CAPACITACIÓN Y REACCIÓN ACROSOMICALa capacitación y reacción acrosomal del espermatozoide son eventos que se desarrollan en el aparato reproductor de la hembra y son indispensables para vertebrados de fecundación interna. Estos eventos requieren inicialmente la eliminación de los factores descapacitantes presentes en el semen, así como Una serie de cambios en el espermatozoide tanto lipıdicos como proteicos de su membrana celular, la activación de canales iónicos, la síntesis de AMPc (adenosın monofosfato cıclico), la fosforilacion-desfosforilacion proteica, la activación de enzimas, la reacción acrosomal con exocitosis y fusión de membranas, la vesiculacion y finalmente un aumento considerable de su movilidad. En este trabajo se hace una breve revisión de los mecanismos de transducción de señales activadoras de estos eventos.

La capacitación es un proceso del espermatozoide que comprende una serie de cambios previos a la fecundación, se desarrolla en el aparato reproductor femenino en vertebrados de fecundación interna, y requiere de la comunicación entre el espermatozoide y los ambientes que recorre en su tránsito hacia el sitio de fertilización. Cuando se une al ovocito, se induce otro proceso denominado reacción acrosomal (exocitosis), así como la hıpermovilidad, que es un movimiento especial del flagelo, el cual facilita su desplazamiento, la penetración de las cubiertas del ovocito y finalmente la unión con ´este. Hay que aclarar que el proceso de capacitación puede también ser inducido in vitro, para lo que una mejor comprensión de este fenómeno es mencionar que estructuralmente el espermatozoide se divide en:

Cabeza. -Es el núcleo, con ADN super enrollado, gracias a las proteınas denominadas protaminas

Que sustituyen a las histonas en otros tipos celulares, con una envoltura nuclear (EN) de la cual se

Han removido durante la espermiogenesis el complejo de poro nuclear (CPN), con excepcion de algunas especies que las presentan. El citoesqueleto participa en el soporte de la membrana plasmática y de la membrana acrosomal y algunos de sus elementos son termosensibles. El principal elemento del citoesqueleto de la cabeza del espermatozoide es la teca peri nuclear (TP), que es una capsula rígida que cubre el núcleo del espermatozoide de mamíferos y tiene como función la unión de las membranas espermáticas y la preservación de su integridad. La TP esta subdividida en dos regiones: las capas subacrosomal (sirve para anclarlo a las vesıculas derivadas del aparato de Golgi) y postacrosomal. La capa postacrosomal se considera que participa en la activación del ovocito durante la fertilización y es el sitio para la actina en los espermatozoides de algunos mamıferos. En la región apical de la capa subacrosomal del espermatozoide de toro, carnero y caballo, se ha detectado una subestructura llamada subestructura de la teca perinuclear (STP); el segmento ecuatorial, que es un complejo súper doblado de TP; la membrana acrosomal interna (MAI) y -membrana acrosomal externa (MAE) que transportan moléculas receptoras involucradas en la unión esperma-ovocito; la vaina post acrosomal (VPA), la cual se cree que tiene un complejo de señales de proteínas (CPS) o factores activadores del ovocito.

Flagelo.- Es la parte encargada del movimiento, se divide en cuatro regiones; la pieza de conexión, que une a la cabeza con el flagelo, la pieza media, que es también llamada cuello y donde se encuentran las mitocondrias en un arreglo helicoidal, la pieza principal que abarca la mayor parte del flagelo utilizado en la propulsión, y la vaina fibrosa o parte terminal de la cola (Fig. 1). Cada región tiene funciones especıficas en el movimiento, reconocimiento del ovocito y la fecundación (Sutovski y Manandhar 2007).

Cambios durante la capacitación

En el espermatozoide de cobayo, la F-actina está involucrada en la estabilización de la STP. La localización de la actina en la región acrosomal de algunas especies de mamíferos respalda su posible participación en la capacitación espermática y en la reacción acrosomal (RA); así, la polimerización y despolimerización de la actina pueden estar involucradas en la función espermática. En el espermatozoide del cerdo, caballo, toro, ratón y carnero, la polimerización de la actina ocurre durante la capacitación y el desdoblamiento de la F-actina debe ocurrir para que se lleve a cabo la RA. En el espermatozoide de verraco, la inhibición de la polimerización de la actina bloquea su capacidad para fertilizar in vitro.

