquete estadístico SAS (61). Los análisis estadísticos estarán a cargo de la Dra. Guadalupe Bernal Santos y del Dr. Gerardo Nava, quién se enfocará a los análisis multifactoriales de la diversidad genética bacteriana, empleando paquetes estadísticos específicos. 5.4 Referencias bibliográficas 1. Reis de Souza TC, Mariscal-Landín, G. 1997. El destete, la función digestiva y de la digestibilidad de los alimentos en cerdos jóvenes. Técnica Pecuaria en México. 35 (3), 145 – 159. 2. Mariscal-Landín G, Reis de Souza TC; Parra JES, Aguilera AB, Mar BB. 2008. Ileal digestibility of protein and amino acids from canola meal in weaned piglets and growing pigs. Livest. Science.116:53-62. 3. Reis STC, Mariscal LG, Aguilera BA. 2005. Efecto de diferentes cereales en dietas de iniciación para lechones sobre la digestibilidad de los nutrimentos y la preferencia alimenticia. Veterinaria México. 36:11-24. 4. Reis de Souza TC, Aumaitre A, Mourot J, Peiniau J. 2000. Effect of graded levels of tallow in the diet on performance, digestibility of fat, lipogénesis and body lipid deposition of the weaned piglet. Ausiam-Aus. J. Anim. Sci. 13 (4): 497-505. 5. Lallès JP, Bosi P, Smidt H, Stokes CR. 2007. Weaning, a challenge to gut physiologists. Livest. Sci. 108:82-93. 6. Le Dividich J, Sève B. 2000. Effects of underfeeding during the weaning period on growth, metabolism, and hormonal adjustments. Domestic Anim. Endocrinol. 19:63-74. 7. Dong GZ, Pluske JR. 2007. The low feed intake in newly-weaned pigs: problems and possible solutions. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 20:440-452. 8. Valencia DG, Serrano MP, Centeno C, Lázaro R, Mateos GG. 2008. Pea protein as a substitute of soya bean protein in diets for young pigs: Effects on productivity and digestive traits. Livest. Sci. 118: 1-10.

9. Friedman M. 1996. Nutritional Value of Proteins from Different Food Sources. A Review. J. Agric. Food Chem. 44: 6-29. 10. Carbonaro M, Grant G, Cappeloni M, Pusztai A. 2000. Perspectives into factors limiting in Vivo digestion of legume proteins: antinutritional compounds or storage protein. J. Agric. Food Chem. 48: 742-749. 11. Cranwell PD. 1995. Development of the neonatal gut and enzyme systems. In: Varley M.A., editor. Wallingford. CAB International. p. 99-154. 12. Gaskins HR, Collier CT, Anderson DB. 2002. Antibiotics as growth promotants: mode de action. Anim. Biotechnol. 13:1-42. 13. Wellock IJ, Fortomaris PD, Houdijk JGM, Kyriazakis I. 2008. Effects of dietary protein supply, weaning age and experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection on newly weaned pigs: health. Animal. 2:834-842. 14. Ball RO, Aherne FX. 1987. Influence of dietary nutrient density, level of feed intake and weaning age on young pigs. II. Apparent nutrient digestibility and incidence and severity o diarrhea. Can. J. Anim. Sci. 67:1105-1115. 15. Pluske JR, Pethick DW, Hopwood DE, Hampson DJ. 2002. Nutritional influences on some major enteric bacterial diseases of pigs. Nutr. Res. Rev. 16. Reynoso E, Cervantes M, Figueroa JL, Cuca JM. 2004. Productive response of pigs to low-protein diets added aminoacids and yeast culture. Cuban J. Agric. Sci. 38:269-275. 17. Van Dijk AJ, Margry CF, Van der Lee AG, Hemke G, Beynen AC. 2002. Growth performance and Health status in weanling piglets fed spray-dried proccine plasma under typical Northen european conditions. J. Anim. Physiol. A Anim. Nutr. 86:17-25. 18. Jin Z, Yang YX, Choi JY, Shinde PL, Yoon SY, Hahn TW, Lim HT, Park Y, Hahn KS, Joo JW, Chae BJ. 2008. Potato (Solanum tuberosum L cv. Gogu valley) protein as a novel antimicrobial agent in weanling pigs. J. Anim. Sci. 86:1562-1572. 19. Fitzgerald RJ, Murray BA. 2006. Bioactive peptides and lactic fermentations. Internat. J. Dairy Technol. 59:118-125 20. Le Bellego L, Noblet J. 2002. Performance and utilization of dietary energy and amino acids in piglet fed low protein diets. Livest. Prod. Sci. 76:45-58. 21. Nyachoti CM, Omogbenigun FO, Rademacher M, Blank G. 2006. J. Anim. Sci. 84:125-134. 22. Wellock IJ, Fortomaris PD, Houdijk JGM, Kyriazakis I. 2006. The effect of dietary protein supply on the performance and risk of post-weaning enteric disorders in newly weaned pigs. Anim. Sci. 82:327-335. 23. Htoo JK, Araiza BA, Sauer WC, Rademacher M, Zhang Y, Cervantes M, Zijlstra RT. 2007. Effect of dietary protein content on ileal amino acid dierstibility, growth performance, and formation of microbial metabolites in ileal and cecal digesta of early-weaned pigs. J. Anim. Sci. 85:3303-3312. 24. Melin L, Jensen-Waern M, Johannisson A, Ederoth M, Katouli M, Wallgren P. Developement of selected faecal microfloras and of phagocytic and killing capacity of neutrophils in yong pigs. Vet. Microb. 54: 287-300. 25. Montagne L, Pluske JR, Hampson DJ. 2003. A review of interactions between dietary fibre and the intestinal mucosa, and their consequences on digestive health in young non-rumiant animals. Anim. Feed Sci. Tecnol. 108:95-117. 26. Takahashi S, Yoshida Y, Nakanishi N, Tsukahara T, Ushida K. 2008. Quantitative real-time PCR monitoring of Escherichia coli and Clostridium

