Capitulo 3 Microorganismos de Interes Industrial

Universidad de los Lago Departamento

Ciencias y Tecnologa Alimentos

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

CAPITULO 3: MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

Profesor:

Hctor Mancilla Chvez

Osorno- 2007

Capitulo 3 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

CAPITULO 3 MICROORGANISMOS DE INTERS

INDUSTRIAL

1. Microorganismos utilizados a nivel industrial. 2. Actividades y caractersticas de inters. Principales tipos. 3. Fisiologa del crecimiento 4. Metabolismo microbiano.

___________________________________________________________________ 1 Microorganismos utilizados a nivel industrial

No todos los microorganismos tienen un uso industrial. Mientras que los microorganismos aislados de la naturaleza muestran el crecimiento celular como su principal propiedad fisiolgica, los microorganismos industriales son organismos que se han seleccionado cuidadosamente para que produzcan uno o ms productos especficos. Incluso cuando el microorganismo industrial es uno que se ha aislado por las tcnicas tradicionales, se convierte en un organismo altamente "modificado" antes de entrar en las industrias a gran escala. En gran parte, los microorganismos industriales son especialistas metablicos capaces de producir especficamente determinados metabolitos y con gran rendimiento. Con el fin de lograr esta elevada especializacin, las cepas industriales estn alteradas genticamente, por mutacin o por recombinacin. Habitualmente se reprimen o se eliminan las vas metablicas menores y frecuentemente existe en ellas un desequilibrio metablico. Los microorganismos industriales pueden presentar muchas propiedades celulares y bioqumicas alteradas. Aunque las cepas industriales pueden crecer satisfactoriamente bajo las condiciones altamente especializadas de un fermentador, pueden mostrar un crecimiento pobre en ambientes naturales competitivos.

1.1 Origen de las cepas industriales

La fuente ltima de todas las cepas de microorganismos industriales es el ambiente natural. Pero a travs de los aos, a medida que los procesos microbianos a gran escala se han ido perfeccionando, un cierto nmero de cepas industriales se han ido depositando en las

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colecciones de cultivos. Cuando se patenta un nuevo proceso industrial, al solicitante de la patente se le requiere para que deposite una cepa capaz de llevar a cabo el proceso, en una coleccin de cultivos reconocida. Hay varias colecciones de cultivos que actan de depositarias y suministradoras de cultivos microbianos. Aunque estas colecciones pueden ser una fuente rpida y fcil de cultivos, es comprensible que la mayora de las compaas industriales se sientan poco dispuestas a depositar sus mejores cultivos en las colecciones de cultivos. Adems de cultivos de microorganismos, muchas colecciones de cultivos tienen tambin colecciones de varios plsmidos, de genes clonados y de vectores para su uso en ingeniera gentica, de lneas celulares animales para el cultivo de virus animales, y de hibridomas para producir anticuerpos monoclonales.

ORIGEN DE LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES 1. Alimentos fermentados a) Seleccin involuntaria segn las caractersticas del

1.2 M

Cimmrmevcciri

proceso b) Seleccin in vitro de aquellas cepas que presentaran unas caractersticas ms interesantes 2. Produccin de aditivos y enzimas de uso alimentario a) Seleccin a partir de cualquier fuente natural b) Colecciones de cultivo pblicas y privadas

ejora de cepas orno hemos indicado, la fuente inicial de un microorganismo ndustrial es el ambiente natural, pero el aislamiento original se odifica en gran medida en el laboratorio. Como resultado de esta odificacin, es posible anticipar una mejora progresiva en el

endimiento de un producto. El ejemplo ms espectacular de tal ejora progresiva es el de la penicilina, el antibitico producido por

l hongo Penicillium chrysogenum. Cuando se produjo por primera ez la penicilina a gran escala, se obtuvieron rendimientos de 1- 10 g/ml. A lo largo de los aos, como resultado de la mejora de las epas acoplada a cambios en el medio y en las condiciones de ultivo, el rendimiento de penicilina aument hasta 50.000 g/ml. Es nteresante decir que todo este incremento de 50.000 veces el endimiento, se obtuvo por mutacin y seleccin; no estuvo mplicada ninguna manipulacin gentica. La introduccin de nuevas

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tcnicas genticas ha conducido a posteriores, aunque mucho ms modestos, incrementos del rendimiento.

2 Actividades y caractersticas de inters. Principales tipos.

2.1 Propiedades de un microorganismo industrial

Un microorganismo adecuado para su utilizacin industrial debe producir la sustancia de inters, pero hay muchos otros aspectos a considerar. Es preciso disponer del organismo en cultivo axnico (puro), debe ser genticamente estable, y debe crecer en cultivo a gran escala. Adems, debe ser posible mantener cultivos del organismo durante un perodo de tiempo largo en el laboratorio y en la planta industrial. El cultivo debe producir preferentemente esporas o alguna otra forma celular reproductora, para que los organismos se puedan inocular fcilmente en los grandes fermentadores. Una caracterstica importante es que el organismo. industrial crezca rpidamente y produzca el compuesto deseado en un perodo de tiempo relativamente corto. El organismo, adems, debe ser capaz de crecer en un medio de cultivo lquido y relativamente barato, que se pueda obtener en grandes cantidades. Muchos procesos microbiolgicos industriales utilizan fuentes carbonadas de desecho de otras industrias, como principal ingrediente o como suplemento para los medios de cultivo a escala industrial. Algunas de estas fuentes son, por ejemplo, el licor de maceracin de maz (un producto rico en nitrgeno y factores de crecimiento), el suero (un producto lquido de desecho de la industria lechera, que contiene lactosa y sales minerales) y otros materiales de desecho industriales, que tienen elevado contenido de carbono orgnico. (La utilizacin de estos materiales carbonados de desecho ayuda tambin a resolver los problemas de eliminacin de residuos, creados por la elevada demanda biolgica de oxgeno (BOD) de los residuos orgnicos de desecho). Adems, un microorganismo industrial debera no ser daino para las personas ni para los animales y plantas econmicamente importantes. Debido al gran tamao de la poblacin dentro del fermentador y a la imposibilidad prctica de evitar la contaminacin del ambiente fuera del fermentador, un patgeno podra plantear problemas potenciales desastrosos. Otro requisito importante de un microorganismo industrial es que sea posible eliminar las clulas microbianas del medio de cultivo con relativa facilidad. En el laboratorio, las clulas se retiran principalmente por centrifugacin, pero la centrifugacin a gran escala puede ser difcil o cara. Los organismos industriales ms favorables son aquellos que tienen un tamao de clula grande,

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porque las clulas ms grandes se depositan rpidamente en un cultivo o pueden filtrarse fcilmente con materiales de filtro relativamente baratos. Los preferidos son los hongos, las levaduras y las bacterias filamentosas. Las bacterias unicelulares, debido a su pequeo tamao, son difciles de separar del fluido de cultivo. Finalmente, un microorganismo industrial debera ser susceptible de manipulacin gentica. En microbiologa industrial, el incremento del rendimiento se ha obtenido primordialmente por medio de la mutacin y seleccin. Tambin es deseable que el organismo industrial sea capaz de sufrir recombinacin gentica, bien por un proceso sexual o por algn tipo de proceso parasexual1. La recombinacin gentica permite incorporar en un solo genoma, caractersticas genticas de ms de un organismo. Sin embargo, muchas cepas industriales se han mejorado enormemente por mutacin y seleccin, sin el uso de la recombinacin gentica. REQUISITOS DE LAS CEPAS INDUSTRIALES 9 Posibilidad de obtener cultivos puros 9 Genticamente estables 9 Fcil de mantener por largos perodos de tiempo 9 Tasa rpida de produccin de formas de propagacin 9 Tasa rpida de crecimiento en preinculo y en fermentador 9 Ausencia de problemas tecnolgicos durante el escalado 9 Nutricionalmente poco exigentes 9 Autoproteccin (bajada de pH, temperatura ptima extrema, 9 produccin de agentes antagonistas, etc). 9 Produccin rpida de los metabolitos de inters 9 Fcil separacin entre el producto y el microorganismo 9 Produccin mayoritaria del metabolito de inters 9 Falta de produccin de sustancias txicas 9 Susceptible de mejora gentica Existen una serie de caractersticas que comparten todos los microorganismos y que suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la ms fundamental, el pequeo tamao de la clula

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1 Ciclo que implica cambios en el nmero cromosmico, pero que difiere en lugar y tiempo del ciclo sexual; tiene lugar en los hongos cuyo ciclo normal est suprimido o aparentemente ausente. Cuando es Homocaritico los ncleos presentes en una hifa son del mismo tipo gentico. Para el caso Heterocaritico dos o ms ncleos son genticamente distintos. En la Heterocariosis se produce la fusin de micelios genticamente distintos, el par formado sufre mitosis o, puede suceder en la mutacin de un micelio Homocaritico.

