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CAPACIDAD ANTIFUNGICA DE UN CONSORCIO BACTERIANO Y QUITOSANO

PARA EL CONTROL DE Aspergillus niger EN AGUACATES CULTIVADOS EN LOS

MONTES DE MARIA.

PEREZ CAMARGO R.

OCHOA ATENCIA Y.

TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE BACTERIÓLOGO.

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA

CARTAGENA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA

CARTAGENA

2015

CAPACIDAD ANTIFUNGICA DE UN CONSORCIO BACTERIANO Y QUITOSANO


MONTES DE MARIA.

PEREZ CAMARGO R.

OCHOA ATENCIA Y.

ASESOR: ADRIANA PEREZ ACOSTA M.S.c

GRUPO DE INVESTIGACIÓN MICROBIOLOGÍA Y AMBIENTE

(GIMA)

LÍNEA: SANEAMIENTO Y SISTEMAS DE SEGURIDAD ALIMENTARIA EN

AMBIENTES AGROINDUSTRIALES.

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA

CARTAGENA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA

CARTAGENA

2015

CAPACIDAD ANTIFUNGICA DE UN CONSORCIO BACTERIANO Y QUITOSANO PARA

EL CONTROL DE Aspergillus niger EN AGUACATES CULTIVADOS EN LOS MONTES

DE MARIA.

INVESTIGADORAS:

YESICA ALEJANDRA OCHOA ATENCIA

ROSA LEONOR PEREZ CAMARGO

NOTA DE ACEPTACION:

___________________________

___________________________

___________________________

___________________________

JURADO: __________________________

JURADO: ___________________________

PRESIDENTE DEL JURADO: _________________________________________

Cartagena, 26 de Marzo de 2015

Decana de la Facultad de ciencias de la salud

Programa de bacteriología

Universidad de san Buenaventura

Dra. Lourdes Benítez Peña

E. S. D.

Saludo de Paz y Bien:

La presente es para informarle que nuestro trabajo de grado el cual lleva por título,

CAPACIDAD ANTI FÚNGICA DE UN CONSORCIO BACTERIANO Y QUITOSANO


MONTES DE MARÍA. ha sido revisado por nuestras asesora, Adriana Pérez Acosta; quien

hace constar por medio de su firma que el proyecto se encuentra apto para ser evaluado por el

comité de investigaciones de la facultad de ciencias de la salud de la Universidad De San

Buenaventura Seccional Cartagena.

Investigadores:

__________________________

Yesica Alejandra Ochoa Atencia

Estudiante de Bacteriología

_____________________________

Rosa Leonor Pérez Camargo .

Estudiante de Bacteriología.

_____________________________

Adriana Pérez Acosta

Asesora

Éxito, reconocimiento, fama y gloria. Muchos luchamos por razones como estas, pero no

puedes construir un buen nombre de un día para otro. Es necesario trabajar duro, incluso

si hay tropiezos o caídas; es necesario superar los obstáculos, tener motivación perseverar

e insistir. La vida es una sucesión de batallas. Lo que hagamos en la vida hará eco en la y

también expectativas para el futuro.

(EL GLADIADOR - GORDON RUSSELL)

DEDICATORIA

Al padre celestial mi señor Jesucristo le agradezco por permitir la oportunidad de construir un

camino de lado a mis padres a mi mama por todos el amor que me brinda sus acciones de

magnitudes inmedibles y a mi papa por siempre ser mi maestro espiritual, mi familia y amigos

que utiliza como herramienta para ser mi apoyo incondicional durante todo este tiempo, hago

extensivo este agradecimiento a mi amiga Edith tache por demostrarme que los valientes

sobreviven agarrados de la confianza le doy gracias por escucharme a toda hora y ayudarme a

sacar perseverancia por hacerme reír con lágrimas en los ojos y encontrar soluciones que estaban

escondidas en la oscuridad de situaciones desfavorables y con su impaciencia siempre decirme “

aja te estoy esperando “ , por dónde vienes” como te fue “ si eso es lo que quieres hazlo maria

helena “ . Dedico en especial este trabajo a quien me acompaño a guerrear en este camino

aquella persona con la que más dificultad tuve durante mis últimos semestres académicos

encontrones fuertes peleas y maldades académicas y a quien hoy en día por situaciones de la vida

es la persona con la que realice este proyecto por que pudimos superar nuestras barreras

personales y podernos llamar amigas mi más querida colega y la persona más chiquitita que me

saca sonrisas. Quisiera dedicar estas líneas para mi prima Rosaura Lorena Camargo Moscote

(MD) y a Oliva Primera Pedroso mi hermana (PHD) ambas por su infinita confianza,

colaboración cariño y esa interminable lista de consejos con respecto a mi trabajo de grado

jamás me dejaron caer me fortalecieron hasta el final. También a mi pequeño Ian Rafael de la

torre primera que se convirtió en mi motor y manejar mí parte más sensible llenándome de

motivación para la realización de este proyecto.

ROSA LEONOR PEREZ CAMARGO

DEDICATORIA

Esta tesis se la dedico a mi Dios quién supo guiarme por el buen camino, darme fuerzas para

seguir adelante y no desmayar en los problemas que se presentaban, enseñándome a encarar las

adversidades sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el intento.

A mi Padre Javier Ochoa Vargas quien por él soy lo que soy. Para mi tía Didier Verbel

Bohórquez por su apoyo, consejos, comprensión, amor, ayuda en los momentos difíciles, y por

regalarme su apoyo emocional en los momentos de adversidad y Me ha brindado todo lo que soy

como persona, mis valores, mis principios, mi carácter, mi empeño, mi perseverancia, mi coraje

para conseguir mis objetivos. También a mi única amiga de Carrera Rosa Leonor Pérez, que a

pesar de las dificultades, discusiones nunca desmayo, quién se convirtió en mi motor emocional,

dejando una huella para toda la vida, una verdadera amistad. A mis hermano por estar siempre

presente, acompañándome para poderme realizar. Y a mi misma por ese motivo, inspiración y

felicidad por la investigación

YESICA OCHOA ATENCIA

AGRADECIMIENTOS

Al personal de la Universidad de San Buenaventura seccional Cartagena, eternamente

agradecidas por la colaboración por parte de los laboratorios de ingeniera de alimentos y química

de la universidad de Cartagena y el Hospital universitario que nos apoyó en todo el proceso y

contribuyeron al logro de esta investigación; especialmente Adriana Pérez Acosta por todo su

empeño y dedicación para con el proyecto más que asesora amiga maestra de vida e

investigación.

Contenido RESUMEN ........................................................................................................................................ 25

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 27

GLOSARIO ........................................................................................................................................ 28

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................................. 31

2. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 35

2.1 OBJETIVO GENERAL .......................................................................................................................... 35

2.1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................ 35

3. MARCO REFERENCIAL ................................................................................................................... 36

3.1 Investigaciones Previas ..................................................................................................................... 36

3.2 BASES TEÓRICAS ......................................................................................................................... 42

3.2.1 Aguacate ................................................................................................................................. 42

3.2.2 Antifúngicos ................................................................................................................................... 44

3.2.2.1 Quitosano ................................................................................................................................... 46

3.2.2.2 Bacterias Ácido Lácticas ............................................................................................................ 47

3.2.2.3 Aspergillus niger ......................................................................................................................... 51

3.2.3 Conservación ................................................................................................................................. 53

3.2.4 Maduración ................................................................................................................................... 53

3.2.4.1 Bioconservación ......................................................................................................................... 54

3.2.5 Enfermedades Fúngicas de Pos cosecha....................................................................................... 54

4. DISEÑO METODOLOGICO ............................................................................................................. 56

4.1 Tipo de investigación ........................................................................................................................ 56

4.2 Delimitación ...................................................................................................................................... 57

DIAGRAMA DEL DISEÑO DE EXPERIMENTO ....................................................................................... 59

5. FUENTES .............................................................................................................................................. 60

5.1 Fuentes Primarias ............................................................................................................................. 60

5.1.2 Fuentes Secundarias ...................................................................................................................... 60

5.2 ETAPAS ...................................................................................................................................... 60

5.3.1 Tercera etapa: Activación pre inoculó Bacterias Acido Lácticas .................................................... 61

5.3.2 Cuarta etapa: Suspensión Aspergillus niger y diluciones seriadas. ................................................ 61

5.3.3 Quinta etapa: Preparación del Quitosano 3% ............................................................................... 61

5.3.4 Sexta etapa: Aplicación del tratamiento ........................................................................................ 62

5.4 OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABL ...................................................................................... 64

6. ANALISIS E INERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ......................................................................... 65

7. CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 78

8. INVESTIGACIONES DERIVADAS ..................................................................................................... 79

9. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES .................................................................................................. 80

10. ADMINISTRACIÓN DEL PROYECTO .............................................................................................. 82

11. REFERENCIAS.............................................................................................................................. 85

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.Preinoculo de Bacterias Ácido lácticas ........................ ¡Error! Marcador no definido.7

Figura 2. Suspensión del hongo o solución madre……………………………...…………….38

Figura 3. Preparación del Quitosano……….............................................................………….39

Figura 6. Identificación macroscópica del hongo en agar Sabouraud..........................................62

Figura 7. Identificación macroscópica del hongo en Agar MRS..................................................63

Figura 8. Identificación macroscópica del hongo en el reverso..................................................64

Figura 9. Identificación microscópica..........................................................................................65

Figura 10, 10.1, 10.2 Controles ambientales...............................................................................66

Figura 11. Control ambiental de bacterias aerobias mesofilas....................................................67

Figura 11, 11.1, 11.2, 11.3 Nivel 1 Bacterias Ácido lácticas.......................................................68

Figura 12 .Nivel 2 Quitosano........................................................................................................69

Figura 13. Combinación de los niveles.........................................................................................71

Figura 14. Prueba Microscópica de las Bacterias Ácido lácticas.................................................72

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Identificación macroscópica de Bacterias ácido lácticas……….......……………40

Esquema 2. Identificación macroscópica de Aspergillus niger....................................................41

Diagrama 1. Vía homofermentativa de las bacterias ácido lácticas............................................46

Diagrama 2. Vía heterofermentativa.de las bacterias ácido lácticas............................................47

Diagrama 3. Diagrama del diseño del experimento.....................................................................57

Diagrama 4. Diagrama de flujo del experimentó.........................................................................61

LISTA DEANEXOS

Anexo 1. Aguacates

enfermos……………………………………………………………………80 94

Anexo 2. Preparación de medios de cultivo……………………………………………..........…81

Anexo 3. Aislamiento de Aspergillus niger……………………………………………......…….82

Anexo 4. Bacterias acido lácticas. ………………………………………....................................82

Anexo 5. Diluciones seriadas de Aspergillus niger......................................................................83

Anexo6. Aplicación del experimento............................................................................................84

RESUMEN

En la actualidad las enfermedades post cosechas son una preocupación para el sector

agroindustrial por las grandes pérdidas causadas, resaltan las fitopatogenias por hongos

filamentosos como Aspergillus niger, provocando lesiones degenerativas en las diferentes frutas

y hortalizas; en el caso del aguacate siendo un fruto de alta producción en el país origina la

necesidad de establecer un control perdurable y eficiente con la capacidad de sobrevivir a las

condiciones físicas y químicas del fruto sin alterar sus propiedades organolépticas. Con lo

anterior prima la importancia de proponer un tratamiento innovador mediante un consorcio

bacteriano láctico más Quitosano como biocontroladores por ser de origen natural, estables y con

capacidad de inhibición anti fúngica.

Objetivo: Analizar el efecto anti fúngicos in vitro para el cultivo de aguacates de los Montes de

María, con el propósito de controlar el crecimiento de Aspergillus niger utilizando un pool de

Bacterias Ácido lácticas, Quitosano y la mezcla de ambos.

Método: Se realizó un estudio de tipo experimental y multifactorial; trabajando como matriz

aguacates enfermos. Aplicando un tratamiento anti fúngico a diferentes niveles que fueron

bacterias acido lácticas, Quitosano y la mezcla de ambos. La observación e identificación se

hizo mediante microscopia convencional y la técnica de azul de lactofenol.

Resultados: De un total de 42 bloques experimentales, se pudo controlar el crecimiento del

hongo al 70% de los niveles expuesto del tratamiento se identificaron las estructuras

microscópicas compatibles con morfología bacteriana, hifas y micelios.

Conclusión Al finalizar esta investigación se pudo probar que este tratamiento solo es útil en la

caso de que el fitopatógeno este iniciando su crecimiento. Pues la técnica in vitro nos revelo

que el pool de BAL puede controlar el hongo a bajas concentraciones es decir cuando el

aguacate muestre indicios del crecimiento de un hongo contaminante.

Palabras Clave: consorcio Bacteriano láctico, Aguacates, Quitosano, Aspergillus niger.

Capacidad anti fúngica de un consorcio bacteriano en aguacates afectados. 26

Abstract

Currently postharvest deseases are something to concern for the agroindustrial sector due to the

huge loses, the Phytopathology are highligthed by filamental fongus as Aspergillius niger,

causing degenerative injures on different fruits and vegetables; in case of avocado fruit of high

production in the country is evident the need for a sustainable control and the ability to survive

to the phisical and chemical condition without any organoleptic properties alteration. With that

is really important to propouse a innovative treatment by a lactic acid bacteria consotium plus

chitosan as both acting as a growth biocontrol, their sourced bye nature and the ability of

antifungal inhibition.

Objective: To analyze the antifungal effect in vitro of avocados from Montes de Maria, in

order to control the growth of Aspergillus niger using lactic acid bacteria consortium, chitosan

and the mixture of both.