perfringes with oral administration of Lactobacillus plantarum strin Lq 80 to weaning piglets. Anim. Sci. J. 79:737-744. 27. Escalante-Lozada, Gosset-Lagarda, Martinez-Jiménez A, Bolívar-Zapata F. 2004. Diversidad bacteriana del suelo: método de estudio no dependiente del cultivo microbiano e implicaciones biotecnológicas. Agrociencias. 38:583-592. 28. Konstantinov SR, Zhu WY, Williams BA, Tamminga S, de Vos WM, Akkermans ADL. 2003. Effect of fermentable carbohydrates on piglets faecal bacterial communities as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16s ribosomal DNA. FEMS Microbiology Ecology. 43:225-235. 29. Konstantinov SR, Favier CF, Zhu WY, Williams BA, Klüb J, Souffrant WB, de Vos WM, Akkermans ADL, Smidt H. 2004. Anim. Res. 53:317-324. 30. Williams BA, Bosch MW, Awati A, Konstantinov SR, Smidt H, Akkermans ADL, verstegem MWA, Tamminga S. 2005. In vitro assement of gastrointestinal tract (GIT) fermentation in pigs: fermentable substrates and microbial activity. Anim. Res. 54:191-201. 31. González JM. 2004. Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio. http://www.rtphc.csic.es/Marie%20Curie%20Research%20Training/10_Gonzalez.pdf. Consultado el 16/11/2008. 32. Leser TD, Amenuvor JZ, Jensen TK, Lindecrona RH, Boye M, Møller K. Culture-independent analysis of gut bacteria: the pig gastrointestinal tract microbiota revisited. Appl Environ Microbiol. 2002 Feb;68(2):673-690. 33. Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, Gill SR, Nelson KE, Relman DA. 2005. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308:1635-1638. 34. Rajilić-Stojanović M, Smidt H, de Vos WM. Diversity of the human gastrointestinal tract microbiota revisited. Environ Microbiol. 2007;9(9):2125-36. 35. Thomas D. Leser,* Joanna Z. Amenuvor, Tim K. Jensen, Rikke H.Lindecrona, Mette Boye, and Kristian Møller. 2002. Culture-Independent Analysis of Gut Bacteria: the Pig Gastrointestinal Tract Microbiota Revisited. Appl Environ Microbiol. 68:673–690. 36. NRC NRC. 1998. Nutrient Requirements of Swine. 10th rev. ed. Natl Acad. Press, Washington, DC. 37. Shirkey TW, Siggers RH, Goldade BG, Marshall JK, Drew MD, Laarveld B, Van Kessel AG. 2006. Effects of cmmensal bacteria on intestinal morphology and expression of proinflamatory citoquines i the gnobiotic pig. Exp. Biol. Med. 231:1333-1345. 38. Li M, Gong J, Cotrill M, Yu H, de Lange C, Burton J, Topp E. 2003. Evaluation of QIAamp® DNA stool mini kit for ecological studies of gut microbiota. J. Microbiol. Meth.54:13-20. 39 Grüntzig V, Stres B, Ayala del Río HL, Tiedje JM. 2002. Improved Protocol for T-RFLP by Capillary Electrophoresis. Center for Microbial Ecology. Michigan State University East Lansing, Michigan, 48824. http://rdp8.cme.msu.edu/html/t-rflp_jul02.html. Consultado el 15/11/2008. 40. Reboud JP, Ben AA, Desnuelle P. 1962. Variations de la teneur en enzymes de páncreas de rat en function de la composition des régimes. Bioch. Biophys. Acta. 58:326-327.

41. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:263-270. 42. Reis de Souza TC, Guerrero MJC, Aguilera BA, Mariscal LG. 2005. Efecto de diferentes cereales sobre la morfología intestinal de lechones recién destetados. Tec. Pec. Méx. 43:309-321. 43. Gu X, Li D. 2004. Effect of dietary crude protein on villous morphology, immune status and histochemistry parameters of digestive tract in weaning piglets. Anim. Feed Sci. Techol. 114:113-126. 44. Piel C, Montagne L, Sève B, Lallès JP. 2004. Increasing digesta viscosity using carboxymethylcellulose in weaned piglets stimulates ileal globet cell numbers and maturation. J. Nutr. 135:86-91. 45. Kim YS, Brophy EJ. 1976. Rat intestinal brush border membrane peptidases. J. Biol. Chem. 251:3199-3205. 46. Gray GM, Santiago NA. 1977. Intestinal surface amino-oligopeptidases. J. Biol. Chem. 252:4922-4928. 47. Lapp CA, O’Conner JL. 1984. Peptidase activity in the hypothalamus of the rat: Utilization of leucine-p-nitroanilide to monitor activity degrading luteinizing hormone releasing hormone. Biol. Rep. 30:848-854. 48. Hedemann MS, Jensen BB. 2004. Variations in enzyme activity in stomach and pancreatic tissue and digesta in piglets around weaning Arch. Anim. Nutr.58:47-59. 49. Rick W, Fritsch WP. 1974. Chymotrypsin, trypsin, and pepsin. In: HU Bergmeyer (ed.). Methods of Enzymatic Analysis. Academic. New York. p.1006-1057. 50. Novozamsky IR, van Eck R, van Schouwenburg J Ch, Walinga I. 1974. Total nitrogen determination in plant material by means of the indophenol-blue method. Neth. J. Agric. Sci. 22:3-5. 51. Vahjen W, Osswald T, Schäfer K, Simon O. 2007. Comparison of xylanase and a complex of non starch polysaccharide-degrading enzymes with regard to performance and bacterial metabolism in weaned piglets. Arch. Anim. Nutr. 61: 90-102. 52. Janeczko S, Atwater D, Bogel E, Greiter-Wilke A, Gerold A, Baumgart M, Bender H, McDonough PL, McDonough SP, Goldstein RE, Simpson KW. 2008. The relationship of mucosal bacterial to duodenal histopathology, cytokine mRNA, and clinical disease activity in cats with inflammatory bowel disease. Vet. Microb. 128:178-193. 53. Lee DN, Chuang YS, Chiou HY, Wu FY, Yen HT, Weng CF. 2008. Oral administration recombinant porcine epidermal growth factor enhances the jejunal digestive enzyme genes expression and activity of early-weaned piglets. J Anim. Physiol. Anim. Nutr. 92: 463-470. 54. Piè S, Lallès JP, Blazy F, Laffitte J, Sève B, Oswald IP. Weaning is associated with an upregulation of expression of inflammatory cytokines in the intestine of piglets. J. Nutr. 134: 641-647. 55. Yang J. 1990. Medical Cytochemistry and cell biotechnology (in Chinese). Asóciate Prees of Beijing Medical University and Chinese Xiehe Medical University, Beijing. P. 253-294. 56. Gong Z, Zhan R (eds). 1994. Pathology tissue production and dyeing technology (in Chinese). Shangai Science and Technology Press, Shangai, China. P. 308-332.