La Parasexualidad consiste en los siguientes procesos: Heterocariosis, cariogamia, recombinacin, segregacin mediante entrecruzamiento mittico y haploidizacin. Los procesos parasexuales se asemejan a la reproduccin sexual, pero estos pueden tener lugar cuando el micelio est en desarrollo, mientras que la fase sexual (s la hay) depende de las condiciones nutritivas y del hbitat


microbiana y su correspondiente alta relacin de superficie a volumen. Esto facilita el rpido transporte de nutrientes al interior de la clula y permite, por consiguiente, una elevada tasa metablica. As, la tasa de produccin de protena en las levaduras es varios rdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su vez, es 10 veces ms alta que en el ganado. Esta velocidad de biosntesis microbiana extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo 20 minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelacin del agua y el punto de ebullicin, en agua salada y dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas permanecen inactivos durante aos hasta que el medio ambiente, ms favorable, permita el desarrollo de las clulas. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse as a muchas fuentes de nutricin. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen en nutrientes baratos. Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de inters; debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra caracterstica importante es que el microorganismo industrial crezca rpidamente y produzca el producto deseado en un corto perodo de tiempo. El microorganismo debe tambin crecer en un relativamente barato medio de cultivo disponible en grandes cantidades. Adems, un microorganismo industrial no debe ser patgeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la facilidad de separar las clulas microbianas del medio de cultivo; la centrifugacin es dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales ms favorables para esto son aquellos de mayor tamao celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias filamentosas) ya que estas clulas sedimentan ms fcilmente que las bacterias unicelulares e incluso son ms fciles de filtrar.

2.2 Diferentes tipos de microorganismos industriales

Los microorganismos que sintetizan productos tiles para el hombre representan, como mximo, unos pocos centenares de especies de entre las ms de 100000 descritas en la Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fcil o barata por otros mtodos.

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2.2.1 Levaduras

Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de aos para la fabricacin de pan y bebidas alcohlicas. La levadura que sin duda fue la primera y an hoy en da sigue siendo la ms utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean diferentes cepas para la fabricacin de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequea escala para la produccin de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de cido ctrico. Trichosporum cutaneum desempea un importante papel en los sistemas de digestin aerbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidacin de compuestos orgnicos, includos algunos que son txicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenlicos.

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2.2.2 Hongos filamentosos

Los hongos tienen una gran importancia econmica, no tan slo por su utilidad, sino tambin por el dao que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradacin de gran parte de la materia orgnica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre. Los efectos perjudiciales de los hongos estn contrarrestados por su utilizacin industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinacin de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son tambin la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), cidos orgnicos (ctrico, lctico), antibiticos (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

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2.2.3 Bacterias

Entre las especies bacterianas de inters industrial estn las bacterias del cido actico, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en cido actico. El gnero Bacillus es productor de antibiticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del gnero Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azcares originando acetona y butanol. Las bacterias del cido lctico incluyen, entre otras, las especies de los gneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. El olor caracterstico a tierra mojada se debe a compuestos voltiles (geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia radica en la produccin de antibiticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc

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3 Fisiologa del crecimiento

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es un aumento de la poblacin. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: A escala individual A escala poblacional

Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de ste podemos abordar los siguientes temas:

inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de plsmidos);

segregacin de cromosoma y plsmidos a las clulas hijas;

sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular

seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos:

cintica del crecimiento; factores que afectan al tiempo de generacin (g); factores ambientales que limitan el crecimiento.

3.1 Ciclo celular

Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior.

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Ciclo eucaritico

Los eventos clave son la fase S, de sntesis de ADN, y la fase M (mitosis y divisin celular). Las fases S y G2 son relativamente constantes en sus proporciones. Cuando se altera la duracin del ciclo total (por modificacin de la velocidad de crecimiento), lo que cambia es el tiempo de la fase G1 y, en menor medida, de la fase M.

Ciclo eucaritico



Ciclo procaritico

Hasta hace unos 20 aos se pensaba que los ciclos bacterianos carecan de eventos clave. Ello se deba a que en bacterias no existe mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces la sntesis de ADN pareca continua durante todo el ciclo.

Pero hoy sabemos que s existen fenmenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en medios menos ricos que permiten slo crecimientos lentos. Los periodos del ciclo procaritico son:

Ciclo procaritico

Hasta hace unos 20 aos se pensaba que los ciclos bacterianos carecan de eventos clave. Ello se deba a que en bacterias no existe mitosis y porque en los medios de cultivo ricos empleados entonces la sntesis de ADN pareca continua durante todo el ciclo.

Pero hoy sabemos que s existen fenmenos clave, que se pueden poner mejor de manifiesto cuando el crecimiento se estudia en

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medios menos ricos que permiten slo crecimientos lentos. Los periodos del ciclo procaritico son:

fase C (equivalente a la S eucaritica): replicacin del ADN cromosmico;

fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide con el final de divisin celular;

fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide con el final de divisin celular;

Lo caracterstico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generacin (g), lo hace a expensas de la fase "G1". Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min.

3.1.1 Ciclo celular en funcin del tiempo de generacin

Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qu ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generacin.

Cuando g>C+D existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicacin). En estas condiciones podemos observar ntidamente periodos diferenciados entre s (de sntesis de ADN y de divisin celular).

Cuando g=C+D ya no existe G1, y cada ronda de replicacin comienza inmediatamente tras la precedente divisin celular (es decir, cada clula hija recin nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo, la clula inicia la divisin celular).

Cuando g


Una caracterstica del ciclo es que, cuanto ms rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de las clulas. Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que est en un medio rico son ms grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre.

3.1.2 Control de la replicacin del ADN2 cromsomico

De lo anterior se deduce que debe de existir algn tipo de acoplamiento entre las ondas de replicacin y la divisin celular.

Nosotros, sobre el esquema que hemos comentado, podemos inferir cundo se debe de iniciar una nueva ronda siempre que sepamos los valores de g, C y D:

Contamos C+D minutos a partir de g, y entonces podemos prever que la ronda de replicacin tendr lugar g--(C+D) minutos antes de la prxima divisin celular (o bien, G1-g minutos si existe periodo G1).

Pero, por supuesto, la clula no es tan "lista" (no sabe contar hacia atrs en el tiempo) ni tiene el don de la prediccin (los humanos tampoco, para la mayor parte de las cosas importantes). La bacteria tampoco sabe "contar hacia adelante", ya que el tiempo de inicio de una ronda de replicacin no guarda una relacin sencilla con la divisin celular previa.

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Entonces, cmo se acoplan divisin celular y replicacin cromosmica? Una clave hacia la respuesta a esta pregunta es que la razn (proporcin) entre orgenes de replicacin y masa celular en el inicio (inmediatamente antes de la replicacin) es igual para todas las tasas de crecimiento. H aqu un modelo hipottico sobre el mecanismo de coordinacin entre ambos eventos del ciclo celular:

2 ADN es la abreviatura del cido desoxirribonucleico (en ingls, DNA: Deoxyribonucleic Acid). Constituye el principal componente del material gentico de la inmensa mayora de los organismos, junto con el ARN. Es el componente qumico primario de los cromosomas y el material en el que los genes estn codificados. En las bacterias, el ADN se encuentra en el citoplasma mientras que en organismos ms complejos, tales como plantas, animales y otros organismos multicelulares, la mayora del ADN reside en el ncleo celular. Se conoce desde hace ms de cien aos. El ADN fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, bilogo suizo, en los ncleos de las clulas del pus obtenidas de los vendajes quirrgicos desechados y en el esperma del salmn. l llam a la sustancia nuclena, aunque no fue reconocida hasta 1943 gracias al experimento realizado por Oswald Avery.


El sistema de coordinacin detecta la concentracin de orgenes de replicacin; conforme la bacteria crece, esta concentracin va descendiendo, hasta que se alcanza un valor umbral crtico que desencadena una nueva onda de replicacin. Ello hace que se doble el nmero de orgenes. Una ulterior ronda no se pone en march r la concen

Se trata "oscilado l pararme tal modo r iniciador disparar

3.1.3 Relacione

Es fcil co s un medio, , mayor es

a.

1.