A pesar de que al momento aún falta mucho por conocer acerca de los mecanismos que inducen la capacitación, se sabe que hay modificaciones lipoproteínas membrana les que:

a) permiten la exteriorización de receptores

b) activan canales iónicos que intervienen en la activación de mecanismos de transducción (flujo de calcio, síntesis de AMPc, fosforilacion-desfosforilacion de proteínas, etc.)

c) cambian el metabolismo energético que conducen a la desestabilización de la membrana plasmática a nivel de la región acrosomica y la hıper activación del movimiento flagelar. Estos cambios permiten al espermatozoide responder a inductores específicos y experimentar la reacción acrosomal al fin de la capacitación

Pérdida de los factores discapacitantes

Los factores discapacitantes son moléculas que se originan en las secreciones testiculares, epididimarias y seminales y que funcionan protegiendo a los espermatozoides durante su periodo de almacenamiento en la región caudal del epidídimo, estabilizando el acrosomal o inhibiendo la unión con la zona pelucida (ZP) del ovocito, por lo que es importante su remoción antes de la fecundación, pues se ha sugerido que estos factores actúan bloqueando a los receptores o grupos electrostáticos localizados en la membrana. Cabe señalar que la cara externa de la membrana plasmática es rica en carbohidratos cargados eléctricamente (glicocaliz), en esta cara se encuentran los carbohidratos absorbidos o polisacáridos unidos a la membrana por uniones superficiales no covalentes. Ası los factores discapacitantes, son susceptibles de enmascarar los sitios de la unión de receptores iónicos o de activación celular.

Cambios membranales

Bioquımicamente la membrana del espermatozoide está constituida por una bıcapa lipıdica y proteınas unidas por interacciones no covalentes, los lıpidos están dispuestos en forma de una doble capa continua de 4 a 5 nm de grosor. Las proteínas que están incluidas en la bicapa lipıdica realizan diversas funciones, como son: el transporte de las moléculas específicas hacia el interior y exterior de la célula; mismas que actúan como enzimas o catalizadores de las diversas reacciones y funcionan como receptores en la transducción de señales. Además de lıpidos y proteınas, la membrana también contiene carbohidratos, que en la mayoría de los casos son cadenas de azucares simples o polisacáridos. Los lıpidos componen entre el 30 y el 50% de la membrana y de algún modo se encuentran anclados a su posición. Aspecto que resulta importante para la fertilización pues la fusión de los gametos masculino y femenino, requiere la participación particular de un microambiente de lıpidos. Se ha determinado que en la superficie de la membrana del espermatozoide existe un alto nivel de fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, difofatidilglicerol, esterol y lípidos neutros, representando el 70-80%, así como un alto nivel de ácidos grasos y algunos glucolıpidos, que al parecer tienen una función importante, aunque no son tan abundantes como los fosfolıpidos o esteroles, sumamente importantes para el espermatozoide, pues además se ha observado que el cambio en la composición de lıpidos de la membrana plasmática es una de las principales características de la maduración espermática, demostrándose, que el total de lıpidos en ´esta célula disminuye con el paso a lo largo del conducto epididimario, considerando que la

fosfatidilcolina se encuentra estable en las tres principales regiones del epidıdimo (cabeza, cuerpo y cola) y las cantidades de fosfatidiletalonamina,

Fosfatidilserina y fosfatidilinositol declinan significativamente hasta llegar a la región

Caudal. Asimismo, la distribución de las proteınas en la membrana también cambia marcadamente entre la cola, pieza media y el acrosoma, y cuando se compara las proteınas de la membrana espermática con las de otros tipos celulares, los espermatozoides, probablemente exhiben el más alto grado de polaridad, reportándose entre las proteınas especıficas de la membrana espermática: _-1,4 galactosiltransferasa, fucosiltransferasa-d-manosidasa, sp56, p95, entre otras. De acuerdo al modelo de mosaico fluido, las proteínas o glicoproteınas están asociadas a la bicapalipıdica mediante uniones no covalentes; otras que están localizadas en la superficie de la membrana se asocian con interacciones electrostáticas.