Method: An experimental and multifacotiral study type was made it; working as an matrix

affected avocados. Applying antifungal treatment in different levels, these were: lactic acid

bacteria, chitosan and the mixture of both. The observation and identification was made by

conventional microscopy and blue Lactophenol technique.

Results: a total of 42 experimental blocks, the 70% levels showed up growth controling of

treatment exposed, microscopic structures compatible with bacterial morphology, hyphae and

mycelia were identified.

Conclusion At the end of this research is proved that this treatment is only useful when the

fungus starts his growth. For in vitro technique revealed to us that the pool of BAL can control

the fungus at low concentrations on the avocado surface growth shows signs of a contaminant

fungus.

Keywords: lactic acid bacteria consortium, avocados, chitosan, Aspergillus niger

.

https://www.google.com.co/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&uact=8&ved=0CCgQFjAB&url=http%3A%2F%2Fapsjournals.apsnet.org%2Floi%2Fphyto&ei=e1r1VL-wCcr5ggSbu4G4Cw&usg=AFQjCNHuFtT6J6NCVE1KthrWl7yN5v6SWw&sig2=_v0_Z0xNswwZCbAldwjnig&bvm=bv.87269000,d.eXY


INTRODUCCIÓN

El aguacate (Persea americana mill), originario de México y Centro-América, existiendo

evidencia de su selección y consumo en México desde hace 10000 años, es considerado

como una de las mayores contribuciones nutricionales de América al mundo cultivándose

actualmente en 60 países, entre los que México sobresale como primer productor con

102.467 hectáreas. Colombia es uno de los principales productores y consumidores de aguacate.

En los municipios del departamento de Bolívar se presentan casos donde los cultivos de

Aguacate se ven afectados por los grandes periodos de sequía e invierno lo cual favorece al

desarrollo de hongos contaminantes; en esta investigación se abordó principalmente el hongo

micotoxigénico Aspergillus niger, el cual es un microorganismo capaz de producir aflatoxinas

las cuales pueden causar afecciones en la salud humana y animal. A su vez es capaz de alterar el

árbol de aguacate generando pigmentaciones que van desde verdes amarillas, cafés y negras,

ocasionando que el fruto tenga características físicas indeseables para el consumidor y agricultor

generando así grandes pérdidas para los cultivadores, debido a esto el sector agrícola ha

propuesto alternativas para contrarrestar estos fitopatógeno, empleando agroquímicos los cuales

además de inhibir al agente causal también altera la flora natural del suelo y de la planta

generando un gran impacto ambiental y en la salud humana; por ende esta investigación es tipo

experimental puesto que se propuso emplear una herramienta biológica utilizando Bacterias

Ácido lácticas y Quitosano las cuales son las variables de estudios a emplear puesto que se ha

demostrado que tienen efectos anti fúngicos.


GLOSARIO

Aguacate: el aguacate es una fruta de mucha antigüedad, originara de México y cultivada en

distintos países de centro América y Suramérica. Debido a las múltiples capacidades nutritivas y

sus diferentes tipos de usos esta fruta es uno de los grandes aportes de Latinoamérica para el

mundo.

Aislamiento: El aislamiento de microorganismo se hace básicamente para obtener una cepa pura

y que pueda ser utilizada en cualquier tipo de experimento o prueba que sea requerida en un

momento dado, esta técnica es muy eficiente porque se obtiene un solo tipo de microorganismo y

que no haya de varios.

Biotecnología: Cuerpo de conocimientos relativos al uso de organismos, células o constituyentes

derivados de células con el fin de desarrollar productos que son técnica, científica y clínicamente

útiles. La alteración de la función biológica a nivel molecular (es decir, INGENIERÍA

GENÉTICA) es una cuestión central; los métodos de laboratorio utilizados incluyen tecnologías

de TRANSFECCIÓN y CLONACIÓN, algoritmos de análisis de secuencia y estructura, bases de

datos automatizadas y análisis y predicción de la función de estructuras de genes y proteínas.

Bloque Control: Punto necesario para evaluar el efecto de los tratamientos experimentales,

existen diversas circunstancias en las que el bloque control es necesario, un bloque control al que

no se de tratamiento revela las condiciones en que se efectuó el experimento.

Carga microbiológica: es la populación de microorganismos viables presentes sobre una

materia o producto.

Consumidor: es un sujeto de mercado que adquiere bienes o usa servicios para destinarlos a su

propio uso o satisfacer sus propias necesidades, personales o familiares.

Ccultivo Starter: consiste en una especie o combinación de especies microbianas que una vez

adicionados a un producto originan un conjunto de transformaciones en los componentes básicos

(glúcidos–proteínas–lípidos) con un resultado final que se manifiesta en el cambio de la textura,


color y sabor del producto final, incrementando su poder de conservación y en ocasiones aportan

efectos benéficos para la salud del consumidor.

Streptococcus salivarius subsp. thermophilus: bacteria Grampositiva, inmóvil, anaerobia

facultativa. Organismo no formador de espora, fermentador homoláctico y alfa-hemolítico del

grupo viridans.

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: Es una bacteria Grampositiva, en forma de bacilo

largo y filamentosos, no móvil y no formador de esporas. Esta bacteria es considerada

como acidúricos o acidófila, ya que requiere un pH bajo (alrededor de 5.4 a 4.6) para crecer con

eficacia. La bacteria tiene un complejo de requerimientos nutricionales, incluyendo la

incapacidad para fermentar todo el azúcar, excepto la lactosa.

Diseño Experimental: Arreglo necesario de las unidades experimentales utilizadas para

controlar el error experimental y a la vez acomodar los tratamientos. Demuestra el uso de

precisión y exactitud en los resultados con eficiencia en los recursos.

Equipo: es el conjunto de maquinaria, utensilios, recipientes, tuberías, vajillas y demás

accesorios que se empleen en la fabricación, procesamiento, preparación, envase,

fraccionamiento, almacenamiento, distribución, trasporte, y expendio de alimentos y sus materias

primas.

Factor: es un grupo específico de tratamiento: temperatura, humedad y tipos de suelo, se

considera un factor cada uno. Las diversas categorías de un factor se denominan niveles del

factor.

Finca: Es el que se aplica a un determinado tipo de establecimiento que tiene lugar en el ámbito

rural y que se dedica a la producción de algún tipo de elemento agrícola o ganadero. Las fincas

suelen ser establecimientos ubicados en terrenos más bien amplios, con un centro habitable,

grandes extensiones de tierra y otros establecimientos relacionados con la producción como

tambos, molinos, silos, etc.


Hectárea: (conocida también como hectómetro cuadrado o hm²) es la superficie que ocupa

un cuadrado de un hectómetro de lado, totalizando con ello una superficie de 100 m x 100 m =

10 000 m².

Materia prima: son las sustancias naturales o artificiales, elaboradas o no, empleadas por la

industria de alimentos para su utilización directa, fraccionamiento o conversión en los alimentos

para consumo humano.

Medio de cultivo: Un medio de cultivo está compuesto por un gel o una solución que

proporcionan los nutrientes necesarios para permitir, condiciones favorables de pH y

temperatura, en el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso

pequeñas plantas.

Producto: El producto es un conjunto de atributos que el consumidor considera que tiene un

determinado bien para satisfacer sus necesidades o deseos. Según un fabricante, el producto es

un conjunto de elementos físicos y químicos engranados de tal manera que le ofrece al usuario

posibilidades de utilización.

Proceso tecnológico: es la secuencia de etapas u operaciones que se aplican a las materias

primas y demás ingredientes para obtener un alimento. Esta definición incluye la operación de

envasado y embalaje del producto terminado.

Tratamiento: Conjunto de circunstancias creadas para el experimento en respuesta a distintas

hipótesis de la investigación y que son el centro de la misma.

Unidades Experimentales: Es la entidad física o el sujeto expuesto al tratamiento

independientemente de otras unidades, constituye una sola réplica del tratamiento.

Quitosano: Es un biopolímero natural que se obtiene de la Quitina por métodos químicos,

electroquímicos o enzimáticos. Químicamente es una Poli (D-glucosamina), por ello se considera

un polisacárido Biodegradable. El tamaño molecular depende de la especie y de la edad de los

individuos dado que se obtienen desde un polímero biosintetico.

http://es.wikipedia.org/wiki/Superficie_(f%C3%ADsica)

http://es.wikipedia.org/wiki/Cuadrado

http://es.wikipedia.org/wiki/Hect%C3%B3metro


1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El aguacate ( Persea americana mill ) es una fruta originaria de México y Centro-américa,

existiendo evidencia de su selección y consumo en México desde hace 10000 años, este

frutal es considerado como una de las mayores contribuciones nutricionales de América al

mundo cultivándose actualmente en 60 países, entre los que México sobresale como

primer productor con 102.467 hectáreas (ha); sin embargo, la producción en México por

unidad de superficie es menor que otros países como Brasil, República Dominicana, Israel

y Colombia(1)

. El consumo de este fruto ha aumentado a nivel mundial, especialmente en países

como Estados Unidos, Francia, Alemania, y España, el aguacate sustenta su alta demanda en el

mercado mundial gracias a sus características, tales como su sabor, sus cualidades nutritivas y

sus amplias posibilidades de uso, tanto culinarias como en la industria farmacéutica y

cosmética(2)

.

La especie Persea americana mill, pertenece a la familia de las Lauraceae, la cual es

considerada junto a otras como la más primitiva de las dicotiledóneas; está formada por árboles o

arbustos y algunas parásitas trepadoras. La familia Lauraceae comprende cerca de 40 géneros y

alrededor de 1000 especies distribuidas en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, el

aguacate, ha sostenido un permanente incremento en su producción mundial, pasando de

producirse 2.510.088 toneladas en 2010 a 3.585.156 toneladas en 2015. Esto significa un

incremento de 51.43% en cinco años. En Colombia, en el 2013 la producción se incrementó en

un 63%, alcanzando un total de 185.800 toneladas y un área cultivada de 17.084 hectáreas (3)

.

Según estadísticas del Ministerio de Agricultura, la producción de aguacate en Colombia en 2014

existían 21.590 hectáreas (ha) que están altamente dispersas ya que el cultivo está distribuido en

veintiún departamentos del país. El 29,9% del área se concentra en el departamento de Bolívar,

le sigue Santander y Tolima con 16,8% cada uno (4)

. Algo muy importante y que llama mucho la

atención es que, a pesar del gran potencial que tiene Colombia como productor de aguacate

exportable, el país no ha podido consolidarse como un exportador neto. Los principales aspectos

que influye en este fenómeno es en la gran demanda interna que obliga a la importación en

ciertas temporadas del año, así como la falta de prácticas agrícolas apropiadas que dificultan el

acceso a los mercados internacionales(2)

.


En los Montes de María, exactamente en El Carmen de Bolívar, es un municipio que ha sido

afectado de manera directa por el conflicto armado que azota al país por este motivo muchos

agricultores fueron asesinados y otros desplazados lo cual con llevo al abandono de los cultivos,

generando a su vez problema grave de nivel biológico, como es la pudrición de las raíces y

subsiguiente muerte del árbol generado por los hongos Phytophthora cinnamomi Rands,

Verticillium sp, Aspergillus, Diplodia

(2).

Otro grave problema de nivel biológico en esta zona, son las enfermedades pos-cosecha, que

ocupan un lugar importante en el grupo de enfermedades del aguacate, el factor común de estas

patologías, es que aparecen cuando el fruto comienza su ablandamiento. De esta forma los

síntomas más visibles se presentan cuando los frutos están a la mano de consumidor (5)

.

Las enfermedades pos-cosecha de aguacate tienen importancia en todos los países donde es

cultivado, afecta gravemente desde el campo, la calidad del fruto y en pos cosecha llega a causar

pérdidas económicas importantes. Estas enfermedades son causadas predominantemente por el

hongo Aspergillus niger (5)

, este es un importante patógeno vegetal que ataca la raíz, tallo, hojas,

flores y fruto; la infección por este patógeno se presenta en estadios tempranos del desarrollo del

fruto, pero la enfermedad aparece luego en etapas de maduración (6)

.

Los principales síntomas causados por este hongo se dan tanto antes como después de la

cosecha, los desarrollados después de la cosecha aparecen como lesiones circulares pequeñas de

color café claro, cuando la lesión se alarga se torna hundida en el centro y cambia a color café

oscuro o negro (5)

.

Las enfermedades pos-cosecha son consideradas como las más destructivas a nivel de Colombia,

debido a su amplia distribución y a la magnitud de las pérdidas que ocasiona la misma, llevando

así a una gran pérdida económica. (7)

Es de relevancia señalar que para marzo del 2011en los Montes de María ocurrió una importante

pérdida en la mayoría de las hectáreas de aguacates sembradas en toda esta zona, generando la

muerte de 3500 árboles de aguacate de los 7000 árboles sembrados, por esta razón se generó una

crisis bastante preocupante debido a que la producción y comercialización de aguacate es la


principal fuente de empleo que existe en este municipio tan marcado y golpeado por la violencia

(8).

Es importante abordar el manejo y tratamiento en la pos-cosecha del aguacate puesto que existen

uno o más síntomas dañinos cuando el aguacate ha alcanzado su madurez, esta labor de

acondicionamiento y beneficio es realizada antes de llevarla al comercio, lo que es de vital

importancia introducir técnicas tales como; lavado, selección por tamaño o madurez,

clasificación por calidad y empaque, todo este proceso puede efectuarse de manera manual o

mecanizada de tal forma que se pueden generar lesiones que afecten la calidad del producto.