2.

a hasta que el crecimiento haga de nuevo descendetracin de orgenes.

ra, pues, de una especie de reloj biolgico yr" que usara como medida del tiempo etro de masa celular, volumen, u otro equivalente, de que la concentracin crtica de un facto o la dilucin de un represor serviran para la replicacin a una concentracin determinada.

s entre velocidad de crecimiento y tamao celular

mprobar en los cultivos bacterianos que cuanto ms rico e y por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g)el tamao medio de las clulas.

io.

bacterias creciendo en un medio relativamente pobre (supongamos que en este medio g=60 min,

C+D=g);

si transplantamos una clula recin dividida procedente del cultivo anterior a un medio ms rico (por ejemplo, que permite un tiempo de generacin g=35 min) podemos observar que: a. la primera divisin ocurre C+D (60 minutos)

despus; es decir, con un tiempo idntico al que tena en el medio anterior;

b. pero como en este medio g=35 min, la iniciacin de una nueva ronda de replicacin ocurre antes de dicha replicacin celular (es decir, C y D se superponen);

c. se observa que se alcanza un nuevo equilibrio, con un tamao celular mayor que en el medio pobre, y una masa de inicio (tras la divisin celular) mayor, alterndose igualmente el tiempo de inic

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3.1.4 Segregacin de cromosomas y plsmidos

Existe un mecanismo eficiente que asegura la segregacin de los cromosomas bacterianos a las clulas hijas. Como se recordar, el cromosoma se encuentra unido a la membrana citoplsmica, al parecer a travs de un mesosoma. Existen indicios de que durante la replicacin, el vrtice de la horquilla de replicacin va pasando por ese punto de anclaje. La replicacin cromosmica se inicia en una regin especial denominada oriC, a partir de la cual se efecta una replicacin bidireccional, hasta que ambas horquillas se encuentran en un punto situado a 180o respecto de oriC. Cuando el mesosoma llega a ese trmino de replicacin se escinde en dos mesosomas, cada uno de los cuales constituye el punto de anclaje de cada copia del cromosoma. Cuando se forme el septo transversal, cada mesosoma va a parar a cada clula hija, de modo que las copias de los cromosomas quedan segregadas. Parece ser que algunos plsmidos se segregan por este mismo mecanismo. As pues, el mesosoma parece actuar como un anlogo primitivo del aparato mittico.

3.1.5 Productos anmalos de la divisin celular

Existen diversos tipos de mutantes cuyos fenotipos implican serias alteraciones del proceso de divisin celular y de replicacin o segregacin del material gentico a las clulas hijas. Algunos de estos mutantes han encontrado tiles aplicaciones en estudios genticos y moleculares.

Clulas sin cuerpos nucleares (= maxiclulas)

Determinados mutantes termosensibles son incapaces de iniciar la replicacin a temperaturas elevadas, de modo que siguen creciendo en tamao y se dividen mucho despus de que se haya completado la ltima replicacin cromosmica (iniciada a una temperatura ms baja, permisiva). El resultado de la divisin celular a la temperatura no permisiva es que se producen clulas de tamao normal, pero sin cromosoma, aunque poseen los dems componentes celulares, incluyendo copias de plsmidos. Por estos mutantes se puede deducir que no existe una relacin directa entre la septacin (o sea, la fase D de divisin celular) y la replicacin cromosmica anterior (fase C).

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Miniclulas Se producen en ciertos mutantes que forman septos anmalos acntricos (asimtricos, cerca de un extremo y no en el centro). En las miniclulas tampoco se segrega cromosoma, pero pueden "heredar" copias de plsmidos. De estos mutantes se deduce otro rasgo del ciclo celular: el lugar habitual donde se produce la septacin est programado genticamente, y esta programacin se puede alterar por mutaciones. Uso de maxiclulas y miniclulas en estudios moleculares y genticos: Un empleo habitual de estas "clulas" anmalas en el laboratorio se deriva del hecho de que durante cierto tiempo pueden sintetizar protenas codificadas por los nicos genes que poseen: los del plsmido o plsmidos que alberguen. Por marcaje radiactivo y electroforesis en gel de protenas, se detectan unas pocas bandas, correspondientes slo a las protenas de los pocos genes existentes, con la ventaja de que no hay interferencia de los cientos o miles de protenas de la clula normal.

3.2 Mtodos para el estudio y medicin del crecimiento a escala individual

3.2.1 Por microscopa

Se basan en la observacin microscpica de microcultivos a temperatura constante.

seguimiento de clulas individuales por microfotografa secuencial

por inmunofluorescencia: se observa en microscopio de fluorescencia la incorporacin de materiales de P.C. o de membrana marcados con algn colorante fluorescente.

3.2.2 Por obtencin de cultivos sincrnicos

Como veremos en el prximo captulo, en un cultivo bacteriano habitual, las distintas clulas se encuentran en fases distintas del ciclo celular, es decir, no estn sincronizadas. Por lo tanto, del

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estudio de la poblacin no es posible sacar conclusiones sobre eventos del ciclo celular. Sin embargo, por una serie de procedimientos, es factible producir cultivos sincrnicos, en los que durante cierto tiempo (casi) todas las clulas estn en la misma fase, de modo que tienen la misma edad, el mismo tamao, y se dividen y replican el cromosoma al mismo tiempo. Entonces, el comportamiento de la poblacin (ms fcil de estudiar que el de un solo individuo) es una "imagen ampliada" del individual. Los principales mtodos de obtencin de cultivos sincrnicos se basan en seleccionar, a partir de un cultivo estndar no sincrnico, aquellas clulas que o bien son del mismo tamao, o bien son de la misma edad. Las tcnicas principales son:

seleccin por tamaos: se suele recurrir a gradientes de densidad, sobre todo los formados por mezclas de agua normal y agua deuterada (H2O/D2O).

seleccin por edades: el mtodo ms empleado es la seleccin por filtracin (tcnica de Helmstetter-Cummings), aunque slo se puede aplicar a ciertas cepas (en E. coli funciona con la cepa B/r, pero no con la K12).

Procedimiento

9 Se filtra un cultivo asincrnico que est en fase exponencial a travs de una membrana de nitrocelulosa: las clulas se adhieren al filtro. 9 Se invierte el filtro. 9 Se va pasando medio fresco (=nuevo) precalentado. Cada clula unida al filtro se nutre y crece, y finalmente se divide: una de las clulas hijas queda unida al filtro y la otra pasa al eluato, que se recoge. En cada momento concreto de esta operacin, las clulas hijas eluidas y recogidas corresponden a clulas "recin nacidas". Las clulas eluidas en cada momento concreto (y por lo tanto, de la misma edad) sirven como "fundadoras" de un cultivo sincrnico.

Obsrvese la cintica de un cultivo "sincrnico" expresada como nmero de individuos en funcin del tiempo:

durante unas pocas generaciones el cultivo es ms o menos sincrnico;

las mesetas indican las fases en que el nmero de clulas no vara, porque todas estn creciendo en tamao antes de dividirse;

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las subidas bruscas (casi verticales) en el nmero de individuos nos indican que todas las clulas del cultivo se estn dividiendo a (casi) el mismo tiempo.

Pero la sincrona se va perdiendo paulatinamente, de modo que al cabo de unas generaciones la grfica se convierte en una recta con pendiente. La explicacin estriba en que el tiempo exacto de divisin, o ms concretamente C y D no duran exactamente lo mismo en los distintos individuos. Estas pequeas variaciones estadsticas se van acumulando, generando desfases cada vez mayores entre clulas, hasta que la sincrona se pierde irreversiblemente.

3.3 Medida del crecimiento

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologas.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas individuales, sto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:

Recuento microscpico de partculas Recuento electrnico de partculas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias Mtodo del nmero ms probable

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

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Determinacin de peso hmedo Determinacin de peso seco Determinacin de nitrgeno total Determinacin qumica de un cido nucleico

Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del incremento de la biomasa.

Recuentos Directos

Recuento microscopico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono).

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

Camara de recuento de Petroff-Hausser


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Tipo de cuadro Area [cm2]

Volumen [ml]

Factor [1/Volumen]

Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104

Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106

Cuadrado pequeo 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107

1/Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento.

Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se utilizaron para contar un el nmero de bacterias.

Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cmara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realiz el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeo tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 m x 50 m x 20 m = 5 x 104 m3 = 5 x 10-8 ml).