Las membranas son un ensamble dinámico de proteínas y lıpidos capaces de responder a señales específicas que modifican las funciones celulares. Todas las membranas biológicas poseen moléculas superficiales que actúan como receptores para diversos compuestos exógenos como enzimas, hormonas, proteınas, etc. (Rosado, 1988). En el caso de los espermatozoides se han identificado receptores membranales a moléculas como AMPc, esteroides, glucosaminoglicanos, cuya actividad se modifica durante la capacitación (Gadella et. al, 2008).

Los cambios en la topografıa membranal dentro o fuera de las regiones especıficas, pueden considerarse como adaptaciones fisiológicas a las modificaciones ambientales (Flesch y Gadella, 2000). La redistribución o los cambios estructurales en la topologıa superficial de las moléculas membranales ocurren, a través de varios mecanismos:

a) el enmascaramiento o desenmascaramiento de moléculas superficiales, tanto por adsorción de moléculas y arreglo de proteınas intrınsecas,

b) la insercion local de las moleculas por adsorción del medio y/o supresión de las mismas,c) la migración de moleculas por la fijación de ligandos (Gadella, 2008). Las proteınas intrınsecas y

no adsorbidas pueden ser modificadas por su extremo glicosilado, enmascarado o exteriorizándose, o desplazarse lateralmente como se ha observado con anticuerpos monoclonales o lectinas, las cuales denotan que la reactividad depende del grado de capacitación. En el epidıdimo, el espermatozoide presenta cambios en los dominios de los esteroles de membrana (complejos de esterol-caveolina), confiriéndoles una distribución heterogénea (Gadella, 2008). Estos dominios sirven como una “barra transportadora” para acoplar proteınas que inducirán diferentes rutas de señalización).

d) Como se habıa mencionado la cabeza presenta dos subdominios:e) Acrosomal, presenta “balsas” lipıdicas de composición ordenada de colesterol y esfingolıpidos,

anclados a caveolinas, inmersas en una membrana de composición “desordenada”, b) Subacrosomal, rica en fosfolıpidos. Las “balsas lipıdicas” son importantes en la compartamentalizacion hecha durante la espermatogenesis para la señalización en regiones especıficas de la célula.

La capacitación in vitro cambia el patrón de fijación de estas moléculas a partir de caveolinas, proteínas especializadas en la regionalización de ´estas en sitios adecuados para un rearreglo de la capa superficial de las glicoproteínas, dejando libre la región acrosomal; este reacomodo parece deberse al intercambio de glicoproteínas provenientes de las secreciones propias del aparato genital femenino y la membrana espermática. Se ha demostrado que los cambios le generan la capacidad fertilizante a los espermatozoides, son iniciados por la fosforilacion dependiente de AMPc y simultáneamente por los cambios de los lıpidos membranales (Gadella, 2008). Un ejemplo claro de los cambios superficiales se ve con los grupos sulfhidrilo y amino. Si se bloquean estos sitios se interfiere con la reacción acrosomal. La composición de los fosfolıpidos y su relación molar con el colesterol que regulan la fluidez y la permeabilidad iónica en las membranas cambia durante la capacitación, este fenómeno está asociado a proteínas captadoras de esteroles en el medio (Topfer-Petersen y col., 2008). Hiperactivación son los cambios en la movilidad espermática, caracterizado en:

a) aumento en el movimiento y flexión del flagelo.b) gran amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza c) trayectoria curva y tortuosa.

Genera la fuerza requerida para la penetración de la capa de células de la granulosa y la insercion inicial del espermatozoide con el ovocito (Tulsiani, 2006). Para inducirla se requiere Ca++ extracelular, elevación intracelular de AMPc y disminución del pH intracelular. La hiperactivacion del flagelo se debe al Ca++ que se une a proteınas fijadoras en el brazo externo de la dineına (en la parte interna del flagelo) induciendo el movimiento asimétrico (Inaba, 2003). Este Ca++ proviene de varias fuentes:

a) Reservas intracelulares mediada por los receptores de inositol 1,4,5 trifosfato (IP3),b) Mitocondriac) ingresa por sistemas de transporte Na+/H+ y Na+/Ca++ (Gadella et. al, 2008).