Cabe resaltar que este producto se puede ver afectado por el transporte y almacenamiento, en los

que se mencionan: daños por golpes o magulladuras, relativamente estos proceso son

económicos y permiten mantener el producto en estado de calidad (9)

. Sin embargo existen

ciertos recubrimientos o matrices formuladas a base de lípidos, proteínas o carbohidratos que

prolongan la vida útil del mismo, por tal razón es de gran importancia utilizar recubrimientos

comestibles como el Quitosano, el cual reduce el crecimiento de hongos y bacterias. Los

recubrimientos pueden servir como vehículos para un amplio rango de aditivos, incluyendo

compuestos antimicrobianos, con la finalidad de proporcionarles mayores atributos como es el

control de microorganismos y a su vez prolongar la vida de aquellos productos agrícolas. Así

mismo podría ser una alternativa viable para sustituir los métodos de control de microorganismos

tradicionales o químicos. El Quitosano utilizado como recubrimiento no es más que una cubierta

en la superficie del fruto, que actúa como barrera mecánica para proteger el fruto de infecciones

causadas por hongos específicamente (10)

.

Las Bacterias Ácido lácticas tienen un uso como cultivos iniciadores en la industria alimentaria,

ya que son un grupo de bacterias benéficas de tipo industrial que ayudan a llevar a cabo procesos

de fermentación en los alimentos, pero en los últimos años, gracias a los grandes avances en la

biotecnología alimentaria, este grupo de bacterias han sido exploradas en nuevos campos, siendo

uno de ellos la utilización de estas como bioconservante natural capaz de inhibir distintos tipos

de bacterias patógenas teniendo así resultados prometedores(11)

.

Estudios realizados han demostrado que las Bacterias Ácido lácticas (BAL), por medio de

fermentación de carbohidratos tienen la capacidad de generar compuestos orgánicos como ácido


láctico, acido fórmico, etanol, dióxido de carbono entre otros, los cuales contribuyen a la

inhibición de microorganismos por medio de la interacción de la membrana celular lo que causa

en esta una acidificación, debilitamiento y desnaturalización de proteínas (11)

.

A su vez estos agentes biológicos generan compuestos enzimáticos como las bacteriocinas que

son sustancias peptídicas con acción antimicrobiana de alto peso molecular, desplazan

microorganismos competitivos por medio de un mecanismo de englobamiento donde los

péptidos se une a la membrana citoplasmática mediante fuerzas electrostáticas; este proceso

depende del potencial de la membrana el cual está influenciado por el pH, y el ATP generado por

la acción competitiva de los microorganismos lo que conlleva a la muerte celular.(11)

Las

Bacteriocinas se generan al final de la fase exponencial e inicio de la fase estacionaria, estas

tienen la capacidad de debilitar la membrana de la agente patógeno para una posterior inhibición

de él(11)26

. Las BAL se caracterizan por ser homofermentativas y heterofermetativas, poseen

acción anti fúngicas, conservante y al introducirlas en un organismo vivo tiene la capacidad de

ejercer efectos antagonistas desplazando la flora patógena (11)

.

El sector agrícola para controlar Aspergillus niger está implementando el uso de agroquímicos

los cuales pueden que controlen el crecimiento de este, pero a la vez deteriora la flora natural de

suelo dejando así a la planta expuesta a futuros ataques por otros patógenos (12)

Por lo anterior manifestado se propone trabajar con diferentes anti fúngicos, con el propósito de

contrarrestar el crecimiento de Aspergillus niger y su vez mejorar la conservación del aguacate

tipo Antillana, cultivados en El Carmen de Bolívar, todo este proceso basado con el Quitosano,

Bacterias Ácido lácticas y la combinación de ambos, los cuales son utilizados para detener el

crecimiento de Aspergillus niger, causante de la pudrición en el aguacate y otras frutales,

problemática que enfrenta los Montes de María(11)

.

Todo lo anterior permite plantear el siguiente interrogante

¿Puede generar efecto anti fúngico el Quitosano y las Bacterias Ácido lácticas en Aspergillus

niger aislado de aguacates?


2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Analizar el efecto anti fúngicos in vitro para el cultivo de aguacates de los Montes de María, con

el propósito de controlar el crecimiento de Aspergillus niger utilizando un pool de Bacterias

Ácido lácticas, Quitosano y la mezcla de ambos.

2.1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Aislar Aspergillus niger en aguacates afectados provenientes de la asociación

ACAPARBOL de los Montes de María.

Evaluar la actividad anti fúngica in-vitro del Quitosano, de un consorcio microbiano y la

mezcla de estos, sobre el crecimiento de Aspergillus niger.


3. MARCO REFERENCIAL

3.1 Investigaciones Previas

Con la finalidad de respaldar y apoyar la sustentación teórica de esta investigación realizamos

una serie de revisiones bibliográficas, descritas a continuación.

ACTIVIDAD ANTIFUNGICA DE CEPAS DE BACTERIAS ACIDO LACTICAS

AISLADAS DE UN ECOSISTEMA DE SEMOLA CONTRA Aspergillus niger

CONTAMINANDO PRODUCTOS DE PANADERIA. InstituteofSciences ,2010;(10):p.1-8.

Realizado por Francesca Valerio M, Palmira De Bellis A, Silvia de Candia.

Se tomaron 30 muestras de trigo duro de sémola y trigo duro integral de sémola, generalmente

usados para la producción de panes tradicionales al sur de Italia, fueron sometidos análisis

microbiológicos con el fin de investigar la diversidad de Bacterias Ácido lácticas y encontrar la

cepa con capacidad anti fúngica.

Un total de 125 Bacterias Ácido lácticas presuntivas aisladas ( Grampositivas y catalasa

negativa) fueron caracterizadas por la técnica PCR mediante secuencias repetitivas

palindromicas extra génicas (REP-PCR) y el análisis de la secuencia del gen 16S rNA,

conllevando a la identificación de las siguientes especies : Weissella confusa, Weissella cibaria,

Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis, Lactobacillus rossiae and

Lactobacillus plantarum.17 cepas cada una caracterizada por patrones diferentes de REP-PCR

fueron seleccionados por sus propiedades anti fúngicas. Estas cepas fueron cultivadas en Agar a

base de harina simulando un sistema alimentario real y los productos que resultaron de la

fermentación fueron ensayados contra hongos que generalmente contaminan los productos de

panadería Aspergillus niger, Penicillium roqueforti y Endomyces fibuliger. Los resultados del

estudio indicaron una fuerte actividad inhibitoria comparando a la obtenida con el conservante

propionato de calcio de diez Cepas BAL contra la más amplia difusión de contaminantes de

productos de panadería, P. roqueforti. La proyección también destacó la actividad anti fúngica

poco estudiada de L. citreum, L. rossiae y W. cibaria, que inhiben todas las cepas fúngicas a la

misma o mayor medida en comparación con propionato de calcio. Los productos de


fermentación de estas tres cepas fueron caracterizados por valores bajos de pH, y un alto

contenido de ácidos láctico y acético.

Con los resultados de la investigación mencionada resaltamos la confirmación de la existencia de

productos finales por parte de la Bacterias Ácido lácticas demostrando su capacidad anti fúngica

por técnicas moleculares en relación especifica con el hongo Aspergillus niger; de lo anterior se

basa la referencia de este artículo con respecto a la investigación propuesta por el uso de un

consorcio de Bacterias Ácido lácticas y sus propiedades anti fúngicas frente a el mismo patógeno

postulado , aplicando técnicas macroscópicas sencillas para medir el crecimiento de ambos

microorganismos y el uso de materiales, métodos similares como lo son : Agar MRS, suspensión

del hongo para diluciones seriadas.

INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO RADIAL “IN VITRO” DE Fusarium verticillioides

EN PRESENCIA DE QUITOSANO. Revis.Ibero.Poli.2010;(11):p.1-6. Realizado por

Quintana Obregón E, Plascencia Jatomea M, Sánchez Mariñez R, Rosas-Burgos M, Cortez

Rocha M.

En el anterior estudio se utilizaron el Quitosano como una nueva alternativa frente a la

utilización de los químicos como método para la preservación de productos agrícolas contra las

enfermedades fúngicas, debido a que ya se ha demostrado que este biopolímero puede inhibir el

crecimiento radial de hongos afectando su morfología y la ultra estructura en distintos productos

como el maíz, tomate y uvas.

Los métodos que se emplearon en el estudio fueron: primero se utilizó una cepa de F.

verticillioides, luego se preparó un inóculo en matraces con agar papa dextrosa (PDA) y se

incubó durante 5 días a 25°C. Posteriormente se adicionó al inóculo 20 mL de Tween-20 al 0,1%

(v/v) estéril y se agitó con barra magnética por 5 minutos. Se determinó la concentración de las

esporas suspendidas mediante conteo en una cámara de Neubauer. Se preparó Quitosano de baja,

media y alta viscosidad en ácido acético 0,1 M, con agitación a 25°C hasta disolver

completamente y se esterilizaron a 121°C durante 15 minutos. Posteriormente, se prepararon

medios de cultivo con agar papa dextrosa (PDA) acidificado con ácido acético 0,1 M estéril

mezclado con Quitosano y se obtuvieron soluciones de 1, 2, 3 y 4 g/L de Quitosano para cada


tipo de Quitosano y control acidificado con ácido acético 0,1 M (medio PDA sin Quitosano). Se

vaciaron 20 mL de medio de cultivo en caja Petri. Con una pipeta Pasteur se hizo un pozo de 0,6

cm de diámetro en el centro de la caja y se depositó una concentración 1 x 105 esporas/mL de

inoculó. Se incubó a 25°C y fotoperiodos de 12 horas luz-oscuridad y se midió manualmente dos

diámetros de la colonia cada 24 horas por placa. Se calculó el porcentaje de inhibición de

crecimiento radial, el ensayo se hizo por triplicado (12)

.

Dentro de los resultados más importantes encontraron, que el tratamiento más efectivo para

controlar el crecimiento radial de F. verticilliodes in vitro en medio PDA acidificado en un 50%

es el Quitosano de baja viscosidad. Además, se calculó la CQ50 de Quitosano de baja viscosidad,

que es de 3 g/L, la cual se recomienda utilizar para evaluar el efecto sobre germinación de

esporas y producción de micotoxinas producidas por F. verticillioides in vitro y valorar el uso de

Quitosano para tratamiento preventivo de control (12).

Por último, este estudio presenta relación con esta investigación ya que la mayoría de los

materiales que fueron empleados, también se utilizaròn en esta investigación, entre ellos el Agar

Sabouraud donde aislaremos las colonias de Aspergillus niger, posterior a esto determinan la

concentración de Quitosano adecuada, la cual se utilizó como referente para inhibir o controlar el

hongo mencionado anteriormente.

Rivas, Franco P. Garro, Oscar. PREPARACIÓN DE CULTIVOS INICIADORES.

OPTIMIZACIÓN DEL SUSTRATO DE CRECIMIENTO. Realizado en la universidad

nacional del nordeste, facultad de agroindustrias en el año 2006.

Esta investigación fue realizada con el fin de observar el medio de cultivo más óptimo para el

crecimiento de BAL y la simbiosis que pudiera generar la unión de ambas, obteniéndose estas,

de diferentes yogures comerciales y luego cultivándola en los medios de LAPTg y MRS.

Adquiriendo muestra de estas siembras cada dos horas con el fin de realizarles pruebas de acidez,

pH y densidad óptica. Uno de los resultados obtenidos de esta investigación y el más relevante

fue que en los ensayos realizados, la muestra que obtuvo mayor crecimiento fue donde estaban

sembradas L. bulgaricus y S. thermophilus.


Para nuestro trabajo es de mucha importancia el acierto de esta investigación ya que nos ayuda a

confirmar que L. bulgaricus y S. thermophilus actúan y adquieren su mayor crecimiento en

simbiosis que si lo hacen por separado (17).

RECUBRIMIENTO DE QUITOSÁN EN AGUACATE. REVIS. SOCIEDAD QUÍMICA

DE MÉXICO, VOL. 43, NÚM. 1 (2014).P: 18-23. Realizado por SALVADOR SUSANA P,

NIDIA ARAGÓN V.

El aguacate (Persea americana Mills c.v. Hass) es susceptible de perder su calidad al verse

alterado por el ataque de microorganismos y por las condiciones pos cosecha a las que se ve

sujeto. Teniendo como antecedentes las características anti fúngicas del Quitosano, en el

desarrollo del trabajo se probó dicha actividad, para lo cual, se aislaron e identificaron de

aguacates enfermos Colletrotrichum sp y Diplodia sp., causantes de la antracnosis y pudrición

del pedúnculo respectivamente. Al ser usada la refrigeración 3°C-10°C en combinación con la

película de Quitosano se obtuvieron 24 días de vida útil del fruto y un porcentaje de afección

menor que en el testigo. A diferencia de 27°C-29°C 6 días de vida (14).

La anterior investigación fue la base fundamental para la utilización y preparación del

Quitosano como anti fúngico en aguacates.

CONTROL BIOLÓGICO IN VITRO POR BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS

AISLADAS DE RESIDUOS DE CERVECERÍA. Revista Bio Ciencias ISSN 2007-3380.

Vol. 2 Núm. 1. 2012;(67):p.58-67.28 Realizado por Gerbaldo G, Asurmendi P, Ruíz F,

Pascual L, Dalcero A, Barberis L.

En el presente artículo se describe un estudio donde los autores proponían evaluar in vitro el

efecto antifúngico y anti-aflatoxicogénico de las bacterias acido lácticas (BAL) sobre especies

fúngicas de Aspergillus spp, Listeria monocytogenes e incidencia de aflatoxina B1 (AFB1) en

residuos de cervecería. Este grupo de agentes biológicos es destacado por su efecto inhibitorio

sobre otros microorganismos por la producción de metabolitos secundarios como: ácidos

orgánicos, peróxido de hidrógeno y especialmente la generación de bacteriocinas; en este estudio

cabe resaltar que dentro del grupo de hongos contaminantes y con efectos toxigenicos en cereales


y pienso almacenados se encontraron Aspergillus spp, Penicillium spp, Fusarium spp. Para este

estudio se emplearon un total de 20 muestras de residuos de cervecería de una fábrica de cerveza

artesanal, ubicada en Villa General Belgrano Argentina; las muestras para el procesamiento y

determinación de los microorganismos fueron tomadas durante el período Julio de 2010 - Junio

de 2011. Se tomó 1 mL de cada una de las diluciones y se realizaron siembras en profundidad

por duplicado. Las placas se incubaron en microaerofilia a 37°C durante 48 h. Sólo se

seleccionaron para el recuento bacteriano las placas que contenían entre 30- 300 unidades

formadoras de colonias (UFC), la identificación de las cepas de BAL se realizó mediante el

sistema semiautomatizado API 50 CH (bioMérieux ®, Francia). Para el recuento fúngico se

tomaron 0.1 mL de las diluciones 10-1

, 10-2

y 10-3

y se inocularon por duplicado sobre los

medios de cultivo agar diclorán cloranfenicol rosa de bengala (DRBC) y agar glicerol 18 %

(DG18). Las placas se incubaron aeróbicamente a 25°C durante 7 días en oscuridad. Las placas

que contenían entre 10 y 100 UFC fueron utilizadas para el recuento. Las especies fúngicas se

identificaron según características morfológicas de acuerdo a la clave taxonómica de Klich. Los

resultados de ambos recuentos se expresaron como unidades formadoras de colonias por gramo

(UFC/gr). Se examinó diariamente el crecimiento fúngico a través de la medición del diámetro

de la colonia fúngica donde todos los diámetros se determinaron utilizando 3 réplicas de cada

interacción. Cabe destacar que los mayores recuentos de Aspergillus se observaron durante el

período de Noviembre - Diciembre; Sin embargo, durante el período de Mayo - Junio de 2011

no se aislaron especies fúngicas pertenecientes a este género de lo que se puede inferir que las

condiciones climáticas fueron claves o de gran influencia para el desarrollo fúngico debido a

que en este período las temperaturas cálidas y el elevado porcentaje de humedad podrían haber

favorecido el desarrollo de la microbiota, a diferencia del periodo mayo-junio 2011 en donde no

se aislaron especies de Aspergillus spp, posiblemente porque la época era invernal en donde las

temperaturas oscilan entre -2 y 14°C.(18)

De este estudio se puede observar que en aquellas muestras donde había mayor concentración de

BAL se obtuvo un recuento más bajo, casi nulo de Aspergillus niger, L. monocytogenes y la

incidencia de AFB, lo que permite llegar a la conclusión de que las BAL tienen gran efecto de

biopreservación y las cepas de Lactobacillus coryniforme subsp coryniformis y L. cellobiosus


poseen un gran efecto anti fúngico por la generación de ácido láctico un producto final que

acompañado de la producción de otros metabolitos es capaz de alterar la membrana de los

microorganismos reduciendo el pH citoplasmático y causando así la perdida de la viabilidad y

lisis celular especialmente por el gasto de energía que se pierde en todo el proceso por el estrés al

que es sometido el agente patógeno. Por otro lado la actividad inhibitoria podría ser atribuida a la

competencia por los nutrientes entre las BAL y las cepas A. niger. Porque lo más probable es

que en un cultivo donde no se adicione los nutrientes ideales, las BAL sean más competentes

que los hongos por su metabolismo más simple y rápido. Después de haber comprobado in vitro

la capacidad que tienen las BAL de controlar u desplazar el crecimiento fúngico se llega a la

conclusión de que perfectamente se pueden emplear estas cepas en futuros estudios para

demostrar su efectividad in situ.(18)

Por último, este estudio presenta relación con esta investigación ya que demostró el poder anti

fúngico de las BAL de forma in vitro y lo importante que es tener en cuenta las condiciones

climatológicas para que se pueda encontrar Aspergillus sección ya que esto permitiría que al

momento de hacer un acercamiento a la población de estudio se obtenga información sobre las

condiciones ambientales y las mejores épocas del año para la recolección de la muestra y así no

se presenten inconveniente para aislar Aspergillus niger.


3.2 BASES TEÓRICAS

3.2.1 Aguacate

El aguacate es una fruta tropical que es originaria de México, que ha tenido una creciente

aceptación en un alto porcentaje de consumidores debido a su contenido nutricional, a las

diferentes opciones para su consumo fresco y su uso en la industria cosmética (3)

.

Es una planta perenne, de gran crecimiento vegetativo, llegando en su hábitat natural a una altura

de 10 a 12 metros. Con raíces superficiales, que absorben agua y nutrientes principalmente en las

puntas a través de los tejidos primarios; esto determina la susceptibilidad del árbol al exceso de

humedad que induce a ataques de hongos y pudriciones vasculares. Las ramas son abundantes,

delgadas y frágiles, sensibles a las quemaduras de sol y a las heladas, se rompen con facilidad al

cargar muchos frutos o por acción del viento, las flores son hermafroditas, simétricas, de color

verde amarillento. Las hojas son simples y enteras, presentan un color rojizo y al llegar a la

madurez se tornan lisas, coriáceas, y de un verde intenso(6).

Con relación a la polinización, en las regiones subtropicales y templado-cálidas, las plantas

actúan como auto fértiles, tal es el caso de las plantaciones de Aguacate variedad Hass de

Guatemala en donde no son necesarias las variedades polinizadoras. El fruto del aguacate es una

drupa carnosa, de forma periforme, ovoide, globular ó elíptica alargada; Su color varía del verde

claro al verde oscuro, y del violeta al negro. La forma, el color, la estructura y consistencia de la

cáscara y de la pulpa, son características determinadas por el grupo ecológico y la variedad

analizada. La mayoría de las variedades comerciales en los países productores de aguacate se han

clasificado en tres razas básicas o grupos ecológicos: La mexicana, de origen Mexicano, La

guatemalteca y antillana, ambas de origen Guatemalteco y parte de Centroamérica. Entre las

características distintivas se tomó en cuenta, la época de floración y recolección, el período de

floración-recolección, el peso y tipo de corteza de la fruta, el contenido de aceite de la pulpa y la

resistencia al frío(12).


El aguacate contiene:

Vitaminas: E, A, B1, B2, B3, D, y en menor cantidad C,

Minerales: muy rico con 14 variedades destacan: hierro, fósforo y magnesio.

Otros: Ácido fólico, Niacina, Biotina.

BENEFICIOS: El cultivo de aguacate es una alternativa viable para la diversificación en áreas

cafetaleras, ya que puede incorporarse a la estructura productiva de la finca en asocio con el café,

sirviendo de sombra para este y generando ingresos económicos en el mediano plazo.(10)

El país

exporta cada año unas cuatro mil 500 toneladas métricas de aguacate, Con apoyo de la

Asociación Gremial de Exportadores.(10)

El aceite de aguacate, por ejemplo, “es tan competitivo

como el aceite de oliva, por ser rico en grasas no saturadas y vitamina E, por su baja acidez y su

alta composición de fitosterol, un componente similar a la lanolina, usada en la industria de

cosméticos.(10)

ASPECTOS TÉCNICOS

Ecología: Los requerimientos agro ecológicos para el cultivo de aguacate son similares a los del

cultivo de café, por lo que se pueden establecer en asocio; o en áreas limpias de las fincas

cafetaleras(7)

Altitud de 400 a 1,800 msnm, susceptible a heladas, temperaturas de 17º a 30º C.

Precipitación Pluvial: 1,200 a 2,000 mm anuales bien distribuidas,

Humedad relativa de 60%, no tolera encharcamientos de agua, susceptible a vientos

fuertes.

Ph entre 5.5 a 6.5

Suelos: Los mejores son los de textura media, suelos francos arcillo arenosos, profundos (0.80 a

1.50 metros), con buen drenaje interno y superficial, de 3 a 5% de materia orgánica, No es

aconsejable plantar árboles de este cultivo en suelos salinos, arcillosos o con capas duras que

impidan el buen desarrollo radicular.(7)

Cosecha: De 20 a 30 días previos a cosechar y durante la cosecha, no se deberán aplicar

pesticidas sistémicos ó translaminares en los platos o sobre el follaje de los árboles de aguacate;


los productos de contacto se permite aplicarlos 8 días antes de la cosecha. Se deben cosechar los

frutos que hayan alcanzado su madurez fisiológica y que están en un estado conocido como

sazón, (tres cuartos (3/4)) o madurez de cosecha(7)

Variedades:

Variedad Hass, Variedad Antillana, Guatemalteca y Mexicana.

Siembra: La mejor época para efectuar la siembra es al inicio del período lluvioso, cuando las

plantaciones cuentan con sistemas de riego puede plantarse en cualquier época del año. Una vez

colocado el pilón, compactar adecuadamente la mezcla para no dejar cámaras de aire, cuidando

de no enterrar las plantas más allá del nudo vital(7).

3.2.2 Antifúngicos

Se entiende por anti fúngico a toda sustancia que tiene la capacidad de evitar el crecimiento de

algunos tipos de hongos o incluso de provocar su muerte. Dado que los hongos además de tener

usos beneficiosos para el ser humano (levadura del pan, hongos de fermentación de los quesos,

los vinos, la cerveza, entre otros muchos ejemplos) forman parte del colectivo de seres vivos que

pueden originar enfermedades en el ser humano, el conocimiento y uso de los antifúngicos es de

vital importancia a la hora de tratar muchas enfermedades(17).

Los anti fúngicos actúan como

recubrimiento no es más que una biopelicula que recubre todo el alimento, cuya función es

mantener la calidad del producto retrasando las principales causas de alteración como son:

Evitando ganancia o pérdida de humedad, ralentizando cambios químicos que pueden afectar al

color, aroma o valor nutricional del alimento, mejorando la estabilidad microbiológica, y

mejorando la integridad mecánica en el caso de las frutas y hortalizas (18)

.

Los son matrices continuas formuladas a base de lípidos, proteínas o carbohidratos o mezclas de

estos componentes, que les confieren diferentes propiedades fisicoquímicas. Un carbohidrato

utilizado para la formulación de los recubrimientos comestibles es el Quitosano, el cual reduce el

crecimiento de hongos y bacterias. Los recubrimientos pueden servir como vehículos para un

amplio rango de aditivos, incluyendo compuestos antimicrobianos, con la finalidad de

http://es.wikipedia.org/wiki/Hongo

http://es.wikipedia.org/wiki/Levadura

http://es.wikipedia.org/wiki/Pan

http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Queso

http://es.wikipedia.org/wiki/Vino

http://es.wikipedia.org/wiki/Cerveza

http://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad


proporcionarles mayores atributos como es el control de microorganismos. Entre los aditivos

naturales están los aceites esenciales. Se tiene amplia evidencia que los aceites esenciales

extraídos de diferentes plantas presentan inhibición contra hongos y bacterias. Al formular

recubrimientos comestibles con Quitosano y adicionar a las formulaciones productos como los

aceites esenciales, se evita el desarrollo de microorganismos, se prolonga la vida de anaquel de

los productos agrícolas, y se mantienen las propiedades sensoriales de éstos. En este artículo se

llevó a cabo una revisión de literatura sobre el tema de recubrimientos comestibles y sus

principales componentes sobre la fisiología del producto. Asimismo, se revisó literatura con

respecto al efecto de la elaboración de recubrimientos con Quitosano y la incorporación de

aceites esenciales sobre su actividad en diferentes microorganismos patógenos (10)

.

Para prolongar la vida post cosecha de los productos hortofrutícolas se han implementado

diferentes tecnologías, entre ellas el almacenamiento a bajas temperaturas, la utilización de

empaques plásticos para crear atmósferas modificadas, la aplicación de tratamientos

hidrotérmicos, irradiación y formulaciones que contienen agentes biológicos, entre otras. Todas

ellas a su vez ejercen cierto control en la incidencia de microorganismos patógenos. se ha

reportado que durante el manejo post cosecha de los productos vegetales se pueden estimar

pérdidas hasta del 40% del total cosechado, estas varían entre productos, áreas de producción y

época del año. De las principales razones que generan estas pérdidas está la incidencia de

enfermedades causadas principalmente por hongos de diversos géneros. Por otro lado, los

productos contaminados por bacterias tales como Escherichia coli, salmonella sp. y listeria

monocytogenes, pueden causar enfermedades graves a los humanos ocasionando hasta la muerte

si no son tratados a tiempo(10)

.

Generalmente, en el caso de los hongos, éstos no aparecen durante el crecimiento de las plantas,

en algunos casos permanecen en estado latente hasta la maduración del producto hortícola y otros

se adquieren durante la cosecha, el transporte y/o el manejo del producto en relación a las

bacterias, éstas pueden contaminar el producto durante la etapa pre cosecha principalmente por

aguas contaminadas o durante la manipulación de los productos hortícolas. Una alternativa con

potencial viable para la conservación de frutas y vegetales frescos es la utilización de

recubrimientos comestibles multicomponentes, los cuales pueden elaborarse con ingredientes

básicos adecuados al producto para brindarle la protección de barrera deseada y además, sirven


como vehículos para incorporar aditivos específicos que refuerzan su funcionalidad tales como

antioxidantes, colorantes y antimicrobianos, que en el caso de estos últimos se evitaría el

crecimiento de microorganismos patógenos en la superficie de los productos vegetales (10)

.

3.2.2.1 Quitosano

La quitina es un polímero natural que se clasifica dentro del tipo polisacárido, considerado a

menudo como un derivado de la celulosa por sus características, pero con ciertas diferencias en

su estructura molecular. La quitina es blanca, dura, inelástica y es la mayor fuente de

contaminación superficial de las áreas cercanas al mar. El Quitosano es el derivado de la quitina,

éste es un polímero con propiedades tales como biocompatibilidad, biodegradabilidad, toxicidad

nula, etc. Estos productos bioquímicos se pueden obtener a partir del tratamiento químico de

exoesqueletos de crustáceos entre ellos el camarón (también se encuentra en insectos, moluscos y

hongos). El quitosano se obtiene por modificación química de la quitina, la cual es tratada con

una solución alcalina concentrada y caliente, el polímero que se obtiene posee ciertas

características químicas y físicas de gran interés industrial. El quitosano es un polímero de

naturaleza policationica que se obtiene a través de un proceso de desacetilizacion de la quitina,

esta es un polisacárido muy abundante en la naturaleza y se puede extraer de las conchas,

cabezas y patas de los crustáceos. Este polímero se está utilizando en procesos biotecnológicos

gracias a su capacidad de inmovilización enzimática y efecto de agente floculante, y en la

agricultura se ha utilizado en la modificación de suelos, como fungicida, y en el recubrimiento de

frutos para prevenir enfermedades pos cosechas. El Quitosano figura como una de las

alternativas naturales más importantes para controlar todas las pudriciones pos cosechas de los

productos hortofrutícolas causadas por distintas variedades de hongos(19)

.

Actualmente, se le ha prestado especial atención al Quitosano, por ser un polisacárido de gran

potencial. En este sentido, se han reportado varios estudios orientados a la preparación de

Quitosanos modificados por vía química. El Quitosano es soluble en soluciones acuosas de

algunos ácidos; algunas alquilaciones y n-vacilaciones han sido intentadas sobre la estructura de

este biopolímero. A partir de estas iniciativas, ha sido posible obtener derivados solubles en agua


o de alta absorción, los cuales presentan mayor manejabilidad a nivel de producción y desarrollo de

nuevas formas farmacéuticas (19).

3.2.2.2 Bacterias Ácido Lácticas

Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) son un grupo de microorganismos representada por varios

géneros con características morfológicas, fisiológicas, y metabólicas en común. En general las

BAL son cocos o bacilos Grampositivos, no esporulados, no móviles, anaerobios, microaerofilos

o aerotolerantes, oxidasa y catalasa negativos, y productoras de ácido láctico como el único o

principal producto de la fermentación de los carbohidratos. Estas bacterias están ampliamente

distribuidas en la naturaleza debido a que han sido aisladas a partir de diversos alimentos, tierra,

plantas verdes, así como también del tracto digestivo y vagina de los mamíferos. Por lo general

estos microorganismo son utilizados en la elaboración y conservación de productos lácteos tales

como leche acidificada, yogurt, mantequilla, crema y quesos por otra parte están presentes en el

procesamiento de carnes, bebidas alcohólicas y vegetales (20)

.

Las Bacterias Ácido lácticas son bacterias que fermentan el azúcar productoras de ácido láctico,

estas bacterias tienen efectos inhibitorios poderosos sobre el desarrollo y producción de toxinas

de otras bacterias. Esta actividad antagonista puede resultar de: La competencia de nutrientes

disponibles, producción de ácido láctico y ácido acético y la disminución resultante en el pH.

Tanto las bacterias ácido lácticas como sus metabolitos desempeñan un papel importante en este

fenómeno y presentan la ventaja de que son reconocidos como ingredientes seguros (GRAS,

general y recognized as safe, por sus siglas en inglés) por las entidades regulatorias de alimentos

de Estados Unidos, la Unión Europea y Colombia. Su capacidad de bioconservación se debe a

que producen una amplia gama de sustancias con actividad antimicrobiana, entre las que se

incluyen, las bacteriocinas, estas, son péptidos o pequeñas proteínas que frecuentemente inhiben

varias bacterias indeseables incluyendo los patógenos de alimentos(22)

.


DIAGRAMA 1. FERMENTACIÓN LÁCTICA HOMOFERMENTATIVA.

DIAGRAMA Nº2: FERMENTACIÓN LÁCTICA HETEROFERMENTATIVA.

S. thermophilus es una bacteria ácido láctica perteneciente al grupo termófilo ya que su

temperatura óptima es de 40 a 45°C, crece formando cadenas lineales de células ovoides a pH

9.6 o en caldo con NaCl al 6.5%. La identificación de su especie se basa en la hidrólisis de

arginina y esculina, fermentación de ácido en amigdalina, celobiosa, inulina, maltosa, manitol,

rafinosa y caldos N -acetilglucosamina y su capacidad para crecer a 45°C. Es considerada

Glucosa

Ácido-6-fosfoglucónico

Ribulosa-5-fosfato CO2

Gliceraldehído 3-

fosfato Ácido láctico

Acetil

fosfato

Etanol

Glucosa

Fructosa 1,6-difosfato

Gliceraldehído

3-fosfato

Dihidroxiacetona

-fosfato

Ácido pirúvico Ácido láctico


genéticamente como segura por la Food and Drug Administration o FDA (Administración de

Alimentos y Fármaco, por sus siglas en inglés (34).

S. thermophilus convierte rápidamente la lactosa en ácido láctico, provocando una rápida

disminución en el pH y la producción de metabolitos importantes, por sus propiedades

tecnológicas. Es ampliamente utilizado en la industria de alimentos para la producción de

quesos y yogurt; para la elaboración de queso se utiliza solo o acompañado con Lactobacilus,

mientras que para la producción del yogurt si requiere de estar acompañado con Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus(35),

quien lleva este nombre en honor al país donde fue

descubierto: Bulgaria, hecho que se llevó a cabo en el año 1905 por el médico Estambre

Grigorov. Más tarde en 1983 los estudios realizados por Weiss, Schillinger y Kandler

cambiaron la taxonomía de Lactobacillus bulgaricus convirtiéndose en una subespecie de

Lactobacillus delbrueckii.

L. bulgaricus y S. thermophilus pueden trabajar juntas produciendo mucho más ácido láctico

resultado de su metabolismo ya que mantienen una relación simbiótica armónica y

complementaria; donde, L. bulgaricus produce aminoácidos y péptidos pequeños que estimulan

el crecimiento de S. thermophilus, produciendo éste ácido fórmico muy importante para el

crecimiento de L. bulgaricus (36, 37).

Empleo de bacterias ácido láctico como cultivos starter en los alimentos:

Las bacterias ácido lácticas son empleados como cultivos starter en la industria láctea, cárnica,

de vegetales y cereales, con el objetivo de hacer uso de su metabolismo; no solo porque

transforman el producto alimenticio, sino también porque brindan seguridad frente a

microorganismos patógenos por la producción de compuestos antimicrobianos, haciéndolo más

fiable y beneficioso para la salud del consumidor.

Los cultivos de bacterias ácido lácticas empleados en los productos alimenticios deben cumplir

fundamentalmente cuatro funciones, en proporciones variables:

Disminuir el valor del pH a determinada velocidad dentro de determinados límites.

Acción sustitutoria frente a gérmenes nativos y gérmenes que reinfectan los alimentos por

contaminación microbiana.


Efecto generador de aroma como consecuencia del metabolismo microbiano en el alimento

(sólo en determinadas especies), para obtener determinadas cualidades.

Producción de enzimas para provocar procesos catalíticos y/o hidrolíticos en el sistema de

sustancias.

La finalidad fundamental de emplear bacterias ácido lácticas en los alimentos estriba no solo en

la sustitución de microorganismos no deseables sino también en conseguir las propiedades

codiciadas en los mismo, lográndolo en muchas ocasiones con el empleo de cultivos que son

combinación de varias especies distintas de bacterias ácido lácticas; siendo el único requisito

para ello, que las especies puedan entrar en asociación simbiótica o metabólica y se mantengan

estables en condiciones definidas (38).

Bacterias Ácido lácticas y sus aplicaciones

Las bacterias ácido lácticas son agentes que han marcado en los últimos años un papel muy

importante en la industria cárnica ya que son aceptados y muy utilizados como métodos de

conservación y extensión de la vida útil de los producto cárnicos, al no permitir que

microorganismo patógenos los contaminen. La carne se considera un buen sustrato donde

pueden sobrevivir gracias a que poseen una elevada actividad proteolítica; se considera que las

enzimas intracelulares de Lactobacillus pueden ser responsables de la generación de péptidos

pequeños y aminoácidos que contribuyen al proceso ya sea como potenciadores del sabor o

como precursores directos de otros compuestos de sabor durante la maduración de productos

cárnicos como por ejemplo de los embutidos crudos. La gran dimensión conservante que tienen

las bacterias ácidos lácticos en los alimentos se debe a que son fuertes competidoras por

nutrientes y son productoras de metabolitos antimicrobianos como ácidos orgánicos, peróxido

de hidrógeno, enzimas y bacteriocinas.(40)

Las bacteriocinas actúan creando poros en la membrana de las células dianas por medio de los

cuales pueden ingresar y causar serios daños a nivel de su funcionalidad y con esto la muerte de

la célula; con lo anterior mencionado, las bacterias ácido lácticas no solo consiguen extender la

vida útil de los alimentos cárnicos sino también lograr una protección adicional en condiciones

de altas temperaturas. La disminución del riesgo de transmisión de patógenos por alimentos,

generaría economías que se traducen al hecho de no deteriorarse los alimentos y a la reducción

de la aplicación de productos químicos conservantes, entre otros (39).


Los hongos pertenecientes al género Aspergillus generan deterioro o afecciones en muchos

productos alimenticios. Los productos metabólicos secundarios resultantes de la invasión fúngica

son muy tóxicos para el hombre y animales. Producen la inhibición de la germinación

acompañado con cambios de color, calentamiento, amohosado, apelmazado y podredumbre de

las semillas (44).

3.2.2.3 Aspergillus niger

Aspergillus niger es un hongo que produce un moho negro en vegetales muy común en la

lechuga, el tomate y aguacate. Es una de las especies más corrientes del género Aspergillus. Su

clasificación taxonómica es dominio: Eucaryota, Reino: Fungi, Filo:Ascomycota, Clase:

Eurotiomycetes, Familia: Trichomaceae, Genero: Aspergillus. Su identificación son cabezas

conidiales de tonos negro a negro grisáceo, negro café, negro púrpura o negro carbón, son

globosas, radiadas o divididas formando columnas de cadenas de conidios irregulares o bien

definidas. Los conidióforos son de color hialino a café, típicamente lisos o en pocas especies

ligeramente granulares, de paredes robustas, quebradizas, dividiéndose longitudinalmente al ser

trituradas. Vesículas globosas o casi globosas, hialinas o de color café claro a oscuro.

Esterigmata en una o dos series dependiendo de las especies, con frecuencia profundamente

coloreadas. Los conidios son globosos o subglobosos, elípticos o achatados horizontalmente,

lisos o casi lisos, espinosos, o con estriaciones longitudinales marcadas. Esclerotia globosa o

subglobosa, de coloración crema cuando es joven, tornándose rosada, gris o café.(41)

Los hongos pertenecientes al género Aspergillus generan deterioro o afecciones en muchos

productos alimenticios. Los productos metabólicos secundarios resultantes de la invasión fúngica

son muy tóxicos para el hombre y animales. Producen la inhibición de la germinación

acompañado con cambios de color, calentamiento, amohosado, apelmazado y podredumbre de

las semillas44

.

Dentro del género Aspergillus la especie más relevante en la contaminación del aguacate es A.

niger y se encuentran produciendo metabolitos secundarios los cuales son llamados aflatoxinas

que se producen en los frutos cuando estos están sometidos a humedades relativamente altas y

temperaturas elevadas. 46

La presencia de estas tienen un evidente efecto negativo para la salud

http://es.wikipedia.org/wiki/Hongo

http://es.wikipedia.org/wiki/Lechuga

http://es.wikipedia.org/wiki/Tomate

http://es.wikipedia.org/wiki/Aspergillus


humana y animal, tienen un amplio poder carcinogénico actuando principalmente en el hígado

causando cáncer hepático cuando son consumidas en dosis altas47

., Según las investigaciones

indican que especies de A. niger también contribuyen a la producción de fumonisinas en el maíz

y otros cereales. Las fumonisinas son un tipo de micotoxinas cancerígenas producidas

principalmente por Fusarium spp.

49.

Las especies de A. niger se comporta como un endófito en el aguacate y los cacahuetes, porque

tiene la capacidad de vivir dentro de los tejidos de la planta pero no causando daños. Este

generalmente se considera como un patógeno pos-cosecha causando principalmente pudrición

del maíz, uvas y otros tipos de frutas y granos.

Aspergillus niger se desarrolla mediante la producción ramificación filamentos las cuales son

denominadas hifas. El micelio del hongo segrega ciertas enzimas que descomponen las fuentes

de alimentos complejos. Las pequeñas moléculas resultantes son absorbidas por el micelio para

el crecimiento50

. Los hongos invernan como micelio o como esclerocios. El esclerocio germina

para producir hifas adicionales o producción de conidios, que puede dispersarse fácilmente en el

aire y suelo; estas esporas logran llegar los granos de maíz por insectos o por el viento donde

infectan y germinan en granos de maíz.

El ojo humano no logra observar hifas individuales, pero el conjunto de estas que son los

micelios con conidios (esporas asexuales) por lo general se pueden observar11

. Cuando los

conidios del A. niger son jóvenes o inmaduros aparece un color blancas o amarillas en el grano,

pero cuando las esporas están completamente desarrolladas o maduras se

observa pigmentación51

.En la naturaleza, A niger tiene la capacidad de crecer en diversas fuentes

de nutrientes. Es predominantemente un saprofito, crece en planta muerta y tejido animal en el

suelo, por tal razón, es muy importante en el reciclaje de nutrientes. Aspergillus niger puede ser

patógeno en diversas especies de plantas y animales, incluyendo seres humanos y animales

domésticos. El hongo puede contaminar muchos cereales como son las semillas de maíz, maní,

algodón. Puede verse a menudo esporulación sobre las semillas dañadas a dichos núcleos de

maíz, por lo general, sólo unos pocos granos serán visiblemente infectados52

.


3.2.3 Conservación

La conservación de los alimentos y las frutas tiene como principio fundamental prevenir impedir

la alteración o descomposición de los mismos. Se dice que cuando un alimento se descompone o

se altera, es cuando pierde sus características normales. Dichas características pueden ser olor,

sabor, color, también puede haber una modificación en cuanto a la pérdida de textura del

alimento como en el enmohecimiento avanzado de las frutas y hortalizas, los alimentos pueden

descomponerse por bacterias y hongos. Cualquier método de conservación debe crear

condiciones bajo las cuales el microorganismo no pueda multiplicarse o sobrevivir (22)

.

3.2.4 Maduración

La maduración es el proceso en el cual el fruto llega al momento justo y adecuado para poder ser

consumido. Esta se puede dividir a su vez, en dos fases: la fase de maduración fisiológica y la de

maduración organoléptica. Además otro término empleado en el mercado es la madurez

comercial siendo aquel estado fisiológico que los compradores exigen de la fruta.(53)

Maduración fisiológica. La madurez fisiológica suele iniciarse antes de que termine el

crecimiento celular y finaliza, más o menos, cuando el fruto tiene las semillas en disposición de

producir nuevas plantas. La evolución de la maduración fisiológica sólo se complementa

adecuadamente cuando el fruto se encuentra en la planta.

Maduración organoléptica. La maduración organoléptica hace referencia al proceso por el cual

las frutas adquieren las características sensoriales que las define como comestibles. Por lo tanto,

se trata de un proceso que transforma un tejido fisiológicamente maduro pero no comestible en

otro visual, olfatorio y gustativamente atractivo. La maduración organoléptica se puede

completar tanto en la planta como una vez que la fruta ya se ha recolectado.

Madurez comercial. La madurez comercial hace referencia al momento adecuado de proceder a

la recolección de un producto destinado a un fin concreto, al objeto de que cumpla las exigencias

del mercado. En el grado de madurez comercial óptima, el producto debe tener los índices de

madurez adecuada para el consumidor o ser capaz de alcanzarla (25)

.


3.2.4.1 Bioconservación

Se define como la extensión de la vida útil e incremento de la seguridad sanitaria de los

alimentos mediante la microflora natural o sus metabolitos. Su utilización tanto en carne fresca

como en productos cárnicos cocidos o fermentados – curados, pueden facilitar la elaboración de

productos más saludables, naturales y convenientes, menos industrializados y con un gusto más

suave, tal como demanda los consumidores (21)

.

La bioconservación es uno de los tratamientos de conservación no térmicos que se basa en el uso

de la microbiota natural de los alimentos y/o de sus productos antibacterianos, como ciertos

metabolitos de bajo peso molecular (por ejemplo, ácido láctico) y bacteriocinas de naturaleza

proteica, inhibidores naturales de microorganismos patógenos y alterantes, que aumentan la vida

útil e incrementan la seguridad de los alimentos. El ejemplo más conocido de este tipo de

tecnología son las Bacterias del Ácido láctico (BAL), utilizadas en la elaboración de multitud de

alimentos fermentados y que tienen la propiedad de actuar como conservantes naturales. De

hecho, la tecnología de la fermentación ha sido explotada durante siglos para mejorarla calidad y

prolongar la vida media de muchos alimentos (26)

.

3.2.4.2 Efecto inhibidor

Es la capacidad que tiene un agente biológico de producir ciertas sustancias como bacteriocinas,

aldehídos, peróxidos, ácidos orgánicos que tienen propiedades antimicrobianas que no permiten

el crecimiento y desarrollo de los mismos en ciertos ambientes (27)

.

3.2.5 Enfermedades Fúngicas de Pos cosecha

Los hongos son microorganismos filamentosos comúnmente conocidos como mohos. En la

naturaleza, ellos aparecen frecuentemente como filamentos juntos parecidos a algodón. Muchas

especies fúngicas pueden causar la descomposición de los alimentos y, asemejen por bacterias,

ellas acostumbran a reproducirse muy bien en calor y condiciones de humedad. Los hongos son

generalmente más difíciles de erradicar que las bacterias, las células fúngicas son mucho más

grandes y producen esporas que son altamente resistentes a la sequedad y a otras condiciones


ambientales agresivas o estresantes. Las esporas solas pueden formar cuántas estructuras de

células reproductivas que se dispersan por el agua o viento así como también por animales y

equipos (29


4. DISEÑO METODOLOGICO

4.1 Tipo de investigación

La presente investigación es de tipo experimental debido a que se manipularan las variables

independientes o factores, asimismo es multifactorial debido a que se utilizaran tres diferentes

tipos de tratamiento. Se trabajará en bloques, se garantizará la aleatorización y la utilización de

réplicas, donde se establecerán un conjunto de circunstancias particulares, debido a que se

escogerán aguacates de solo raza antillana, del mismo peso, mismo aspecto y cosechados en la

asociación FELIDERES todo esto será controlado por los investigadores.

Variable independiente y/o factor

En el presente estudio las variables independientes serán: Quitosano al 3% y Bioconservante

108UFC.

Tratamiento y niveles de los factores

Los tratamientos en el estudio con sus respectivos niveles serán:

Formulación A: Bacterias Acido Lácticas 108

UFC.

Formulación B: Quitosano 3%

Formulación C: Quitosano 3% más Bacterias ácido lácticas 108

UFC.

Unidad experimental

Se define como unidad experimental de esta investigación a cada uno de los aguacates que serán

tratados con las diferentes formulaciones (formulación A, formulación B y formulación C).

Replicas

Para determinar el número de réplicas se definió 1 tratamiento y 3 niveles; al implementar el

arreglo factorial se obtiene un factor de 13, por lo tanto el número de réplicas será igual a 3 por

cada bloque. A cada replica se le aplicaran los respectivos tratamientos.


Niveles

Se realizaròn tres (3) bloques experimentales y (6) bloque control: bloque control negativo y

bloque control positivo.

4.2 Delimitación

Delimitación espacial

El Carmen de Bolívar, es un municipio que está ubicado en el departamento de Bolívar, limita al

norte con el Municipio de San Jacinto, al sur con el Municipio de Ovejas, Departamento de

Sucre, por el este con Zambrano y Córdoba, y por el oeste con los municipios sucreños de San

Onofre y Colosó. Tiene una extensión aproximada de 2677 km2 y una temperatura promedio de

27ºC.

Las alturas en el municipio oscilan entre 123 y 989 msnm dentro del sistema montañoso de los

Montes de María o Serranía de San Jacinto. En esta se destacan los cerros; La Cansona (420

msnm), Mabungo, Venado, Camarones, Pelado, Alto del Trueno, El salto, Peralonso, entre otros.

Toda esa región se ha especializado en la siembra de frutales y hortalizas, especialmente el

aguacate (2)

.

Delimitación temporal

Esta investigación se viene realizando desde el mes de Noviembre 2014 y finalmente fue

realizada en el primer semestre del año 2015.

Delimitación poblacional

La asociación APACARBOL está conformada por 120 productores, lo que equivale a 600

hectáreas de fincas productoras de aguacate.

Delimitación muestral

La muestra fue seleccionada aplicando un arreglo factorial, que consiste en hallar el cálculo del

TTONIVELES

obteniendo un producto de 13, que es igual a 1 aguacates escogidos al azar en cada

una de las fincas pertenecientes a la asociación APACARBOL



DIAGRAMA DEL DISEÑO DE EXPERIMENTO


5. FUENTES

5.1 Fuentes Primarias

Los datos de esta investigación se obtendrán de fuentes primarias de estudios, dado que el

análisis, la discusión y la conclusión se conseguirán de la elaboración del experimento.

5.1.2 Fuentes Secundarias

Se utilizaron recursos bibliográficos, libros, revistas, artículos especializados, etc.

5.2 ETAPAS

5.2.1 Control de ambientes y superficie.

Para certificar la calidad higiénico-sanitaria en las superficies y los equipos utilizados en el área

de trabajo fue necesario realizar un estudio microbiológico de ambientes y superficies, manejado

como control interno para el buen desarrollo del experimento, arrojando resultados satisfactorios

que indican procesos óptimos de limpieza, desinfección y esterilidad del área para realizar

análisis microbiológico. Ver anexo 1.

5.2.2 Primera etapa: Recolección de los aguacates:

En primera instancia se realizó un recorrido por cada una de las fincas de la asociación

APACARBOL, donde se hizo el análisis observacional, para recolectar los frutos afectados, Por

consiguiente se tuvo en cuenta las sintomatologías más frecuentes en las enfermedades pos

cosecha, para así facilitar la recolección de los aguacates que coincidan con los síntomas que

genera Aspergillus niger.

5.3 Segunda etapa: Obtención de la cepa nativa Aspergillus niger

Después de haber seleccionado los aguacates afectados, se llevó a cabo el aislamiento

microbiológico, retirando del aguacate tejidos enfermos para adicionarlos en una solución de

Etanol al 70%, sumergimos por 5 minutos, luego se dejaron secar en papel absorbente por 2

minutos y con una pinza estéril se colocaron cada una de las muestras se colocaron en todo el

centro en una caja de Petri con Agar Sabouraud, posteriormente se dejaron a temperatura

ambiente, luego a las 48 horas se realizó la lectura, con el fin de obtener las características


microscópica y macroscópica de Aspergillus niger (Ver Anexo 3). ´Por consiguiente decidimos

realizar diferentes subcultivos con el fin de mantener la cepa pura.

5.3.1 Tercera etapa: Activación pre inoculó Bacterias Acido Lácticas

Antes de iniciar con el diseño experimental, es necesario asegurarse que los equipos y las

superficies utilizadas en este proceso se encuentren debidamente, limpios y en condiciones

higiénicas adecuadas. Por tal motivo realizamos un análisis microbiológico de los ambientes y

superficies de las instalaciones del laboratorio Microbiología de la Universidad San

Buenaventura (Ver anexo 1). Un día antes de realizar el experimento fue necesario realizar la

activación metabólica de las bacterias acido lácticas, de tal manera que tomamos 0.75gr de

almidón de yuca más 250mililitros de agua destilada y finalmente adicionar 0.62gr de las BAL,

los adicionamos en cada uno de los tubos de ensayos, los cuales contenían 10ml de la Solución

de almidón de yuca e incubamos durante 24horas, todo esto se hace con el fin de brindarle a las

BAL el sustrato disponible. (Ver anexo 2).

5.3.2 Cuarta etapa: Suspensión Aspergillus niger y diluciones seriadas.

Esta etapa fue necesaria con el fin de obtener una concentración del hongo, por ende tomamos 12

tubos de ensayos, cada uno marcado con sus respectiva dilución desde 101-

1012

. Se le adiciono a

cada tubo 9ml de Agua destilada y al primer tubo 10ml, luego se tomó una pequeña parte del

cultivo de Aspergillus niger y se introdujo en el primer tubo ensayo, inmediatamente de

homogenizo y se empezaron a extraer de cada tubo 1mil hasta llevarlo a la dilución 1012

, siendo

está la dilución con la que se realizó la siembre en el experimento (Ver Anexo 4).

5.3.3 Quinta etapa: Preparación del Quitosano 3%

Se tomaron 300ml de agua de destilada con un pH 5.0 en un Erlenmeyer y pesamos 3gr de

Quitosano, mezclamos y luego adicionamos 1ml de Ácido acético, dejamos en agitación por

1.000r.m.p (Ver Anexo 5)


5.3.4 Sexta etapa: Aplicación del tratamiento

Luego de a ver tenido las bacterias acido lácticas activadas, suspensión del hongo y a su vez el

Quitosano, procedimos a aplicar cada uno de los diferentes niveles, antes de realizar lo anterior,

se realizó una desinfección y limpieza del área. Previamente todo el material se encontraba

estéril. Tomamos 7 cajas de Agar MRS y Agar Sabouraud Se realizó una siembra masiva de

Aspergillus niger en Agar MRS y Agar Sabouraud de la dilución 101-10

12, de las cuales se

realizó replicas por siete, posteriormente se colocaron dos tirillas de 3 cm en cada caja

impregnado con el pool de BAL del pre inoculó antes preparado, Quitosano y la mezcla de

ambos el cual se difundirá desde las tirillas al Agar, luego se incubo a 35°C +/- 2 por un periodo

de 5 días; realizando la primera revisión al día siguiente para descartar cualquier tipo de

contaminación, la lectura fue realizada al cuarto y quinto día en el cual se observó el número de

UFC/ ml de las cajas que contenían las diluciones, comparándola con las cajas de los controles.


DIAGRAMA DE FLUJO DEL EXPERIMEENTO

Recolección de los

aguacates

Limpieza y

desinfección de los

aguacates

Aislamiento

Microbiológico

Realización de los

subcultivos

La contaminación es severa, que

es necesario realizar un proceso

de limpieza, por el fin de obtener

una cepa pura nativa del

aguacate.

Obtención de

Aspergillus niger

12 diluciones

madres Subcultivos Subcultivos

Activación de las

bacterias acido lácticas

con almidón yuca por

24 horas

Preparación del

Quitosano 3%

Preparación de las bacterias acido lácticas mas

Quitosano

Realización del experimento, impregnar cada uno de

los niveles con las tirillas.

Tiempo de 48 horas

Prueba Azul

Lactofenol

Prueba de Gram


5.4 OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABL

VARIABLE DEFINICIÓN

TEORICA

DEFINICIÓN

OPERACIONAL

TIPOS DE

VARIABLE

ESCALA DE

MEDICION

FUENTE INSTRUMENTO

Bacterias

Ácido lácticas

Microorganismos

benéficos con

características

probioticas.

Efecto antagonista

de las BAL frente

A. niger

Cualitativa

Presencia o

ausencia

Aguacate Encuesta

Aspergillus

niger

Fitopatógeno

Efecto antagonista

de las BAL frente

A. niger

Cualitativa

Presencia o

ausencia

Aguacate Encuesta

Quitosano

Compuesto

antifungico

Efecto antifungico

del Quitosano

frente A. niger

Cualitativa

Presencia o

ausencia

Aguacate Encuesta


6. ANALISIS E INERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Los datos fueron organizados y tabulados a través del programa Microsoft Word 2015, en fotos

necesarias para la construcción de los análisis de los resultados.

NIVELES: Preinoculo de Bacterias Ácido lácticas (Figura 1), Suspensión hongo (Figura 2) y

Quitosano (Figura 3).

Figura 1

Figura 2

Figura 3


CONTROLES: Para la veracidad y confiabilidad de los resultados obtenidos, fue necesario

realizar los diferentes controles para evitar algún tipo de contaminación y a su vez controlar las

variables de estudio.

Control de Bacterias Acido lácticas en medio MRS (Esquema 1) y Sabouraud (Esquema 2) con

su respectivo Gram.

Esquema 1. Esquema 2.

Los anteriores esquemas representan cada uno de los controles que se realizaron en el

experimento, con el fin de confirmar la viabilidad de las Bacterias Ácido lácticas, demostrando

que en ambos medios de cultivo MRS y Sabouraud se obtuvo crecimiento macroscópicamente y

confirmándose con la prueba convencional de Gram, resultando de ambos medios de cultivos la

morfología microscópica a 100x de bacilos y cocos Grampositivos. Esquemas 1 y 2. De esta

forma aseguramos que las bacterias Ácido lácticas se encuentran presentes en el experimento


ensayado. El liófilo con cepas de bacterias ácido lácticas utilizadas en esta investigación fue

suministrado por el centro Agro lechero, las cuales fueron activadas en una solución nutritiva e

incubadas a 37 °C durante 48 horas.

Control de Aspergillus niger sembrado en ambos medios de cultivo MRS y Sabouraud.

Figura 6 Figura 7

Figura 8

Figura 9

Para controlar nuestro objeto de estudio Aspergillus niger , fue necesario sembrarlo en ambos

medios de cultivo MRS (figura 6) y (Sabouraud figura 7), obteniendo como resultado

crecimiento en los dos medios de cultivo; macroscópicamente en el medio Sabouraud las

colonias se muestran granulosas negras y planas (figura 6) de crecimiento relativamente rápido

con 48 horas en el anverso, su reverso tiene una forma gamusa de color amarillento (figura 8),

en MRS las colonias son blancas de micelio aéreo color negro e ilimitadas ( figura 7 ), las


características morfológicas microscópicas a 40 x con azul de lactofenol fueron: conidióforo

aseptado liso y de pared gruesa pigmentado rodeado de conidias color café , vesícula globosa.

Cabezuela radiada, biseriada Es 100% fértil, lo cual pone de manifiesto la presencia del

Aspergillus niger.

Controles Ambientales

El control ambiental para hongos se realizó durante dos tiempos en el experimento debido a que

Aspergillus niger es un hongo ambiental, por lo tanto se pretendió demostrar que el ensayado no

fue resultado de una contaminación cruzada y que su única fuente de obtención fue del aguacate.

Tiempo final del experimento 4 horas

FIGURA 10 FIGURA 10.1 FIGURA 10.2

Representación fotográfica del control ambiental, la figura 10 muestra el resultado de los

primeros 15 minutos del experimento; figura 10.1 muestra el crecimiento luego haber

transcurrido 95 minutos, macroscópicamente sus colonias son similares en color blancas

pulvurulentas y micelio de color verde. A su vez se le realizó la prueba azul de lactofenol,

observamos hifas hialinas de color azul a 40x lo que nos da a entender que no existe relación

macroscópica ni microscópica con el objeto de estudio demostrado en los controles descritos

anteriormente (figuras 6-7-8-9).


Control Ambiental para Bacterias aerobias mesófilas

Figura 11

En el control ambiental para bacterias se obtuvo crecimiento de 3UFC ( figura 11), el medio de

cultivo utilizado fue Plate Count, con el resultado mostrado no se encontró pertinente realizar

tinción gram, el número de colonias fue escasa y en el experimento no se observaron morfologías

macroscópicas similares.


Nivel 1 Bacterias Acido lácticas

Figura 11

Figura 11.1

Figura 11.2 Figura 11.3

Las anteriores figuras muestran claramente los resultados obtenidos en el nivel 1 del

experimento, tenemos una sustancia de bacterias acido lácticas contra el hongo Aspergillus niger.

Y podemos observar un tipo de colonia característica del crecimiento macroscópico de

Aspegillus niger, un hongo de crecimiento relativamente rápido post 48 horas de incubación , en


el anverso (figura 11-11.1) es de color crema o blanco y negro con crecimiento radial. Las

características microscópica usando la técnica azul de lactofenol objetivo 40x fueron:

conidióforo aseptado, vesícula globosa, es biseriado, tiene métula es 100 fértil, conidias de

color oscuras y Marrón sueltas, bordeando el conidióforo de pared gruesa y color marrón

(Figura 11.2). Dentro de cada caja se le observan de 2 a 3 colonias, ubicadas alrededor de las

tirillas impregnadas con las BAL( figuras 11-11.1) , este crecimiento se encuentra tanto en Agar

MRS y Sabouraud ( figuras 11-11.1) sobresaliendo con mayor velocidad de crecimiento el

hongo en su agar ideal, a su vez se observa un crecimiento poco visible de las Bacterias Ácido

lácticas en ambos bloques, Es importante resaltar que cada de uno de los microorganismos se les

atribuyeron todas la condiciones fisicoquímicas por igual, de tal forma que se pueda observar

mejor el comportamiento sinérgico. Por ende observamos el crecimiento del hongo en ambos

medios de cultivo. El consorcio de bacterias acido lácticas impregnada en las tirillas se

encuentran presentes en todas las réplicas realizadas, por ende se le realizó un Gram a este nivel,

resultando la morfología típica de los bacilos y cocos Grampositivos (figura 11.3). En cuanto al

control realizado para las bacterias se logró garantizar el crecimiento del pool de BAL en el agar

MRS, demostrando que es capaz de utilizar los nutrientes del medio de cultivo y se comprobó

la viabilidad y ausencia de contaminación.

Los resultados anteriores se deben en primera instancia por la competencia de nutrientes

presentes en los diferentes medios de cultivo MRS y Agar Sabouraud dentro de sus componentes

cuentan con una fuente de carbono como la glucosa, este carbohidrato permite el crecimiento de

Bacterias Ácido lácticas al igual de Aspergillus niger por lo cual se observa el desarrollo de

ambos microorganismo en los dos medios de cultivos, según (Agudelo N, 2013)54

las Bacterias

Ácido lácticas pueden asimilar fácilmente azúcares como la glucosa, sacarosa y fructosa para la

generación de bacteriocinas, sin embargo, para que estas bacterias generen una mayor

producción de péptidos antimicrobianos necesitan como sustrato ideal la glucosa, a su vez el

medio MRS contiene peptona el cual es una fuente de nitrógeno óptima que favores a la

generación de bacteriocinas junto con los demás compuestos orgánicos obtenidos en la vía

metabólica acido-6-fosfogluconato; son capaces de retardar el crecimiento de microorganismos

fúngicos, por lo que se deduce si las bacterias acido lácticas tiene un medio más propicio y

cuentan con todos los requerimientos necesarios para que estas se desarrollen metabólicamente


sería una opción para que puedan controlar el crecimiento de Aspergillus niger cuando se

encuentre en una mayor concentración .

Según Schillininger Villareal y colaboradores 201055

mencionan que un factor esencial para que

exista competencia es la escasez del sustrato o limitación de un elemento, Lo que nos da a

entender que a pesar que las Bacterias Ácido lácticas no tienen todo los sustratos disponibles en

su totalidad en el Agar Sabouraud, como por ejemplo el acetato de sodio que es requerido para la

actividad antifúngica, ellas son capaces de utilizar otros compuestos como lo es la pluripeptona

para sobrevivir y generar su acción lo que indica un desplazamiento del patógeno, por la

generación de Biomasa, mostrando una inhibición por sustrato limitante, sin embargo lo que

existe es un retardo control del crecimiento de Aspergillus niger más no una inbición completa

del hongo.

(Según Valerio, Favilla, y colaboradores)56

mencionan que los controles biológicos como es el

caso de la Bacterias acido lácticas, generan metabolitos primarios y secundarios a través de vías

homoheterofermentativas, las cuales son capaces de crear una acción anti fúngico de tal manera

que controle el crecimiento de hongos contaminantes y micotoxigenicos. Las BAL producen

metabolitos como son las bacteriocinas las cuales son péptidas con actividad antimicrobiana

segregadas por las bacterias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos competidores.

(Según Wangiwang 2013), encontraron que las BAL tienen compuestos anti fúngicos como el

Reuterin el cual actúa como supresor de la actividad ribonucleasa la cual está implicada en la

biosíntesis o DNA del hongo, lo que nos lleva a comprender el retardo del crecimiento del hongo

en ambos medios de cultivo. También existen estudios realizados por (Valerio, Favilla, 2009)

detectaron compuestos orgánicos PLA(Ácido fenilactico) y 1,4-hidroxiacidofenilactico, acido

fórmico, ácido cítrico, acido P-hidroxibenzoico, ácido benzoico, ácido cafeico, catecol, P-

Cumarico, ácido ferulico, ácido salicílico y ácido vanilico que secreta las BAL para su actividad

anti fúngica, frente a una enzima especifica que tiene el Aspergillus niger denominada Xilanasa,

lo cual no le permite tomar todos los nutrientes disponibles del medio, de tal forma que retarda

su crecimiento, por ende observamos un descenso del crecimiento del hongo en las imágenes.

Otro postulado es el factor tiempo, Según María del C, Cristóbal y colaboradores demuestran que

la velocidad de crecimiento de los hongos está dada por las condiciones fisicoquímicas y la


capacidad del microorganismos para colonizar el sustrato empleados en procesos

agroindustriales, teniendo como resultado el crecimiento de Aspergillus niger a las 40 horas de

incubación en un medio de cultivo ideal, está investigación es pertinente con nuestros resultados,

puesto que los resultados los obtuvimos a las 48 horas, enfocado en el crecimiento de las BAL y

del hongo. Y por último el consorcio bacteriano está sumergido a una sustancia que activa

metabólicamente y energéticamente las BAL, por ende su velocidad de crecimiento es más

rápido, puesto que obtiene la fuente de energía o de carbono disponible.

Nivel 2. Quitosano 3%

Figura 12

Nivel 2 QUITOSANO 3% El anterior bloque representa la suspensión del Quitosano 3% contra

Aspergillus niger Se presentó un crecimiento de más de dos colonias típicas de Aspergillus niger

, color negro y blancas en el anverso como se puede observar en la imagen la cajas están

cubiertas en un porcentaje en un 60, 70 y 80% (figura 13) de crecimiento, existiendo presencia

del mismo en ambos medios de cultivo. (Según Santos, Oliveira 2012) mencionan que el

Quitosano tiene propiedades antimicrobianas, hay una fuerte evidencia de que puede actuar

como un inductor mediante la producción de callosa y compuestos fenólicos en plantas


susceptibles. La extensión de la acción antimicrobiana del Quitosano se ve influenciada por

factores tales como su peso molecular y el grado de acetilación (DA). Sin embargo, es difícil

encontrar una correlación clara entre estas dos características y la actividad antimicrobiana. En

general, como los aumentos de acetilación, la actividad antimicrobiana se ha mejorado, ya que el

Quitosano con un alto DA disuelve en el agua por completo, lo que lleva a una mayor

probabilidad de interacción entre el Quitosano y las paredes de las células de carga negativa de

los microorganismos. Del mismo modo, a medida que aumenta, la actividad de Quitosano frente

a patógenos aumenta, pero por encima de un cierto valor, el efecto se invierte, en la presente

investigación el Quitosano 3% no funcionó, las posibles causas fueron; la utilización de una

concentración muy alta, el peso molecular y el grado de acetilación no fue el ideal.

El anti fúngico ensayado y formulado con Quitosano, evidenció no ser optimo contra el

Aspergillus niger Sin embargo Ma. del Carmen y Delia E. Locaso (2011)Estudiaron el empleo

de los recubrimientos comestibles de Quitosano, puesto que se presentan como una estrategia

potencial para evitar las pérdidas por podredumbres pos cosecha de los arándanos frescos. Por

ende es necesario continuar investigaciones para identificar las concentraciones adecuadas, con

el fin de inhibir completamente a Aspergillus niger, específicamente en el aguacate a pesar que

se halla sido muy poco estudiado. El efecto anti fúngico del Quitosano (polímero de B-1,4-

glucosamina) y derivados ha sido estudiado previamente por (Ghouth.,Reddy y Capdeville 2010)

y en la actualidad se están llevando a cabo investigaciones al respecto. Además, por la capacidad

que tiene el Quitosano de formar films semipermeables y se ha utilizado como recubrimientos en

algunas frutas y hortalizas obteniendo buenos resultados en cuanto a reducción de pérdida de

peso y pardeamiento y mejora de la calidad de las frutas, por esta razón fue pertinente utilizar el

Quitosano en el aguacate, aunque no halla obtenido unos resultados satisfactorio, se logró

observar un desplazamiento notorio del crecimiento de Aspergillus niger.(56)

Otro aspecto relevante es la preparación del Quitosano, puesto que juega un papel importante en

el proceso inhibitorio y biocontrolador de hongos, Quitosán es de interés potencial como base de

películas y recubrimientos comestibles porque tiene propiedades de barrera al oxígeno además de

tener actividad bactericida y fungicida contra algunos patógenos de frutos. Según S. Patricia

Miranda, Malick Bill y colaboradores 2014) describen y realizan una comparación que el


Quitosano combinado tiene mejor eficacia, puesto que es una molécula hidrofilia la cual debe

tratarse con algunos aditivos (Aceite esenciales, aceite de tomillo, goma arabica aloe vera) para

propiciar cierta hidrofobicidad y mejorar sus propiedades mecánicas, además de que en alta

humedad relativa se puede disolver es en ácido acético, en la presente investigación fue una

deficiencia puesto que no se tuvo en cuenta un aditivo adicional en los medios de cultivo, por

ende hubiese sido ideal para el efecto in vitro(56)

.

El estudio de interacciones hongo-bacterias es significativo para el área de investigación

agroindustrial, debido a sus implicaciones relevantes en salud, agricultura y medio ambiente en

función de evaluar el potencial de anti fúngicos de este consorcio bacteriano como

biocontrolador del crecimiento

Nivel 3. Combinación de Bacterias acido lácticas más Quitosano 3%

FIGURA 14 FIGURA 14.1


Figura 14.2

N3 Bacterias acido lácticas más Quitosano 3%: El experimento N°3 es la combinación de

ambos niveles, en las que se observa un crecimiento radial del hongo en un 80% en Agar

Sabouraud (figura 14.1) y en MRS en un 20% de dos a tres colonias(figura 14), en Agar

Sabouraud se puede visualizar el crecimiento de las bacterias acido lácticas en un porcentaje

significativo por el bordeado de color blanco lechoso en la tiralla (figura 14.1) se realizó un

Gram para su confirmación y se observa claramente los coco y bacilos Grampositivos en gran

abundancia (figura 14.2), en este experimento el Quitosano se encuentra en una alta

concentración, sin embargo las bacterias cumplieron con su actividad anti fúngica, estó se debe a

que los factores físicos y químicos en el Agar MRS. se encontraban adecuados y el sustrato

disponible. Por otra parte el Quitosano le proporcionó a la bacteria acido láctica un medio

acidificado por el grado de acetilación que se utilizó en la preparación del Quitosano. Es

relevante mencionar que ambos compuestos tienen efecto inhibitorios frente a hongos patógenos

fitosanitarios, por lo tanto el resultado esperado era obtener un control bastante visible, pero no

se obtuvo lo esperado con el Quitosano, frente a las BAL (bacterias acido lácticas) podemos

observar que existe un desplazamiento del hongo en el Agar MRS. (Según Ayala , colina y col

2014)57

Se han propuesto diferentes mecanismos, por los que el Quitosano puede actuar sobre


los microorganismos e inhibir su crecimiento y desarrollo. Se plantea la permeabilidad de la

membrana citoplasmática, mediante la interacción de sus grupos NH3 + con componentes

fosfolipídicos cargados negativamente en las membranas, con lo que se altera el intercambio con

el medio, además de la formación de quelatos con los metales de transición y la inhibición de

algunas enzimas. El biopolímero puede actuar a nivel molecular, sobre los ácidos nucleicos y

alterar sus funciones, mediante cambios transcripcionales específicos, o inducir alteraciones

estructurales de las células fungosas como la presencia de vesículas en el micelio, células sin

contenido citoplasmático, otras desorganizaciones celulares que abarcan la excesiva ramificación

y ensanchamiento de la pared celular, la pérdida de la misma y hasta la desintegración del

citoplasma.

El mejor comportamiento del efecto antagónico de los anteriores niveles, lo vimos en el Nivel 1

que es el consorcio bacteriano actuando con el hongo, puesto que se observó mejor el control del

patógeno lo que podemos afirmar que si se aumenta la frecuencia del control BAL podemos

controlar o inhibir el crecimiento del patógeno, esto debe al gran potencial anti fúngico que

tienen las Bacterias acido lácticos segregando las bacteriocinas que actúan creando poros en la

membrana de las células dianas por medio de los cuales pueden ingresar y causar serios daños a

nivel de su funcionalidad y con esto la muerte de la célula; con lo anterior mencionado, las

bacterias ácido lácticas no solo consiguen extender la vida útil de los alimentos cárnicos sino

también lograr una protección adicional en condiciones de altas temperaturas. La disminución

del riesgo de transmisión de patógenos por alimentos, generaría economías que se traducen al

hecho de no deteriorarse los alimentos y a la reducción de la aplicación de productos químicos

conservantes, entre otros (39)

El modo de acción propuesto para las bacteriocinas es una unión

inicial a la membrana bacteriana por atracción electrostática entre los lípidos cargados

negativamente y las bacteriocinas con su carga neta positiva localizada fundamentalmente en uno

de sus extremos, este proceso produciría la inserción de las bacteriocinas en la bicapa lipídica, la

acción depender de la bacteriocina seleccionada producida por la BAL para el control del

microorganismo que se desee desplazar. De este modo se forman poros en la membrana

bacteriana la cual queda permeabilizada, y la célula empieza a perder iones y metabolitos

fundamentales para su supervivencia y eventualmente se produce la muerte bacteriana69

.

Finalmente se pueden derivar otras investigaciones.


7. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en la presente investigación, revelan lo siguiente:

Las Bacterias Ácido lácticas solo es útil en el caso de que el Fitopatógeno este iniciando

su crecimiento. Pues la técnica in vitro nos revelo que el pool de BAL (Bacterias Ácido

lácticas) puede controlar el hongo a bajas concentraciones es decir cuando el aguacate

muestre indicios del crecimiento de un hongo contaminante.

Aspergillus niger es un hongo alterante de alimentos y puede desarrollarse en el

aguacate, el cual es un fruto de consumo masivo en el mundo; debido a que es una fuente

rica en lípidos y vitaminas lo cual lo hace susceptible al ataque y crecimiento de hongos,

entre ellos especies de hongos micotoxigenicos.

Las BAL (Bacterias Ácido lácticas) a determinadas fases de crecimiento (exponencial)

producen metabolitos como son las bacteriocinas las cuales son péptidos con actividad

antimicrobiana segregadas por las bacterias para inhibir el crecimiento de otros

microorganismos competidores. En la actualidad las bacteriocinas producidas por las

BAL (bacterias acido lácticas) son las que encierran un mayor interés ya que son

consideradas como microorganismos seguros para la salud, tanto ellas como sus

metabolitos han sido consumidos en alimentos fermentados por innumerables

generaciones sin que hubiera efectos adversos en la población.

El Quitosano a pesar de considerarse un antifungico, en este estudio la concentración

utilizado no logro inhibir el crecimiento de Aspergillus niger aislado de aguacates

enfermos.


8. INVESTIGACIONES DERIVADAS

A partir del estudio realizado se podrían plantear las siguientes investigaciones:

1. Estandarización de las concentraciones de bioconservante láctico por gramo de aguacate

para asegurar un grado suficiente de poder inhibitorio frente a microorganismos

alterantes y patógenos.

2. Evaluación de concentraciones eficaces del Quitosano para su óptimo funcionamiento en

conjunto con un consorcio de bacterias acido lácticas como anti fúngico.

3. Análisis de la forma ideal para el uso del Quitosano como compuesto anti fúngico contra

hongos filamentoso Fito patogénicos.

4. Cuantificación de las concentraciones de compuestos anti fúngicos producidos por

bacterias acido lácticas en aguacates.

5. Comparación del crecimiento entre hongos clínicos y agroindustriales para

implementación de técnicas en investigaciones de tipo experimental.

6. Aplicación del bioconservante láctico con Quitosano a repeticiones diarias en aguacates

afectadas.

7. Obtención de Quitosano a partir de Aspergillus niger.


9. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

DISTRIBUCIÓN TEMPORAL 2014

MESES ENERO FEBRERO MARZO ABRIL MAYO JUNIO JULIO AGOSTO SEPTIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE DICIEMBRE

SEMANAS

ACTIVIDADES 1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

REVISION

BIBLIOGRAFICA

ELABORACIÓN DEL

PROYECTO

COMPRA DE REACTIVOS

ACONDICIONAMIENTO DE

LABORATORIO (análisis de

ambientes y superficie) Y

MATERIAL DE VIDRIO

PREPARACION MEDIOS

DE CULTIVO

MONTAJE DEL

EXPERIMENTO

INTERPRETACION DE LOS

RESULTADOS

ORGANIZACION DEL

INFORME FINAL

CORRELACION DEL

INFORME FINAL


DISTRIBUCIÓN TEMPORAL 2015

MESES ENERO FEBRERO MARZO ABRIL MAYO JUNIO JULIO AGOSTO SEPTIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE DICIEMBRE

SEMANAS

ACTIVIDADES 1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

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1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

REVISION

BIBLIOGRAFICA

ELABORACIÓN DEL

PROYECTO

COMPRA DE REACTIVOS

ACONDICIONAMIENTO DE

LAB (análisis de ambientes y

superficie) Y MATERIAL DE

VIDRIO

PREPARACION MEDIOS

DE CULTIVO

MONTAJE DEL

EXPERIMENTO

INTERPRETACION DE LOS

RESULTADOS

ORGANIZACION DEL

INFORME FINAL

CORRELACION DEL

INFORME FINAL


10. ADMINISTRACIÓN DEL PROYECTO

RUBROS

FUENTE A FUENTES B

FUENTES Y RECURSOS

RUBROS

RECURSOS PROPIOS

DE LA UNIVERSIDAD

V. UNITARIO V. TOTAL (USB).

EQ

UIP

OS

Autoclave

RE

AC

TIV

OS

, M

ED

IOS

DE

CU

LT

IVO

Y M

AT

ER

IAL

ES

Papel kraff 42250 42250

Microscopio Cajas de Petri 10 bolsas x 20 11020 110200

Incubadora Tubos de ensayos x 130 1800 234000

Cabina de bioseguridad Nevera de Icopor 5000 5000

Baño serológico Quitosano 603200

Balanza Desinfectante purse 25000 25000

Espectrofotómetro Esponjas x 4 1000 4000

Purificador de agua Agar MRS 163560 163560

Mechero Agar sabouraud x 500 gr 274920 274920

Mortero Papel aluminio x 1 3500

Nevera Parafilm Brand 100 mm x 10 mtr 45000 45000

Agitador vórtex Bisturí 600 600

Neftalina Cajas de fosforo 3500 3500

Agitador magnético

1..230.000


MA

TE

RIA

LE

S

Análisis de ambientes y

Pipetas PRUEBAS DE superficies 189000 189000

Gradillas LABORATORIO Análisis microbiológico

Cajas de petri Y de la carne de cerdo 106000 106000

Tijeras MATERIALES Gorros 10000 10000

Propipeteador PERSONALES Guantes x 3 11000 33000

Micropipeta de 100-1000 ul Tapabocas x 2 6000 12000

Puntas azules

PE

RS

ON

AL

HU

MA

NO

Jefe de laboratorio Aguacates

Auxiliares de laboratorio COMPRA DE LA 61000 61000

Bacteriólogos MATERIA PRIMA

Asesor


PL

AN

TA

FIS

ICA

PA

PE

LE

RIA

CDS x 2 15000 30000

Copias x 100 100 10000

Impresiones x 100 200 20000

Cinta para enmascarar x 1 4000 4000

Laboratorio de control de

calidad de alimento centro

de atención a la

comunidad. Tinta x 4 13000 52000

Impresiones a color x 20 1500 30000

Marcadores x 3 500 1500

Resma de papel x 3 10000 30000

Carpeta norma x 4 500 2000

TR

AN

SP

OR

TE

Local

400000 400000

V

AR

IOS

Llamadas 120000 120000

Refrigerio 300000 300000

Imprevisto 520000

GRAN TOTAL

3795230


11. REFERENCIAS

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ANEXOS

Anexo 1. AGUACATE ENFERMO.


Anexo 2. MEDIOS DE CULTIVOS UTILIZADOS


MRS AGAR marca Merck Preparación de medio

ANEXO 3 AISLAMIENTO DE Aspergillus niger Y SUBCULTIVOS



ANEXO 3 BACTERIAS ACIDO LACTICAS

Liofilo de BAL

Activación de preinoculo


ANEXO 4 DILUCIONES SERIADAS DE Aspergillus niger

ANEXO 5 APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO – DILUCION DE QUITOSANO

DILUCIÓN DEL QUITOSANO AL 3 %


APLICACIÓN DEL TRATAMIENTO

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