Recuento electronico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeas producen cambios en la resistencia que son


comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

Medida de la Biomasa La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metablica, o de un constituyente metablico o qumico. Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud. Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. Peso seco: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias. La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

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Determinacin de acidos nucleicos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado cido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la poblacin. Determinacion de nitrgeno: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno que contiene una muestra en relacin al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrgeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrgeno proteico mediante absorcin en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry, o el nitrgeno total mediante la Digestin de Kjeldahl. Incorporacin de precursores radiactivos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta tcnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la clula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la poblacin. Dispersin de la Luz Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. En relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o

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por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Optica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.

Absorbancia en funcin del Peso Seco

Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0). Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-mg/ml).

La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

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Absorbancia en funcin del Peso Seco

Absorbancia en funcin del Nmero de Microorganismos Totales

En estos grficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo nmero de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensin es distinta.

Lectura complementaria Anexo 1


4 Metabolismo microbiano. 4.1 Introduccin al metabolismo.

El metabolismo es el conjunto de reacciones bioqumicas que permiten el crecimiento de un organismo (por lo tanto, en bacterias, que conduce a la creacin de nuevas clulas). El metabolismo de la clula comprende dos grandes tipos de reacciones:

1) reacciones de mantenimiento, que suministran

a) energa

b) poder reductor

c) precursores metablicos

2) reacciones del anabolismo (biosntesis), que usan energa y poder reductor procedente de las reacciones de mantenimiento.

El trmino metabolismo se utiliza cuando nos referimos a todos los procesos qumicos que tienen lugar dentro de una clula. Los elementos qumicos bsicos que utiliza una clula provienen del medio ambiente y estos elementos qumicos son transformados por la clula en los constituyentes caractersticos que componen dicha clula. Estos compuestos qumicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una clula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa. Esta energa se obtiene del medio ambiente. Las clulas pueden utilizar 3 tipos distintos de fuente de energa: luz, compuestos orgnicos y compuestos inorgnicos. Aunque algunos organismos obtienen su energa de la luz, la mayor parte lo hacen a travs de compuestos qumicos. Cuando estos compuestos qumicos se rompen originando compuestos ms simples se libera energa. Este proceso se denomina catabolismo. Las clulas tambin necesitan energa para otras funciones celulares como es la motilidad (movimiento celular) y transporte de nutrientes. Como hemos visto existen dos procesos bsicos de transformaciones qumicas en las clulas: anabolismo y catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anablicas y catablicas es el metabolismo.

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CLASIFICACION DE LOS ORGANISMOS SEGUN SU FUENTE DE CARBONO Y ENERGIA

FUENTE DE ENERGIA FUENTE DE CARBONO FOTOTROFOS LUZ QUIMIOTROFOS QUIMICA AUTOTROFOS CO2 HETEROTROFOS COMPUESTOS ORGANICOS FUENTE DE ENERGIA FUENTE DE CARBONO FOTOAUTOTROFOS LUZ CO2 FOTOHETEROTROFOS LUZ COMPUESTOS ORGANICOS QUIMIOAUTOTROFOS QUIMICA CO2 QUIMIOHETEROTROFOS QUIMICA COMPUESTOS ORGANICOS

Fotoautotrofos:Vegetales, algas, bacterias fotosintticas.

Fotoheterotrofos: Bacterias Quimioautotrofos: Bacterias.

Quimioheterotrofos: Animales, Protozoos, bacterias. NUTRICION MICROBIANA

Dr. Pedro F. Mateos

Departamento de Microbiologa y Gentica. Facultad de Farmacia. Universidad de Salamanca

I.- NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS II.- NUTRIENTES

1.- MACRONUTRIENTES 2.- MICRONUTRIENTES 3.- VITAMINAS Y HORMONAS 4.- ELEMENTOS TRAZA

III.- PERMEABILIDAD Y TRANSPORTE

I.- NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS

La gran meta que tiene un microorganismo es crecer y dividirse; para ello necesita duplicar el material que posee. Las clulas utilizan elementos qumicos que provienen del medio

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ambiente para transformarlos en los constituyentes caractersticos que componen dicha clula. Estos compuestos qumicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una clula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa. Esta energa se obtiene del medio ambiente. Las clulas pueden utilizar tres tipos distintos de fuentes de energa: luz, compuestos orgnicos o compuestos inorgnicos. Aunque algunos organismos obtienen su energa de la luz, la mayor parte lo hacen a travs de compuestos qumicos. Cuando estos compuestos qumicos se rompen originando compuestos ms simples se libera energa y a este proceso se le denomina catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anablicas y catablicas es el metabolismo. Cuando los microorganismos se separan de su hbitat (donde adquieren los nutrientes) y se cultivan en laboratorios o industrias se deben usar medios de cultivo que contengan los elementos qumicos necesarios para su crecimiento.

II.- NUTRIENTES

Los nutrientes que requiere una clula para su crecimiento se pueden clasificar en los siguientes grupos: 1.- Macronutrientes: carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno. 2.- Micronutrientes: fsforo, potasio, azufre, magnesio. 3.- Vitaminas y hormonas 4.- Elementos traza: zinc, cobre, manganeso, molibdeno, cobalto.

1.- MACRONUTRIENTES

Carbono. Todos los organismos necesitan carbono en alguna de sus formas. El carbono forma el esqueleto de los tres ms importantes nutrientes (carbohidratos, lpidos y protenas) que se utilizan para la obtencin de energa as como material celular. Los microorganismos que utilizan compuestos orgnicos como fuente de carbono se llaman heterotrofos y aquellos que utilizan el CO2 como fuente de carbono se llaman autotrofos. Hidrgeno y Oxgeno. El hidrgeno y oxgeno forman parte de muchos compuestos orgnicos. Se encuentran en el H2O, como componentes de nutrientes y en la atmsfera. Adems el O2 se utiliza en la respiracin aerbica como aceptor terminal de electrones. Nitrgeno. Todos los organismos requieren nitrgeno. El nitrgeno es metabolizado y entra a formar parte de las protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular. Las fuentes de nitrgeno que pueden ser utilizadas por diferentes organismos incluyen el N2 atmosfrico en algunos procariotas, otros utilizan compuestos inorgnicos como nitratos, nitritos o sales de amonio, mientras que otros requieren compuestos nitrogenados orgnicos como son los aminocidos o pptidos.

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2.- MICRONUTRIENTES (c.a. 0,2 g / l)

Fsforo. El fsforo es esencial para la sntesis de cidos nucleicos y ATP; tambin forma parte de los fosfolpidos y polmeros de la pared celular. El fsforo se suministra normalmente como fosfato inorgnico; alternativamente se puede utilizar fosfato orgnico como son los glicerofosfatos y fosfolpidos. Potasio. El in potasio acta como coenzima y probablemente como catin en la estructura de RNA y otras estructuras aninicas celulares. Azufre. El azufre es necesario para la biosntesis de los aminocidos cisteina, cistina y metionina. Tambin forma parte de coenzimas como biotina, coenzima A y ferredoxina. El azufre se suministra en forma inorgnica como sulfato u orgnica como cistina, cisteina y metionina. Magnesio. Se utiliza como cofactor de reacciones enzimticas donde acta el ATP.

3.- VITAMINAS Y HORMONAS

Las vitaminas se clasifican en dos grupos, hidrosolubles y liposolubles. Dentro de stas ltimas la vitamina A, D y E no son necesarias para el crecimiento de las bacterias. Todas las vitaminas hidrosolubles, excepto el cido ascrbico, son necesarias para el crecimiento de bacterias. La mayor parte de las vitaminas hidrosolubles son componentes de coenzimas. En los medios indefinidos se utiliza como fuente de vitaminas el extracto de levaduras.

4.- ELEMENTOS TRAZA (c.a. 25 mg / l)

En general los requerimientos de elementos traza se conocen slo cualitativamente ya que es difcil demostrar su requerimiento debido a que las cantidades necesarias se suelen encontrar a menudo como contaminantes en otros constituyentes del medio. Son necesarios para activar algunos enzimas; por ejemplo, el Mo6+ se necesita en la nitrogenasa que es el enzima que cataliza la conversin del nitrgeno atmosfrico en amonaco en la fijacin biolgica de nitrgeno.

III.- PERMEABILIDAD Y TRANSPORTE

La membrana citoplsmica controla el paso de los nutrientes dentro de la clula, as como hacia fuera de la clula. Existen 4 mecanismos que regulan el transporte de nutrientes: 1.- DIFUSION PASIVA


Las molculas de H2O y algunos nutrientes liposolubles pasan libremente a travs de la membrana hasta equilibrar concentraciones. No hay consumo de energa. 2.- DIFUSION FACILITADA Los nutrientes se unen a una protena transportadora para atravesar la membrana pasando de mayor a menor concentracin. No hay consumo de energa. 3.- TRANSPORTE ACTIVO La mayor parte de los nutrientes son transportados mediante este mecanismo. Este proceso permite concentrar altos niveles de nutrientes necesarios para las actividades metablicas dentro de la clula. Hay consumo de energa. El ATP distorsiona el sitio de unin de la protena transportadora dificultando a la molcula salir de la clula. 4.- TRANSPORTE POR TRANSLOCACION DE GRUPO En este tipo la protena transportadora es un enzima que aade un grupo fosfato del cido fosfoenolpirvico al nutriente durante el transporte. Este nutriente alterado ya no es capaz de unirse a la protena transportadora por lo que se acumula dentro de la clula.

La energa y el poder reductor en el metabolismo microbiano: papel del ATP y de los piridin nucleotidos

La energa qumica es la energa liberada cuando un compuesto orgnico o inorgnico es oxidado. En biologa las unidades de energa ms usadas son la kilocalora (Kcal) y el kilojulio (KJ). 1 Kcal = 4.184 KJ. La utilizacin de energa qumica en los organismos vivos est implicada con las reacciones de oxidacin-reduccin, llamadas REDOX ya que por cada oxidacin que ocurre tiene que haber una reduccin. Una oxidacin se define como la eliminacin de electrones de una sustancia y una reduccin se define como la adicin de electrones a una sustancia. En bioqumica, las oxidaciones y reducciones frecuentemente conllevan no slo la transferencia de electrones, sino de tomos enteros de hidrgeno.

La energa liberada como resultado de las reacciones redox debe de conservarse para ser utilizada por la clula. En los organismos vivos, la energa qumica liberada en las reacciones redox se transfiere normalmente a una variedad de compuestos fosfato en la forma de enlaces fosfato de alta energa. El compuesto ms importante en los organismos vivos que contiene enlaces fosfato de alta energa es el adenosn trifosfato (ATP). El ATP contiene 2 enlaces fosfato de alta

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energa. Se puede considerar que el ATP tiene por objeto "atrapar" una parte de la energa libre que queda disponible en las reacciones catablicas e impulsar reacciones biosintticas al activar ciertos metabolitos intermediarios de la biosntesis.

Adems del ATP, existen otros compuestos de alta energa que activan intermediarios metablicos y as impulsan ciertas reacciones de biosntesis:

Compuestos de alta energa Causa activacin en la biosntesis de: Guanina, Uridina Protenas, Peptidoglicano, Glucgeno

Citidina Fosfolpidos Desoxitimidina Lipopolisacridos Acetil coenzima A Acidos grasos

Ya hemos dicho que cuando ocurre una oxidacin tiene que haber una reduccin, es decir una sustancia que acepte los electrones eliminados. En la mayor parte de los casos, cada etapa de oxidacin de un metabolito implica la eliminacin de dos electrones y, por ello, la prdida simultnea de dos protones; esto equivale a la eliminacin de dos tomos de hidrgeno y se denomina deshidrogenacin. Inversamente, la reduccin de un metabolito implica la adiccin de dos electrones y de dos protones y se considera una hidrogenacin. Los compuestos que con ms frecuencia llevan a cabo oxidaciones y reducciones biolgicas (es decir, que sirven como aceptores de tomos de hidrgeno liberados en las reacciones de deshidrogenacin y como donadores de tomos de hidrgeno requeridos para las reacciones de hidrogenacin) son dos piridn nucletidos: nicotinamida adenn dinucletido (NAD) y nicotinamida adenn dinucletido fosfato (NADP). Estos dos piridn nucletidos pueden fcilmente sufrir oxidaciones y reducciones reversibles en el grupo nicotinamida. La oxidacin-reduccin reversible del NAD y del NADP puede simbolizarse as:

NAD+ + 2H -----> NADH + H+ oxidado reducido

NADP+ + 2H -----> NADPH + H+

Mecanismos de obtencion de ATP

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En el metabolismo, el ATP se genera por dos mecanismos bioqumicos fundamentalmente diferentes: Fosforilacin a nivel de sustrato y fosforilacin oxidativa.

1.- Fosforilacin a nivel de sustrato: Mediante la fosforilacin a nivel de sustrato, el ATP se forma a partir de ADP por transferencia de un grupo fosfato de alta energa de un intermediario de una ruta catablica. La siguiente reaccin sirve de ejemplo:

Acido 2 fosfoglicrico -----> Acido fosfoenolpirvico + ADP -----> Acido pirvico + ATP Como consecuencia de la prdida de una molcula de H2O, el enlace ster de baja energa del fosfato del cido 2-fosfoglicrico se convierte en un enlace enlico de alta energa en el cido fosfoenolpirvico. Este fosfato de alta energa puede luego ser transferido al ADP con lo que se produce una molcula de ATP. 2.- Fosforilacin oxidativa (Transporte de electrones): En los diferentes modos de metabolismo microbiano, incluyendo la respiracin y la fotosntesis, el ATP se genera por transporte de electrones a travs de una cadena de molculas transportadoras que tienen una orientacin fijada en la membrana celular. Los componentes de la cadena son molculas transportadoras capaces de sufrir oxidaciones y reducciones de modo reversible de tal manera que cada miembro de la cadena es capaz de ser reducido por la molcula transportadora que le precede y oxidado por la que le sigue. En la cadena de transporte de electrones algunos miembros transportan tomos de hidrgeno (un electrn ms un protn), mientras que otros transportan slamente un electrn. La orientacin de los transportadores en la membrana celular es tal que los transportadores de tomos de hidrgeno realizan el transporte hacia fuera de la clula y los transportadores de electrones lo realizan hacia el interior con lo que en cada confluencia se transporta fuera de la clula un protn. La membrana celular es impermeable a los protones; como resultado, el transporte de electrones retiene una porcin de energa qumica liberada por la reaccin global de la cadena (oxidacin del donador primario de electrones por el aceptor terminal de electrones). Esta energa se utiliza en los sistemas de permeasas, movilidad celular por flagelos y en la sntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico. Esta sntesis de ATP est catalizada por un enzima complejo unido a la membrana la ATP fosfohidrolasa (ATPasa). La fosforilacin oxidativa se puede explicar

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aplicando el smil de la generacin de energa elctrica a travs de agua embalsada. La membrana acta como una presa que retiene el agua (en este caso los protones que se transportan fuera de la clula a travs de la cadena transportadora de electrones); en el momento que se abren las compuertas (ATPasa) este agua liberada (protones) mueve la turbina (ATPasa) que genera energa elctrica (sntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico).

4.2 Metabolismo primario

Suma de los procesos esenciales para las funciones bsicas de la clula, como la gluclisis.

Un proceso microbiano tpico, en el que el producto se forma durante la fase primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentacin3. El etanol es un producto del metabolismo anxico de la levadura y de algunas bacterias y se forma como parte del metabolismo de la energa. Debido a que el crecimiento slo puede tener lugar si puede producirse energa, la formacin de etanol tiene lugar en paralelo con el crecimiento. En la imagen inferior, se muestra una tpica fermentacin alcohlica indicando la formacin de clulas, de etanol, y la utilizacin del azcar.

Sustrato de crecimiento

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3 En microbiologa industrial, el trmino fermentacin se refiere a cualquier proceso microbiano a gran escala, sea o no sea bioqumicamente una fermentacin. De hecho, la mayora de las fermentaciones industriales son aerbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentacin industrial se denomina fermentador y el microorganismo implicado es el agente de la fermentacin

Metabolito Clulas Primario

Las clulas y el metabolito se producen ms o menos simultneamente


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4.3 Metabolismo secundario

Suma de los procesos no esenciales para las funciones metablicas bsicas de la clula. Estos procesos estn asociados a ciertas ventajas adaptativas, como los mecanismos de defensa (antibiticos, toxinas, etc.).

Un tipo ms complejo de productos industriales es aquel en el que el producto deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos ms comunes y ms importantes de inters industrial. Los ms conocidos y ms ampliamente estudiados son los antibiticos y en la imagen inferior puede verse la cintica del proceso de obtencin de la penicilina. Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las clulas, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro. Las caractersticas reconocidas del metabolismo secundario son:

1. Cada metabolito secundario slo lo forman relativamente pocos organismos.

2. Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproduccin.

3. La formacin de metabolitos secundarios es extremadamente dependiente de las condiciones de crecimiento, especialmente de la composicin del medio. Con frecuencia, se produce la represin de la formacin del metabolito secundario.

4. Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo de estructuras estrechamente relacionadas. Por ejemplo, se ha visto que una sola cepa de una especia del Streptomyces produce 32 antibiticos distintos pero relacionados, del tipo antraciclina.

5. Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproduccin de metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como estn al metabolismo primario, usualmente no se pueden superproducir de una manera tan espectacular.

Trofofase e idiofase. En el metabolismo secundario, las dos fases distintas del metabolismo se denominan trofofase e idiofase. La trofofase es la fase de crecimiento (el prefijo trofos, significa "crecimiento" ) mientras que la fase de produccin de metabolitos es la idiofase. Si estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas para un excelente crecimiento y que

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las condiciones se alteren adecuadamente y en el momento oportuno para que la formacin del producto sea excelente. En el metabolismo secundario, la produccin en cuestin puede no derivarse del sustrato primario del crecimiento, sino a partir de un producto que l mismo form a partir del sustrato primario del crecimiento. Por tanto, el metabolito secundario se produce, generalmente, a partir de varios productos intermedios que se acumulan, bien en el medio de cultivo o bien en las clulas, durante el metabolismo primario. Una caracterstica de los metabolitos secundarios es que las enzimas implicadas en la produccin del metabolito secundario estn regulados separadamente de las enzimas del metabolismo primario. En algunos casos se han identificado inductores especficos de la produccin de metabolitos secundarios. Por ejemplo, se ha identificado un inductor especfico de la produccin de estreptomicina, un compuesto denominado Factor A.


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Metabolito Secundario

Despus de producidas las clulas y el metabolito primario, las clulas convierten el metabolito primario en uno secundario



Rmcrspeemll

o


Metabolito Secundario

Despus de producidas las clulas el sustrato se convierte en un metabolito secundario durante un posterior crecimiento

Caractersticas de los metabolitos secundarios Especficos de un grupo de organismos No esenciales para el crecimiento Dependiente de las condiciones de crecimiento Producidos como grupo de estructuras relacionadas: 9 Una cepa de Streptomyces produce 32 antibiticos

distintos del tipo antraciclina Puede obtenerse una superproduccin espectacular 37

elacin entre el metabolismo primario y el secundario. La ayora de los metabolitos secundarios son molculas orgnicas

omplejas que para su formacin requieren un gran nmero de eacciones enzimticas especficas. Se sabe, por ejemplo, que en la ntesis del antibitico tetraciclina estn implicados al menos 72 asos enzimticos separados y ms de 25 en la sntesis de la ritromicina, y que ninguna de estas reacciones tiene lugar durante l metabolismo primario. Sin embargo, las vas metablicas de estos etabolitos secundarios arrancan del metabolismo primario porque

os materiales de partida para el metabolismo secundario vienen de as vas biosintticas principales.

Muchos metabolitos secundarios estructuralmente complejos, se riginan a partir de precursores estructuralmente muy similares.


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4.4 Mecanismos de obtencin de energa por microorganismos

Como ya hemos dicho, los organismos quimioheterotrofos son

.- Fermentacin: cuando las reacciones redox ocurren en ausencia

.- Respiracin: cuando se utiliza el oxgeno molecular o algn otro

Fermentacin

Existen muchos tipos de fermentaciones pero en todas ellas slo

a oxidacin en una fermentacin est acoplada a la reduccin de un

quimioheterotrofos

aquellos que utilizan compuestos orgnicos como fuente de carbono y energa. Estos organismos son los animales, protozoos, hongos y casi todas las bacterias. Las vas utilizadas por los quimioheterotrofos para la oxidacin de compuestos orgnicos y la conservacin de la energa en ATP se pueden dividir en dos grupos:

1de cualquier aceptor terminal de electrones.

2agente oxidante como aceptor terminal de electrones. Aerbica: oxgeno; Anaerbica: Nitrato, Sulfato, Fumarato, Oxido de Trimetilamina.

ocurre una oxidacin parcial de los tomos de carbono del compuesto orgnico y por lo tanto slo se produce una pequea parte de la energa disponible.

Lcompuesto orgnico generado a partir del catabolismo del sustrato inicial, por lo que no son necesarios aceptores externos de electrones. El ATP en la fermentacin se produce a partir de la fosforilacin a nivel de sustrato. Como consecuencia de la no participacin de un aceptor externo de electrones, el sustrato orgnico experimenta una serie de reacciones oxidativas y reductoras equilibradas; los piridn nucletidos reducidos en un paso del proceso son oxidados en otro. Este principio general se ilustra en dos fermentaciones: la fermentacin alcohlica (tpica del metabolismo anaerbico de la glucosa por levaduras) y la fermentacin homolctica (tpica del metabolismo de algunas bacterias lcticas). Ambos procesos fermentativos utilizan la ruta Embden-Meyerhof: las dos molculas de NAD reducidas por esta ruta se reoxidan en reacciones que implican un ulterior metabolismo del piruvato. En el caso de la fermentacin homolctica, esta oxidacin ocurre como consecuencia directa de la reduccin del cido pirvico a cido


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Las bacterias pueden producir productos fermentativos finales

esultados de la fermentacin de la glucosa. El resultado final

l efecto Pasteur se produce en microorganismos capaces de

Respiracin aerbica (Rutas de utilizacin del piruvato por

La glucosa, tanto en el metabolismo respiratorio como en el

Embden-Meyerhof (eucariotas y procariotas)

lctico. En el caso de la fermentacin alcohlica, el cido pirvico se descarboxila primero para formar acetaldehdo y la reoxidacin del NADH ocurre en paralelo con la reduccin del acetaldehdo para formar etanol.

distintos al cido lctico y al etanol debido a las diferencias en el metabolismo del cido pirvico. Estos productos finales pueden ser cido frmico, 2,3 butanodiol, isopropanol, cido butrico, butanol. La mayor parte de las fermentaciones bacterianas pueden originar varios productos finales, pero ninguna fermentacin da lugar a todos los productos finales.

Rde la glicolisis es el consumo de glucosa, la sntesis de 2 ATP y la produccin de productos de fermentacin. Para el organismo el producto ms importante es el ATP y los productos de la fermentacin son productos de desecho. Sin embargo, estos productos son muy importantes para el cervecero, panadero, quesero. La fermentacin anaerbica de glucosa por levaduras produce etanol que es el producto principal de las bebidas alcohlicas, y la produccin de cido lctico es el paso inicial en la produccin de productos lcteos fermentados incluyendo el queso. Para los panaderos, la produccin de CO2 por la fermentacin de levaduras es el paso esencial en el esponjamiento del pan.

Erealizar metabolismo fermentador y respiracin aerobia (anaerobios facultativos). En presencia de O2 utilizan la respiracin aerbica, pero pueden emplear la fermentacin si no hay O2 libre en su medio ambiente. Pasteur fu el primero en observar que el azcar es convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo el CO2 el principal producto final de esta reaccin aerbica. Este efecto indica el mayor rendimiento energtico de la respiracin sobre la fermentacin.

aerobios)

fermentativo, se transforma en cido pirvico por una de las siguientes rutas:


Pentosa fosfato (eucariotas y procariotas)

Entner Doudoroff (slo en ciertos procariotas como alternativa a la ruta Embden-Meyerhof)

Embden-Meyerhof

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Entner Doudoroff

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En la mayor parte de los aerobios, el piruvato sufre una descarboxilacin oxidativa catalizada por un sistema enzimtico llamado complejo piruvato deshidrogenasa que produce acetil-coenzima A (acetil-CoA). El acetil-CoA es un metabolito precursor que puede entrar en rutas biosintticas; alternativamente, puede ser oxidado completamente a CO2 a travs de una ruta conocida como ciclo de Krebs o ciclo de los cidos tricarboxlicos (TCA). Este ciclo es la principal va de generacin de ATP en los heterotrofos aerbicos (por paso de electrones a travs de una cadena transportadora de electrones desde los piridn nucletidos reducidos). El ciclo TCA genera adems tres metabolitos precursores, a-cetoglutarato, succinil-CoA y oxalacetato. El ciclo TCA efecta la oxidacin completa de una molcula de cido actico a CO2, produce tres molculas de piridn nucletidos reducidos, una molcula de ATP y una molcula de FAD reducido (flavoprotena que cede electrones a una cadena de transporte independiente de piridn nucletidos).

Reacciones anaplerticas. El ciclo TCA, adems de oxidar el acetil CoA (dentro del ciclo) genera metabolitos precursores que son utilizados en la biosntesis (fuera del ciclo), por lo que requiere un aporte de cido oxalactico que reponga el utilizado en la sntesis de los metabolitos precursores. Estas reacciones de sntesis de oxalactico se denominan anaplerticas y fundamentalmente consisten en reacciones que carboxilan el piruvato o el fosfoenolpiruvato para obtener oxalacetato. Como resultado, el carbono procedente del piruvato entra en el ciclo por dos rutas: va acetil-CoA y va piruvato o fosfoenolpiruvato.

Ciclo del glioxilato. Durante la oxidacin de cido actico o cidos grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formacin intermedia de piruvato, ocurre una modificacin especial del ciclo TCA conocida como ciclo del glioxilato. Bajo estas circunstancias no puede generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato (anaplerticas) ya que en los microorganismos aerbicos no existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El oxalacetato requerido para la oxidacin del acetato se repone mediante la oxidacin de succinato y malato, que se produce por una secuencia de dos reacciones. En la primera reaccin el isocitrato, que es un intermediario normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y glioxilato. En la segunda reaccin el acetil-CoA se condensa con el glioxilato para formar malato, el precursor inmediato del oxalacetato. As, el ciclo del glioxilato acta como una secuencia anaplertica que permite el funcionamiento normal del ciclo TCA.

Balance energtico de la respiracin aerbica. El TCA produce la

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completa oxidacin del cido pirvico en 3 molculas de CO2 con la produccin de 4 molculas de NADH y una molcula de FADH. El NADH y FADH pueden ser reoxidados a travs del sistema de transporte de electrones originando 3 molculas de ATP por NADH y 2 molculas de ATP por FADH. Tambin se produce una molcula de ATP por fosforilacin a nivel de sustrato en la oxidacin de a-cetoglutarato a succinato. En total suman 15 molculas de ATP por ciclo. Como por cada molcula de glucosa se originan 2 molculas de cido pirvico, en total seran 30 molculas de ATP. A estos hay que aadir las 2 molculas de ATP formadas en la glicolisis y los 2 NADH que en presencia de O2 pueden ser reoxidados en el transporte de electrones originando 6 molculas de ATP. En total son 38 ATP por cada molcula de glucosa que contrastan con los 2 ATP producidos en la fermentacin.

4.5 Mecanismos de obtencin de energa por microorganismos auttrofos

A diferencia de lo que ocurre en los heterotrofos las reacciones de mantenimiento de los autotrofos, que obtienen su carbono celular del CO2, tienen lugar en dos fases bioqumicas distintas:

1.- Sntesis de metabolitos precursores 2.- Sntesis de ATP y piridn nucletidos reducidos Sntesis de metabolitos precursores: Ciclo de Calvin-Benson

Este ciclo es compartido por la mayora de los fotoautotrofos y los quimioautotrofos. La mayor parte de los autotrofos (aunque hay excepciones) fijan el CO2 mediante una reaccin catalizada por el enzima ribulosa difosfato carboxilasa que convierte la ribulosa 1,5-difosfato en cido 3-fosfoglicrico, a partir del cual se sintetizan todos los metabolitos precursores. Sin embargo, la fijacin de CO2 depende de la disponibilidad de ribulosa difosfato. Por consiguiente, parte del cido fosfoglicrico debe de utilizarse para regenerar este aceptor de CO2 (Ribulosa difosfato). El ciclo de Calvin-Benson puede dividirse en 3 fases:

1.- Fijacin de CO2 2.- Reduccin del CO2 fijado 3.- Regeneracin del aceptor de CO2

El ciclo de Calvin-Benson, en lugar de producir ATP y reducir piridn

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nucletidos, los consume. En los autotrofos tales compuestos se sintetizan por otros mecanismos.

Sntesis de ATP y piridn nucletidos reducidos A.- Quimioautotrofos

Los quimioautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la oxidacin de compuestos inorgnicos. Los substratos que pueden servir como fuente de energa son H2, CO, H3N, NO2-, Fe2+ y compuestos reducidos de azufre (H2S, S, S2O3-). En este tipo de metabolismo respiratorio, los electrones de estos compuestos pasan a travs de una cadena de transporte de electrones que genera ATP por el modo que opera en los heterotrofos (fosforilacin oxidativa). El aceptor terminal de electrones de la cadena de los quimioautotrofos es normalmente el O2. Algunos de estos substratos inorgnicos (H2 y CO) son agentes reductores suficientemente potentes como para reducir directamente a los piridn nucletidos, pero otros no lo son. Estos agentes reductores dbiles (NO2- y Fe2+) reducen los piridn nucletidos por un proceso llamado transporte inverso de electrones; en el cual parte de la fuerza motora de protones generada en el funcionamiento de la cadena normal de transporte de electrones se utiliza para impulsar electrones en una direccin inversa, que de otro modo sera termodinmicamente desfavorable, a travs de otra cadena que une el sustrato inorgnico con los piridn nucletidos oxidados que resultan por ello reducidos.

B.- Fotoautotrofos

Los fotoautotrofos obtienen ATP y poder reductor mediante la fotofosforilacin, proceso por el que los organismos fototrofos convierten la energa radiante de la luz en energa metablica y poder reductor. Existen dos tipos de fotosntesis, la oxignica y la anoxignica.

Fotosntesis oxignica: La generacin de ATP y poder reductor se lleva a cabo en dos centros de reaccin fotoqumica diferentes llamados fotosistema I (PSI) y fotosistema II (PSII), los cuales contienen clorofila y se localizan en las membranas de los tilacoides. Estos dos fotosistemas actan de una manera conjunta en cianobacterias, algas y plantas. i) Cuando la luz es absorbida por las molculas de clorofila existentes en el PSI, stas molculas de clorofila se fotoactivan lo que les permite oxidarse. Los electrones eliminados de las molculas de clorofila del PSI son aceptados por el NADP reducindose a NADPH2. Todo esto deja a las molculas de clorofila del PSI temporalmente deficientes en electrones lo que les confiere una carga positiva. ii) De la misma manera, la luz absorbida

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por las molculas de clorofila existentes en el PSII provoca que un electrn sea eliminado de cada molcula. Estos electrones pasan a travs de un sistema transportador de electrones hasta que llegan al PSI donde son aceptados por las molculas de clorofila deficientes en electrones que se reducen. Este sistema transportador de electrones es parecido al descrito en la fosforilacin oxidativa, utilizndose la energa liberada para la sntesis de ATP. La diferencia radica en que el donador primario de electrones es la clorofila del PSII y el aceptor terminal de electrones es la clorofila del PSI (NADH2 y O2 respectivamente en la fosforilacin oxidativa). iii) En este punto la clorofila del PSII es deficiente en electrones. Sin embargo, esta clorofila es un fuerte agente oxidante que obtiene los electrones necesarios para reducirse de las molculas de H2O. Esta oxidacin del H2O genera oxgeno gaseoso. Las cianobacterias, algas y plantas son organismos que generan oxgeno mediante la fotosntesis oxignica, siendo los responsables de la produccin mayoritaria del oxgeno que existe en la atmsfera terrestre. La atmsfera de la primitiva Tierra no contena oxgeno hasta que se desarrollaron las cianobacterias hace entre 1000 y 3000 millones de aos. El desarrollo de los organismos aerobios slo fu posible despus de que se acumularan en la atmsfera apreciables cantidades de O2 (generado mediante la fotosntesis oxignica de las cianobacterias).

Fotosntesis anoxignica: Los fototrofos anoxignicos convierten la energa de la luz en energa qumica necesaria para el crecimiento; sin embargo, y al contrario que las plantas, algas y cianobacterias en este proceso de transformacin de la energa no se produce oxgeno y por ello se le llama fotosntesis anoxignica. Otra diferencia es que los fototrofos anoxignicos contienen un tipo de clrofila, bacterioclorofila, diferente a la clorofila de las plantas. Estas bacterias contienen adems carotenoides, pigmentos encargados de la absorcin de la energa de la luz y posterior transmisin a la bacterioclorofila. El color de estos pigmentos son los que le dan el nombre a estas bacterias: bacterias rojas y bacterias verdes. En las cianobacterias estos pigmentos captadores de luz son las ficobilinas, de ah su nombre: bacterias azules (cianobacterias). En las bacterias rojas y bacterias verdes slo existe un fotosistema, de tal manera que la energa absorbida de la luz se utiliza para transportar un electrn desde la clorofila a la cadena de transporte de electrones que finalmente cede el electrn a la misma clorofila. En esta cadena de transporte de electrones se genera la energa necesaria para sintetizar ATP. Sin embargo, el transporte de electrones es cclico (el donador primario de electrones y el aceptor terminal de electrones es la misma clorofila) no existiendo por lo tanto reduccin de NADP a NADPH. Esta reduccin se lleva a cabo mediante transporte inverso de electrones gracias a los electrones donados por el hidrgeno

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gaseoso (H2) o el sulfuro de hidrgeno (H2S). En cualquier caso nunca se produce O2.

4.6 Biosntesis

La clula es una excelente "industria qumica" encargada de ensamblar las intrincadas molculas de la vida. Muchas de estas sustancias qumicas "fabricadas" por las clulas son tan complejas que todava no han podido ser sintetizadas artificialmente por los qumicos en el laboratorio. Sin embargo, las bacterias pueden sintetizarlas a partir de los nutrientes y a temperatura ambiente. Estas sustancias son:

1.- Sustancias nitrogenadas, incluyendo protenas (como son los enzimas) y cidos nucleicos (DNA y RNA). 2.- Carbohidratos, donde se incluyen polisacridos complejos como es la parte correspondiente del peptidoglucano de la pared celular. 3.- Fosfolpidos, los cuales son componentes importantes de la membrana citoplsmica.

4.6.1 Sustancias nitrogenadas

A.- Protenas El cido glutmico es el aminocido ms importante a partir del cual las bacterias sintetizan otros aminocidos. En Escherichia coli el cido glutmico se obtiene por reduccin aminada del cido a-cetoglutrico. Este cido glutmico se puede transformar en otros aminocidos por dos mecanismos:

Transaminacin: el grupo amino del cido glutmico se intercambia por un tomo de oxgeno de diversos cidos orgnicos convirtindolos en aminocidos. Por ejemplo, la sntesis de alanina a partir de la transaminacin del cido pirvico:

Acido glutmico (-NH2) + Acido pirvico (=O) --------> Acido a-cetoglutrico

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(=O) + Alanina (-NH2)

Alteracin de la estructura molecular: la otra va por la cual el cido glutmico se utiliza para sintetizar otros aminocidos es alterando su estructura molecular. Estos cambios estructurales requieren energa en forma de ATP. Un ejemplo es la sntesis de prolina:

Acido glutmico + ATP + NADH2 --------> Semialdehido del cido glutmico + ADP + P + NAD --------> H2O + Pirrolina-5-cido carboxlico + NADPH2 --------> Prolina + NAD

Una vez sintetizados, estos aminocidos deben activarse para as poder ser utilizados en la sntesis de protenas. Las clulas activan los aminocidos usando la energa del ATP de la siguiente manera:

Aminocido + ATP --------> Aminocido-AMP + Pirofosfato

La sntesis de protenas se ver en captulos posteriores. B.- Acidos nucleicos

Los aminocidos son utilizados tambin por las clulas para sintetizar nucletidos (bloques constituyentes de los cidos nucleicos). Existen dos tipos de nucletidos segn el azcar que contengan:

Ribonucletidos: ribosa; sntesis de RNA Deoxiribonucletidos: deoxiribosa; sntesis de

DNA Estos nucletidos tambin se clasifican en dos grupos segn la base nitrogenada que contengan: Purinas: adenina o guanina Pirimidinas: citosina, timina o uracilo En la biosntesis de las purinas se requieren los aminocidos glicina, asprtico y glutamina adems de energa en forma de ATP y GTP (guanosina trifosfato). En la biosntesis de las pirimidinas se requieren los aminocidos glutamina y cido asprtico as como

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energa en forma de ATP. En ambos casos la ribosa fosfato se obtiene a partir de glucosa. Una vez que se han sintetizado los nucletidos, stos se activan por ATP. En este proceso el nucletido, que ya contiene un grupo fosfato, adquiere otros dos grupos fosfato. Por ejemplo, la guanosina monofosfato se activa a guanosina trifosfato:

GMP + 2 ATP --------> GTP + 2 ADP

El ATP, adems de ser una molcula que intercambia energa, es la forma activa de un nucletido, la adenosina monofosfato (AMP), que se utiliza para sintetizar cidos nucleicos.

La biosntesis de DNA y RNA a partir de los nucletidos activados la veremos en captulos posteriores

Carbohidratos

Los microorganismos sintetizan carbohidratos mediante diferentes mecanismos segn sean autotrofos (CO2) o heterotrofos (compuestos orgnicos como la glucosa) a partir de los cuales obtienen los diferentes monosacridos. Estos monosacridos deben ser activados para poder ser ensamblados en los polisacridos correspondientes. Por ejemplo, la forma activada de la glucosa es uridin difosfato glucosa (UDP-Glucosa) y la fuente de energa usada es ATP y UTP:

Glucosa + ATP + UTP --------> UDP-Glucosa + ADP + Pirofosfato

Biosntesis del peptidoglucano de la pared celular: La sntesis de los polisacridos bacterianos se puede ilustrar mediante la biosntesis del peptidoglucano. Si bien este peptidoglucano est localizado en la pared celular, la mayora de la energa utilizada en este proceso biosinttico se consume dentro de la clula. Los distintos pasos involucrados en este proceso se sumarizan en: (i) A partir de glucosa y utilizando ATP y UTP se obtiene N-

acetilglucosamina-UDP (NAG-UDP). (ii) Algunas de estas molculas de NAG-UDP se utilizan para

obtener N-acetilmurmico-UDP (NAM-UDP). La energa requerida en este paso se obtiene a partir del fosfoenolpirvico.

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(iii) A cada molcula de NAM-UDP se le unen 5 aminocidos para formar una cadena pentapeptdica. La adicin de cada aminocido requiere energa en forma de ATP.

(iv) El grupo UDP del NAM-pentapptido-UDP se reemplaza por

un lpido llamado lpido transportador.

(v) A este NAM-pentapptido-lpido transportador se le une una molcula de NAG-UDP para formar una unidad completa activada que se insertar en la cadena de peptidoglucano.

(vi) Esta unidad completa activada se transporta, con la ayuda

del lpido transportador, a travs de la membrana hacia la pared celular.

(vii) Una vez en la pared celular, esta unidad completa activada

se une a una cadena de peptidoglucano alargndose esta cadena en una unidad.

(viii) El ltimo paso es la unin de esta cadena a otras cadenas

para formar la malla del peptidoglucano que constituye la estructura de la pared celular. Esta unin se inicia con la eliminacin del quinto aminocido de la cadena pentapeptdica, reaccin catalizada por el enzima transpeptidasa. La rotura de este enlace libera energa que es utilizada por la transpeptidasa para unir los tetrapptidos de dos cadenas distintas (el tercer aminocido de una con el cuarto aminocido de otra).

Lpidos Los lpidos ms importantes de las clulas bacterianas son los fosfolpidos que, junto con las protenas, forman la estructura de la membrana citoplsmica. La va general por la cual los microorganismos sintetizan fosfolpidos comienza a partir de glucosa (6C) que a travs de la glucolisis se oxida originando dos molculas de cido pirvico (3C) que a su vez se descarboxila a acetil-CoA (2C); este acetil-CoA puede carboxilarse para formar malonil-CoA (3C). Esta ltima reaccin consume energa en forma de ATP:

Acetil-CoA + CO2 + ATP --------> Malonil-CoA + ADP + P

El acetil-CoA y malonil-CoA son las formas activas del cido actico y malnico respectivamente las cuales se utilizan para sintetizar cidos grasos de cadena larga:

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(2C) Acetil-CoA + (3C) Malonil-CoA --------> Acetil-protena + Malonil-protena --------> (4C) Butiril-protena + CO2 --------> + Malonil-protena --------> (6C)-protena + CO2 --------> + Malonil-protena --------> --------> --------> --------> --------> (16C 18C)-protena + CO2

Una vez formados los cidos grasos de cadena larga, stos se utilizan para sintetizar los fosfolpidos. Para ello se necesita adems glicerol fosfato, compuesto que se obtiene por reduccin de la dihidroxiacetona fosfato que es un intermediario en la glucolisis. A cada molcula de glicerol fosfato se le unen dos molculas de cidos grasos de cadena larga para formar una molcula de cido fosfatdico que es un fosfolpido sencillo a partir del cual se sintetizan otros fosfolpidos mediante la unin de otros grupos qumicos al grupo fosfato. Por ejemplo, el aminocido serina se puede adiccionar al cido fosfatdico para formar fosfatidilserina. La energa que se requiere en esta reaccin se obtiene a partir de la citidina trifosfato (CTP):

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Capitulo 3 Microorganismos de Interes Industrial