57. AOAC. 2002. Official Methods of Analysis. 17th ed. Association of Official Analytical Chemists. Arlington. VA. 58. van Soest PJ, Robertson J, Lewis BA. 1991. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition. J. Dairy. Sci. 74:3583–3594. 59. Henderson JH, Ricker RD, Bidlingmeyer BA, Woodward C. 2000. Rapid, accurate and reproducible HPLC analysis of amino acids. Amino acid analysis using Zorbax Eclipse AAA columns and the Agilent 1100 HPLC. Agilent technologies Part No. 5980-1193E. p. 10. 60. Steel RGD, Torrie JH. 1980. Principles and procedures of statistics. A Biometrical approach. 2nd Edition. McGraw-Hill Kogakusha, Ltd. 61. SAS. 1992 SAS/STAT User’s Guide (Version 6, 4th Ed.). Cary NC: SAS Inst Inc. 6. Grupo de trabajo 6.1 Instituciones participantes: 1. Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro (FCN-UAQ), Cuerpo académico “Morfofisiología y Nutrición Animal” (CAMNA). 2. Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas Pecuarias Y Forestales (CENID Fisiología – INIFAP). 3. Washington University School of Medicine, Dept. Pathology & Immunology. 6.2 Integrantes: 1. Dra. Tércia Cesária Reis de Souza. CAMNA/LMVZ/FCN/UAQ (responsable técnico). 2. Dra. María Guadalupe Bernal Santos. CAMNA/LMVZ/FCN/UAQ. 3. M. en C. Araceli Aguilera Barreyro. CAMNA/LMVZ/FCN/UAQ. 4. M. en C. María de Jesús Guerrero Carrillo. CAMNA/LMVZ/FCN/UAQ. 5. Dr. Juan Joel Mosqueda. LMVZ/FCN/UAQ. 6. Dr. Gerardo Mariscal Landín. Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas Pecuarias Y Forestales (CENID Fisiología – INIFAP). 7. Dr. Gerardo Nava. Washington University School of Medicine, Dept. Pathology & Immunology. USA. 8. José Guadalupe Gómez Soto. LMVZ/FCN/UAQ. Candidato a estudiante de doctorado. Los investigadores miembros del CAMNA son colaboradores del presente proyecto y poseen gran experiencia en nutrición animal. Los aspectos que van más allá de la nutrición están respaldados por colaboradores expertos en las área de biología molecular, histopatología, microbiología e inmunología veterinaria, cubriendo así todos los dominios de la ciencia planteados en el proyecto. La cooperación científica existente con el CENID Fisiología del INIFAP data de más de 10 años, constituyendo una base sólida para el éxito del presente proyecto. Se contará con la asesoría del Dr. Gerardo Nava, investigador experto en el diseño de estrategias complejas basadas en técnicas utilizando PCR para identificación y caracterización de genes microbianos y sus análisis estadísticos.

Por otro lado, se contará con la asesoría del Dr. Gerardo Nava, investigador experto en el diseño de estrategias complejas basadas en técnicas utilizando PCR para identificación y caracterización de genes microbianos y sus análisis estadísticos. 7. Infraestructura disponible 7.1. Infraestructura de la Facultad de Ciencias Naturales

Laboratorio de Microbiología, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Laboratorio de Histopatología y Laboratorio de Nutrición animal – FCN - UAQ