Transporte de iones

Los espermatozoides mantienen gradientes iónicos precisos a través de su membrana plasmática, mismos que son regulados por ATPasas dependientes de NA+/K+ y Ca++, así, la alteración en la concentración iónica activa adenilato ciclasas, enzimas de origen acrosomal y enzimas relacionadas con los cambios en la movilidad (Gadella, 2008). Se ha reportado que una ATPasa dependiente de Ca++ en la membrana acrosomal externa, estimula la reacción acrosomal, y cuando esta ´ultima es inducida, se genera la desaparición del potencial de membrana. Se ha visto también que, la exocitosis es inhibida por una alta concentración de Ca++ y un aumento en la captación de Ca++ y Na+, ası como la liberación de H+/K+. En mamıferos, se ha demostrado in vitro que un aumento en la relación K+/Na+ en el medio, aumenta la tasa de fecundación; aunque en otras especies el K+ extracelular inhibe la capacitación, posiblemente porque la ATPasa funciona permitiendo el intercambio Na+/K+ y manteniendo una baja concentración intracelular de Na+.

La zona pelucida (ZP) se une al menos con dos diferentes receptores en la membrana plasmática del espermatozoide. Uno es el G1 o tirocin cinasa, que activa la fosfolipasa C_1; el otro es un receptor tirocin cinasa acoplado a fosfolipasa C. La unión con el receptor podrá regular la adenilato ciclasa provocando el aumento del AMPc y la activación de la proteın cinasa, misma, que activa los canales de Ca++ dependientes de voltaje en la cara externa de la membrana acrosomal, la cual libera Ca++ desde el citosol del acrosoma. Este es el primer aumento de Ca++, el cual promueve la activación de la fosfolipasa C. Los productos de la hidrolisis del fosfatidil inositol bifosfato por la fosfolipasa C, diacilglicerol e inositol-trifosfato, promueven la traslocacion de la proteın cinasas y su activación. La proteın cinasa abre un canal de Ca++ dependiente de voltaje en la membrana plasmática, provocando un segundo aumento de Ca++. El G1 puede también activar la fosfolipasa A2 para generar ´acido araquidonico a partir de fosfolıpidos de membrana. El ´acido araquidonico sera convertido a prostaglandina y leucocitotrienos por las enzimas, ciclooxigenasas y lipooxigenasas, respectivamente. El aumento de Ca++ y el pH, sumado con lo anterior, provocan la fusión membranal y la exocitosis acrosomal.

Actividad enzimática

El inicio y mantenimiento de la movilidad espermática, están asociados con la activación de sistemas

Enzimáticos, hay evidencias de que la actividad de la adenilato ciclasa aumenta durante la capacitación, la cual eleva la concentración intracelular de AMPc. Estos cambios favorecen la movilidad vigorosa y estimulan la actividad de las cinasas dependientes de este nucleótido. La fosforilacion de proteínas es inducida por AMPc e induce cambios fisiológicos de la membrana, a través de modificar las estructuras de las proteınas presentes en ella. La actividad de la fosfolipasa A esta asociada con los eventos de fusión caracterısticos de la reacción acrosomal. La acción de esta enzima sobre los fosfolıpidos de la membrana provoca la acumulación de lisofosfolıpidos, que son compuestos capaces de producir fusión y lisis membranal (Flesch y Gadella, 2000). La reacción acrosomal es especie especıfica, e implica la existencia de moleculas para el reconocimiento entre los gametos masculino y femenino y generar la repuesta fisiológica adecuada. Se sabe de la presencia en el fluido oviductal de factores para señalización extracelular y para el reconocimiento del ovocito. La reacción acrosomal puede ocurrir espontáneamente, y es posible inducirla in vitro. Es indispensable para la fecundación y se genera como resultado de la acción de inductores adecuados (Rosado, 1988). Morfológicamente, el acrosoma es parecido a un capuchón con una gran cantidad de enzimas hidrolitıcas, se deriva del aparato de Golgi durante la espermiogenesis y por su origen, estructura y función celular, es comparable a un lisosoma (Gadella y col., 2008). Pero a diferencia de ´este, presenta exocitosis regulada por el metabolismo de fosfoinosıtidos, interacción de nucleótidos endógenos y exógenos, Ca++, calmodulina, microtubulos y microfilamentos.

Hay fusión de membrana plasmática y acrosomal externa en varios sitios, formando vesıculas que se desprenden, quedando la membrana acrosomal interna ahora como nueva membrana de superficie. Las vesıculas liberan su contenido a medida que el espermatozoide penetra a través de la ZP. A partir del modelo de reacción acrosomal han sido numerosos los grupos de investigación que han trabajado en

este aspecto, sin embargo, no se conoce en la actualidad de manera precisa, la cascada de eventos que ocurren antes de la fusión de la membrana. Hay evidencias que señalan que la reacción acrosomal in vivo comienza con la estimulación de un agonista natural como es la progesterona o la ZP. Este estımulo provoca una entrada de Ca++ al espermatozoide. Por otro lado, se sabe que es posible inducir la reacción acrosomal con el ionoforo A23187, el cual provoca la entrada de Ca++. Se ha propuesto un modelo en el que intervienen ATPasas de membranas cuya función es mantener bajos niveles de Na+ y Ca++ y altos niveles de K+.

La entrada de Ca++ provoca la desactivación de las ATPasas, además de un aumento del Na+ intracelular con una salida de H+ y en consecuencia, un aumento del pH intraacrosomal, lo que induce la activación de enzimas como la acrosina. Además, se ha observado como el aumento de Ca++ intracelular, también conduce a una serie de modificaciones en los lípidos como la formación de segundos mensajeros, que se incorporan a una cascada de acontecimientos que ocurre durante la reacción acrosomica y la activación de determinadas enzimas como una fosfolipasa A2, especifica de la fosfatidilcolina, que genera lisofosfatidilcolina y ´acido araquidonico, sustancias conocidas por sus propiedades de fusión necesarias en la reacción acrosomal.

La inducción de la reacción acrosomal se ha caracterizado al microscopio electrónico en 5 etapas, (Gadella et. al, 2008):

1) Acrosoma, membrana acrosomal y plasmática intactas, matriz acrosomal homogénea y compacta.

2) Hinchamiento de la matriz acrosomal, membranas intactas.3) Invaginación de la membrana acrosomal externa, con la presencia de muchas vesıculas dentro

del capuchón acrosomal por la fusión de membranas.4) Fusión de membrana plasmática y acrosomal; pérdida de casi toda la matriz acrosomal.5) Perdida de las membranas plasmática, acrosomal, y de toda matriz acrosomal.

Bioquımicamente la reacción acrosomal se caracteriza por la activación de las enzimas acrosomales y la secreción de algunas de ellas, antes de la formación de vesıculas. El calcio desempeña un papel fundamental en todos los mecanismos de exocitosis, principalmente el Ca++ extracelular. In vitro, en medios libres de Ca++ no hay reacción acrosomal, aun adicionando al medio agentes inductores (Gadella y Harrison, 2000). Otra característica es la necesidad de glucosa en el medio de incubación para que el proceso se lleve a cabo normalmente, aunque esta propiedad parece ser dependiente de la especie, puesto que en algunas es posible inducirla sin su presencia (Topfer-Petersen y col., 2008). La mayorıa de los estudios realizados al respecto han sido in vitro y es difıcil extrapolar estos resultados a las condiciones fisiológicas in vivo. Hay consenso de que la ZP es inductora y que los ionoforos de Ca++ imitan su efecto (Gadella y Harrison, 2000). El reconocimiento específico de los gametos, la fijación del espermatozoide con su acrosoma intacto, la inducción de la reacción acrosomal y del bloqueo para la polis permia están relacionados con la ZP, así que su estructura glucoproteica, hace que el mecanismo de interacción sea por un sistema de reconocimiento antıgenoanticuerpo (Gadella y col., 2008). La fracción conocida como ZP3, es la proteına involucrada en la fijación y reacción acrosomal, ocurrida ´esta, el espermatozoide puede entonces penetrar (Gadella y Harrison 2000) e interaccionar con la ZP2,

la cual mantiene firme esta interacción. Bajo condiciones in vitro varias hormonas, neurotransmisores e intermediarios del metabolismo de lípidos funcionan como inductores, la mayoría de ellos están presentes en el líquido folicular y son las catecolaminas, prostaglandinas, esteroides, serotonina y ácidos grasos (Flesch y Gadella 2000). La progesterona es inductora a través de un mecanismo de receptores especıficos presentes en la membrana plasmática de la región acrosomal, causando un transporte de Ca++ hacia el interior y en consecuencia elevando considerablemente su concentración. Transducción de señales en capacitación y reacción acrosomal. En este proceso interviene la proteına G (PG, es una familia de proteınas, caracterizada por ser un complejo de proteína-GDP (Guanosın difosfato) con actividad de GTPasa), GDP, GTP y AMPc. Los sistemas transductores de señales están diseñados para responder a cambios en el estado de equilibrio de la proteına G, GDP, GTP. En condiciones basales la actividad de GTPasa supera la velocidad de intercambio GDP/GTP inactivando a la proteına G (PG). La estimulación depende del intercambio de GDP por GTP en la PG activada y de la velocidad de hidrolisis de la GTP. La constante intrínseca de hidrolisis es de 0.5 a 5 min y los efectores la aceleran de 10 a 50 veces. La proteına G se formada por las subunidades alfa, beta y gama, durante el cicloade GTPasa. La subunidad alfa pasa por tres conformaciones:

Complejo heterometrico inactivo, alfa-GDP-betagama, hay gran afinidad por beta y gama. Transición alfa-V, la estimulación por unión al ligando disminuye la afinidad al complejo

heteromerico, formandose otro estabilizador de la unión y Activa, se forma el complejo alfa-GTP, separación del receptor activado, beta y gama, la

hidrolisis del GTP cierra el ciclo, inactivándose alfa. Se ha estudiado el papel de las proteınas G en ratón, toro y humano, su inactivación no interfiere con la fijaciaon del espermatozoide a la ZP, pero inhibe casi por completo la reacción acrosomal (Almog y Noar 2008, Rosado 1988). Algunas de sus funciones son:

Activación o inhibición de la adenilato ciclasa, estimulación de la fosfodiesterasa retiniana y de la hidrolisis de fosfoinosıtidos y finalmente la regulación de canales iónicos. En resumen, la secuencia de activación para la capacitación y reacción acrosomal es como se describe a continuación: el complejo heterometrico es incapaz de activar la adenilato ciclasa, al unirse el ligando hormona-receptor libera el GDP, sustituido por GTP formándose el intermediario activo. La subunidad alfa fija el GTP, separándose de beta y gama, activando la adenilato ciclasa, la cual genera AMPc, este a su vez, activa las protein cinasas. La PG es GTPasa de acción lenta, el GTP pegado a alfa provoca la extinción progresiva de la señal transmitida por el ligando. La estimulación depende del intercambio de GDP por GTP en la proteına G activada y de la velocidad de hidrolisis del GTP. La transducción funciona como un circuito de amplificación de la señal desde que el ligando se une al receptor. La señal se amplıa conforme se activan más proteínas G, generando a su vez más AMPc. Finalmente cada proteın cinasa activada, fosforila más proteínas, lo cual es el paso final del mecanismo de activación. Muchos de los efectos del AMPc en células eucariontes son a través de la activación de protein cinasas de dos subunidades, una reguladora unida al AMPc y otra catalítica. En ausencia de AMPc el complejo es inactivo, al unirse ´este se separa el complejo y se activa la actividad enzimática (Almog y Naor, 2008).

Bibligrafia

http://www.izt.uam.mx/contactos/n78ne/fisiologica.pdf

Almog T, Naor Z. Mitogen actived protein kinases (MAPKs) as regulators of spermatogenesis and spermatozoa fuctions. Mol & Cell Endo 282: 39. 2008.