5 Incubadoras Binder

1 Lector de placas de ELISA

1 Microtomo LEICA RM 2145

1 Analizador de fibra ANKOM,

2 Refrigeradores 1 Equipo de electroforesis

1 Incluidor LEICA con calentador de parafina E61130

1 Incubador in vitro DAISY II-200 ANKOM.

1 Cámara de crecimiento

1 Cámara de transferencia para Western Blott

1 campana de extracción de vapores

1 Purificador de agua Barnsted

1 Microcentrífuga. 1 Transiluminador 1 deshidratador de tejidos LEICA TP1020

2 Estufas de circulación forzada, 2 Estufas de secado

1 Centrífuga para tubos Falcon

1 Sotware para análisis de imágenes electroforéticas

4 Microscopios ópticos, 1 de fluorescencia

2 Ultracongeladores REVCO

2 Autoclaves 1 Termociclador 1 Criostato LEICA CM 1900

2 Unidad de digestión Kjeldahl

2 Campanas sencillas

2 Campanas de bioseguridad

2 Refrigeradores verticales

2 Unidad de destilación Kjeldahl Buchi K-370

Campana de bioseguridad II

1 Bioanalizador de citometría de flujo

1 Baño de flotación 2 Scrubber o lavador de gases Buchi.

1 Termociclador 1 contador de radiación gamma

1 Desparafinador 2 Congeladores verticales, 2 Refrigeradores verticales

1 Termociclador de tiempo Real

Baños metabólicos con y sin agitación,1 Calentador circulador de agua

2 Agitadoras magnéticas con calentamiento

1 Cromatografo de gases Agilent HP mod 6850A.

2 Incubadoras agitadoras

Baños metabólicos con y sin agitación,

2 Enfriadores, uno con recirculación Buchi y Poliscience.

1 Software para análisis de cromatogramas Chemstation

1 Fotodocumentador

1 Unidad de extracción de grasa

1 Campana By-pass para

Espectrofotómetro UV-VIS Agilent HP

6 plazas Buchi extracción de vapores

mod 8453

3 Cámaras de electroforesis

1 Centrífuga refrigerada Beckman

Rotaevaporadores Buchi

1 Freezer LANBCONCO

5 Cuenta colonias 1 Bomba calorimétrica automática Parr

3 Balanzas analíticas

2 homogenizadores de tejidos Powergen 125.

2 Microscopios ópticos, 1 estereoscópico, 1 de fluorescencia, 1 electrónico

2 Molinos 1 Liofilizadora 2 tituladores automáticos

7.2. Infraestructura del CENID - Fisiología Animal – INIFAP: 7.2.1 Laboratorio de Nutrición: El CENID cuenta con tituladores, espectrofotómetro, equipo para extracción de grasas, equipo automático para la determinación de nitrógeno (marca Buchï), equipo para determinar fracciones de fibra, liofilizadora, ultracongeladores uno de -20 °C, dos de -40 °C y uno de -70 °C, congeladores, molino de laboratorio, destilador de agua y purificador de agua para agua tipo III, equipo NIRS, HPLC, Cromatógrafo de gases, equipo de electroforesis, software para análisis de geles, criotomo, equipo para histología. 7.2.2 Infraestructura de la granja experimental porcina – INIFAP: Es una granja de ciclo completo con una población de 60 vientres, además de su infraestructura que sirve al flujo normal de producción: Corrales de gestación y de sementales, jaulas de gestación, sala de lactación, sala de destete, corrales de engorda. Cuenta con: una sección metabólica con quirófano, instrumental quirúrgico y equipo de anestesia para realizar las cirugías requeridas por los experimentos, 12 jaulas metabólicas para lechones, 12 jaulas de digestibilidad para lechones, 10 jaulas de digestibilidad para cerdos en crecimiento, 4 jaulas metabólicas para cerdos en crecimiento, 10 jaulas individuales de adaptación, 96 corraletas individuales para pruebas de comportamiento en cerdos de 20 a 100 kg de peso, 24 corraletas colectivas para pruebas de comportamiento en cerdos de 20 a 100 kg de peso, fábrica de alimentos balanceados.

8. Programa de actividades por etapas anuales.

Etapa Actividad Periodo 1 Periodo 2 Periodo 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1. Etapa Experimental 1 Adquisición de materiales √ √ √ √ Adquisición de equipos √ √ Trabajo de campo (Exp1) √ √ √ Análisis de Laboratorio (Exp1) √ √ √ √ √ Profesor Visitante √ Trabajo de campo (Exp2) √ √ √

Análisis de Laboratorio (Exp2) √ √ √

Redacción del artículo Exp1 √ √ √ √ √

Tesis de maestría √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √

Tesis de licenciatura √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √

Tesis doctoral √ √ √ √ √ √ √ √ √

Participación en congreso √ Reunión de evaluación √

2. Etapa Experimental 2 Adquisición de materiales √ √ √ √ Análisis de Laboratorio(Exp2) √ √ Trabajo de campo (Exp3) √ √ √ Análisis de Laboratorio (Exp3) √ √ √ √ √

Redacción del artículo Exp2 √ √ √ √ √ √ Participación en congreso √ √ Tesis doctoral √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √

Tesis de maestría √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √

Tesis de licenciatura √ √ √ √ √ √

Reunión de evaluación √

3. Etapa Final Análisis de Laboratorio (Exp3) √ √ Redacción del artículo Exp3 √ √ √ √ √

Participación en congreso √ √ Trabajo de campo (Exp4) √ √ √ Análisis de Laboratorio (Exp4) √ √ √ √ √ √ Reunión de evaluación √ Redacción del artículo (Exp4) √ √ √ √ √ Tesis de doctorado √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √